CN108841996A

CN108841996A - 新城疫新型可视化重组酶聚合酶常温扩增核酸试纸条检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN108841996A
Application number: CN201810354518.3A
Authority: CN
Inventors: 赵明秋; 刘志香; 张静远; 李晓明; 陈金顶
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2018-11-20

Abstract

本发明公开一种检测新城疫病毒的重组酶常温扩增(RT‑RPA)核酸试纸条试剂盒及应用。该试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所示的引物及探针和核酸检测试纸条。该试剂盒的使用方法为：首先配置RT‑RPA反应体系，进行常温恒温反应；恒温反应所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行判读：阳性结果为出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内；阴性结果仅在质控区一条红色条带，在检测区内无红色条带出现。本发明首次采用RPA‑核酸试纸条技术建立快速检测新城疫病毒的方法，具有操作简单，特异性高，且反应结果易于观察，安全无污染等特点，非常适用于临床现场检测。

Description

新城疫新型可视化重组酶聚合酶常温扩增核酸试纸条检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于预防兽医学检验领域，涉及一种检测新城疫病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA反应的用于快速检测新城疫病毒的试纸条RPA试剂盒，还涉及在快速检测新城疫病毒中的用途。。

背景技术

新城疫(Newcastle Disease)是由一种I型副黏病毒-新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性禽类传染病，严重危害禽类健康，其发病率和死亡率都很高。它是当今世界上最严重的禽类传染病之一，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的传染病。传统的检测方法大都存在特异性和敏感性差、操作繁琐、费时费力等缺点，不能满足兽医临床现地检测的需要。为了更好地诊断和监测该病，迫切需要建立一种快速、简便、准确的检测方法。重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)是一个模拟生物体内DNA 复制过程，在37℃—42℃即可对目标片段进行等温扩增，并在20min完成扩增反应，具有反应迅速、操作简便等技术优点，同时还具有高度特异和敏感的特点。

新城疫首先于上世纪20年代中期发生于东南亚地区，此次大流行的新城疫病毒以基因II、Ⅲ和Ⅳ型为主；第2次新城疫的大流行始于20世纪60年代的中东地区，通过基因分型证明此次流行的毒株以基因Ⅴ型为主；第3次大流行起源于中东的上世纪70年代末，1981年经欧洲迅速蔓延到世界各地，这次流行的毒株经证实是由基因VI型的鸽源新城疫病毒所引起，主要是由未经免疫的鸡接触了感染的家养鸽而引起的，因此在鸽体内发生变异的新城疫病毒对养禽业存在很大的威胁隐患。疫苗免疫能够很好地控制新城疫的发生，但是疫苗免疫并不能阻止病毒的排毒、感染和传播，而且毒株在疫苗免疫的选择压力下会发生基因变异并逃避免疫抑制作用，这些变异的新城疫病毒会极有可能引起鸡群的感染发病。基因Ⅶ型的新城疫病毒于上世纪80年代在中国台湾发现，随后相继在世界范围内不断有NDV基因Ⅶ型的各种亚型分离的报道。目前中国主要的流行NDV基因型为Ⅶ型，此基因型NDV近年来在世界各地陆续分离到，被视为第四次大流行主要的基因型。

目前用于新城疫病毒的检测方法主要包括病原的分离鉴定，血清学方法、分子生物学方法。病原学方法是最传统的检测方法，其特异性强，结果真实可靠，但是实际操作时费时费力且敏感性低，因此在临床应用过程中有一定的局限性。目前常用的血清学方法都可以检测禽类的特异性血清抗体。通常使用的方法包括酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)琼脂扩散试验、血凝抑制试验(hemagglutinationinhibition test，HI)、血清中和试验、病毒中和试验，电镜技术，荧光抗体技术，免疫组化技术等。其中最常用的是血凝抑制试验。而RT-PCR、荧光定量PCR等分子生物学方法需要昂贵的仪器设备且需要专业技术人员进行操作，难以满足非实验室等基层现场环境下的检测要求。

