CN112779355A - 一种自热型扩增检测装置及其制备方法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种自热型扩增检测装置，包括反应结构、检测结构、中间结构、自热结构和密封结构。本发明能够实现自发热，同时能够对不同样品进行扩增反应检测，也能提高装置在反应过程中的安全性能。本发明还提供该检测装置的制备方法和使用方法，其有益效果如上述所述。本发明还提供设计一种核酸检测系统，包括提取装置和检测装置，本发明将RPA技术、封闭式的核酸提取设备和依赖自发热型的胶体金测试卡结合起来，使得提取反应体系与外环境完全隔离，依靠封闭式常温扩增节约检测时间的同时也能有效避免生物安全问题，使得核酸检测能完全脱离大型仪器设备，实现边采样边检测的现场检测目标。

Description

一种自热型扩增检测装置及其制备方法和使用方法
技术领域
本发明涉及环境中RNA核酸提取与现场检测领域，具体涉及一种自热型扩增检测装置。本发明还涉及一种自热型扩增检测装置的制备方法。本发明还涉及一种自热型扩增检测装置的使用方法。本发明还涉及一种核酸检测系统。
技术背景
由于新型冠状病毒的高度传染性，样品采集、运输、前处理、提取和核酸检测过程都极易污染环境，导致工作人员感染，因此对于新型冠状病毒的疫情防控和检测工作要求依照三级防护标准进行。对于样本采集、运输、提取和检测制定了相关规范和实施细则。因此新冠核酸检测对于实验室要求较高，且要求采用全自动仪器进行提取，避免人为提取导致的意外感染。PCR检测的靶基因为新冠病毒的ORF1ab基因及核衣壳蛋白N，当出现双基因阳性后判断样本检出新冠病毒。但是实际检测过程中患者病程具有不可预测性，一旦采样时间段不在病人的病毒排毒期就可能导致采集不到病毒样本。此外样本采集管的质量将影响病毒采样管缓冲液对病毒保护效果，导致病毒运输过程中出现部分降解。同时样本运输条件比较苛刻，病毒采集管需要放置在较低温度下以便保证样本中病毒的完整性。最后样本的提取和检测过程中存在的操作不规范和试剂不稳定也直接影响检测结果。综上所述，采用常规PCR法检测新型冠状病毒，受到大量客观因素的影响制约，必须进行反复复检并辅助以抗体检测等方式来确诊新冠。然而抗体检测的敏感度较低，只有较高浓度抗体才能与检测试剂结合，出现阳性反应。相比之下，核酸检测具有其高灵敏度的特征，但常规的PCR检测方法高度依赖实验室大型仪器设备，且需要对核酸进行高纯度提取，无法满足现场检测需要。
RPA简易装置是将RPA扩增技术与现场检测结合起来。LFD(Lateral flowdipstick，侧向流试纸)是一类简易的检测装置，可以对靶核苷酸进行定性或半定量检测，当结果为阳性时，可以在LFD检测区内形成肉眼可见的红色条带，实现可视化检测。它操作简单，反应快速，且无需借助任何仪器。LFD-RPA技术利用带生物素标记的引物和带羧基荧光素(FAM)标记的探针对靶核酸进行扩增，使扩增产物同时携带FAM和生物素标记，然后将扩增产物应用LFD试纸条样进行检测。LFD样品端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素受体，当反应液进入试纸条时，带有FAM和生物素的扩增产物就会通过抗原抗体结合作用，在检测线上形成生物素抗体-核酸-纳米金粒复合体并显色。
现有的RPA技术也存在很多应用难点，相关产品以LFD-RPA及EXO-RPA为主要检测模式，但是仍依赖于实验室操作，对于扩增反应要求非常高，同时也依赖于恒温扩增仪等必备仪器。RPA扩增反应对引物和探针的要求很高，普通的PCR引物探针无法进行RPA扩增。现场检测对扩增体系的要求需要体系反应过程尽可能的脱离仪器依赖， RPA扩增反应尚不能适应不同的检测样品，受到扩增环境的影响较大，未达到现场检测的要求。要实现RPA基因扩增的现场检测，还必须克服实验体系的实施和检验过程具有一定的技术难度，降低人为操作因素，减少人为误差，尽可能的将检测流程自动化和可控化。
发明内容
针对现有的技术问题，本发明拟希望解决RPA现场检测新型冠状病毒的技术难关。提供一种自热型扩增检测装置及其制备方法和使用方法，该装置集核酸扩增和胶体金显色报告与一体，可以一步法进行RPA扩增检测。另外为保证在检测装置的使用过程中所用到的核酸提取液的安全且有效，本发明还提供一种核酸检测系统，该核酸提取及检测系统能够确保提取反应体系与外环境完全隔离。
本发明的自主研发装置和检测方法将为环境监测和人体样本快速检测新型冠状病毒的现场工作提供技术支持；通过分析不同靶位点扩增体系对检测结果的影响因素，排除干扰因子，最终建立稳定的常温扩增技术平台；设计并评估新型可视化扩增装置和试纸设备，建立脱离大型仪器设备的独立核酸扩增体系，为耐药微生物的现场检测和快速应急分析提供技术方法。
本发明提供一种自热型扩增检测装置，包括反应结构、检测结构、中间结构、自热结构和密封结构；其中，
所述中间结构包括自上而下设置的玻璃纤维膜、吸水层以及底板；
所述反应结构包括至少两个独立的反应槽，其穿过所述玻璃纤维膜、所述吸水层固定在所述底板上，且靠近所述检测结构的一侧设有开口和用于开闭该开口的滑动隔板，所述反应槽用于反应样本的RPA扩增；
所述检测结构包括多个独立的扩增扩散区和独立的报告区；所述报告区包括设于所述吸水层远离所述反应槽一端的吸水层上的判读线，所述判读线包括检测线和对照线，所述玻璃纤维膜上开设有便于观察所述判读线的观察口；所述扩增扩散区为设于所述反应槽和所述报告区之间、且内设有扩增产物报告所需的抗体及报告试剂的吸水层；当经提取后的样本在所述反应槽内反应完成后滑动所述滑动隔板，所述反应槽内的反应的样本从所述开口往所述扩增扩散区流动，并扩散至检测线；
所述自热结构包括设于所述底板下方的产热层，所述产热层接触空气后自动发热；
所述密封结构包括对所述反应结构、检测结构和中间结构进行密封的第一密封层和对所述产热层进行密封的第二密封层。
进一步的，所述反应槽包括加样孔，所述加样孔位于远离底板的一侧，且所述加样孔与玻璃纤维膜上表面齐平。
进一步的，所述产热层为铁粉活性炭产热层，所述铁粉活性炭产热层经接触空气后自发产热。
进一步的，一种自热型扩增检测装置还包括便于携带或穿戴的便携结构。
进一步的，所述反应槽内设有用于常温快速检测新型冠状病毒的RPA扩增体系，所述RPA扩增体系包括：RBD阳性质粒模板、RNA逆转录酶、T4 UvsX蛋白、T4 UvsY 蛋白、T4gp32单链结合蛋白、DNA聚合酶1Bsu、NFO酶、磷酸肌酸、肌酸激酶、ATP、二硫苏糖醇、高分子聚PEG、Tris、乙酸钾、乙酸镁、引物对和探针；
其中所述引物对为SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：5；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示。
有益效果：
1、本发明通过产热层的设置，能够为扩增反应提供所需的温度的要求，无需依赖于恒温扩增仪等必备仪器，通过多个反应槽以及多个独立的扩增扩散区和独立的报告区的设置，能够实现不同样品的扩增反应检测，另外通过第一密封层和第二密封层的设置能够提高装置在反应过程的安全性能。
