CN104073572B - 同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒,主要包括特异性引物以及PCR反应试剂,所述特异性引物序列为:上游引物:5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’;下游引物:5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。本发明还提供了同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法,所述方法包括:(1)提取柑桔待测样品总RNA;(2)样品总RNA经反转录获得其cDNA;(3)以样品cDNA为模板,加入特异性引物和PCR反应试剂,进行实时荧光RT-PCR检测。该方法检测特异性强,灵敏度高,稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学的病毒检测领域,具体的说,涉及一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法。
背景技术
柑桔是世界第一大水果,我国柑桔栽培面积和产量均居世界首位,在国民经济中占有十分重要的地位。近几年来,随着我国柑桔产业的发展和优势产业带的确立,柑桔的种植区域更趋集中,面积亦进一步扩大,而病害问题日益引起生产者的重视。随着国际柑桔贸易的持续增长及种质资源交换的日益频繁,各种检疫性柑桔病害传入我国的机率不断加大。
温州蜜柑萎缩病毒(Satsumadwarfvirus,SDV)引起的温州蜜柑萎缩病主要危害温州蜜柑,造成温州蜜柑果实的畸形,影响果实品质,使其失去经济价值。一般发病10年以上的植株明显矮化,产量锐减(只有健康树的40-50%),严重时全无收成。病树主干直径比健康树小20-30%,树冠小50-60%。上世纪80年代我国从日本引进温州蜜柑品种,SDV随带毒的接穗和苗木传入我国,该病相继在浙江、四川、湖北、湖南、广西等地发生。
柑桔花叶病毒(Citrusmosaicvirus,CiMV)引起的柑桔花叶病最早发现于日本,病果的果皮部分或整个不着色,同时出现云纹状或轮纹状的斑驳;糖、酸含量低,没有经济价值。高接在温州蜜柑上的柠檬、金柑的果实也产生斑驳,且与感病温州蜜柑混栽的日本夏橙、伏令夏橙、鸣门柑、代代酸橙、八朔柑等春梢的嫩叶上会产生斑驳、杂色花叶、黄脉以及镶边脉等症状。
CiMV是SDV的分离株,两者具有亲缘关系。传统的柑桔病毒病检测方法主要是指示植物鉴定,夏代代、香橼、柠檬等鉴定SDV,枸头橙、马叙葡萄柚、白芝麻等鉴定CiMV,虽然指示植物进行病毒病鉴定沿用至今,但烦琐耗时。目前也有检测SDV和CiMV的ELISA检测方法,虽然应用免疫学方法检出速度快,但特异性和灵敏度相对比较差。
实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与目前使用的生物学鉴定,血清学检测和PCR等检测技术相比,实时荧光RT-PCR法具有快速、灵敏和准确的特点,较普通RT-PCR的灵敏度高出10-100倍,而且能对病原体的数量进行精确定量。SYBRGreenI染料法具有灵敏度高、信噪比高、适用范围广和低价等特点。在核酸的实时检测方面有很多优点,由于它与所有的双链DNA相结合,不必因为模板不同而特别定制,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低。并且普通RT-PCR技术一次只能检测一种病原物,如果反应体系中含有两种以上的病原物,则需多次进行PCR,不但操作复杂,而且费用较高。目前已建立了SDV和CiMV的单一RT-PCR分子检测技术,但尚未见2种病害同时检测的实时荧光RT-PCR体系的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、准确的能同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法,适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。
本发明解决其技术问题采用的技术方案:一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒,主要包括特异性引物以及PCR反应试剂,所述特异性引物序列如下:
上游引物:5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’;
下游引物:5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
本发明还涉及一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法,所述方法包括:
(1)提取柑桔待测样品总RNA;
(2)样品总RNA经反转录获得其cDNA;
