CN101812541A - 一种香菇病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种香菇病毒检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括①食用真菌病毒RNA提取试剂；②RT-PCR检测试剂为：包括dNTPs 100μmol/L、Tris-HCl缓冲液、提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和三对RT-PCR特异性引物；③对照样品包括阳性对照样品和阴性对照样品，试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。检测步骤是：A、从待测样品香菇菌丝体或子实体中提取总RNA；B、以提取的总RNA为模板，用设计的引物分别对RNA进行RT-PCR扩增；反应中使用的反转录酶为M-MLV反转录酶，DNA聚合酶使用Taq酶或高保真DNA聚合酶Pfu；C、取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，判断样品。本发明检测灵敏度高，结果准确，早期对香菇病毒进行快速、灵敏、准确的检测，大大减少了香菇生产中病毒病造成的危害。

Description

一种香菇病毒检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种农业生物技术，具体地说，涉及检测香菇病毒所用的PCR引物和准确快速检测香菇病毒的RT-PCR检测试剂盒，同时还涉及香菇病毒的检测方法，适用于香菇菌种的病毒检测和香菇生产中早期病毒的检测。

背景技术

香菇是著名的食药兼用菌，也是我国栽培的主要食用真菌之一，随着国际市场的开拓和国内消费的不断增加，生产呈逐年上升趋势。从上世纪末到本世纪初，我国年产鲜香菇140多万吨。产量和出口量都居世界第一位。地处浙江南部山区的丽水市是世界人工栽培香菇的发源地，鲜香菇年产量40-45万吨，年出口超过20万吨，是目前全球最大的香菇产销集散地。香菇的生产和出口已成为部分县农业支柱产业和农民致富的重要途径。

随着香菇栽培规模扩大，近年出现不同程度的香菇病毒病危害，给菇农带来惨重经济损失。香菇病毒在菌丝体和营养生长阶段感染，轻度感染病毒的症状一般较为隐蔽，外观上不易识别。严重带毒菌株开始表现也不明显，后期则表现为菌丝生长速度慢，形状不整齐，局部伴有缺刻或菌丝紊乱的现象。香菇在子实体生长阶段感染病毒，带毒菌丝对不良培养环境的适应性降低，尤其是抵抗霉菌侵染的能力下降，不能萌发成子实体或发育成畸形菇。菌丝体生长缓慢，长势减弱，子实体畸形，质量和产量严重下降。病毒感染菌株培养后期的纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶活性和对木屑培养料中纤维素、半纤维素、木质素的降解能力比其正常菌株明显下降。

香菇病毒的发生不仅使香菇的产量下降、品质降低，产品难以出口，特别是香菇病毒病早期不容易辨认，或症状时隐时现，一旦肉眼发现香菇发生病毒病，往往已到了香菇生产的中后期，这样对香菇的生产造成的损失就十分巨大。同时，由于香菇病毒病发现较晚，也对香菇菌种的无病毒育种提出严峻挑战，对高质高产香菇菌种无病毒培育造成重大威胁。因此，急需开发香菇病毒病的早期快速检测方法，从而保证香菇生产在无病毒感染的条件下持续生产，促进全国各地香菇生产和出口。

关于香菇病毒的研究，早在上世纪70年代就有报道。1972年，日本学者从栽培香菇中分离到香菇病毒。1992年，我国学者也从香菇中分离到香菇病毒。这些研究主要是从形态学上进行观察，并没有进行深入的分子生物学研究，只有沈学仁等从球形香菇病毒中提取出病毒核酸，确定病毒核酸类型是RNA。由于香菇病毒基因组核酸序列的研究还是空白，国际病毒分类委员会2005年公布的第八次报告中，香菇病毒仅作为未分类病毒列出。香菇病毒的检测目前主要是通过电镜观察检测，另有一些酶法检测的试验报道。

香菇栽培在国内外都有较长的历史，但直到上世纪八十年代，香菇栽培主要是段木栽培，从上世纪九十年代以来，香菇栽培一般都改为代料栽培。以代料栽培方式栽培，香菇生长的营养条件和环境条件都发生了巨大变化。随着香菇代料栽培的迅速增加扩大，病毒病在香菇生长的不同阶段都有出现，对香菇产业的健康持续发展构成威胁。为了开发方便快速的香菇病毒检测方法，近年来我们对发生在浙江、福建等地的香菇病毒病进行了研究，发现代料栽培的香菇中，病毒主要是是长杆形颗粒，大小为20nm×100-200nm。病毒基因组为双链RNA分子，大小约8.0kb，随后完成了香菇病毒部分基因组的序列分析(Accession no：GQ372842)。这些工作为开发新的香菇病毒检测方法奠定了很好的基础。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种香菇病毒检测试剂盒，该试剂盒组成成分简单，检测灵敏度高，结果准确，可在香菇菌种制备阶段或香菇栽培早期就对香菇病毒进行快速、灵敏、准确的检测，大大减少了香菇生产中病毒病造成的危害。

本发明的另一个目的是在于提供了一种香菇病毒检测试剂盒的检测方法，用本发明提供的检测方法，反转录(RT)和PCR一步完成，操作简单方便；使用多对特异性引物进行RT-PCR，可有效排除假阳性出现。香菇病毒检测方法所需的试验条件简单，不需要电镜、超速离心机等大型仪器设备，在一般食用真菌菌种生产单位和基层研究单位都可满足这些试验条件，有利于本发明在香菇栽培地区大范围推广应用。