2、本发明通过产热层为铁粉活性炭产热层的设置，依靠自发热方式，实现稳定的温度提供；另外通过便于携带或穿戴的便携结构的设置，方便在防护服手腕处佩带。
3、本发明通过分析不同靶位点RPA扩增体系对检测结果的影响因素，排除干扰因子，最终建立稳定的RPA常温扩增技术平台；设计并评估新型可视化RPA扩增装置和试纸设备，建立脱离大型仪器设备的独立核酸扩增体系，为耐药微生物的现场检测和快速应急分析提供技术方法。
本发明还提供一种自热型扩增检测装置的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备反应槽：
反应槽为长方体，尺寸为0.6cm×0.6cm×0.4cm，其中前后左下4个面为固定的PET聚酯材料板，上面设有加样孔，靠近检测结构的右面为可移动PET聚酯滑动隔板，尺寸为0.58cm×0.5cm×0.15cm，反应槽内设有RPA扩增体系；
S2、制备检测板：
S2.1、首先在吸水层上确认反应槽、扩增扩散区和报告区的放置位置，确保扩增扩散区位于反应槽和报告区之间，根据反应槽的个数将吸水层采用不透水的塑料条隔绝成多个检测单元，每个检测单元在扩增扩散区内分别滴加扩增产物报告所需的抗体及报告试剂，并进行干燥处理后备用，在报告区内制备两条结果判读线，分为检测线和对照线，其中检测线靠近扩增扩散区，将相应试剂均匀的涂抹在结果判读线上，并进行干燥处理后备用；
S2.2、将第一密封层、玻璃纤维膜、吸水层、底板、产热层和第二密封层按从上至下依次连接，将至少两个S1中制备的反应槽穿过玻璃纤维膜、吸水层固定在底板上，反应槽的加样孔与玻璃纤维膜上表面齐平，其右面的滑动隔板面向扩增扩散区和报告区；
S3、检测板制作完成后，在外侧安装符合尺寸的无纺布表带和PVC外壳，装置安装完毕后进行干燥处理，并进行避光封膜装袋。
进一步的，步骤S2.2中，所述吸水层材料为多层脱脂棉；所述底板为不透水层。
进一步的，步骤S2.2中，所述产热层为铁粉活性炭产热层，所述铁粉活性炭产热层由铁粉、活性炭粉末、5％的氯化钠颗粒和少量水经混合并压制成型后立刻使用明胶包裹，并套上纤维透气膜制得，其中铁粉：活性炭粉(质量比)＝(3.5～5.0)：1。
其有益效果如上述所述。
本发明还提供一种自热型扩增检测装置的使用方法，包括以下步骤：
X1、撕开最上层的第一密封层一端，去除最下层的第二密封层，将检测装置佩带在三级防护衣外层手腕上或放置在其他能够随身携带的位置，保证检测装置尽量贴合水平放置，等待产热层稳定产热10min；
X2、向反应槽中滴加50μL提取好的待测标本核酸提取液，立刻贴好第一密封层，进行扩增反应20min；
X3、撕开第一密封层一端，拔出滑动隔板，向反应槽中加入500μL的PBST缓冲液，使反应产物进行侧向流经扩增扩散区进入报告区；
X4、在10min内对反应结果进行判读，当报告区的检测线出现胶体金聚集线反应时，判断为阳性。
其有益效果如上述所述。
本发明还提供一种核酸检测系统，其包括提取装置和检测装置，所述提取装置包括提取结构、存储结构、磁性结构和驱动结构，所述检测装置为上述所述的一种自热型扩增检测装置；
所述提取结构包括提取室、与所述提取室连通的单向进液管、与所述提取室连通的单向排液管以及与单向进液管、单向排液管远离提取室的一端均连通的吸取口；
所述存储结构包括多个与所述提取室连通且用于存储反应试剂的储存管；
所述磁性结构包括置于所述提取室内的磁珠和用于控制所述磁珠的磁性环；
所述驱动结构包括驱动所述提取结构通过所述吸取口提取液体或排除液体的第一驱动组件、驱动所述存储结构将反应试剂送入所述提取室内的第二驱动组件；
其中，所述磁珠的直径大于所述单向进液管、所述单向排液管的直径，所述提取结构的吸取口设有密封件，所述提取装置呈针筒状。
本发明的有益效果是：
1、本发明将RPA技术、封闭式的核酸提取设备和依赖自发热型的胶体金测试卡结合起来，依靠封闭式常温扩增节约检测时间的同时也能有效避免生物安全问题，使得核酸检测能完全脱离大型仪器设备，简单便捷；另一方面，封闭式提取装置使用简便，无污染，能与三级生物安全防护管理有效结合起来，自发热型检测装置撕开胶膜后佩带手腕处即可实现恒温扩增；自发热型的胶体金测试卡能够在接触空气后依靠铁碳复合物颗粒，缓慢持续的提供恒温热量，保证扩增的进行，实现随采随检的目标。本发明采用自发热法进行常温现场快速核酸检测的技术应用，可应用于没有大型设备支持的隔离区环境或野外样本的现场检测，无需任何设备，依靠自发热方式，只需要在防护服手腕处佩带即可实现核酸扩增和目标抗原检测结果读取，可以不依赖大型实验室，实现边采样边检测的现场检测目标。
2、本发明通过导向结构的设置，可以方便磁性环的滑动，使得提取过程更加便捷；通过单向阀的设置，可以确保反应液的单向流动，保证装置的密封性；通过锁扣结构的设置，可以便于对单向排液管的控制。
附图说明
图1为本发明自热型扩增检测装置的结构示意图及使用安装示意图。
图2为本发明自热型扩增检测装置中检测板的结构示意图。
图3为本发明核酸提取装置结构透视图。
图4为本发明试剂储存管安装示意图。
图5为图4中储存管活塞下滑运动示意图。
图6为本发明锁扣结构开启和封闭单向排液管的示意图。
图7为本发明单向排液管和进液管内单向阀剖面图。
图8为图3中不带活塞帽的俯视图。
图9为本发明导向结构结构示意图。
图10为本发明中新型冠状病毒全基因组中RBD序列比对及引物探针位置。
图11为本发明SARS-COV-2病毒RNA的重组酶聚合酶扩增方法示意图。
图12为本发明不同靶位点的RPA扩增体系对RBD结合区基因扩增的敏感性分析结果；其中，1S～8S：8种扩增阳性反应的扩增体系；m1/m2：covRBD1/2实验组；T1～6：分别为沙门氏菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、诺如病毒、H1N1甲型流感、手足口病毒阳性DNA对照样本。
图13为本发明中covRBD1/2实验组的重复性试验结果，每个实验组进行了10次重复检测试验。
附图标记：1、吸取口；2、装置外壳；3、单向进液管；4、单向排液管；5、单向阀；6、锁扣结构；7、提取室；8、磁珠；9、试剂储存管；10、主活塞；11、磁铁；12、储存管活塞；13、活塞杆；14、活塞帽；15、封闭保护膜；16、玻璃纤维膜；17、吸水层；18、反应槽；19、底板；20、铁粉活性炭产热层；21、粘性不透气层；22、样品报告带；23、RPA内参；24、人源标本对照带；25、滑动隔板；26、移动导轨；27、磁铁卡口；28、固定线圈；29、外壳卡槽。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供一种自热型扩增检测装置，如图1、图2所示，包括反应结构、检测结构、中间结构、自热结构和密封结构；其中，
所述中间结构包括自上而下设置的玻璃纤维膜16、吸水层17以及底板19；
