CN101948935A - 蜜柑萎缩病毒rt-pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测温州蜜柑萎缩病毒的RT-PCR检测方法和试剂盒，属于生物技术领域。本方法通过提取核酸、应用温州蜜柑萎缩病毒特异性引物进行RT-PCR扩增及电泳来判断检测样品中是否存在温州蜜柑萎缩病毒：电泳图谱中如出现251bp特征性条带，表明该样品中存在温州蜜柑萎缩病毒，如果没有出现251bp特征性条带，表明该样品中不存在温州蜜柑萎缩病毒。本发明还相应地建立了检测试剂盒，可特异、灵敏、高效地检测温州蜜柑萎缩病毒，适用于田间样品检测、温州蜜柑萎缩病毒流行监控、脱毒苗木鉴定等多种用途。
Description
技术领域
本发明属于一种PT-PCR检测方法及其检测用试剂盒，具体的说，涉及一种温州蜜柑萎缩病毒的RT-PCR检测方法及试剂盒。
背景技术
温州蜜柑萎缩病是日本温州蜜柑生产上的重要病害,自从1937 年发现以来已经遍及各个柑橘产区。20世纪80年代以来,我国研修人员从日本携带温州蜜柑优良品种回国时无意中将该病带入浙江黄岩、重庆奉节和江苏吴县。该病可通过嫁接、汁液和土壤传播,并通过苗木运输进行远距离传播,可以危害几乎所有的柑橘属及近缘属的植物。但温州蜜柑表现症状明显、受害严重。目前的防治方法主要是检测无病毒母树、推广无病毒苗木,并挖除病树。
该病由温州蜜柑萎缩病毒( Satsuma dwarf virus, SDV)引起。SDV 为双分体病毒,包含两条正单链RNA分子: RNA1 和RNA2,是豇豆花叶病毒科,线虫传多面体病毒属的暂定成员。由于多数寄主植物受侵染后不表现明显症状,病原检测显得更为重要。传统的检测方法是指示植物鉴定，主要用白芝麻，可以检测到春梢嫩叶中的病毒。但是，白芝麻检测季节性强、周期长、症状易混淆，而且在检测过程中需要有温室做配套设施。血清学检测SDV，受季节和寄主部位的影响，只能检测嫩组织中的病毒，检测不到老叶和老枝皮中的病毒。
RT-PCR检测快速、灵敏，可以实现病害的早期诊断， 2003年日本下存克己等建立了SDV的RT-PCR检测技术体系，但其灵敏度与ELISA相差不大，到目前为止， SDV的RT-PCR检测还处于初级阶段。
发明内容
本发明的目的在于克服现有传统检测技术中的不足之处，提供一种检测温州蜜柑萎缩病毒的特异性强、灵敏度高的RT-PCR检测方法，并在此基础上研制SDV的RT-PCR检测试剂盒，适合大规模、高通量样品检测。
本发明是这样实现的：本发明从已经报道的温州蜜柑病毒的所有引物对中筛选出一对特异性引物，碱基序列为：
上游引物：5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’
下游引物：5’- AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’。
本发明的目的通过如下措施来实现：
（1）核酸提取
取适量SDV寄主植物的叶或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取样品总核酸或RNA；
（2）逆转录反应
所用引物为SDV特异性下游引物5’- AGAGAGATTTCTACTC GCA-3’ ，反应体系5ul，包括：核酸抽提液1.0μL, 10 ×buffer0.5μL, 25mmol/L的 MgCl2 0.5μL, 10mmol/L的 dNTP0.5μL , 10μmol/L引物0.5μL ,40U/μLRNAsin0.1μL, 200U/μL逆转录酶0.2μL, 超纯水1.7μL， 42 ℃温育30min；
（3）扩增反应
所用特异性上、下游引物分别为：5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’、 5’- AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’；反应总体积为25μL 包括：逆转录反应混合液5μL、10 ×buffer2μL, 25mmol/L的 MgCl2 1.5μL , 10μmol/L 的SDV上游引物0.5μL, Taq DNA 聚合酶0.4μL, 超纯水15.6μL；反应条件94 ℃ 4min, 94 ℃ 15 s, 63 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s, 5 个循环; 62 ℃, 5 个循环; 61 ℃, 5 个循环; 60 ℃, 10个循环; 59 ℃, 10个循环; 72 ℃ 10min；
（4）电泳图谱获得
琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色、获取电泳图谱；
（5）SDV的诊断
依据上述图谱的条带特征诊断SDV的分子变异类型。参见图1，泳图谱中如出现251bp扩增条带，表明该样品中存在温州蜜柑萎缩病毒，如果没有出现251bp扩增条带，表明该样品中不存在温州蜜柑萎缩病毒。
在上述技术方案中：所述步骤（1）的提取方法为：称取SDV病毒寄主不同位置处的嫩叶各5㎎，装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入60μL TES缓冲液和60μL饱和酚：氯仿：异戊醇（体积比为25：24：1），混匀；70℃水浴5~10分钟。室温下13000rpm离心5 分钟，吸取40μL上清液加入由Sephadex G-50-80构成的微柱中，置于一新的无菌离心管，5000rpm离心4 分钟，收集洗脱液。
本发明的检测温州蜜柑萎缩病毒的检测试剂盒由以下试剂构成：缓冲液A、RT酶、Taq酶、SDV正对照、缓冲液B和双蒸水；其中，其中缓冲液A含10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性下游引物：5’- AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’ 、10 ×buffer, 25mmol/L的 MgCl2, 10mmol/L的 dNTP 、40U/μLRNAsin和超纯水；缓冲液B含10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性上游引物：5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’、 10 ×buffer、 25mmol/L的 MgCl2 和超纯水。