重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplication，RPA)是在重组酶和聚合酶的介导下模拟生物体内DNA复制的过程，被称为可以替代 PCR的核酸检测技术。其扩增原理是，重组酶与引物结合形成复合物后，寻找匹配的DNA同源序列，紧密结合发生重组，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板DNA开始解链，引物与模板DNA配对，在bsuDNA聚合酶的作用下复制延伸，对目的片段进行指数级扩增(Forget et al.,2012)。RPA与PCR不同，整个过程仅需要在37℃～42℃等温条件下反应15～20min即可得到扩增产物，不需要高温变性和退火的过程，整个反应简单、快速、高效。对于RPA与侧向流动免疫层析技术相结合(Recombinase Ploymerase Amplication-lateral flow dipstick,RPA-LFD),可以在水浴锅或者直接用人体温进行加热，将温度控制在 37℃～42℃之间，随后可直接通过侧向流动层析试纸条读取实验结果。在整个反应体系中，需要生物素标记的反向引物和羧基荧光素(FAM)标记的特异探针，该探针在距羧基荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer),该位点可被大肠杆菌核酸外切酶nof进行识别并切割，产生自由的羟基末端，然后在DNA聚合酶的作用下延伸，形成具有生物素和羧基荧光基团双标记的RPA产物。将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记的抗FAM的抗体结合，形成三元复合物，通过层析膜扩散，被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线。此方法直观高效， 3～5min内就可通过肉眼判读。

本发明针对新城疫病毒的F基因，建立并评估了基于RT-RPA核酸试纸条检测试剂盒。

发明内容

针对RT-RPA-LFD应用于新城疫病毒检测领域的空白，本发明提供了一种 RT-RPA-LFD检测新城疫病毒的引物组、探针以及试剂盒以及该试剂盒的使用方法，该试剂盒和方法具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作简单等优点。

本发明通过将重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)与封闭式侧向流层析技术 (LFD)结合，使新城疫病原检测更加易于判定，在基层临床快速检测中具有广泛的应用前景。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

一方面，本发明提供了一种用于检测新城疫病毒的引物组，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.3：

5’-TTGGTGTAGAACTCAACCTGTACCTAACTG-3’；

SEQ ID NO.5：

5’-CAGACAAGGTCTCCAAGTAGGTAGCACGCA-3’；

进一步地，所述的下游引物的5’端标记生物素Biotin，其表示为：

5’-Biotin-CAGACAAGGTCTCCAAGTAGGTAGCACGCA-3’。

与常规PCR引物不同，RPA所需的引物长度为30～35bp，探针序列的长度为46～52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。

另一方面，本发明提供了一种和上述引物配合使用的探针，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

SEQ ID NO.7：

5’-CAGTATTCGGGCCACAAATCACTTCCCCTGCTTAACTCAGCTGAC-3’。

进一步地，所述探针的5’端标记羧基荧光素FAM，且在距羧基荧光基团30 个碱基处有一个脱碱基位点dSpacer，3’端由C3-spacer修饰，其可以表示为：

5’-(Fitc(FAM))CAGTATTCGGGCCACAAATCACTTCCCCTG-(dSpace)-CTTAACTCAGCTGAC-C3spacer-3’。

另一方面，本发明提供了一种检测新城疫病毒的试剂盒，该试剂盒含有权利上述的引物组及探针。

作为优选的实施方式，所述的试剂盒含有：

上游引物：

5’-TTGGTGTAGAACTCAACCTGTACCTAACTG-3’

下游引物：

5’-Biotin-CAGACAAGGTCTCCAAGTAGGTAGCACGCA-3’

探针：

5’-(Fitc(FAM))CAGTATTCGGGCCACAAATCACTTCCCCTG-(dSpace)-CTTAACTCAGCTGAC-C3spacer-3’

作为优选的实施方式，所述的试剂盒为RT-RPA核酸试纸条试剂盒。

作为一种可选的实施方式，所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

作为优选的实施方式，本发明试剂盒，还含有全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置。

在本发明一个示范性的实施例中，所述的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为杭州优思达生物技术有限公司产品。该检测装置为为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。