为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种香菇菌病毒检测试剂盒由以下成分组成，分别是：

①、食用真菌病毒RNA提取试剂，包括液氮、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液、2-硫醇基苯并噻唑(2-ME)、氯仿、异戊醇、0.1％(w/v)焦碳酸二乙酯(DEPC)、无水乙醇、70％(v/v)乙醇、三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(TE，pH 8.0)。

其中，CTAB提取液的配方为：2％(w/v)CTAB，2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH 8.0，焦碳酸二乙酯处理的水配制)，25mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5g/L亚精胺(Spermidine)，2.0M氯化钠(NaCl)，2％(v/v)巯基乙醇(使用前加入)。

②、RT-PCR检测试剂：包括100μmol/L四种焦磷酸核苷酸混合液(dNTPs)、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH 8.8)、从香菇样品中提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和三对RT-PCR特异性引物。

其中，酶混合试剂包含莫洛尼鼠类白血病毒(M-MLV)反转录酶和DNA聚合酶Taq酶(或高保真DNA聚合酶Pfu)，两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶0.5-2。

三对RT-PCR的特异性引物分别为：

第一对引物为：LEV F1：5′-ACAAAAAGCAAAAGCCGAGAGC-3′，

              LEV R1：5′-ATTGCGAAGAAGCCCGTAAGAT-3′；

第二对引物为：LEV F2：5’-TCTTACGGGCTTCTTCGC-3’

              LEV R2：5’-TGATTCGGGAGAGGGACT-3’；

第三对引物为：LEV F3：5′-CTAAGGCAAAGTCCAGGCACA-3′，

              LEV R3：5′-TGCGTTGGGAGCTCTTCCGATAAC-3′。

这三对引物在病毒基因组核酸上对应区域的分子大小分别为400bp、600bp和500bp，且三个区域略有重叠。使用其中的两对引物对香菇病毒进行检测，另一对引物备用。

③对照样品包括阳性对照样品和阴性对照样品。阳性对照样品是武香异常株WL株香菇菌丝体，试验确定含有香菇病毒颗粒和病毒核酸。阴性对照为浙江正常株JL-0株香菇菌丝，试验确定不含病毒颗粒和病毒核酸序列。

试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。

一种香菇菌病毒检测试剂盒的检测方法包括三个步骤，分别是：

第一步，从待测样品香菇菌丝体或子实体中提取总RNA。提取方法是：

(1)待测样品0.1-0.2克，放置于1.5mL离心管中，液氮冰冻。

(2)通过振荡器剧烈震荡，用玻璃棒将菌丝体或子实体样品研碎，细度达50-80目。

(3)加入0.4-0.6mL十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液液匀浆，再加入2-硫醇基苯并噻唑(2-ME)至终浓度为2％(w/v)，振荡混匀。

(4)45-65℃温育30-60min，再加入0.4-0.8mL氯仿，混匀5-10min。

(5)8000-15000g离心5-10min，上层水相移到一个新离心管中。

(6)加入0.5-1.5倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置30-60min。

(7)8000-15000g离心10-20min，弃去上清。

(8)70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，8000-15000g离心2-5min，再用无水乙醇洗涤一次。

(9)弃去上清，真空干燥5-15min。

(10)沉淀溶于30-100μL三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(TE，pH 8.0)中，-20℃保存备用。

第二步，以提取的总RNA为模板，用设计的第一对和第二对引物分别对RNA进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系包括：

酶混合试剂                                2μL

三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 8.8)       5μL

病毒部分基因组上游引物(F1、F2或F3)        1μL

病毒部分基因组下游引物(R1、R2或R3)        1μL

香菇病毒模板核酸                          1-4μL

100μmol/L四种三磷酸脱氧核苷混合液(dNTPs) 4μL

无RNA酶去离子水                           加至50μL

进行RT-PCR的反应条件是，首先42-50℃反转录30-60min，然后94℃变性3min；以94℃ 30sec，50-58℃ 1min，72℃1min为一个循环，共进行30-35个循环；最后72℃延伸5-10min。

反应中使用的反转录酶为M-MLV反转录酶，DNA聚合酶使用Taq酶或高保真DNA聚合酶Pfu，酶混合试剂中两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶0.5-2。

第三步，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，判断样品是否呈阳性

若两条扩增条带的分子大小为400bp和600bp，则待测样品为阳性。若两对引物都没有扩增产物，则待测样品为无病毒样品。若两对引物PCR检测结果只有一对引物的结果呈阳性，则将这对引物换为第三对引物，与第一次检测时呈阴性的引物分别对待测样品进行第二次RT-PCR，反应条件与第一次RT-PCR的条件相同。第二次PCR结果只要任何一对引物的结果呈阳性，都判断待测样品有病毒污染。在病毒检测试剂盒开始使用时，为了验证这种判断的正确性，对从浙江、湖北等地收集的香菇样品菌株扩大培养，获得足够的材料分离病毒，在电镜下进行检测，电镜检查结果与本发明提供试剂盒的检测结果相一致。