所述反应结构包括至少两个独立的反应槽18，其穿过所述玻璃纤维膜16、所述吸水层17固定在所述底板19上，且靠近所述检测结构的一侧设有开口和用于开闭该开口的滑动隔板25，所述反应槽18用于反应样本的RPA扩增；
所述检测结构包括多个独立的扩增扩散区和独立的报告区，多个独立的扩增扩散区和独立的报告区与多个反应槽18一一对应，反应槽18、扩增扩散区和报告区三者形成一个独立的检测单元；所述报告区包括设于所述吸水层17远离所述反应槽18一端的吸水层17上的判读线，所述判读线包括检测线和对照线，所述玻璃纤维膜16上开设有便于观察所述判读线的观察口；所述扩增扩散区为设于所述反应槽18和所述报告区之间、且内设有扩增产物报告所需的抗体及报告试剂的吸水层17；当经提取后的样本在所述反应槽18内反应完成后滑动所述滑动隔板25，所述反应槽18内的反应的样本从所述开口往所述扩增扩散区流动，并扩散至检测线；
所述自热结构包括设于所述底板19下方的产热层，所述产热层为铁粉活性炭产热层20，所述产热层接触空气后自动发热；
所述密封结构包括对所述反应结构、检测结构和中间结构进行密封的第一密封层和对所述产热层进行密封的第二密封层。
在本实施例中，如图2所示，通过产热层为铁粉活性炭产热层20的设置，能够为扩增反应提供所需的温度的要求，无需依赖于恒温扩增仪等必备仪器，通过多个反应槽 18以及多个独立的扩增扩散区和独立的报告区的设置，能够实现不同样品的扩增反应检测，另外通过第一密封层和第二密封层的设置能够确保反应过程的安全。
在本实施例中，如图1所示，优选的，一种自热型扩增检测装置还包括便于携带或穿戴的便携结构，如表带，可以方便佩带在三级防护衣外层手腕上，或设置成其他便携式样式，方便携带。
在本实施例中，如图1所示，优选的，所述反应槽18内设有用于常温快速检测新型冠状病毒的RPA扩增体系，所述RPA扩增体系包括：RBD阳性质粒模板、RNA逆转录酶、T4 UvsX蛋白、T4 UvsY蛋白、T4 gp32单链结合蛋白、DNA聚合酶1Bsu、 NFO酶、磷酸肌酸、肌酸激酶、ATP、二硫苏糖醇、高分子聚PEG、Tris、乙酸钾、乙酸镁、引物对和探针；
其中所述引物对为SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：5；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示。
本发明还提供一种自热型扩增检测装置的制备方法，如图1、图2所示，包括以下步骤：
S1、制备反应槽18：
反应槽18为长方体，尺寸为0.6cm×0.6cm×0.4cm，其中前后左下4个面为固定的PET聚酯材料板，上面设有加样孔，靠近检测结构的右面为可移动PET聚酯滑动隔板 25，尺寸为0.58cm×0.5cm×0.15cm，反应槽18内设有RPA扩增体系；
S2、制备检测板：
S2.1、首先在吸水层17上确认反应槽18、扩增扩散区和报告区的放置位置，确保扩增扩散区位于反应槽18和报告区之间，根据反应槽18的个数将吸水层17采用不透水的塑料条隔绝成多个检测单元，每个检测单元在扩增扩散区内分别滴加扩增产物报告所需的抗体及报告试剂，并进行干燥处理后备用，在报告区内制备两条结果判读线，分为检测线和对照线，其中检测线靠近扩增扩散区，将相应试剂均匀的涂抹在结果判读线上，并进行干燥处理后备用；
S2.2、将第一密封层、玻璃纤维膜16、吸水层17、底板19、产热层和第二密封层按从上至下依次连接，所述吸水层17材料为多层脱脂棉，所述底板19为不透水层，所述产热层为铁粉活性炭产热层20，所述铁粉活性炭产热层20由铁粉、活性炭粉末、5％的氯化钠颗粒和少量水经混合并压制成型后立刻使用明胶包裹，并套上纤维透气膜制得，其中铁粉：活性炭粉(质量比)＝(3.5～5.0)：1；第二密封层通过粘性设计包裹铁粉活性炭产热层20，保证铁粉活性炭产热层20不透气和不透水；将至少两个S1中制备的反应槽18穿过玻璃纤维膜16、吸水层17固定在底板19上，反应槽18的加样孔与玻璃纤维膜16上表面齐平，其右面的滑动隔板25面向扩增扩散区和报告区；
S3、检测板制作完成后，在外侧安装符合尺寸的无纺布表带和PVC外壳，装置安装完毕后进行干燥处理，并进行避光封膜装袋。
在本实施例中，如图2所示，通过该制备方法制备的自热型扩增检测装置，能够为扩增反应提供所需的温度的要求，无需依赖于恒温扩增仪等必备仪器，另外能够实现不同样品的扩增反应检测，最后也能够确保反应过程的安全。
本发明还提供一种自热型扩增检测装置的使用方法，如图1、图2所示，包括以下步骤：
X1、撕开最上层的第一密封层一端，去除最下层的第二密封层，将检测装置佩带在三级防护衣外层手腕上或放置在其他能够随身携带的位置，保证检测装置尽量贴合水平放置，等待产热层稳定产热10min；
X2、向反应槽18中滴加50μL提取好的待测标本核酸提取液，立刻贴好第一密封层，进行扩增反应20min；
X3、撕开第一密封层一端，拔出滑动隔板25，向反应槽18中加入500μL的PBST 缓冲液，使反应产物进行侧向流经扩增扩散区进入报告区；
X4、在10min内对反应结果进行判读，当报告区的检测线出现胶体金聚集线反应时，判断为阳性。
在本实施例中，该自热型扩增检测装置在进行检测使用时，能够通过产热层为扩增反应提供所需的温度的要求，无需依赖于恒温扩增仪等必备仪器，通过多个反应槽18 以及多个独立的扩增扩散区和独立的报告区的设置，能够实现不同样品的扩增反应检测，另外通过第一密封层和第二密封层的设置能够确保反应过程的安全。
实施例2
本发明提供一种自热型扩增检测装置，如图2所示，包括从上至下依次连接的封闭保护膜15、玻璃纤维膜16、吸水层17、底板19、铁粉活性炭产热层20和粘性不透气层21，所述吸水层17材料为多层脱脂棉，底板19为不透水层，保护上层反应试剂与下层铁粉活性炭产热层20不接触，铁粉活性炭产热层20使用纤维透气膜作为外层包装，在透气膜内表面设置一层明胶以防止无反应时氧气进入内部引发氧化反应，具体结构为内层包裹的是Fe粉和活性炭粉末，并加入5％的氯化钠颗粒和少量水进行混合，将混合后的物质压制成型后立刻使用明胶包裹，套上纤维透气膜后，四周包裹粘性不透气胶膜后紧贴于底板19下部。所述吸水层17上设有一一对应的两个扩增扩散区和两个报告区，两个扩增扩散区和两个报告区之间采用不透水的塑料条隔绝，结合两个反应槽18的设置形成两个检测单元，即为双靶标检测；两个反应槽18中放置有RPA扩增试剂、 SARS-COV-2扩增探针及引物冻干粉，其中，RPA扩增试剂的成分含量具体包括：RNA 逆转录酶浓度为20ng/μL、T4 UvsX蛋白浓度为120ng/μL、T4UvsY蛋白浓度为60 ng/μL、T4 gp32单链结合蛋白浓度为600ng/μL、DNA聚合酶1Bsu浓度为30ng/μL、 NFO酶(核酸内切酶IV)浓度为30ng/μL、磷酸肌酸浓度为50mM、肌酸激酶浓度为100 ng/μL、ATP浓度为3mM、二硫苏糖醇浓度为2mM、高分子聚PEG浓度为5％、Tris 浓度为20nM、乙酸钾浓度为100mM、乙酸镁浓度为10mM；其中引物冻干粉中引物对为SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：5，引物浓度为150～600 nM；SARS-COV-2扩增探针中探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示，探针浓度为60～80nM。