作为优选的实施方式，所述的试剂盒还含有重组酶、聚合酶、水解缓冲液、醋酸镁溶液、ddH₂O中的一种或多种。作为优选的实施方式，含有全部。

或者优选地，所说的试剂盒含有TwistAmpTM nfo kit，该TwistAmpTM nfo kit为商用试剂盒，其中包含重组酶和聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液Rehydration Buffer、280mM醋酸镁溶液。作为可选的实施方式，所述的TwistAmpTM nfo kit 购自英国TwistDX公司。

另一方面，本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，其包含以下步骤：

(1)将重组酶、聚合酶、水解缓冲液、引物组、探针、ddH₂O、待检测的 DNA、醋酸镁混匀后恒温反应；

(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，2～5min 观察结果；

(3)结果判读：直接肉眼判读

①阴性：仅在质控区一条红色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所检测的样本没有新城疫病毒感染；

②阳性：出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明所检测的样本为新城疫病毒感染；

③无效：质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

其中，步骤(1)中所述的上游引物和下游引物的终浓度均为60nM～420nM；优选地，均为420nM；探针的终浓度为20nM～120nM；优选地，为120nM；

其中，步骤(2)中反应温度为30℃～45℃，时间为20～30min，结束后通过侧向流动层析试纸条对结果进行检测；优选地，反应温度为37℃，反应时间20min。

作为一种具体的实施方式，步骤(1)的具体操作为：步骤(1)的具体操作为在RPA冻干颗粒(即重组酶聚合酶的冻干酶粉)中加入29.5μL水解缓冲液Rehydration Buffer,2.1μL 10μM上游引物，2.1μL 10μM下游引物，0.6μL 10 μM探针，9.2μL ddH₂O，4μL待检测的DNA，在反应管盖上加280mM醋酸镁 2.5μL，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心后，恒温反应。

(1)配置RT-RPA反应体系，在RPA冻干颗粒中加入29.5μL Rehydration Buffer，2.1μL 10μM上游引物，2.1μL 10μM上游引物，0.6μL 10μM探针，9.2 μL ddH2O，4μL病毒DNA模板，在反应管盖上加280mM醋酸镁溶液2.5μL，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心；恒温反应。

本发明的引物组、探针、试剂盒以及方法，适用于多种新城疫病毒毒株，如 F48E9株、GM株、Lasota株、野毒株等等。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益结果：

(1)本发明系首次采用RT-RPA核酸检测试纸条建立快速检测NDV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为NDV的现场检测提供了一种灵敏、可靠的新方法。本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

(2)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对新城疫病毒进行检测的方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性。

本发明选用的新城疫病毒F基因引物是经过大量试验筛选获得的，特异性好，与禽的其他病毒包括禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊炎病毒、马立克氏病病毒及大肠杆菌、沙门氏菌均无交叉反应。RPA能够将痕量的核酸模板扩增到可以检测的水平；本发明所建立的NDV RT-RPA-LFD检测方法可检测到低至6.67pg含量的cDNA模板，灵敏度显著高于RT-PCR凝胶电泳、 RT-RPA琼脂糖凝胶电泳法。

(3)本发明的RPA技术并结合核酸试纸条技术检测新城疫病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和现场的新城疫病毒的检测。

(4)检测速度快：与常规PCR相比，不用经过变性、退火、延伸三个步骤， RPA最适温度在37℃～42℃之间，不需高温变性，在常温下20min左右即可完成反应。

(5)不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测，本发明所建立检测方法可以在常温等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不需要PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等复杂的仪器设备，且RPA不需要复杂的样品处理，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