香菇病毒检测方法中所用的离心管和其它器皿器具均预先用0.1％DEPC处理。

本发明与现有病毒检测方法相比所具有的优点：

香菇病毒检测目前主要是通过电镜观察检测。由于香菇菌丝体和子实体中含有大量粘多糖，使从香菇病毒中分离高质量的病毒颗粒非常困难，电镜下经常只能看到少量病毒颗粒。况且由于电镜检测操作繁琐，需要大型仪器设备超速离心机和电子显微镜，在一般的食用真菌生产单位和基层研究部门难以进行。

香菇病毒检测的另一种方法是通过酶法检测，即通过对酯酶同工酶图谱和氧化酶同工酶图谱的分析早期检测香菇病毒。但香菇同工酶的变化可由病毒感染引起，也可以由其它病原感染引起，即使是香菇培养条件的变化和培养基营养成分的变化，也能引起香菇同工酶的变化，使这种酶法检测不具有唯一性，实际操作中会出现大量误判。

dsRNA技术也是检测食用真菌病毒普遍的手段，申请人在研究中也用dsRNA技术对香菇病毒进行了检测。这种技术虽然也可检测香菇病毒，但由于病毒核酸分子量较大(约8.0kb)，从香菇中提取高质量病毒核酸样品比较困难，检测时电泳条带模糊，由于不能对这样大的RNA进行克隆和测序，也不能确定获得的条带就是目的病毒核酸。

本发明以香菇样品中提取的RNA为模板，用两对引物对模板RNA进行RT-PCR，对香菇病毒进行早期快速检测。本发明提供的方法克服了以前香菇病毒检测的一些缺陷，操作方便易行，需用样品量少，对香菇病毒检测快速、灵敏、准确，可在菌种制备阶段或香菇栽培早期就检测到病毒，可大大减少香菇生产中病毒病造成的危害，也为香菇无毒菌种的培育提供了很好的检测手段，填补香菇病毒检测技术的空白，为香菇的持续稳定高质高产奠定基础。本发明提供的香菇病毒检测技术所需的试验条件简单，不需要电镜、超速离心机等大型仪器设备，在一般的菌种生产单位和基层研究单位都可满足这些试验条件，有利于本发明在香菇栽培地区大范围推广应用。

另外，虽然香菇病毒目前还没有用RT-PCR进行检测的报道，但其它一些植物RNA病毒和动物RNA病毒有用这类方法检测的报道。然而，在这些报道中，一般都设一对PCR引物，由于要提高检测的灵敏性，设计引物所对应的核酸片段都较短，一般在300-600bp之间，这样在RT-PCR时容易出现假阳性结果。为了克服以前报道在这方面的不足，申请人提供的发明专利中包括三对引物，首先用两对引物对同一样品分别进行RT-PCR，若出现结果不一致，怀疑检测结果出现假阳性，可用第三对引物替换前两对引物中的一个，分别对样品进行第二次RT-PCR。这样的方法既有效避免检测中的假阳性出现，又保证了本方法的快速性、灵敏性和准确性。

具体实施方式

实施例1：

一种香菇菌病毒检测试剂盒由以下成分组成，分别是：

①、食用真菌病毒RNA提取试剂，包括液氮、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液、2％(w/v)2-ME(2-硫醇基苯并噻唑)、氯仿、异戊醇、0.1％(w/v)DEPC(焦碳酸二乙酯)、无水乙醇、70％(v/v)乙醇、TE(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液(pH8.0)。

其中，CTAB提取液的配方为：2％(w/v)CTAB，2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，100mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH8.0，DEPC处理的水配置)，25mMEDTA(乙二胺四乙酸)，0.5g/L Spermidine(亚精胺)，2.0M NaCl(氯化钠)，2％(v/v)巯基乙醇(使用前加入)。

②、RT-PCR检测试剂，包括100μmol/L dNTPs(四种三磷酸核苷混合液)、Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液(pH 8.8)、从香菇样品中提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和三对RT-PCR特异性引物。

其中，酶混合试剂包含M-MLV(莫洛尼鼠类白血病毒)反转录酶、高保真DNA聚合酶Pfu，两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶0.7。

三对RT-PCR的特异性引物分别为：

第一对引物为：LEV F1：5′-ACAAAAAGCAAAAGCCGAGAGC-3′，

              LEV R1：5′-ATTGCGAAGAAGCCCGTAAGAT-3′；

第二对引物为：LEV F2：5’-TCTTACGGGCTTCTTCGC-3’

              LEV R2：5’-TGATTCGGGAGAGGGACT-3’；

第三对引物为：LEV F3：5′-CTAAGGCAAAGTCCAGGCACA-3′，

              LEV R3：5′-TGCGTTGGGAGCTCTTCCGATAAC-3′。

③对照样品包括阳性对照样品WL株香菇菌丝体，阴性对照为JL-0株香菇菌丝。试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。

一种香菇菌病毒检测试剂盒的检测方法包括三个步骤，分别是：

第一步，从待测样品香菇菌丝体中提取总RNA。待测香菇菌种菌丝体样品6个，分别为浙江培育菌种868-1、868-1Z、868-2Y、868-2Z、908-Y和908-Z株。阳性对照样品为WL株菌丝体，阴性对照样品为JL-0株菌丝体。提取方法是：