两个检测单元分别进行S蛋白RBD基因片段和人源标本RNaseP基因的检测，在两个扩增扩散区内分别滴加扩增产物报告所需的抗体及报告试剂，报告区为简易侧向流胶体金试纸，两个报告区各制备有两条结果判读线，其中一个报告区分别为RBD基因检测T线(即样品报告带22)和对照C线(即RPA内参23)，另一个为RNaseP基因检测P线(即人源标本对照带24)和对照C线(即RPA内参23)，将对应试剂(抗 FAM/DAG抗体及链霉亲和素)分别均匀的涂抹在两条结果判读线上。
具体使用方法包括：
X1、撕开最上层的封闭保护膜15一端，去除最下层的粘性不透气层21，将检测装置佩带在三级防护衣外层手腕上或放置在其他能够随身携带的位置，保证检测装置尽量贴合水平放置，避免振荡和甩动，等待产热层稳定产热10min后进行下一步操作；
X2、向反应槽18中滴加50μL提取好的待测标本核酸提取液，立刻贴好封闭保护膜15，进行扩增反应20min；
X3、当反应槽18反应完成后，撕开封闭保护膜15一端，拔出滑动隔板25，向反应槽18中加入500μL的PBST缓冲液，反应液经扩增扩散区侧向流浸润扩散至报告区，各反应产物经抗体结合后在报告区的不同位置发生相应的结合和吸附反应，达到扩增报告的目的；
X4、在10min内对反应结果进行判读，当报告区的检测线出现胶体金聚集线反应时，判断为阳性。
在本实施例中，步骤X4中，判断方法如下：T+，C+：RBD基因阳性，SARS-COV-2 核酸检测阳性；P+，C+：RNaseP基因阳性，采集到了人体标本；T-，C+：RBD基因阴性，SARS-COV-2核酸检测阴性；P-，C+：RNaseP基因阴性，未采集到人体标本，需要重新采集复检；T+/-,C-或P+/-,C-:检测试剂过期，质量控制未通过，检测结果不可靠。
在本实施例中，该自热型扩增检测装置在进行检测使用时，能够通过产热层为扩增反应提供所需的温度的要求，无需依赖于恒温扩增仪等必备仪器，另外通过双靶标检测可以实现S蛋白RBD基因片段和人源标本RNaseP基因的检测，最后通过封闭保护膜 15和粘性不透气层21的设置，也能够确保反应过程的安全。
在本实施例中，本发明选取的Genbank新型冠状病毒数据库(www.coronavirus.gov) 中SARS-CoV-2全基因组序列(Genbank编号：MT447160)糖蛋白S基因部分序列(RBD 序列)作为目标扩增区段，将其构建至载体pUC-SP中，制备成新型冠状病毒的阳性质粒，选取S基因部分区域的序列如下：
AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGC CCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGG AAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTT CCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAA TGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAG GGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCT GCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTA CCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAAC TGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTA CTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATA CAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGAC CTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTC
本发明以Homo sapiens chromosome 10的RNaseP基因序列为采样对照靶基因模板，设计RPA探针和引物(委托上海生物工程公司合成)，RNaseP基因序列为人体特有序列，当样本采集到人体标本后，该基因能报告样本采样的准确性。
RNaseP序列(Genbank编号NC_000010)
ATGGGACTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTG ACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCGTGAGTTGCCCCG GCTTCGCGCCTGGCCAACCTCATGCCACCCAGACCATCGGGCCACACTCCGGAGT AACTATTTCCTGATGGGTCTCGGTCAGGTCTCCCAGAGTCTCTGGGATGTCCCTGG AGGCTGATGCCCGCCGAGGTG
针对RNaseP序列的引物对和探针如下所示：
上游引物：ATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCG
下游引物：Biotin-TGGGTGGCATGAGGTTGGCCAGGCGCGAAG
探针：DAG-ACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCC
/idSp/CTCACCGTGAGTTGCC-C3 Spacer
本发明中设计的具体实验方法以及序列合成为常规方法。
模板处理：使用委托上海生物工程公司合成的含RBD序列的pUC-SP阳性模板质粒(4μg/mL)作为原始样本，使用ddH2O经过1∶9(v/v)进行梯度稀释，制备稀释度为1，10，100，103，104，105，106，107，108，109的核酸标准品。
选取以下组合的引物对和探针。
组合1(covRBD1)：
上游引物：AACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAAT(SEQ ID NO:1)
下游引物：Biotin-TAGTAAAGCAGAGATCATTTAATTTAGTAGGA(SEQ ID NO:2)
探针：FAM-TCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGC
