CN102586481B

CN102586481B - 同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重pcr检测方法

Info

Publication number: CN102586481B
Application number: CN2012100460171A
Authority: CN
Inventors: 刘金香; 周常勇; 李中安; 唐科志; 王雪峰
Original assignee: CITRUS RESEARCH INSTITUTE OF CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: CITRUS RESEARCH INSTITUTE OF CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2032-02-27
Also published as: CN102586481A

Abstract

本发明公开了一种同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重PCR检测方法，通过对4种重要嫁接传播病原柑桔衰退病毒，柑桔裂皮病类病毒，柑桔碎叶病毒，柑桔黄龙病菌的引物优选，以及对引物浓度，PCR扩增条件等的优化，实现了同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原。本发明检测方法快速准确，避免了常规PCR的重复检测，检测的稳定性好，特异性强，一致性高，适用于大规模推广，可以用于指导引进品种和推广苗木的无毒化，确保柑桔安全生产。

Description

同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重PCR检测方法

技术领域

本发明属于农业分子生物领域，具体的说，涉及一种同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法。

背景技术

我国目前已确定有5种嫁接传播病害，包括黄龙病，衰退病，碎叶病，裂皮病和温州蜜柑萎缩病。由于应用无病毒苗木，温州蜜柑萎缩病在田间发生分布很少。柑桔衰退病是柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的一种重要病害，广泛分布于世界各柑桔产区，严重威胁着世界上以酸橙为砧木的柑桔产区和对CTV茎陷点株系敏感的葡萄柚、甜橙等品种的安全。柑桔裂皮病是由柑桔裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid，CEVd)引起的一种世界范围的重要柑桔病害，是限制我国柑桔产量的一种重要的嫁接传播性类病毒，主要为害以枳、枳橙和菜檬作砧木的柑桔品种，引起砧木部树皮开裂、植株矮化等症状，并导致病树落花落果严重，枯枝多，严重时全株死亡。柑桔碎叶病是由柑桔碎叶病毒(Citrus tatter-leaf virus，CTLV)引起的一种柑桔病害，主要危害以枳及其杂种作砧木的柑桔，我国浙江、广东、四川和重庆等省市均有此病的发生。柑桔黄龙病(HLB)是一种在柑桔生产上危害极其严重的类细菌病害，该病的亚洲种病原物为Candidatus liberobacter asiaticus，是我国南部柑桔产区的毁灭性病害，是国内植物检疫对象。柑桔这4种重要嫁接传播病原物在果园中经常以两种或两种以上病原混合侵染为害，危害轻者可引起树势衰退，产量下降，品质变劣；重者可引起成片柑桔树的死亡，对柑桔高产优质生产构成严重障碍。

传统的柑桔病毒病和类病毒病检测方法主要以指示植物鉴定，一般采用Etrog香橼作为指示植物鉴定CEVd，目前鉴定CTV采用墨西哥来檬和酸橙等5种指示植物，CTLV通常采用腊斯克枳橙作为指示植物进行鉴定，虽然指示植物进行病毒病鉴定沿用至今，但烦琐耗时。黄龙病病原物上世纪70年代电镜观察为诊断黄龙病的重要手段，但电镜的检出率较低。目前也有检测CTV和CTLV溃疡病病菌的ELISA检测方法，虽然应用免疫学方法检出速度快，但特异性和灵敏度相对比较差。而PCR法具有快速、灵敏和准确的特点，作为一种强有力的检测工具已广泛应用于各种病害的检验与诊断。

但常规PCR技术一次只能检测一种病原物，如果反应体系中含有两种以上的病原物，则需进行多次进行PCR，不但操作复杂，而且费用较高。多重PCR(Multiplex PCR)是近几年兴起的一项新技术，该技术在同一反应管内同时加入多对引物，扩增完成后可同时检测出多种目的核酸片段，满足同时分析不同DNA序列的需要，它具有高效快捷、高度特异敏感、降低实验成本、加速实验进程等优点。

目前已建立了CTV、CEVd、CTLV的单一RT-PCR分子检测技术，建立了黄龙病的PCR技术，但尚未见4种重要嫁接传播病害的一步法多重PCR体系的报道。建立稳定灵敏的同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原一步法多重PCR检测技术体系，有利于摸清田间4种病害发生状况，实施柑桔多种病毒病和类病毒病的高效快速检测，同时利于加快茎尖嫁接脱毒苗的评价，推进引进品种和推广苗木的无毒化进程，确保柑桔安全生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、准确能同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法，适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。

本发明的目的是这样实现的：

本发明选用已经报道柑桔嫁接传播病原的引物对，如下：

柑桔衰退病毒引物为：

上游引物：5’-ATGTCAGGCAGCTTGGGAAATT-3’

下游引物：5’-TTCGTGTCTAAGTCRCGCTAA CA-3’

柑桔裂皮病类病毒引物为：

上游引物：5’-GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3’