(1)待测样品0.2克，放置于1.5mL离心管中，液氮冰冻。

(2)通过振荡器剧烈震荡，用玻璃棒将菌丝体样品研碎，细度达50目。

(3)加入0.6mL CTAB提取液液匀浆，加2-ME至终浓度2％(w/v)，振荡混匀。

(4)65℃温育30min，再加入0.7mL氯仿，混匀7min。

(5)8000g离心10min，上层水相移到一个新离心管中。

(6)加入1.2倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置50min。

(7)9000g离心15min，弃去上清。

(8)70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，9000g离心2min，再用无水乙醇洗涤一次。

(9)弃去上清，真空干燥12min。

(10)沉淀溶于50μL TE缓冲液(pH 8.0)中，-20℃保存备用。

第二步，以提取的总RNA为模板，用设计的第一对和第二对引物分别对RNA进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系包括：

酶混合试剂                                    2μL

三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液缓冲液(pH 8.8)     5μL

病毒部分基因组上游引物(F1、F2或F3)            1μL

病毒部分基因组下游引物(R1、R2或R3)            1μL

香菇病毒模板核酸                              2μL

100μmol/L dNTPs                              4μL

无RNA酶去离子水                               加至50μL

进行RT-PCR的反应条件是，首先47℃反转录50min，然后94℃变性3min；以94℃ 30sec，53℃ 1min，72℃ 1min为一个循环，共进行30个循环；最后72℃延伸6min。

反应中使用的反转录酶为M-MLV(莫洛尼鼠类白血病毒)反转录酶，DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶Pfu，酶混合试剂中两种酶混合酶单位比例为：U∶U＝1∶0.7。

第三步，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，对检测结果进行判定。

使用第一和第二对引物分别对6个样品和2个对照进行RT-PCR，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳1小时，溴化乙啶处理后在紫外灯下显示，两对引物对868-1Y、868-2Y和908-Y的RT-PCR产物都出现明显的条带，分子大小分别为400bp和600bp。而两对引物对868-1Z、868-2Z和908-Z的RT-PCR产物都不出现任何条带。阳性对照产物出现相应的条带，阴性对照产物没有任何条带。

检测结论：868-1Z、868-2Z和908-Z样品不含香菇病毒，868-1Y、868-2Y和908-Y是含有香菇病毒的样品。

注：香菇病毒检测方法中所用的离心管和其它器皿器具均预先用0.1％DEPC处理。

实施例2：

一种香菇病毒检测试剂盒，它包括以下三组成份：

①、食用真菌病毒RNA提取试剂，包括液氮、CTAB提取液、2％(w/v)2-ME(2-硫醇基苯并噻唑)、氯仿、异戊醇、0.1％(w/v)DEPC(焦碳酸二乙酯)、无水乙醇、70％(v/v)乙醇、TE缓冲液(pH 8.0)。

其中，CTAB提取液的配方为：2％(w/v)CTAB，2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，100mM Tris-HCl(pH 8.0，DEPC处理的水配置)，25mM EDTA，0.5g/L Spermidine(亚精胺)，2.0M NaCl，2％(v/v)巯基乙醇(使用前加入)。

②、RT-PCR检测试剂，包括100μmol/L dNTPs、Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)、从香菇样品中提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和三对RT-PCR特异性引物。

其中，酶混合试剂包含M-MLV反转录酶、高保真DNA聚合酶Pfu，两种酶的混合比例为U∶U＝1.0∶1.0。

三对RT-PCR的特异性引物分别为：

第一对引物为：LEV F1：5′-ACAAAAAGCAAAAGCCGAGAGC-3′，

              LEV R1：5′-ATTGCGAAGAAGCCCGTAAGAT-3′；

第二对引物为：LEV F2：5’-TCTTACGGGCTTCTTCGC-3’

              LEV R2：5’-TGATTCGGGAGAGGGACT-3’；

第三对引物为：LEV F3：5′-CTAAGGCAAAGTCCAGGCACA-3′，

              LEV R3：5′-TGCGTTGGGAGCTCTTCCGATAAC-3′。

③对照样品包括阳性对照样品WL株香菇菌丝体，阴性对照为JL-0株香菇菌丝。试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。

一种香菇菌病毒检测试剂盒的检测方法包括三个步骤，分别是：

第一步，从待测样品香菇菌丝体中提取总RNA。待测香菇菌种菌丝体样品9个，分别为浙江培育菌种66、80、88、93、97、98、99、919株和申10株菌丝体。阳性对照样品为WL株菌丝体，阴性对照样品为JL-0株菌丝体。提取方法是：

1.1待测样品0.2克，放置于1.5mL离心管中，液氮冰冻。

1.2通过振荡器剧烈震荡，用玻璃棒将菌丝体样品研碎，细度60目。

1.3加入0.5mL CTAB提取液液匀浆，加2-ME至终浓度为2％(w/v)，振荡混匀。

1.4 65℃温育30min，再加入0.6mL氯仿，混匀5min。

1.5 8000g离心10min，上层水相移到一个新离心管中。

1.6加入1.0倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置60min。

1.7 12000g离心10min，弃去上清。

1.8 70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，10000g离心5min，再用无水乙醇洗涤一次。