/idSp/ACTGTGTTGCTGATTATTC-C3 Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列为：TCTGTTTATGCTTGGAA
CAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTC(SEQ ID NO:3)
组合2(covRBD2)：
上游引物：GTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTC(SEQ ID NO:4)
下游引物：Biotin-TTGGAAACCATATGATTGTAAAGGAAAGTA(SEQ ID NO:5)
探针：FAM-GGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATAT
/idSp/TCAACTGAAATCTATCA-C3 Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列为：GGAAGTCTAATCTCA
AACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCA(SEQ ID NO:6)
组合3(covRBD3)：
上游引物：TTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCT
下游引物：Biotin-AATGAATTGCATAGACATT
探针：FAM-TATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATT
/idSp/CCACTTTTAAGTGTT-C3 Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列为：TATTCTGTCCTATATAA
TTCCGCATCATTTCCACTTTTAAGTGTT
组合4(covRBD4)：
上游引物：TGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGA
下游引物：Biotin-TTATAATCAGCAATCTTTCCAG
探针：FAM-TACTAATGTCTATGCAGATCATTTGTAATT
/idSp/GAGGTGATGAAGTCA-C3 Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列为：TACTAATGTCTATG
CAGATCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCA
组合5(covRBD5)：
上游引物：GCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCAT
下游引物：Biotin-TTTGTCTGACTTCATCACCTCTAATTA
探针：FAM-TATGGAGTGTCTCCTACTATTAAATGATC
/idSp/CTGCTTTACTAATGTC-C3 Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列为：TATGGAGTGTCTCC
TACTATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTC
组合6(covRBD6)：
上游引物：GATTCATTTGTAATTAGAGGTGA
下游引物：Biotin-AGATTGTTAGAATTCCAAGCTATA
探针：FAM-ATCGCTCCAGGGCAAACTGGATAGATTGCTGAT
/idSp/ATAATTATAAATTAGCAGATGATTTTAC-C3 Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列为：ATCGCTCCAGGGCAA
ACTGGATAGATTGCTGATTATAATTATAAATTAGCAGATGATTTTAC
组合7(covRBD7)：
上游引物：AAGATTGCTGATTATAATTATAAATTAC
下游引物：Biotin-AGGTAATTATAATTACCACCAAC
探针：FAM-TACAGGCAGCGTTATAGCTTGGAAT
/idSp/CTAACAATCTTGATTC-C3 Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列为：TACAGGCAGCGTT
ATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTC
组合8(covRBD8)：
上游引物：TGATTTTACAGGCTGCGTTATA
下游引物：Biotin-CTACTACTCTGTATGGTTGGTAACCAACACCA
探针：FAM-TTGATTCTATGGTTGGTGGTAATTATAATTACCT
/idSp/TATAGATTGTTTAGGA-C3 Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列为：TTGATTCTATGGTT
GGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGA
组合9(covRBD9)：
上游引物：CTTTTGAGAGAGATATTT
下游引物：Biotin-AAGGAAAGTAACAATTAAAA
探针：FAM-ATCAGGCCTGTAGCACACC/idSp/TGTAATGGTGTTG-C3 Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列为：ATCAGGCCTGTA
GCACACCTTGTAATGGTGTTG
组合10(covRBD10)：
上游引物：CTTTACAATCATATGGTT
下游引物：Biotin-GCATGTAGAAGTTCAAAAGAAAGTA
探针：FAM-CCAACCCTCTAATGGTGTTGGTT/idSp/
CCAACCATACCGAGTAG-C3 Spacer
其中，探针所对应的核苷酸序列为：CCAACCCTCTAATGG
TGTTGGTTACCAACCATACCGAGTAG
本发明还提供一种常温快速检测新型冠状病毒的方法，如图11所示，具体为：将上述用于常温快速检测新型冠状病毒的扩增体系在自热型扩增检测装置下反应10min，完成RPA扩增，根据RPA产物与胶体金标记的羊抗兔FAM单克隆抗体的反应情况完成对新冠病毒的检测。
其结果见表1、图10、图12、图13。
验证试验方法
扩增结果的特异性
采用上述covRBD1～10的组合的引物对和探针，利用上述的扩增体系方法进行体系扩增，根据扩增体系对新冠病毒进行检测，取含沙门氏菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、诺如病毒、H1N1甲型流感、手足口病毒及新型冠状病毒RBD序列的pUC-SP阳性质粒的提取核酸，对扩增体系进行常温扩增，对产物进行LF侧向流试纸测试，以确认扩增体系是否具有特异性。其结果见表1、图10、图12。