附图说明

图1为NDV RT-RPA凝胶检测体系的建立及引物筛选结果图；

泳道1为2000bp DNA Maker；泳道2为空白对照(ddH2O)；3～5泳道为 F1筛选下游引物，对应下游引物依次为R1、R2、R3；6～8泳道为F2筛选下游引物，对应下游引物依次为R1、R2、R3；9～11泳道为F3筛选下游引物，对应下游引物依次为R1、R2、R3；得出每个上游引物所对应的最佳下游引物组合依次为F1和R2、F2和R3、F3和R2，其中组合F2和R3为最佳，根据探针与引物设计原则，选择F2作为探针，F3为上游，R2为下游。

图2为NDV RT-RPA-LFD检测方法的建立；

NDV RT-RPA-LFD检测方法建立结果图，分别表示为1：ddH₂O(空白对照)；2：阴性尿囊液(控制对照)；3：阴性血液(控制对照)；4：阴性脑脊液(控制对照)；5：阴性肺组织(控制对照)；6：NDV(阳性对照)。

图3为NDV RT-RPA-LFD检测方法反应条件优化结果图；

A为NDV RT-RPA-LFD检测条件温度优化结果图，分别表示为1：ddH₂O (空白对照)；2：10℃；3：15℃；4：20℃；5：25℃；6：30℃；7：37℃；8： 40℃；9：45℃；10：50℃；

B为NDV RT-RPA-LFD检测条件时间优化结果图，分别表示为1：ddH₂O (空白对照)；2：1min；3：5min；4：10min；5：15min；6：20min；7：25min； 8：30min；

C为NDV RT-RPA-LFD检测条件引物及探针浓度优化结果图，分别表示为 1：ddH₂O；2：引物浓度420nM，探针浓度120nM；3：引物浓度300nM，探针浓度100nM；4：引物浓度240nM，探针浓度80nM；5：引物浓度150nM，探针浓度50nM；6：引物浓度120nM，探针浓度40nM；7：引物浓度90nM，探针浓度30nM；8：引物浓度60nM，探针浓度20nM；9：引物浓度30nM，探针浓度10nM。

图4为检测本发明试剂盒特异性的结果图；

图中1-8的模板分别为1：ddH2O(空白对照)；2：AIV(禽流感病毒)； 3：IBV(鸡传染性支气管炎病毒)；4：IBDV(鸡传染性法氏囊炎病毒)；5： MDV(马立克氏病病毒)；6：沙门氏菌；7：大肠杆菌；8：NDV(新城疫病毒)。

图5为检测本发明试剂盒敏感性检测结果图；

A为新城疫毒株间敏感性结果图，图中1-4的模板分别为1：ddH2O(空白对照)；2：NDV Lasota株；3：NDV GM株；4：NDV F48E9株；5：NDV野毒株；

图B1、B2、B3分别为NDV RT-RPA-LFD、NDV RT-PCR及NDV RT-RPA 电泳凝胶检测体系cDNA含量敏感性结果图，cDNA的初始浓度为333.7ng/μL， 10倍倍比稀释后：1：ddH2O(空白对照)；2：333.7ng/μL；3：333.7×10^-1ng/μL； 4：333.7×10^-2ng/μL；5：333.7×10^-3ng/μL；6：333.7×10^-4ng/μL；7：333.7×10^-5ng/μL； 8：333.7×10^-6ng/μL；9：333.7×10^-7ng/μL；

C1为构建标准质粒胶回收产物电泳图；

C2、C3、C4为NDV RT-RPA-LFD、NDV RT-PCR及NDV RT-RPA电泳凝胶检测体系重组质粒标准品梯度稀释敏感性结果图，标准品原始浓度为167.0 ng/μL，重组质粒拷贝数为4.46×10¹⁰copies/μL，10倍梯度稀释后：1：ddH2O(空白对照)；2：4.46×10¹⁰copies/μL；3：4.46×10⁹copies/μL；4：4.46×10⁸copies/μL； 5：4.46×10⁷copies/μL；6：4.46×10⁶copies/μL；7：4.46×10⁵copies/μL；8：4.46×10⁴ copies/μL；9：4.46×10³copies/μL；10：4.46×10²copies/μL；11：4.46×10¹copies/μL。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

