CN104073572B - 同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法 - Google Patents

同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物以及PCR反应试剂，所述特异性引物序列为：上游引物：5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’；下游引物：5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。本发明还提供了同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括：(1)提取柑桔待测样品总RNA；(2)样品总RNA经反转录获得其cDNA；(3)以样品cDNA为模板，加入特异性引物和PCR反应试剂，进行实时荧光RT-PCR检测。该方法检测特异性强，灵敏度高，稳定性好。

Description

同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学的病毒检测领域，具体的说，涉及一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法。
背景技术
柑桔是世界第一大水果，我国柑桔栽培面积和产量均居世界首位，在国民经济中占有十分重要的地位。近几年来，随着我国柑桔产业的发展和优势产业带的确立，柑桔的种植区域更趋集中，面积亦进一步扩大，而病害问题日益引起生产者的重视。随着国际柑桔贸易的持续增长及种质资源交换的日益频繁，各种检疫性柑桔病害传入我国的机率不断加大。
温州蜜柑萎缩病毒(Satsumadwarfvirus，SDV)引起的温州蜜柑萎缩病主要危害温州蜜柑，造成温州蜜柑果实的畸形，影响果实品质，使其失去经济价值。一般发病10年以上的植株明显矮化，产量锐减(只有健康树的40-50％)，严重时全无收成。病树主干直径比健康树小20-30％，树冠小50-60％。上世纪80年代我国从日本引进温州蜜柑品种，SDV随带毒的接穗和苗木传入我国，该病相继在浙江、四川、湖北、湖南、广西等地发生。
柑桔花叶病毒(Citrusmosaicvirus，CiMV)引起的柑桔花叶病最早发现于日本，病果的果皮部分或整个不着色，同时出现云纹状或轮纹状的斑驳；糖、酸含量低，没有经济价值。高接在温州蜜柑上的柠檬、金柑的果实也产生斑驳，且与感病温州蜜柑混栽的日本夏橙、伏令夏橙、鸣门柑、代代酸橙、八朔柑等春梢的嫩叶上会产生斑驳、杂色花叶、黄脉以及镶边脉等症状。
CiMV是SDV的分离株，两者具有亲缘关系。传统的柑桔病毒病检测方法主要是指示植物鉴定，夏代代、香橼、柠檬等鉴定SDV，枸头橙、马叙葡萄柚、白芝麻等鉴定CiMV，虽然指示植物进行病毒病鉴定沿用至今，但烦琐耗时。目前也有检测SDV和CiMV的ELISA检测方法，虽然应用免疫学方法检出速度快，但特异性和灵敏度相对比较差。
实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与目前使用的生物学鉴定，血清学检测和PCR等检测技术相比，实时荧光RT-PCR法具有快速、灵敏和准确的特点，较普通RT-PCR的灵敏度高出10-100倍，而且能对病原体的数量进行精确定量。SYBRGreenI染料法具有灵敏度高、信噪比高、适用范围广和低价等特点。在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。并且普通RT-PCR技术一次只能检测一种病原物，如果反应体系中含有两种以上的病原物，则需多次进行PCR，不但操作复杂，而且费用较高。目前已建立了SDV和CiMV的单一RT-PCR分子检测技术，但尚未见2种病害同时检测的实时荧光RT-PCR体系的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、准确的能同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法，适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。
本发明解决其技术问题采用的技术方案：一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物以及PCR反应试剂，所述特异性引物序列如下：
上游引物：5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’；
下游引物：5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
本发明还涉及一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括：
(1)提取柑桔待测样品总RNA；
(2)样品总RNA经反转录获得其cDNA；
(3)以样品cDNA为模板，加入特异性引物和PCR反应试剂，进行实时荧光RT-PCR检测，根据Ct值诊断是否含有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；所述特异性引物核苷酸序列如下：
上游引物：5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’；
下游引物：5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
根据Ct值进行判断，当Ct值≤35时，样品判断为阳性，带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；当Ct值>35时，样品判断为阴性，不带CiMV和SDV。
所述CiMV或SDV特异性引物实时荧光RT-PCR扩增产物大小为160bp。
步骤(3)所述PCR反应体系如下：SYBRPremixExTaqⅡ12.5μL；10μM的上、下游引物各0.2μL，cDNA模板1μL，超纯水11.1μL。
步骤(3)所述PCR反应程序为：95℃5s，60℃30s，采集荧光信号，共40个循环。
本发明的有益效果是：本发明通过设计能针对两种病毒的实时荧光定量RT-PCR特异性引物，建立了同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法，能同时检测柑桔2种重要嫁接传播病原，快速准确，避免了常规PCR的重复检测。且检测特异性强，灵敏度高，稳定性好，工序简单，节约成本，适用于大规模推广，有利于摸清田间CiMV和SDV病害发生状况，同时利于加快茎尖嫁接脱毒苗的评价，加速引进品种和推广苗木的无毒化进程，确保柑桔安全生产。
附图说明
图1为SDV和CiMV实时荧光RT-PCR检测结果分析。
图2为分别感染SDV和CiMV的柑桔样品RT-PCR扩增产物电泳图。M：100bpDNA分子量标准；1：SDV；2：CiMV。
图3为分别感染SDV和CiMV的柑桔样品实时荧光RT-PCR扩增阳性样品的融解曲线图。
图4为SDV和CiMV实时荧光RT-PCR特异性检测图。
图5为SDV实时荧光RT-PCR灵敏性检测图。1：SDV抽提样品；2-7：SDV抽提样品依次进行10倍梯度稀释，2-7稀释倍数依次为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6。