扩增结果的敏感性
采用上述covRBD1～10的组合的引物对和探针，利用上述的扩增体系方法进行体系扩增，根据扩增体系对新冠病毒进行检测，将含RBD序列的pUC-SP阳性模板质粒 (4μg/mL)作为原始样本，使用ddH2O经过1∶9(v/v)进行梯度稀释的核酸标准品，分别进行RPA扩增，对产物进行LF侧向流试纸测试，以确认扩增体系的灵敏度。其结果见表1。
扩增结果的重复性
采用上述covRBD1～2的组合的引物对和探针，利用上述的扩增体系方法进行体系扩增，根据扩增体系对新冠病毒进行检测，选择含RBD序列的pUC-SP阳性模板质粒有效检出的最高稀释度标准品，重复RPA扩增10次，分别进行侧向流试纸测试，以确认扩增体系的重复性。其结果见图13。
扩增体系的非特异性空白对照
采用上述covRBD1～10的组合的引物对和探针，将引物和探针加入RPA扩增体系，直接进行RPA扩增，并检测侧向流分析结果，以无阳性条带判断为空白对照阴性。其结果见图12。
扩增体系的启动阴性对照
以含RBD序列的pUC-SP阳性模板质粒原始样本为模板，进行RPA扩增时，不加 Mg(Ac)2不进行RPA扩增反应，以侧向流测试阴性表示扩增体系的RPA依赖性。其结果见图12。
表1 SARS-COV-2不同扩增体系nfo扩增试验最低检出限结果
Figure RE-GDA0003003303000000151
如表1所示，比较covRBD1、covRBD2和covRBD3～10所述的扩增体系对突刺蛋白(spike protein)RBD序列的扩增灵敏，可见，covRBD3～10所述的不同靶基因区域扩增体系的扩增效率较低，检出限高于1000copys/mL，灵敏度较低。
RBD序列(Genbank编号MT447160)的10个不同扩增子(见图10)的引物探针RPA扩增体系，有8个试验组出现阳性反应(见图12-1S～8S实验组结果及表1所示各组检出限拷贝数)，2个试验组扩增失败。其中covRBD1(即SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:3)及covRBD2(即SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)扩增体系具有较高灵敏度，其中covRBD1组具有低于20copys/mL的检出限，优于大部分的 PCR扩增方法。
由图12可知，选择covRBD1及covRBD2扩增体系进行特异性和非特异性鉴定，结果显示特异性良好。covRBD1、covRBD2、covRBD5和covRBD8扩增体系没有出现非特异性扩增现象(见图12-非特异性扩增结果)，其余各组均出现了非特异性扩增，不可使用。非特异性的阳性(假阳性)在很多常温扩增中非常普遍，因为RNA/DNA扩增时，在高温环境中更稳定不容易出现错配和结合，而低于60度后，DNA/RNA都会发生不同程度的结合和错配。扩增体系中的引物和探针在常温环境中无法进行自我结合和错配，说明本发明提供的covRBD1及covRBD2扩增体系是可靠的。
综上，covRBD1、covRBD2扩增体系特异性良好，且灵敏度高，检出限低。
采用covRBD1扩增体系以经108稀释的含RBD序列的pUC-SP阳性模板质粒进行重复性试验，对covRBD2扩增体系以经107稀释的含RBD序列的pUC-SP阳性模板质粒进行重复性试验，由图13可见，covRBD1(左)及covRBD2(右)扩增体系的重复性很好，10次重复试验均检出了阳性结果。
因此，本发明最终选择了covRBD1及covRBD2实验组作为新型冠状病毒的RPA 扩增体系，其引物和探针序列及采用RNaseP序列设计的人体标本检测对照基因序列见表2。
表2新型冠状病毒的S蛋白基因重组酶聚合酶扩增检测最优引物探针
Figure RE-GDA0003003303000000171
需要说明的是，本发明实施例模拟的为实际环境，通常在实际环境中温度是不确定的，本发明在35～42℃，反应5～20min的情况下获得的扩增体系，均具有较高的灵敏度、较低的检出限、重复性好的特点。
实施例3
本发明还提供一种核酸检测系统，如图2、图3所示，其包括提取装置和检测装置，所述提取装置包括提取结构、存储结构、磁性结构和驱动结构，所述检测装置为上述所述的一种自热型扩增检测装置；
所述核酸提取结构包括提取室7、与所述提取室7连通的单向进液管3、与所述提取室8连通的单向排液管4以及与单向进液管3、单向排液管4远离提取室7的一端均连通的吸取口1；
所述存储结构包括多个与所述提取室7连通且用于存储反应试剂的试剂储存管9；
所述磁性结构包括置于所述提取室7内的磁珠8和用于控制所述磁珠8的磁性环；
所述驱动结构包括驱动所述核酸提取结构通过所述吸取口1提取液体或排除液体的第一驱动组件、驱动所述存储结构将反应试剂送入所述提取室7内的第二驱动组件；
其中，所述磁珠8的直径大于所述单向进液管3、所述单向排液管4的直径，所述核酸提取结构的吸取口1设有密封件，所述提取装置呈针筒状。
在本实施例中，将RPA技术、封闭式的核酸提取设备和依赖自发热型的胶体金测试卡结合起来，依靠封闭式常温扩增节约检测时间的同时也能有效避免生物安全问题，使得核酸检测能完全脱离大型仪器设备，简单便捷；另一方面，封闭式提取装置使用简便，无污染，能与三级生物安全防护管理有效结合起来，自发热型检测装置撕开胶膜后佩带手腕处即可实现恒温扩增；自发热型的胶体金测试卡能够在接触空气后依靠铁碳复合物颗粒，缓慢持续的提供恒温热量，保证扩增的进行，实现随采随检的目标。
在本实施例中，如图3至图5所示，优选的，所述提取装置包括外层结构和内层结构；
所述内层结构包括所述提取结构、设于所述提取室7的尾端的所述第一驱动组件、环绕布置在所述提取室7外的多个试剂储存管9、以及设于所述试剂储存管9尾端的所述第二驱动组件；
所述外层结构包括套设在所述内层结构外的装置外壳2、用于可拆卸设置在所述吸取口1处的密封件、以及可滑动套设在所述装置外壳2上用于控制所述提取室7内的所述磁珠8的所述磁性环，其中，所述装置外壳2的下端与所述提取结构固定连接。本发明通过内、外两层结构的设置，能够确保提取装置的密封性能，确保提取过程中的安全。
在本实施例中，如图3、图9所示，优选的，所述磁性结构还包括对所述磁性环的滑动进行导向的导向结构；所述导向结构包括至少两个在所述装置外壳2的外表面均布的移动导轨26，所述移动导轨26的长度方向与所述装置外壳2的轴向一致，所述导向结构还包括外壳卡槽29、磁铁卡口27和固定线圈28，所述移动导轨26安装于外壳卡槽29内，所述固定线圈28安装于移动导轨26上端，所述磁铁卡口27设置在移动导轨 26上，所述磁性环11滑动套设在移动导轨26上，通过固定线圈28可以控制磁性环11 沿提取室7中轴线上下移动，通过磁铁卡口27可以限制磁性环11滑动位置，使得提取室7能够在不同高度位置固定停留，满足实验需求。本发明通过导向结构的设置，可以方便磁性环11的滑动，使得提取过程更加便捷。