TwistAmp nof Kits购自TwistDX公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；提取病毒DNA/RNA试剂盒购自OMEGA Bio-Tek公司；M-MLV 反转录酶，RNA酶抑制剂、2×Taq PCR Mix DNA聚合酶、随机引物、dNTP(2.5 mM)、琼脂糖购自Takara公司；全封闭式靶核酸扩增产物快速检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司。

实施例1快速检测新城疫病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒及检测方法的建立。

一、引物及探针序列的设计及制备

本发明发明人通过对来自于Genbank中的新城疫病毒F基因的FJ480786.1、FJ480785.1、FJ480784.1、FJ480783.1、FJ480782.1、FJ480781.1、FJ480779.1、FJ480778.1、FJ480777.1、FJ480776.1、FJ480775.1、FJ480774.1的同源序列进行比对分析，确定了新城疫病毒F基因的保守区域，以基因库中AY508514.1为模板序列，根据RPA引物设计原则，针对该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的新城疫病毒。RPA对引物长度的要求是30～35bp，扩增产物在 500bp之内，扩增效率较高。要建立一种快速、敏感的检测方法，需要进行多次引物的筛选，引物个别碱基差异会对扩增效果产生影响，所以，在保守基因区域，设计一系列梯度候选物，再根据RT-RPA凝胶检测的结果，从中选择最佳引物。应用引物设计软件Prime Premier 5.0进行RPA引物设计，同时应用生物软件 Oligo7.0对引物进行筛选，以确保各引物对之间产生的二聚体较少为原则。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成了四条上游引物和四条下游引物、一条探针，如下表所示：

表1引物和探针

二、新城疫病毒RT-RPA反应

1、病毒RNA的抽提：

取本实验室保藏NDV F48E9株(华南农业大学兽医科技服务有限公司), 使用OMEGA Viral RNA extraction Kit Ver.5.0抽提RNA，所用离心管等耗材均经0.1％DEPC处理，确保无RNA酶污染，按照以下步骤进行抽提：

(1)配置QVL Buffer：每管(即每个样品)含有560μL QVLBuffer，添加 5.6μLCarrier RNA，10μLβ-巯基乙醇，现配现用；

(2)添加140μL样品，充分混匀30s；

(3)室温孵育5～10min；

(4)添加560μL无水乙醇，充分混匀30s；

(5)加650μL混合物至HiBind RNA,操作要仔细而迅速，10000g，30s弃滤液；

(6)重复步骤(5)至所有的液体全部经过滤柱；

(7)换新的2mL收集管，加500μLRWA，10000g离心30s后，弃滤液；

(8)换新的2mL收集管，加500μLRWB，10000g离心30s后，弃滤液；

(9)空管10000g离心3min后，弃滤液；

(10)换新的1.5mL EP管加30～50μL DEPC水，静置3～5min，10000g 离心1min。

2、cDNA合成

以提取的RNA为模板，用MLV酶进行反转录反应，反应体系如下：

(1)配置RNA反转录反应预体系，将提取的RNA吸取5.75μL于新的1.5 mLEP管中，再加入1μL随机引物，70℃水浴10min后立即冰浴2min。

(2)配置RNA反转录反应体系，RNA引物混合液6.75μL，5×Buffer 2μL， dNTP MIX0.5μL，RNase inhibitor 0.25μL，M-MLV 0.5μL，充分混匀，然后30℃水浴10min，42℃水浴1h。

3、NDV RT-RPA凝胶检测体系的建立及引物筛选：

我们以提取纯化的病毒cDNA为模板进行扩增，并对设计引物进行筛选，筛选出最优引物。实验步骤如：

①分别以F1为上游引物，筛选下游引物R1-R3

(1)配置RT-RPA初始反应体系：29.5μL水解缓冲液(rehydration buffer,TwistAMP nof Kit)，9.2μL的ddH₂O，2.4μL上游引物(10μM)，2.4μL下游引物(10μM)，4μL的病毒cDNA模板；

(2)RT-RPA凝胶检测反应步骤：将上述47.5μL缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAMP nof Kit反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μL的280mM的醋酸镁溶液，混匀后反应即刻发生；