图6为SDV普通RT-PCR灵敏性检测图。1：SDV抽提样品；2-7：SDV抽提样品依次进行10倍梯度稀释，2-7稀释倍数依次为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6。
具体实施方式
实施例1提取样品总RNA
以7份西南大学柑桔实验基地田间采集的柑桔叶片作为待测样品，以分别感染有CiMV和SDV的柑桔叶片(西南大学柑桔研究所的毒源库保存的毒源)作为阳性样品，提取该9份待测样品总RNA，按照如下步骤操作：
(1)取样、研磨：取嫩叶的中脉或嫩皮，从同一植株的不同方位取样，每个样品重复抽提3次，以降低这2种病原的漏检率提高检测的可靠性。取10-15mg皮或叶脉于无菌eppendorf管，液氮研磨；
(2)依次加入60μLTES缓冲液和60μL饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混匀；
(3)70℃水浴5-10min，12000rpm离心5min；
(4)吸取40μL上清液于SephadexG-50-80层析柱中，5000rpm离心4min，收集洗脱液，-20℃保存。所述层析柱制备方法为：加少量TNE平衡的玻璃珠到0.5mL的Eppendorf管底(先用烧红的细针头在最底部打孔)再将此管放入2mL离心管中，并向0.5mL的Eppendorf管内加满用TNE饱和的SephdexG-50，5000rpm，离心3min，取出0.5mL的Eppendorf管置入1.5mL的Eppendorf管中即可制成。
实施例2cDNA合成：
将实施例1提取得到的9份总RNA反转录为cDNA，方法如下：将1μL总RNA在94℃变性，冰水浴2min后，按照反转录试剂盒使用说明，加入cDNA合成所需试剂，利用PCR仪进行扩增。
cDNA合成所需体系如下：模板总RNA1μL，10μM下游引物0.25μL，5×PCRbuffer2μL，10mMdNTPs0.5μL,RNAsin0.25μL，RTase0.25μL，超纯水5.75μL。
cDNA合成条件为：42℃，30min。
实施例3实时荧光RT-PCR检测：
一、利用实施例2得到的cDNA进行实时荧光RT-PCR检测：
实时荧光RT-PCR检测反应体系如下：SYBRPremixExTaqⅡ12.5μL；10μM上、下游引物各0.2μL，cDNA模板1μL，超纯水11.1μL。所述引物序列为：上游引物：5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’，下游引物：5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
反应条件为：95℃5s，60℃30s，采集荧光信号，共40个循环。
二、检测结果分析：
检测结果用Bio-RadiQ5软件进行分析，得到如图1所示结果值，F05为阴性对照，F01是SDV阳性样品，F02是CiMV阳性样品，其余7个为田间采集的未知待测样品。当Ct值≤35时，样品判断为阳性，带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；当Ct值>35时，样品判断为阴性，不带CiMV和SDV。由图1可见，田间采集的7个待测样品均带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种。
将阳性样品--已知感染CiMV和SDV的叶片的扩增产物进行凝胶电泳，电泳图如图2所示，该特异引物扩增的片段长度为160bp。对扩增产物用PCR产物纯化试剂盒切胶回收，纯化产物经过测序预处理后，送基因公司测序，使用NCBI的BLAST登录序列进行同源性比对分析，验证分别为CiMV和SDV的特异基因片段。
利用该特异引物进行实时荧光RT-PCR检测，其融解曲线只有单一峰，如附图3所示，表明无非特异性条带的扩增。
三、特异性测试：
用感染柑桔衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)、柑桔碎叶病毒(Citrustatterleafvirus,CTLV)、鳞皮病毒(Citruspsorosisvirus,CPV)、柑桔裂皮病毒(Citrusexocortisviroid,CEVd)、SDV以及CiMV的柑桔叶片的总RNA反转录得到的cDNA进行实时荧光RT-PCR检测，如图4所示，由扩增的荧光曲线可以看出只有带SDV和CiMV的样品荧光信号才有增加，而其它样品荧光信号均无增加，表明只有SDV和CiMV的核酸得到了扩增，其它病毒核酸均无扩增，说明该体系检测SDV和CiMV的特异性强。
四、灵敏度测试：
用超纯水10倍梯度稀释带有SDV和CiMV的阳性样品的总核酸模板，检测普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR的灵敏度，结果均显示：普通RT-PCR能检测到10-5浓度梯度，而不能检测到10-6浓度梯度；实时荧光RT-PCR能检测出10-6浓度梯度，表明实时荧光RT-PCR灵敏度比普通RT-PCR高出10倍。SDV阳性样品10倍梯度稀释样品的实时荧光RT-PCR检测结果如图5所示，其普通RT-PCR的电泳检测结果如图6所示。

Claims (4)

1.一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物以及PCR反应试剂，其特征在于：所述特异性引物序列如下：
上游引物：5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’；
下游引物：5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
2.一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括：
(1)提取柑桔待测样品总RNA；
(2)样品总RNA经反转录获得其cDNA；
(3)以样品cDNA为模板，加入特异性引物和PCR反应试剂，进行实时荧光RT-PCR检测，所述特异性引物核苷酸序列如下：
上游引物：5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’；
下游引物：5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’；
根据Ct值诊断是否含有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种：当Ct值≤35时，样品判断为阳性，带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；当Ct值>35时，样品判断为阴性，不带CiMV和SDV；CiMV或SDV特异性引物实时荧光RT-PCR扩增产物大小为160bp。
3.如权利要求2所述的同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：步骤(3)所述PCR反应体系如下：SYBRPremixExTaqⅡ12.5μL；10μM的上、下游引物各0.2μL，cDNA模板1μL，超纯水11.1μL。
4.如权利要求2所述的同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：步骤(3)所述PCR反应程序为：95℃5s，60℃30s，采集荧光信号，共40个循环。
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