在本实施例中，如图3所示，优选的，所述提取室7呈U型，所述单向排液管4 设于所述提成仓下方且与其底端连通，所述单向排液管4的出液口与所述单向进液管3 的进液口连通，所述单向进液管3倾斜设于所述单向排液管4一侧，且所述单向进液管 3的出液口延伸至所述提取室7内并高于所述单向排液管4的进液口。本发明通过单向进液管3高于单向排液管4的设置，有助于避免提取过程中洗液生物污染。
在本实施例中，如图3所示，优选的，所述提取结构还包括包裹在所述单向排液管4和所述单向进液管3外的倒锥形，所述倒锥形的宽端与所述提取室7的底端外表面连接，所述倒锥形的窄端与所述吸取口1固定连接。
在本实施例中，如图、图7所示，优选的，所述单向进液管3、所述单向排液管4 内分别设置有三个单向阀5，可以确保反应液的单向流动，保证装置的密封性。
在本实施例中，如图3所示，优选的，所述提取结构还包括设于所述单向排液管4的进液口处且用于控制所述进液口开启或闭合的锁扣结构7；如图6所示，所述锁扣结构7包括中心轴、阀门和拉环，所述阀门为圆片状结构，其尺寸与单向排液管4内径匹配，所述中心轴一端穿过单向排液管4与单向排液管4内的阀门固定连接，另一端固定连接单向排液管4外的拉环，旋转拉环通过中心轴带动阀门旋转，实现单向排液管4的启闭，具体为当拉环处于水平状态时，阀门封闭单向排液管4，当拉环处于竖直状态时，阀门开启单向排液管4，通过拉环的状态选择可以便于对单向排液管4通闭的控制。
在本实施例中，如图3、图4、图5、图8所示，优选的，所述存储结构包括四个轴向与所述提取室7平行且连通的试剂储存管9，分别为裂解液储存管、RNA保护液储存管、中和液储存管和洗脱液储存管，所述试剂储存管9的出口处设有单向硅胶阀门；所述第二驱动组件包括四个与所述试剂储存管9一一对应设置的储存管活塞12，所述试剂储存管9在所述储存管活塞12的作用下将存储的试剂排入所述提取室7内。本发明通过分开设置的多个试剂储存管9，能够确保反应试剂的安全。
在本实施例中，如图3所示，优选的，所述第一驱动组件包括主活塞10、活塞杆 13和活塞帽14，所述活塞杆13一端与主活塞10固定连接，另一端与活塞帽14固定连接，通过活塞帽14的活塞杆13的设置，可以方便提取室7液体的吸入和排除。
实施例4
本发明还提供一种提取装置的制备方法，如图3至图8所示，包括以下步骤：
S1、制备两根玻璃管，分别为单向进液管3和单向排液管4，材质均为聚丙烯PP，直径均为0.5cm，单向进液管3长度为10cm，单向排液管4为7cm，单向进液管3和单向排液管4中分别放置3个单向阀5，在单向排液管4的进液口处安装一个锁扣结构7；锁扣结构7由中心轴、锁环和圆片状的阀门组成，旋转锁环能通过中心轴带动阀门旋转，达到开启和封闭单向排液管4的作用；
S2、制备提取室7，制作圆柱瓶状的提取室7，材质为聚丙烯PP，直径3.0cm，高8.0cm，安装单向进液管3和单向排液管4，单向进液管3和单向排液管4一端与提取室 7下端连通，另一端两者汇合连通吸取口1，单向进液管3伸入圆柱瓶状的提取室7 3cm，且紧贴圆柱瓶状的瓶壁，安装时确保单向进液管3内的单向阀5的开启方向为由外至提取室7内，单向排液管4内的单向阀5的开启方向为由提取室7内至外，圆柱瓶状的瓶外制备4个试剂储存管9，材质为聚丙烯，直径1.5cm，高5cm，下口略收缩成1cm，随后膨大并弯曲与提取室7瓶烧制并连通，4个试剂储存管9依照图6所示，依次标记为ABCD，分别放置裂解液、RNA保护液、中和液和洗脱液，试剂参数如下：
裂解液：0.1M NaOH，50μL CHCl3，50μL异硫氰酸胍，总体积为500μL；
RNA保护液：200μL纯度为100％的RNAstable LD；
中和液：0.1M NaAC 500μL；
洗脱液：含RNA酶抑制剂Murine 1～3U/μL的超纯水50μL；
S3、安装第一驱动组件和储存管活塞12，储存管活塞12安装于试剂储存管9上端，第一驱动组件安装于提取室7上端，其中第一驱动组件包括主活塞10、与主活塞10中心连接的活塞杆13以及与活塞杆13连接的活塞帽14，其中主活塞10为圆柱形橡胶制，直径2.8cm，高1.5cm；活塞杆13长6cm；储存管活塞12亦为圆柱形橡胶制，直径1.3cm，高1cm。
S4、制备装置外壳2和安装磁性环11，磁性环11可选用圆环状的磁铁，装置外壳 2材质为PC，将装置外壳2按照上部分圆柱形和下部分圆锥形拼接起来，其中圆柱形直径4.8cm，高5.2cm，厚0.15cm；圆锥形底部直径4.8cm，高7.5cm，将提取室7、试剂储存管9、单向进液管3和单向排液管4包裹起来，装置外壳2上端与提取室7上缘固定，根据第一驱动组件和储存管活塞12位置打孔，设置外壳卡槽29、固定线圈28、磁铁卡口27和移动导轨26等结构，将移动导轨26安装在外壳卡槽29内，将圆环状的磁铁11滑动套接在移动导轨26上，并通过移动导轨26上的磁铁卡口27限制位置，其中圆环状外径5.5cm，内径5.2cm，高1.0cm，在装置下端的吸取口1上套上密封件，密封件可选用硅胶制的封口帽，完全包裹尖端，以保证体系密封。
在本实施例中，通过该制备方法制备的提取装置，能够尽可能简化RNA核酸提取方法，同时能够有效避免生物安全问题；另外可以实现随采随提取的目标，可以满足没有大型设备支持的隔离区环境或野外样本的现场提取工作。
实施例5
本发明还提供一种提取装置的使用方法，如图3至图8所示，包括以下步骤：
A1、取下密封件，在第一驱动组件的作用下提取室7通过吸取口1提取样本后，密封件密封吸取口1；
A2、通过移动磁性环11解除磁珠8吸附状态，磁珠8沉于提取室7底部，通过第二驱动组件将试剂储存管9内的裂解液和RNA保护液送入提取室7内，充分震荡后垂直静置裂解；
A3、通过移动磁性环11吸附磁珠8并置于提取室7中部，通过第二驱动组件将试剂储存管9内的中和液送入提取室7内，并混合均匀；
A4、取下密封件，在第一驱动组件的作用下提取室7通过吸取口1排出混合液，提取室7在第一驱动组件的作用下通过吸取口1吸取70％乙醇(无具体体积要求)，至确保乙醇浸没磁珠8，密封件密封吸取口1后振摇或晃动；
A5、取下密封件，在第一驱动组件的作用下提取室7通过吸取口1排出乙醇洗涤液，密封件密封吸取口1；
A6、通过移动磁性环11解除磁珠8吸附状态，磁珠8沉于提取室7底部，通过第二驱动组件将试剂储存管9内的洗脱液送入提取室7内，振摇或震荡后静置，即完成核酸提取工作；
在本实施例中，该提取装置在进行核酸提取使用时，能够尽可能简化RNA核酸提取方法，同时能够有效避免生物安全问题；另外可以实现随采随提取的目标，可以满足没有大型设备支持的隔离区环境或野外样本的现场提取工作。
本发明的一种自热型扩增检测装置，可扩展使用以检测其他目标基因片段，使用该装置进行扩增的内容均为本发明保护内容。
本发明一种核酸检测系统，如图2、图3所示，能够进行高压灭菌，可以在有限条件下进行反复使用，但需要进行气密性检测，保证封口帽关闭状态下主活塞11和储存管活塞12无法推动，以保证提取过程的生物安全性。