下游引物：5’-CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3’

柑桔碎叶病毒引物为：

上游引物：5’-TGAAAACCTTTGCTGCCACTTCT-3’

下游引物：5’-TACTCTCCGAACCTGCCTCGA AA-3’

黄龙病病菌引物：

上游引物：5’-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3’

下游引物：5’-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’

(RT)-PCR扩增所需试剂如下：柑桔衰退病毒引物：0.13μmol/L，柑桔裂皮病类病毒引物：0.5μmol/L，柑桔碎叶病毒引物：0.16μmol/L，黄龙病病菌引物：0.4μmol/L，Mg²⁺为2.7mmol/L，dNTP为0.5mmol/L，6mM DTT，RT/Taq酶，2×RT-PCR Buffer，灭菌去离子水。

(RT)-PCR扩增条件为：55℃，30min；94℃，5min；94℃，30s；68℃，80s；35个循环；68℃，7min。

本发明具体按如下步骤进行：

1、总核酸提取：

(1)取样、研磨：由于CTV、CTLV、CEVd和韧皮部杆菌Ca.L.asiaticus在柑桔植株内有各自的分布特点，在进行多重PCR检测时确定在柑桔植株上的取样部位对检测出4种病原至关重要。在柑桔植株内韧皮部杆菌Ca.L.asiaticus在老叶中脉的全年检出率最高；在通过蚜虫以半持久性方式传播的初侵染柑桔植株内CTV由叶片通过维管系统的韧皮部筛管作长距离转运，因而在感病植株内病毒的分布是从从茎顶部到茎基部逐步递减的，特别是在柚类中CTV分布不均匀，应用DTBIA方法检测，在嫩皮和嫩叶检测率相对较高；CTLV和CEVd在皮和叶均可作为取样部位。因此检测时应取柑桔植株近基部老叶中脉，同时要取嫩叶的中脉或嫩皮，从同一植株的不同方位取样，每个样品重复抽提3次，这样可以降低这4种病原的漏检率，提高检测的可靠性。取10-15mg皮或叶脉于无菌eppendorf管，液氮研磨；

(2)依次加入60μL TES缓冲液和60μL饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，

(3)70℃水浴5-10min，12000rpm离心5min，

(4)吸取40μL上清液由Sephadex G-50-80层析柱中，5000rpm离心4min，收集洗脱液，-20℃保存。

上述层析柱制备为：加少量TNE平衡的玻璃珠到0.5mL的Eppendorf管底(先用烧红的细针头在最底部打孔)再将此管放入2mL离心管中，并向0.5mL的Eppendorf管内加满用TNE饱和的Sephdex G-50，5000rpm，离心3min，取出0.5mL的Eppendorf管置入1.5mL的Eppendorf管中即可制成。

2、(RT)-PCR扩增：

将1μL总核酸提取液在94℃变性，冰水浴2min后，加入RT-PCR扩增所需试剂，利用PCR仪进行扩增。

(RT)-PCR扩增所需体系如下：2×RT-PCR Buffer液5μL，dNTP 0.3μL，DTT 0.6μL，MgSO₄0.3μL，RT/Taq酶0.4μL，正向引物混合液0.715μL，反向引物混合液0.715μL，用灭菌去离子水补足体积至10μL。

体系中含各病原引物终浓度如下：柑桔衰退病毒引物：0.13μmol/L，柑桔裂皮病类病毒引物：0.5μmol/L，柑桔碎叶病毒引物：0.16μmol/L，黄龙病病菌引物：0.4μmol/L，内参泛素基因引物：0.24μmol/L。

(RT)-PCR扩增条件为：55℃，30min；94℃，5min；94℃，30s；68℃，80s；35个循环；68℃，7min；

3、PCR产物电泳检测：

取5μLPCR产物与3μL染料相混合，在室温下进行1.5％水平琼脂糖恒压凝胶电泳。电泳条件为初始电压150V，5min；后续电压100V，30min。电泳完毕后EB染色，凝胶成像系统观测电泳结果。

4、电泳结果分析：

柑桔衰退病毒引物、柑桔裂皮病类病毒、柑桔碎叶病毒和黄龙病病菌分别扩增出511bp、371bp、309bp和1160bp的片段，及内参基因194bp，与分别用单一的引物扩增的序列大小相符合，见附图1。

对PCR产物用PCR产物纯化试剂盒分别切胶回收，纯化产物经过测序预处理后，送基因公司测序，使用NCBI的BLAST登录序列进行同源性比对分析，均为特异基因片段。

5、多重(RT)-PCR灵敏度的测试：

分别用超纯水10倍梯度稀释总核酸模板，各取1μL作模板检测(RT)-PCR的灵敏度，结果显示：可以从稀释10倍的总核酸中扩增出CEV，可以从稀释10²倍的总核酸中扩增出CTV，多重PCR与单一PCR具有相同的检测灵敏度。