(3)以样品cDNA为模板,加入特异性引物和PCR反应试剂,进行实时荧光RT-PCR检测,根据Ct值诊断是否含有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种;所述特异性引物核苷酸序列如下:
上游引物:5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’;
下游引物:5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
根据Ct值进行判断,当Ct值≤35时,样品判断为阳性,带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种;当Ct值>35时,样品判断为阴性,不带CiMV和SDV。
所述CiMV或SDV特异性引物实时荧光RT-PCR扩增产物大小为160bp。
步骤(3)所述PCR反应体系如下:SYBRPremixExTaqⅡ12.5μL;10μM的上、下游引物各0.2μL,cDNA模板1μL,超纯水11.1μL。
步骤(3)所述PCR反应程序为:95℃5s,60℃30s,采集荧光信号,共40个循环。
本发明的有益效果是:本发明通过设计能针对两种病毒的实时荧光定量RT-PCR特异性引物,建立了同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法,能同时检测柑桔2种重要嫁接传播病原,快速准确,避免了常规PCR的重复检测。且检测特异性强,灵敏度高,稳定性好,工序简单,节约成本,适用于大规模推广,有利于摸清田间CiMV和SDV病害发生状况,同时利于加快茎尖嫁接脱毒苗的评价,加速引进品种和推广苗木的无毒化进程,确保柑桔安全生产。
附图说明
图1为SDV和CiMV实时荧光RT-PCR检测结果分析。
图2为分别感染SDV和CiMV的柑桔样品RT-PCR扩增产物电泳图。M:100bpDNA分子量标准;1:SDV;2:CiMV。
图3为分别感染SDV和CiMV的柑桔样品实时荧光RT-PCR扩增阳性样品的融解曲线图。
图4为SDV和CiMV实时荧光RT-PCR特异性检测图。
图5为SDV实时荧光RT-PCR灵敏性检测图。1:SDV抽提样品;2-7:SDV抽提样品依次进行10倍梯度稀释,2-7稀释倍数依次为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6。
图6为SDV普通RT-PCR灵敏性检测图。1:SDV抽提样品;2-7:SDV抽提样品依次进行10倍梯度稀释,2-7稀释倍数依次为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6。
具体实施方式
实施例1提取样品总RNA
以7份西南大学柑桔实验基地田间采集的柑桔叶片作为待测样品,以分别感染有CiMV和SDV的柑桔叶片(西南大学柑桔研究所的毒源库保存的毒源)作为阳性样品,提取该9份待测样品总RNA,按照如下步骤操作:
(1)取样、研磨:取嫩叶的中脉或嫩皮,从同一植株的不同方位取样,每个样品重复抽提3次,以降低这2种病原的漏检率提高检测的可靠性。取10-15mg皮或叶脉于无菌eppendorf管,液氮研磨;
(2)依次加入60μLTES缓冲液和60μL饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),混匀;
(3)70℃水浴5-10min,12000rpm离心5min;
(4)吸取40μL上清液于SephadexG-50-80层析柱中,5000rpm离心4min,收集洗脱液,-20℃保存。所述层析柱制备方法为:加少量TNE平衡的玻璃珠到0.5mL的Eppendorf管底(先用烧红的细针头在最底部打孔)再将此管放入2mL离心管中,并向0.5mL的Eppendorf管内加满用TNE饱和的SephdexG-50,5000rpm,离心3min,取出0.5mL的Eppendorf管置入1.5mL的Eppendorf管中即可制成。
实施例2cDNA合成:
将实施例1提取得到的9份总RNA反转录为cDNA,方法如下:将1μL总RNA在94℃变性,冰水浴2min后,按照反转录试剂盒使用说明,加入cDNA合成所需试剂,利用PCR仪进行扩增。
cDNA合成所需体系如下:模板总RNA1μL,10μM下游引物0.25μL,5×PCRbuffer2μL,10mMdNTPs0.5μL,RNAsin0.25μL,RTase0.25μL,超纯水5.75μL。
cDNA合成条件为:42℃,30min。
实施例3实时荧光RT-PCR检测:
一、利用实施例2得到的cDNA进行实时荧光RT-PCR检测:
实时荧光RT-PCR检测反应体系如下:SYBRPremixExTaqⅡ12.5μL;10μM上、下游引物各0.2μL,cDNA模板1μL,超纯水11.1μL。所述引物序列为:上游引物:5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’,下游引物:5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