单样用量的缓冲液A含10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性下游引物：5’- AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’ 0.5μL，10 ×buffer0.5μL, 25mmol/L的 MgCl2 0.5μL, 10mmol/L的 dNTP0.5μL ,40U/μLRNAsin0.1μL,超纯水1.7μL ；单样用量的缓冲液B含10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性上游引物5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’ 0.5μL， 10 ×buffer 2μL, 25mmol/L的 MgCl2 1.5μL ,超纯水15.6μL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）实用性强，传统的检测方法不论是白芝麻检测还是血清学检测，只能检测到春梢嫩叶中的病毒，受季节和寄主部位影响很大，无法检测到老叶和老树皮中的病毒；而本发明可以直接从SDV寄主植物的叶或皮中检测出SDV病毒，不受季节和寄主部位的限制；
（2）速度快，操作简便，重复性好，稳定性高，灵敏度高，从样品制备到获检测结果图谱可在一天之内完成，同一样品的不同检测批次，不同人员操作，其结果一致性强，适合大规模、高通量的样品分析，一次可处理样品几十个。
附图说明
图1是本发明检测结果示意图；
M： DNA标准分子量；从左到右的电泳带为1-2：阴性对照；3-8：温州蜜柑萎缩病毒样品（阳性，有251bp特征性条带）。
具体实施方式
本发明中所使用的术语“PCR”又称聚合酶链式反应，通常需要获得感兴趣区域端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相反链的序列相同或相似，两个引物的5’端核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合，PCR技术可用来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的cDNA中的待定RNA序列、待定DNA序列。见Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant Biol.51.263(1987)。
RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
TES缓冲液指：三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸生物缓冲液。
DEPC水指：用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。
dNTP指，deoxy-ribonucleoside triphosphate(三磷酸脱氧核糖核苷)。
实施例1：温州蜜柑萎缩病毒RT-PCR检测方法
（1） 核酸提取
称取SDV病毒寄主不同位置处的嫩叶各5㎎，装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入60μL TES缓冲液和60μL饱和酚：氯仿：异戊醇（体积比为25：24：1），混匀。70℃水浴5~10分钟。室温下13 000rpm离心5 分钟，吸取40μL上清液加入由Sephadex G-50-80构成的微柱中，置于一新的无菌离心管，5 000rpm离心4 分钟，收集洗脱液。
（2）逆转录
在0. 5mL PCR反应管中加入1. 0μL 抽提液,1. 0μL 超纯水, 95 ℃变性5min,迅速置于冰水中,加入0. 5μL 10 ×buffer, 0. 5μL MgCl2 (25mmol/L) ,0. 5μL dNTP (10mmol/L) , 0. 5μL 特异性下游引物 (10μmol/L) , 2. 52U RNAsin, 25U M2MLV RTase,补超纯水至5μL。在Biometra 公司T1 PCR 仪上42 ℃温育30min。反转录后,将PCR管迅速置冰水中。
（3）扩增反应
在逆转录反应混合液中加入2μL 10 ×buffer, 1. 5μL MgCl2 ( 25mmol/L ) , 0. 5μL特异性上游引物 ( 10μmol/L ) , Taq DNA 聚合酶0. 4μL ( 5U /μL, Promega ) , 反应总体积为25μL。运行Touchdown PCR, 94 ℃ 4min, 94 ℃ 15 s, 63 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s, 5 个循环; 62 ℃, 5 个循环; 61 ℃, 5 个循环; 60 ℃, 10个循环; 59 ℃, 10个循环; 72 ℃ 10min。
（4）电泳及图谱获取
配制2%琼脂糖凝胶，将上步反应混合液5μL与3μL 染料混匀后点样，同时点5μL的DNA标准Marker。电泳条件为初始电压150V，10分钟；后续电压100V，30分钟。电泳完毕后EB染色15分钟，在凝胶成像系统中获取酶切图谱。
(5) SDV的诊断
检测结果如图1所示，通过与DNA标准Marker比较可以估计出图谱中各条带的大小，从而可以判定8个SDV样品中6个为阳性。
实施例2：检测温州蜜柑萎缩病毒的检测试剂盒
试剂盒由以下试剂组成： （100样份）
| 1 | 缓冲液A | 250μl |
| 2 | 缓冲液B | 200μl |
| 3 | RT酶 | 20μl |
| 4 | Taq酶 | 30μl |
| 5 | SDV正对照 | 100μl |
| 6 | 双蒸水 | 300μl |
其中，缓冲液A含10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性下游引物：5’- AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’、10 ×buffer, 25mmol/L的 MgCl2, 10mmol/L的 dNTP 、40U/μLRNAsin和超纯水；它们的体积比为5:5:5:5:1:17。缓冲液B含10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性上游引物5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’、 10 ×buffer、 25mmol/L的 MgCl2和超纯水；它们的体积比为5:20:15:156。