本发明自热型扩增检测装置可佩带在已完成的三级防护服装手腕处，也可简易的贴于生物安全柜或符合生物安全防护条件的环境台面上，保证检测装置处于稳定可靠的检测环境中即可开展检测活动。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
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Claims (10)

1.一种自热型扩增检测装置，其特征在于：包括反应结构、检测结构、中间结构、自热结构和密封结构；其中，
所述中间结构包括自上而下设置的玻璃纤维膜(16)、吸水层(17)以及底板(19)；
所述反应结构包括至少两个独立的反应槽(18)，其穿过所述玻璃纤维膜(16)、所述吸水层(17)固定在所述底板(19)上，且靠近所述检测结构的一侧设有开口和用于开闭该开口的滑动隔板(25)，所述反应槽(18)用于反应样本的RPA扩增；
所述检测结构包括多个独立的扩增扩散区和独立的报告区；所述报告区包括设于所述吸水层(17)远离所述反应槽(18)一端的吸水层(17)上的判读线，所述判读线包括检测线和对照线，所述玻璃纤维膜(16)上开设有便于观察所述判读线的观察口；所述扩增扩散区为设于所述反应槽(18)和所述报告区之间、且内设有扩增产物报告所需的抗体及报告试剂的吸水层(17)；当经提取后的样本在所述反应槽(18)内反应完成后滑动所述滑动隔板(25)，所述反应槽(18)内的反应的样本从所述开口往所述扩增扩散区流动，并扩散至检测线；
所述自热结构包括设于所述底板(19)下方的产热层，所述产热层接触空气后自动发热；
所述密封结构包括对所述反应结构、检测结构和中间结构进行密封的第一密封层和对所述产热层进行密封的第二密封层。
2.根据权利要求1所述的一种自热型扩增检测装置，其特征在于：所述反应槽(18)包括加样孔，所述加样孔位于远离底板(19)的一侧，且所述加样孔与玻璃纤维膜(16)上表面齐平。
3.根据权利要求1所述的一种自热型扩增检测装置，其特征在于：所述产热层为铁粉活性炭产热层(20)，所述铁粉活性炭产热层(20)经接触空气后自发产热。
4.根据权利要求1所述的一种自热型扩增检测装置，其特征在于：还包括便于携带或穿戴的便携结构。
5.根据权利要求1所述的一种自热型扩增检测装置，其特征在于：所述反应槽(18)内设有用于常温快速检测新型冠状病毒的RPA扩增体系，所述RPA扩增体系包括：RBD阳性质粒模板、RNA逆转录酶、T4 UvsX蛋白、T4 UvsY蛋白、T4 gp32单链结合蛋白、DNA聚合酶1Bsu、NFO酶、磷酸肌酸、肌酸激酶、ATP、二硫苏糖醇、高分子聚PEG、Tris、乙酸钾、乙酸镁、引物对和探针；
其中所述引物对为SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：5；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示。
6.一种自热型扩增检测装置的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、制备反应槽(18)
反应槽(18)为长方体，尺寸为0.6cm×0.6cm×0.4cm，其中前后左下4个面为固定的PET聚酯材料板，上面设有加样孔，靠近检测结构的右面为可移动PET聚酯滑动隔板(25)，尺寸为0.58cm×0.5cm×0.15cm，反应槽(18)内设有RPA扩增体系；
S2、制备检测板：
S2.1、首先在吸水层(17)上确认反应槽(18)、扩增扩散区和报告区的放置位置，确保扩增扩散区位于反应槽(18)和报告区之间，根据反应槽(18)的个数将吸水层(17)采用不透水的塑料条隔绝成多个检测单元，每个检测单元在扩增扩散区内分别滴加扩增产物报告所需的抗体及报告试剂，并进行干燥处理后备用，在报告区内制备两条结果判读线，分为检测线和对照线，其中检测线靠近扩增扩散区，将相应试剂均匀的涂抹在结果判读线上，并进行干燥处理后备用；
S2.2、将第一密封层、玻璃纤维膜(16)、吸水层(17)、底板(19)、产热层和第二密封层按从上至下依次连接，将至少两个S1中制备的反应槽(18)穿过玻璃纤维膜(16)、吸水层(17)固定在底板(19)上，反应槽(18)的加样孔与玻璃纤维膜(16)上表面齐平，其右面的滑动隔板(25)面向扩增扩散区和报告区；
S3、检测板制作完成后，在外侧安装符合尺寸的无纺布表带和PVC外壳，装置安装完毕后进行干燥处理，并进行避光封膜装袋。
7.根据权利要求6所述的一种自热型扩增检测装置的制备方法，其特征在于：步骤S2.2中，所述吸水层(17)材料为多层脱脂棉；所述底板(19)为不透水层。
8.根据权利要求6所述的一种自热型扩增检测装置的制备方法，其特征在于：步骤S2.2中，所述产热层为铁粉活性炭产热层(20)，所述铁粉活性炭产热层(20)由铁粉、活性炭粉末、5％的氯化钠颗粒和少量水经混合并压制成型后立刻使用明胶包裹，并套上纤维透气膜制得。
9.一种自热型扩增检测装置的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
X1、撕开最上层的第一密封层一端，去除最下层的第二密封层，将检测装置佩带在三级防护衣外层手腕上或放置在其他能够随身携带的位置，保证检测装置尽量贴合水平放置，等待产热层稳定产热10min；
X2、向反应槽(18)中滴加50μL提取好的待测标本核酸提取液，立刻贴好第一密封层，进行扩增反应20min；
X3、撕开第一密封层一端，拔出滑动隔板(25)，向反应槽(18)中加入500μL的PBST缓冲液，使反应产物进行侧向流经扩增扩散区进入报告区；
X4、在10min内对反应结果进行判读，当报告区的检测线出现胶体金聚集线反应时，判断为阳性。
10.一种核酸检测系统，其包括提取装置和检测装置，所述提取装置包括提取结构、存储结构、磁性结构和驱动结构，其特征在于：所述检测装置为权利要求1至5任一项所述的一种自热型扩增检测装置；
所述提取结构包括提取室(7)、与所述提取室(7)连通的单向进液管(3)、与所述提取室(7)连通的单向排液管(4)以及与单向进液管(3)、单向排液管(4)远离提取室(7)的一端均连通的吸取口(1)；
所述存储结构包括多个与所述提取室(7)连通且用于存储反应试剂的储存管(10)；
所述磁性结构包括置于所述提取室(7)内的磁珠(8)和用于控制所述磁珠(8)的磁性环(11)；
所述驱动结构包括驱动所述提取结构通过所述吸取口(1)提取液体或排除液体的第一驱动组件、驱动所述存储结构将反应试剂送入所述提取室(7)内的第二驱动组件；
其中，所述磁珠(8)的直径大于所述单向进液管(3)、所述单向排液管(4)的直径，所述提取结构的吸取口(1)设有密封件，所述提取装置呈针筒状。
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