1.9弃去上清，真空干燥10min。

1.10沉淀溶于50μL TE缓冲液(pH 8.0)中，-20℃保存备用。

第二步，以提取的总RNA为模板，用设计的第一对和第二对引物分别对RNA进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系包括：

酶混合试剂                                2μL

Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)                    5μL

病毒部分基因组上游引物(F1、F2或F3)        1μL

病毒部分基因组下游引物(R1、R2或R3)        1μL

香菇病毒模板核酸                          2μL

100μmol/L dNTPs                          4μL

无RNA酶去离子水                           加至50μL

进行RT-PCR的反应条件是，首先50℃反转录60min，然后94℃变性3min；以94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min为一个循环，共进行30个循环；最后72℃延伸5min。

反应中使用的反转录酶为M-MLV反转录酶，高保真DNA聚合酶Pfu，酶混合试剂中两种酶的混合比例为U∶U＝1.0∶1.0。

第三步，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，对检测结果进行判定。

第一和第二对引物分别对浙江新培育的9个菌种样品和2个对照菌种样品进行RT-PCR，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳1小时，溴化乙啶处理后在紫外灯下显示，第一对引物引物对919株和申10株菌丝体样品的RT-PCR产物出现分子大小约400bp的条带，对其它样品的RT-PCR产物不出现条带；第二对引物仅对申10株样品的RT-PCR产物出现约600bp的条带，对其它样品的RT-PCR样品不出现任何条带。

由于第一对引物和第二对引物对919株菌丝体样品RNA提取物进行RT-PCR的结果不一致，启用第三对引物。用第二对和第三对引物对919株菌丝体样品分别进行第二次RT-PCR，结果在电泳时都没有出现任何条带，说明第一次RT-PCR出现假阳性。

检测结论：浙江新培育的菌种66、80、88、93、97、98、99和919株中不含病毒，是无病毒菌种，而菌种申10株中含有病毒，不可使用。

结果验证：9个菌株分别在培养基上扩大培养，收集菌丝体处理提取病毒在电镜下观察，结果发现浙江新培育的菌种66、80、88、93、97、98、99和919株样品中没有发现病毒颗粒，对这些样品进行核酸提取，都没有特异RNA条带出现。而在申10样品中及发现病毒颗粒，也出现特异的约8kb核酸条带。这些结果证明我们的检测方法准确可靠。

香菇病毒检测方法中所用的离心管和其它器皿器具均预先用0.1％DEPC处理。

实施例3：

一种香菇病毒检测试剂盒，它包括以下三组成份：

①、食用真菌病毒RNA提取试剂，包括液氮、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液、2-ME(2-硫醇基苯并噻唑)、氯仿、异戊醇、0.1％(w/v)DEPC(焦碳酸二乙酯)、无水乙醇、70％(v/v)乙醇、TE缓冲液(pH 8.0)。

其中，CTAB提取液的配方为：2％(w/v)CTAB，2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，100mM Tris-HCl(pH 8.0，DEPC处理的水配置)，25mM EDTA，0.5g/L Spermidine(亚精胺)，2.0M NaCl，2％(v/v)巯基乙醇(使用前加入)。

②、RT-PCR检测试剂，包括dNTPs 100μmol/L、Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)、从香菇样品中提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和三对RT-PCR特异性引物。

其中，酶混合试剂包含M-MLV反转录酶、DNA聚合酶Taq酶，两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1.0∶1.2。

三对RT-PCR的特异性引物分别为：

第一对引物为：LEV F1：5′-ACAAAAAGCAAAAGCCGAGAGC-3′，

              LEV R1：5′-ATTGCGAAGAAGCCCGTAAGAT-3′；

第二对引物为：LEV F2：5’-TCTTACGGGCTTCTTCGC-3’

              LEV R2：5’-TGATTCGGGAGAGGGACT-3’；

第三对引物为：LEV F3：5′-CTAAGGCAAAGTCCAGGCACA-3′，

              LEV R3：5′-TGCGTTGGGAGCTCTTCCGATAAC-3′。

③对照样品包括阳性对照样品WL株香菇菌丝体，阴性对照为JL-0株香菇菌丝。试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。

一种香菇菌病毒检测试剂盒的检测方法包括三个步骤，分别是：

第一步，从待测样品香菇菌丝体或子实体中提取总RNA。待测香菇菌种菌丝体样品12个，分别是浙江培育菌种661、665、668、808、868、931、9319、937、939和988株菌丝体和从浙江丽水收集的香菇子实体样品2个，子实体样品编号为F101和F103。阳性对照样品为WL株菌丝体，阴性对照样品为JL-0株菌丝体。提取方法是：

(1)待测样品0.15克，放置于1.5mL离心管中，液氮冰冻。

(2)通过振荡器剧烈震荡，用玻璃棒将菌丝体或子实体样品研碎，细度达70目。

(3)加入0.5mL CTAB提取液液匀浆，再加2-ME至终浓度为2％(w/v)，振荡混匀。

(4)60℃温育60min，再加入0.6mL氯仿，混匀5min。

(5)10000g离心5min，上层水相移到一个新离心管中。

(6)加入1.2倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置45min。

(7)12000g离心15min，弃去上清。

(8)70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，10000g离心5min，再用无水乙醇洗涤一次。