(4)将反应管放入37℃的水浴中，处理5min；

(5)反应5min后，取出反应管，再次混匀后继续放入37℃的水浴中反应 20min；

(6)反应结束后，用2％的琼脂糖电泳鉴定，得出R2为最佳下游。试验结果如图1所示；

②以F2为上游引物，筛选下游引物R1-R3，得出R3为最佳下游，试验结果如图1所示；

③以F3为上游引物，筛选下游引物R1-R3，得出R2为最佳下游，试验结果如图1所示，根据结果及探针设计原则，经过多次实验确定NDV RT-RPA凝胶反应体系最优引物组合及探针，即F2(表1中的NDV-RPA-Probe)为探针，F3 为上游，R2为下游，并在下游R2标记生物素(Biotin)。

4、NDV RT-RPA试纸条检测体系的建立

①探针设计：探针5’端标记FAM基团，中间THF替代G或C(dSpacer)，且dSpacer两侧尽量避免G、C，dSpacer与5’端至少30碱基，与3’端至少15 碱基，3’端C3-spacer修饰。

②在筛选出的最佳引物中，将探针相对应的引物的5’标记生物素(Biotin)。 RT-RPA-LFD反应体系引物与探针序列如下所示：

上游引物：

SEQIDNO.3

5’-TTGGTGTAGAACTCAACCTGTACCTAACTG-3’

下游引物：

SEQIDNO.5

5’-Biotin-CAGACAAGGTCTCCAAGTAGGTAGCACGCA-3’

探针：

SEQIDNO.7

5’-(Fitc(FAM))CAGTATTCGGGCCACAAATCACTTCCCCTG

-(dSpace)-CTTAACTCAGCTGAC-C3spacer-3’

③具体实现步骤如下所示：

(1)以病毒cDNA为模板作为阳性对照，以ddH₂O为阴性对照，以阴性尿囊液、阴性血液、阴性脑脊液、阴性肺组织为控制对照，分别加入下列组分：29.5 μL水解缓冲液(rehydration buffer,TwistAMP nof Kit)，9.2μL的ddH₂O，2.1 μL上游引物(10μM)，2.1μL下游引物(10μM)，0.6μL探针(10μM)，4 μL模板；

(2)RT-RPA凝胶检测反应步骤：将上述步骤(1)制备的47.5μL缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAMP nof Kit反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μL的280mM的醋酸镁溶液，混匀后反应即刻发生；

(4)将反应管放入37℃的水浴中，处理5min；

(6)反应结束后，用核酸试纸条密闭反应装置进行检测，通过试纸条的显色进行判读。试验结果如图2所示。

5、NDV RT-RPA-LFD检测条件的优化

①首先，我们确定RT-RPA-LFD方法的最佳反应温度，我们分别试验了10℃、 15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃不同反应温度，并且将孵育时间设定为30min。试验结果如图3A所示，反应温度低于15℃时，试纸条上没有出现条带；在15℃时出现微弱的条带；在20℃-25℃时出现弱的条带；在 30℃～45℃之间试验条带没有可观察的差异；50℃时试纸条上没有出现条带。结果表明该试验的最佳反应温度为30℃～45℃，为了方便设计温度，我们选择37℃作为该方法的反应温度。

②其次，我们确定在37℃条件下，不同的孵育时间对于扩增结果的影响，我们试验了1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min的实验结果，试验结果如图3B所示，在扩增5min的时候，试纸条上出现了微弱的条带；在扩增10～15min时，试纸条上出现了弱的条带；当反应时间在20～30min之间时试纸条带上没有出现可观测的差异。为节省时间，我们选择20min作为该实验的孵育时间。