单样用量的缓冲液A含10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性下游引物：5’- AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’ 0.5μL，10 ×buffer0.5μL, 25mmol/L的 MgCl2 0.5μL, 10mmol/L的 dNTP0.5μL , 40U/μLRNAsin0.1μL,超纯水1.7μL ；单样用量的缓冲液B含10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性上游引物：5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’ 0.5μL， 10 ×buffer 2μL, 25mmol/L的 MgCl2 1.5μL ,超纯水15.6μL。
序列表
<110>西南大学
<120>温州蜜柑萎缩病毒RT-PCR检测方法及试剂盒
<160>2
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>温州柑桔萎缩病毒
<220>
<223>温州柑橘萎缩病毒的特异性上游引物
<400>5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>温州柑桔萎缩病毒
<220>
<223>温州柑橘萎缩病毒的特异性下游引物
<400>5’-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’
Claims (6)
1.一种蜜柑萎缩病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于：以温州蜜柑萎缩病毒特异性上游引物、温州蜜柑萎缩病毒特异性下游引物对待测样品进行RT-PCR扩增，最后电泳鉴定；所述温州蜜柑萎缩病毒特异性引物为：
上游引物：5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’
下游引物：5’-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’。
2.根据权利要求1所述蜜柑萎缩病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)核酸提取，取适量SDV寄主植物的叶或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取样品总核酸或RNA；
(2)逆转录反应，所用引物为SDV下游引物5’-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’，反应体系5ul，包括：核酸抽提液1.0μL，10×buffer0.5μL，25mmol/L的MgCl2 0.5μL，10mmol/L的dNTP0.5μL，10μmol/LSDV下游引物0.5μL，40U/μLRNAsin0.1μL，200U/μL逆转录酶0.2μL，超纯水1.7μL，42℃温育30min；
(3)扩增反应，所用上、下游引物分别为：5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’、5’-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’；反应总体积为25μL包括：逆转录反应混合液5μL、10×buffer2μL，25mmol/L的MgCl2 1.5μL，10μmol/L的SDV上游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，超纯水15.6μL；反应条件94℃4min，94℃ 15s，63℃ 15s，72℃ 20s，5个循环；62℃，5个循环；61℃，5个循环；60℃，10个循环；59℃，10个循环；72℃10min；
(4)琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色、获取电泳图谱；
(5)依据上述图谱的条带特征诊断SDV的分子变异类型。
3.根据权利要求2所述蜜柑萎缩病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(1)的提取方法为：称取SDV病毒寄主不同位置处的嫩叶各5mg，装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入60μL TES缓冲液和60μL饱和酚、氯仿和异戊醇溶液混匀，所述溶液体积比为酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1，70℃水浴5～10分钟；室温下13000rpm离心5分钟，吸取40μL上清液加入由Sephadex G-50-80构成的微柱中，置于一新的无菌离心管，5000rpm离心4分钟，收集洗脱液。
4.根据权利要求2所述蜜柑萎缩病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于：所述温州蜜柑萎缩病毒特异性引物扩增产物大小为251bp。
5.一种检测蜜柑萎缩病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由以下试剂构成：缓冲液A、RT酶、Taq酶、SDV正对照、缓冲液B和双蒸水；其中缓冲液A由10μmol/L温州 蜜柑萎缩病毒特异性下游引物：5’-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’、10×buffer、25mmol/L的MgCl2、10mmol/L的dNTP、40U/μLRNAsin和超纯水组成；缓冲液B由10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性上游引物：5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’、10×buffer、25mmol/L的MgCl2和超纯水组成。
6.根据权利要求5所述检测蜜柑萎缩病毒的检测试剂盒，其特征在于：单样用量的缓冲液A含10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性下游引物：5’-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’0.5μL、10×buffer0.5μL，25mmol/L的MgCl20.5μL，10mmol/L的dNTP0.5μL、40U/μLRNAsin0.1μL，超纯水1.7μL；单样用量的缓冲液B含10μmol/L温州蜜柑萎缩病毒特异性上游引物：5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’0.5μL、10×buffer 2μL、25mmol/L的MgCl2 1.5μL和超纯水15.6μL。
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