(9)弃去上清，真空干燥15min。

(10)沉淀溶于30μL TE缓冲液(pH 8.0)中，-20℃保存备用。

第二步，以提取的总RNA为模板，用设计的第一对和第二对引物分别对RNA进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系包括：

酶混合试剂                                2μL

Tris-HCl缓冲液                            5μL

病毒部分基因组上游引物(F1、F2或F3)        1μL

病毒部分基因组下游引物(R1、R2或R3)        1μL

香菇病毒模板核酸                          1μL

100μmol/L dNTPs                          4μL

无RNA酶去离子水                           加至50μL

进行RT-PCR的反应条件是，首先48℃反转录45min，然后94℃变性3min；以94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min为一个循环，共进行33个循环；最后72℃延伸10min。

反应中使用的反转录酶为M-MLV反转录酶，DNA聚合酶使用Taq酶，酶混合试剂中两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶1.2。

第三步，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，对检测结果进行判定。

使用第一和第二对引物分别对12个样品和2个对照进行RT-PCR，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳1小时，溴化乙啶处理后在紫外灯下显示，两对引物对808、931和F103样品的RT-PCR产物都出现分子大小约400bp和600bp的两个条带，对661、868、9319、、937、939、988和F101样品的RT-PCR产物不出现条带。第一对引物对665和668号样品进行RT-PCR扩增，产物出现约400bp的条带，而第二对引物对这两个样品的RT-PCR扩增，产物电泳后不出现特异条带。

由于第一对引物和第二对引物对665和668样品的RT-PCR的结果不一致，启用备用引物。用第二对和第三对引物对665和668号样品分别进行第二次RT-PCR，结果在电泳时都出现约500bp的特异条带。

检测结论：新培育的菌种661、868、9319、、937、939、988株中不含病毒，是无病毒菌种。菌种665、668、808和931株被病毒污染，不可使用。另外子实体F101样品中不含病毒，而子实体F103样品中存在病毒。

香菇病毒检测方法中所用的离心管和其它器皿器具均预先用0.1％DEPC处理。

实施例4：

一种香菇病毒检测试剂盒，它包括以下三组成份：

①、食用真菌病毒RNA提取试剂，包括液氮、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液、2-ME(2-硫醇基苯并噻唑)、氯仿、异戊醇、0.1％(w/v)DEPC(焦碳酸二乙酯)、无水乙醇、70％(v/v)乙醇、TE缓冲液(pH 8.0)。

其中，CTAB提取液的配方为：2％(w/v)CTAB，2％(w/v)PVP，100mM Tris-HCl(pH8.0，DEPC处理的水配置)，25mM EDTA，0.5g/L Spermi dine，2.0M NaCl，2％(v/v)巯基乙醇(使用前加入)。

②、RT-PCR检测试剂，包括dNTPs 100μmol/L、Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)、从香菇样品中提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和三对RT-PCR特异性引物。

其中，酶混合试剂包含M-MLV反转录酶、高保真DNA聚合酶Pfu酶，两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1.0∶0.8。

三对RT-PCR的特异性引物分别为：

第一对引物为：LEV F1：5′-ACAAAAAGCAAAAGCCGAGAGC-3′，

              LEV R1：5′-ATTGCGAAGAAGCCCGTAAGAT-3′；

第二对引物为：LEV F2：5’-TCTTACGGGCTTCTTCGC-3’

              LEV R2：5’-TGATTCGGGAGAGGGACT-3’；

第三对引物为：LEV F3：5′-CTAAGGCAAAGTCCAGGCACA-3′，

              LEV R3：5′-TGCGTTGGGAGCTCTTCCGATAAC-3′。

③对照样品包括阳性对照样品WL株香菇菌丝体，阴性对照为JL-0株香菇菌丝。试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。

一种香菇菌病毒检测试剂盒的检测方法包括三个步骤，分别是：

第一步，从待测样品香菇菌丝体中提取总RNA。待测香菇菌种菌丝体样品9个，分别为湖北培育菌种WH61、WH65、WH68、WH80、WH81、WH93、WH96、WH97和WH99株菌丝体。阳性对照样品为WL株菌丝体，阴性对照样品为JL-0株菌丝体。提取方法是：

(1)待测样品0.2克，放置于1.5mL离心管中，液氮冰冻。

(2)通过振荡器剧烈震荡，用玻璃棒将菌丝体样品研碎，细度达80。

(3)加入0.4mL CTAB提取液液匀浆，再加2-ME至终浓度为2％(w/v)，振荡混匀。

(4)65℃温育60min，再加入0.5mL氯仿，混匀6min。

(5)9300g离心6min，上层水相移到一个新离心管中。

(6)加入1.0倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置40min。

(7)12000g离心15min，弃去上清。

(8)70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，12000g离心5min，再用无水乙醇洗涤一次。

(9)弃去上清，真空干燥10min。

(10)沉淀溶于60μL TE缓冲液(pH 8.0)中，-20℃保存备用。

第二步，以提取的总RNA为模板，用设计的第一对和第二对引物分别对RNA进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系包括：