③最后，我们在37℃恒温扩增20min的条件下，确定RT-RPA-LFD反应的最佳引物和探针的终浓度。我们分别试验了引物在反应体系中的终浓度为420 nM、300nM、240nM、150nM、120nM、90nM、60nM、30nM，探针在反应体系中的终浓度为120nM、100nM、80nM、50nM、40nM、30nM、20nM、 10nM。试验结果如图3C所示，当引物终浓度低于60nM，探针终浓度低于20nM 时，试纸条上检测线上没有出现试纸条带，在引物终浓度为60nM，探针终浓度为20nM时，检测线上出现了微弱条带，在引物终浓度高于60nM，探针终浓度高于20nM时，检测线上试纸条带没有可观察的差异。结果表明该试验的引物最佳反应终浓度为60nM-420nM，探针最佳反应终浓度为20nM-120nM，尤其优选的引物浓度为420nM，探针浓度为120nM。

检测结果的判定：样品在特定的条件下(37℃，20min)试纸条上质控线且检测线都出现条带的为阳性样品；仅在质控线上出现条带的为阴性样品。

6、检测体系特异性、敏感性分析

使用新城疫病毒(NDV)F48E9株(华南农业大学兽医科技服务有限公司)、禽流感(AIV)(华南农业大学兽医学院传染病实验室)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)(华南农业大学兽医学院传染病实验室)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV) (华南农业大学兽医学院传染病实验室)、马立克氏病病毒(MDV)(华南农业大学兽医学院传染病实验室)、沙门氏菌(华南农业大学兽医学院微生物实验室)、大肠杆菌(华南农业大学兽医学院微生物实验室)做病原特异性分析实验。反应体系如具体步骤所示，反应条件为确定的优化条件，使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置检测(20min后看结果)，得到的结果为：以NDV F48E9株基因组为模板的RT-RPA反应产物，出现两条红色条带，一条位于检测线(T)，另一条位于质控线(C)；以AIV基因组、IBV基因组、IBDV基因组、MDV 基因组、沙门氏菌基因组、大肠杆菌基因组分别为模板的RT-RPA反应产物，仅在质控线(C)出现了一条红色条带，在检测线(T)无红色条带出现。实验结果如图4所示。结果显示检测体系特异性良好，可特异的检测到新城疫病毒，且用核酸检测试纸条检测，操作更方便、省时。

NDV RT-RPA-LFD方法的敏感性分析：

①NDV RT-RPA-LFD方法毒株间敏感性分析，使用4种新城疫病毒毒株分别是F48E9株(华南农业大学兽医科技服务有限公司)、GM株(华南农业大学兽医学院传染病实验室)、Lasota株(华南农业大学兽医科技服务有限公司)、野毒株(华南农业大学兽医科技服务有限公司)，将4种毒株用NDV RT-RPA-LFD 方法进行检测，4种NDV毒株RT-RPA-LFD反应结果均为阳性，结果如图5A 所示。结果表明NDV RT-RPA-LFD方法具有广泛适用性。

②NDV RT-RPA-LFD方法的cDNA敏感性分析，抽提NDV/F48E9株的RNA 模板并反转录成cDNA作为初始模板，cDNA的初始浓度为333.7ng/μL，将初始模板进行10倍梯度稀释(10^-1～10^-7)，分别用常规RT-PCR凝胶电泳、RT-RPA 琼脂糖凝胶电泳法、RT-RPA-LFD方法进行检测。试验结果如图5B，常规RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳法可以检测到的cDNA最低检测限度模板浓度为333.7×10^-4ng /μL，即66.7pg，RT-RPA琼脂糖凝胶电泳法最低检测限度模板浓度为333.7×10^-4 ng/μL，即66.7pg，RT-RPA-LFD检测方法最低检测限度模板浓度为333.7×10^-5ng /μL，即6.67pg，结果表明RT-RPA-LFD检测方法具有高敏感性。