测试模板为柑桔衰退病毒和柑桔裂皮病毒结果显示：模板稀释10倍均可扩增出特异性片段，见附图2。

有益效果：本发明能同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原，快速准确，避免了常规PCR的重复检测。检测的稳定性好，特异性强，一致性高，适用于大规模推广，实现了柑桔多种病毒病和类病毒病的高效快速检测，有利于摸清田间4种病害发生状况，同时利于加快茎尖嫁接脱毒苗的评价，推进引进品种和推广苗木的无毒化进程，确保柑桔安全生产。

附图说明

图1为一步法多重PCR电泳图谱。M：100bp DNA分子量标准；1：4种病原核酸抽提混合液；2：黄龙病病菌；3：柑桔衰退病毒；4：柑桔裂皮病类病毒；5：柑桔碎叶病毒；6：阴性对照。

图2为多重PCR灵敏度测试分析的电泳图谱。M：100bp DNA分子量标准；1-4∶10倍梯度稀释。

图3为随机采取的田间样品进行多重PCR电泳图谱。M：100bp DNA分子量标准；1：4种病原核酸抽提混合液；15：阴性对照；16：水对照，其余为随机采取的田间样品。

具体实施方式

本发明同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法如下：

1、核酸提取：(1)从江西、云南、湖南、浙江、重庆、广东、广西等地方采摘的柑桔样品，随机选取了13种样品，每样取10-15mg皮和叶脉于无菌eppendorf管，液氮研磨；

(3)70℃水浴8min，12000rpm离心5min，

2、(RT)-PCR扩增：

(RT)-PCR扩增所需体系如下：柑桔衰退病毒引物：0.13μmol/L，柑桔裂皮病类病毒引物：0.5μmol/L，柑桔碎叶病毒引物：0.16μmol/L，黄龙病病菌引物：0.4μmol/L，内参基因引物：0.24μmol/L，Mg²⁺为2.7mmol/L，dNTP为0.5mmol/L，DTT 6mM，2×PCR buffer 5.0μL，RT/Taq为0.4μL，用灭菌去离子水补足体积至10μL。

3、PCR产物电泳检测：

取5μL PCR产物与3μL染料相混合，在室温下进行1.5％水平琼脂糖恒压凝胶电泳。电泳条件为初始电压150V，5min；后续电压100V，30min。电泳完毕后EB染色，凝胶成像系统观测电泳结果，见附图3。

Claims

1.一种同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重PCR检测方法，4种重要嫁接传播病原为柑桔衰退病毒，柑桔裂皮病类病毒，柑桔碎叶病毒，柑桔黄龙病菌，其特征在于：提取柑桔样品总核酸，选用4种病原的特异引物，对待测样品进行RT-PCR扩增，同时设计了泛素基因引物序列，体系中设置了泛素基因作为内参基因，最后电泳鉴定：

1)根据泛素基因保守序列区域设计特异引物UBQ-F：GATCTTCGCCTTAACGTTGTCAAT，UBQ-R：GTTGATTTTTGCTGGGAAGCA，作为内参基因，

2)所述RT-PCR扩增所需试剂如下：柑桔衰退病毒引物：0.13umol/L，柑桔裂皮病类病毒引物：0.5umol/L，柑桔碎叶病毒引物：0.16umol/L，黄龙病病菌引物：0.4umol/L，内参泛素基因引物：0.24umol/L，Mg²⁺为2.7mmol/L，dNTP为0.5mmol/L，6mM DTT，RT/Taq酶，2×RT-PCR Buffer，灭菌去离子水，

RT-PCR扩增条件为：55℃，30min；94℃，5min；94℃，30s；68℃，80s；35个循环；68℃，7min；

所述柑桔衰退病毒引物为：

上游引物：5’-ATGTCAGGCAGCTTGGGAAATT-3’

下游引物：5’-TTCGTGTCTAAGTCRCGCTAACA-3’

所述柑桔裂皮病类病毒引物为：

上游引物：5’-GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3’

下游引物：5’-CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3’

所述柑桔碎叶病毒引物为：

上游引物：5’-TGAAAACCTTTGCTGCCACTTCT-3’

下游引物：5’-TACTCTCCGAACCTGCCTCGA AA-3’

所述黄龙病病菌引物：

上游引物：5’-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3’

下游引物：5’-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重PCR检测方法，其特征在于：所述提取柑桔样品总核酸，样品不仅取柑桔植株近基部老叶中脉，同时还应取嫩叶的中脉或嫩皮，并且同一植株的不同方位取样。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测柑枯4种重要病原的一步法多重PCR检测方法，其特征在于：电泳得到的特异性片段大小为：柑桔衰退病毒为511bp，柑桔裂皮病类病毒为371bp，柑桔碎叶病毒为309bp，柑桔黄龙病菌为1160bp，内参泛素基因为194bp。