酶混合试剂                                2μL

Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)                    5μL

病毒部分基因组上游引物(F1、F2或F3)        1μL

病毒部分基因组下游引物(R1、R2或R3)        1μL

香菇病毒模板核酸                          3μL

100μmol/L dNTPs                          4μL

无RNA酶去离子水                           加至50μL

进行RT-PCR的反应条件是，首先46℃反转录50min，然后94℃变性3min；以94℃ 30sec，55℃ 1min，72℃ 1min为一个循环，共进行32个循环；最后72℃延伸12min。

反应中使用的反转录酶为M-MLV反转录酶，DNA聚合酶使用Pfu酶，酶混合试剂中两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶0.8。

第三步，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，对检测结果进行判定。

使用第一和第二对引物分别对9个样品和2个对照进行RT-PCR，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳1小时，溴化乙啶处理后在紫外灯下显示，两对引物对808、931和F103样品的RT-PCR产物都出现分子大小约400bp和600bp的两个条带，对WH61、WH65、WH68、WH80、WH93、WH96、WH97和WH99株样品的RT-PCR产物不出现条带。对WH81株样品出现两个特异条带。

检测结论：武汉新培育的菌种WH61、WH65、WH68、WH80、WH93、WH96、WH97和WH99株中不含病毒，是无病毒菌种。菌种WH81株中有病毒污染，不可使用。

香菇病毒检测方法中所用的离心管和其它器皿器具均预先用0.1％DEPC处理。

实施例5：

一种香菇菌病毒检测试剂盒由以下成分组成，分别是：

①、食用真菌病毒RNA提取试剂，包括液氮、CTAB提取液、2-ME、氯仿、异戊醇、0.1％(w/v)DEPC、无水乙醇、70％(v/v)乙醇、TE缓冲液(pH 8.0)。

其中，CTAB提取液的配方为：2％(w/v)CTAB，2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，100mM Tris-HCl(pH 8.0，DEPC处理的水配置)，25mM EDTA，0.5g/L Spermidine(亚精胺)，2.0M NaCl，2％(v/v)巯基乙醇(使用前加入)。

②、RT-PCR检测试剂，包括100μmol/L dNTPs、Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)、从香菇样品中提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和三对RT-PCR特异性引物。

其中，酶混合试剂包含M-MLV反转录酶、DNA聚合酶Taq酶，两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1.0∶1.2。

三对RT-PCR的特异性引物分别为：

第一对引物为：LEV F1：5′-ACAAAAAGCAAAAGCCGAGAGC-3′，

              LEV R1：5′-ATTGCGAAGAAGCCCGTAAGAT-3′；

第二对引物为：LEV F2：5’-TCTTACGGGCTTCTTCGC-3’

              LEV R2：5’-TGATTCGGGAGAGGGACT-3’；

第三对引物为：LEV F3：5′-CTAAGGCAAAGTCCAGGCACA-3′，

              LEV R3：5′-TGCGTTGGGAGCTCTTCCGATAAC-3′。

③对照样品包括阳性对照样品WL株香菇菌丝体，阴性对照为JL-0株香菇菌丝。试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。

一种香菇菌病毒检测试剂盒的检测方法包括三个步骤，分别是：

第一步，从待测样品香菇子实体中提取总RNA。待测香菇样品7个，分别是从湖北采集的香菇子实体样品HF01、HF05、HF07、HF31、HF52及浙江采集的香菇子实体样品ZM21、ZL32。阳性对照样品为WL株菌丝体，阴性对照样品为JL-0株菌丝体。提取方法是：

(1)待测样品0.10克，放置于1.5mL离心管中，液氮冰冻。

(2)通过振荡器剧烈震荡，用玻璃棒将子实体样品研碎，细度达50目。

(3)加入0.7mL CTAB提取液液匀浆，再加2-ME至终浓度为2％(w/v)，振荡混匀。

(4)65℃温育30min，再加入0.6mL氯仿，混匀10min。

(5)9500g离心5min，上层水相移到一个新离心管中。

(6)加入1.1倍体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置30min。

(7)10000g离心10min，弃去上清。

(8)70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，9500g离心8min，再用无水乙醇洗涤一次。

(9)弃去上清，真空干燥10min。

(10)沉淀溶于45μL TE缓冲液(pH 8.0)中，-20℃保存备用。

第二步，以提取的总RNA为模板，用设计的第一对和第二对引物分别对RNA进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系包括：

酶混合试剂                                2μL

Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)                    5μL

病毒部分基因组上游引物(F1、F2或F3)        1μL

病毒部分基因组下游引物(R1、R2或R3)        1μL

香菇病毒模板核酸                          2μL

100μmol/L dNTPs                          4μL

无RNA酶去离子水                           加至50μL

进行RT-PCR的反应条件是，首先48℃反转录45min，然后94℃变性3min；以94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min为一个循环，共进行33个循环；最后72℃延伸10min。

反应中使用的反转录酶为M-MLV反转录酶，DNA聚合酶使用Taq酶，酶混合试剂中两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶1.2。

第三步，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，对检测结果进行判定。

使用第一和第二对引物分别对7个样品和2个对照进行RT-PCR，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳1小时，溴化乙啶处理后在紫外灯下显示，两对引物对湖北采集的香菇子实体样品HF01、HF52及浙江采集的香菇子实体样品ZL32样品都不出现特异条带。而对湖北采集的香菇子实体样品HF05、HF07、HF31和浙江采集的香菇子实体样品ZM21都出现两个特异条带。