③NDV RT-RPA-LFD方法的毒株重组质粒敏感性分析，根据NDV F基因保守区域，设计构建重组质粒标准品的上下游引物，通过病毒RNA抽提，反转录， PCR反应，PCR产物胶回收，连接，转化等步骤将目的片段克隆到pMD18-T载体形成重组质粒，按照OMEGA质粒抽提试剂盒提取重组质粒。通过紫外分光光度计测定重组质粒浓度为167.0ng/μL，根据公式计算出拷贝数为4.46×10¹⁰ copies/μL，分别稀释出浓度梯度为4.46×10¹⁰-4.46×10¹copies/μL的共计10个梯度作为模板。通过常规RT-PCR凝胶电泳、RT-RPA琼脂糖凝胶电泳法、 RT-RPA-LFD方法检测扩增结果，RPA扩增反应在温度设定为37℃的水浴锅中进行，时间设定为20min。如图5D所示，从该结果可以看出，常规RT-PCR凝胶电泳、RT-RPA琼脂糖凝胶电泳法、RT-RPA-LFD方法三种方法的敏感性一致，敏感性为4.46×10³copies/μL。该方法敏感性较高，并且具有较广的检测范围，至少在4.46×10¹⁰-4.46×10³copies/μL范围内的样品均能被检测出来。

7、NDV RT-RPA-LFD检测方法临床样品的检测分析

采集某鸡场疑似新城疫病病鸡的病料20份，将病料研磨，通过RNA提取，反转录，PCR琼脂糖凝胶电泳法和RPA-LFD方法进行鉴定，结果发现：PCR反应后1％琼脂糖凝胶电泳检出10份，RPA-LFD方法肉眼直观检出8份，NDV RT-RPA-LFD检测方法与PCR琼脂糖凝胶电泳法的符合率为80％，说明NDV RT-RPA-LFD检测方法在临床应用上是可行的。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 新城疫新型可视化重组酶聚合酶常温扩增核酸试纸条检测试剂盒及应用

<141> 2018-04-19

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ctcaacctgt acctaactga attgactaca 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cagtattcgg gccacaaatc acttcccctg 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttggtgtaga actcaacctg tacctaactg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ccgactgagg gtaaagttac ctgtatacct 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cagacaaggt ctccaagtag gtagcacgca 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tgctgaggca aatcccttgg ttgtgcttac 30

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cagtattcgg gccacaaatc acttcccctg cttaactcag ctgac 45

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gccattatcg gcagtgtagc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aataccagga gacataggga 20

Claims

1.一种用于检测新城疫病毒的引物组，其特征在于，所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的下游引物的5’端标记生物素Biotin。

3.一种与权利要求1或2所述的引物组配合使用的探针，其特征在于，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；优选地，所述探针的5’端标记羧基荧光素FAM，且在距羧基荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点dSpacer，3’端由C3-spacer修饰；更优选地，所述的探针为：

4.一种检测新城疫病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1或2任一所述的引物组，以及权利要求3所示的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所示的试剂盒为RT-RPA核酸试纸条试剂盒；优选地，所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包含全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；优选地，全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所示的试剂盒还含有重组酶、聚合酶、水解缓冲液、醋酸镁溶液和ddH₂O中的一种或几种；优选地，含有重组酶、聚合酶、水解缓冲液、醋酸镁溶液和ddH₂O；或者优选地，所述的试剂盒还含有TwistAmpTM nfo kit。

8.根据权利要求4-7任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)将RPA重组酶、聚合酶与水解缓冲液、引物组、探针、ddH₂O、待检测的DNA、醋酸镁混匀后恒温反应；

(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，2～5min观察结果；

(3)结果判读：直接肉眼判读

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的上游引物和下游引物的终浓度均为60nM～420nM；优选地，均为420nM；

优选地，步骤(1)中所述的探针的终浓度为20nM～120nM；更优选地，为120nM；

优选地，步骤(2)中反应温度为30℃～45℃，时间为20～30min；更优选地，反应温度为37℃，反应时间20min。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为在RPA重组酶聚合酶冻干颗粒中加入29.5μL水解缓冲液Rehydration Buffer，2.1μL 10μM上游引物，2.1μL10μM下游引物，0.6μL 10μM探针，9.2μL ddH₂O，4μL待检测的DNA,在反应管盖上加280mM醋酸镁2.5μL，上下颠倒反应管使之充分混匀离心后恒温反应。