反应条件为:95℃5s,60℃30s,采集荧光信号,共40个循环。
二、检测结果分析:
检测结果用Bio-RadiQ5软件进行分析,得到如图1所示结果值,F05为阴性对照,F01是SDV阳性样品,F02是CiMV阳性样品,其余7个为田间采集的未知待测样品。当Ct值≤35时,样品判断为阳性,带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种;当Ct值>35时,样品判断为阴性,不带CiMV和SDV。由图1可见,田间采集的7个待测样品均带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种。
将阳性样品--已知感染CiMV和SDV的叶片的扩增产物进行凝胶电泳,电泳图如图2所示,该特异引物扩增的片段长度为160bp。对扩增产物用PCR产物纯化试剂盒切胶回收,纯化产物经过测序预处理后,送基因公司测序,使用NCBI的BLAST登录序列进行同源性比对分析,验证分别为CiMV和SDV的特异基因片段。
利用该特异引物进行实时荧光RT-PCR检测,其融解曲线只有单一峰,如附图3所示,表明无非特异性条带的扩增。
三、特异性测试:
用感染柑桔衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)、柑桔碎叶病毒(Citrustatterleafvirus,CTLV)、鳞皮病毒(Citruspsorosisvirus,CPV)、柑桔裂皮病毒(Citrusexocortisviroid,CEVd)、SDV以及CiMV的柑桔叶片的总RNA反转录得到的cDNA进行实时荧光RT-PCR检测,如图4所示,由扩增的荧光曲线可以看出只有带SDV和CiMV的样品荧光信号才有增加,而其它样品荧光信号均无增加,表明只有SDV和CiMV的核酸得到了扩增,其它病毒核酸均无扩增,说明该体系检测SDV和CiMV的特异性强。
四、灵敏度测试:
用超纯水10倍梯度稀释带有SDV和CiMV的阳性样品的总核酸模板,检测普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR的灵敏度,结果均显示:普通RT-PCR能检测到10-5浓度梯度,而不能检测到10-6浓度梯度;实时荧光RT-PCR能检测出10-6浓度梯度,表明实时荧光RT-PCR灵敏度比普通RT-PCR高出10倍。SDV阳性样品10倍梯度稀释样品的实时荧光RT-PCR检测结果如图5所示,其普通RT-PCR的电泳检测结果如图6所示。
Claims (4)
1.一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒,主要包括特异性引物以及PCR反应试剂,其特征在于:所述特异性引物序列如下:
上游引物:5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’;
下游引物:5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。
2.一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法,所述方法包括:
(1)提取柑桔待测样品总RNA;
(2)样品总RNA经反转录获得其cDNA;
(3)以样品cDNA为模板,加入特异性引物和PCR反应试剂,进行实时荧光RT-PCR检测,所述特异性引物核苷酸序列如下:
上游引物:5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’;
下游引物:5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’;
根据Ct值诊断是否含有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种:当Ct值≤35时,样品判断为阳性,带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种;当Ct值>35时,样品判断为阴性,不带CiMV和SDV;CiMV或SDV特异性引物实时荧光RT-PCR扩增产物大小为160bp。
3.如权利要求2所述的同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法,其特征在于:步骤(3)所述PCR反应体系如下:SYBRPremixExTaqⅡ12.5μL;10μM的上、下游引物各0.2μL,cDNA模板1μL,超纯水11.1μL。
4.如权利要求2所述的同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法,其特征在于:步骤(3)所述PCR反应程序为:95℃5s,60℃30s,采集荧光信号,共40个循环。
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