检测结论：湖北香菇子实体样品HF05、HF07、HF31和浙江香菇子实体样品ZM21中含有香菇病毒。

结果验证：从香菇子实体样品HF01、HF05、HF07、HF31、HF52、ZM21、ZL32中取组织在培养平板上培养菌丝体，分别取样处理在电镜下观察，发现HF05、HF07、HF31和ZM21样品中都出现病毒颗粒，而HF01、HF52及ZL32样品中没有类似的病毒颗粒存在，证明我们的检测结果准确可靠。

香菇病毒检测方法中所用的离心管和其它器皿器具均预先用0.1％DEPC处理。

Claims (2)

1.一种香菇菌病毒检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒它包括①、食用真菌病毒RNA提取试剂，包括液氮、十六烷基三甲基溴化铵提取液、2-硫醇基苯并噻唑、氯仿、异戊醇、0.1％w/v焦碳酸二乙酯、无水乙醇、70％v/v乙醇、三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液pH 8.0；

其中，十六烷基三甲基溴化铵提取液的配方为：2％w/v十六烷基三甲基溴化铵，2％w/v聚乙烯吡咯烷酮，100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 8.0，焦碳酸二乙酯处理的水配置，25mM乙二胺四乙酸，0.5g/L亚精胺，2.0M氯化钠，2％v/v巯基乙醇；

②、RT-PCR检测试剂为：100μmol/L四种三磷酸核苷混合液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 8.8、从香菇样品中提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和三对RT-PCR特异性引物；

其中，酶混合试剂包含莫洛尼鼠类白血病毒反转录酶和DNA聚合酶Taq酶或高保真DNA聚合酶Pfu，两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶0.5-2；

三对RT-PCR的特异性引物分别为：

第一对引物为：LEV F1：5′-ACAAAAAGCAAAAGCCGAGAGC-3′，

LEV R1：5′-ATTGCGAAGAAGCCCGTAAGAT-3′；

第二对引物为：LEV F2：5’-TCTTACGGGCTTCTTCGC-3’

LEV R2：5’-TGATTCGGGAGAGGGACT-3’；

第三对引物为：LEV F3：5′-CTAAGGCAAAGTCCAGGCACA-3′，

LEV R3：5′-TGCGTTGGGAGCTCTTCCGATAAC-3′；

③对照样品包括阳性对照样品和阴性对照样品，阳性对照样品是武香异常株WL香菇菌丝体，试验确定含有香菇病毒颗粒和病毒核酸，阴性对照为浙江正常株JL-0香菇菌丝，试验确定不含病毒颗粒和病毒核酸序列，试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。

2.权利要求1所述的一种香菇菌病毒检测试剂盒的检测方法，其步骤是：

第一步，从待测样品香菇菌丝体或子实体中提取总RNA，提取方法是：

(1)、待测样品0.1-0.2克，放置于1.5mL离心管中，液氮冰冻；

(2)通过振荡器剧烈震荡，用玻璃棒将菌丝体或子实体样品研碎，细度达50-80目；

(3)、加入0.4-0.6mL十六烷基三甲基溴化铵提取液匀浆，再加入2-硫醇基苯并噻唑至终浓度为2％w/v，振荡混匀；

(4)、45-65℃温育30-60min，再加入0.4-0.8mL氯仿，混匀5-10min；

(5)、8000-15000g离心5-10min，上层水相移到一个新离心管中；

(6)、加入0.5-1.5倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30-60min；

(7)、8000-15000g离心10-20min，弃去上清；

(8)、70％v/v乙醇洗涤沉淀，8000-15000g离心2-5min，再用无水乙醇洗涤；

(9)、弃去上清，真空干燥5-15min；

(10)、沉淀溶于30-100μL三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液pH 8.0中，-20℃保存备用；

第二步，以提取的总RNA为模板，用设计的第一对和第二对引物分别对RNA进行RT PCR扩增；

RT-PCR反应体系包括：

酶混合试剂                            2μL

三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH8.8      5μL

病毒部分基因组上游引物F1、F2或F3      1μL

病毒部分基因组下游引物R1、R2或R3      1μL

香菇病毒模板核酸                      1-4μL

100μmol/L四种三磷酸脱氧核苷混合液    4μL

无RNA酶去离子水                       加至50μL；

进行RT-PCR的反应条件是，首先42-50℃反转录30-60min，然后94℃变性3min；以94℃ 30sec，50-58℃ 1min，72℃ 1min为一个循环，共进行30-35个循环；最后72℃延伸5-10min；

反应中使用的反转录酶为莫洛尼鼠类白血病毒反转录酶，DNA聚合酶使用Taq酶或高保真DNA聚合酶Pfu，酶混合试剂中两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶0.5-2；

第三步，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，判断样品：

两条扩增条带的分子大小为400bp和600bp，则待测样品为阳性；两对引物都没有扩增产物，则待测样品为无病毒样品；两对引物PCR检测结果只有一对引物的结果呈阳性，则将这对引物换为第三对引物，与第一次检测时呈阴性的引物分别对待测样品进行第二次RT-PCR，反应条件与第一次RT-PCR的条件相同；第二次PCR结果只要任何一对引物的结果呈阳性，都判断待测样品有病毒污染。