CN114438264A - 一种秀珍菇rna病毒检测引物组及检测方法 - Google Patents

一种秀珍菇rna病毒检测引物组及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种秀珍菇RNA病毒检测引物组及检测方法，属于生物技术领域。所述检测引物组选自引物组Plp_vir1或引物组Plp_vir2，引物组Plp_vir1序列如SEQ ID NO.1~2所示，引物组Plp_vir2序列如SEQ ID NO.3~4所示。所述检测方法为提取待测秀珍菇样品的总RNA，反转录成cDNA，然后以反转录的cDNA为模板，以引物组Plp_vir1或引物组Plp_vir2进行RT‑PCR扩增，凝胶电泳检测扩增产物，并对电泳结果进行判断，确定待测秀珍菇样品是否携带RNA病毒。本发明结果判定简单，操作便捷，成本低，具广泛应用前景。

Description

一种秀珍菇RNA病毒检测引物组及检测方法
技术领域
本发明涉及一种秀珍菇RNA病毒检测方法，具体涉及一种秀珍菇RNA病毒的检测引物组及检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
秀珍菇Pleurotus pulmonarius是20世纪90年代由中国台湾等地发现将凤尾菇的采收时间适当提前，其风味异常鲜美，并经过品种选育和栽培工艺的改进而开发的新品种，1998年林俊仁先生从中国台湾引进，在福建省罗源县试种成功后，逐渐向全国推广。秀珍菇是高温型的菌类，并且其子实体朵形优美，口感俱佳，不仅营养价值高，还有较高的药用价值，深受人们的喜爱，在全国有很好的种植基础，特别是近年来其菇价一直较高，多地已掀起了种植秀珍菇的热潮。
然而高温季节出菇也容易受到病虫害等的侵染，给生产带来严重的威胁。其中病毒的入侵将给秀珍菇生产带来无法预测的影响：由于形态微小，肉眼看不到，同时其可以潜伏在菌丝中，只有在子实体出现畸形后才被发现，此时对产量和质量已造成不可挽回的损失。此外，病毒还可以通过垂直传播给下一代，影响菌种质量。感染病毒的秀珍菇，将使幼小子实体发黄，并产生畸形（图1），严重的使子实体发黄、萎蔫而绝收（图2）。因此，如何在早期鉴别菌丝体是否感染了病毒至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种秀珍菇RNA病毒的检测引物组和检测方法。通过设计秀珍菇RNA病毒基因的特异引物，建立秀珍菇RNA病毒的分子检测方法，为方便、快速、有效地检测秀珍菇菌种及子实体是否携带病毒提供技术支撑。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先提供了一种秀珍菇RNA病毒的检测引物组，所述检测引物组选自以下引物Plp_vir1或引物Plp_vir1：
引物组Plp_vir1：
正向引物序列：5'-TTTCCGATCAGGCCAATGAG-3'，
反向引物序列：5'-CCGCAGTTCCAGCCAAATAG-3'；
引物组Plp_vir2：
正向引物序列：5’-CCAACGCTTTGTCCGCATTC-3’，
反向引物序列：5’-ATGACGCCATATCCAAGTCC-3’。
其次，本发明还提供了一种秀珍菇RNA病毒的检测方法，首先提取待测秀珍菇样品的总RNA，通过反转录成cDNA，以反转录的cDNA为模板，再以上述的检测引物组作为引物进行RT-PCR扩增，凝胶电泳检测扩增产物，并对电泳结果进行判断，确定待测秀珍菇样品是否携带RNA病毒。
进一步的，上述一种秀珍菇RNA病毒的检测方法具体包括以下步骤：
（1）提取待测秀珍菇样品的总RNA；
（2）将步骤（1）提取的秀珍菇总RNA反转录成cDNA；
（3）以步骤（2）所得cDNA为模板，建立秀珍菇RNA病毒的RT-PCR检测；
PCR扩增体系总体积25μl：cDNA模板1.5～3μl，Premix Taq 12.5μl，10μmol/L正向引物1μl，10 μmol/L反向引物1μl，ddH2O 7.5～9μl ；
PCR反应条件：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，56℃退火30 sec，72 ℃延伸45sec, 30～35个循环；72 ℃延伸10 min；
（4）根据凝胶电泳检测的DNA图谱，若用引物组Plp_vir1扩增出563 bp的特异DNA条带，或用引物组Plp_vir2扩增出521 bp的特异DNA条带，则表示待测秀珍菇样品携带RNA病毒，若采用引物组Plp_vir1和引物组Plp_vir2均未扩增出特异DNA条带，则表示待测秀珍菇样品不携带RNA病毒。
本发明的有益效果在于：
本发明所提供的秀珍菇RNA病毒检测方法，与电镜检测病毒、dsRNA检测病毒和酶联免疫吸附法病毒等方法相比，具有灵敏度高、检测时间短、检测结果可靠、容易判断、重复性好的优点，具体如下：
1、电镜检测病毒，此法最经典、最有效、最可靠等优点，但存在病毒粒子分离难、需要昂贵设备等不利于在普通实验室的快速检测。
2、dsRNA检测技术，该方法是基于病毒为双链RNA建立的检测技术，首先需要提取dsRNA，然后再用双酶切进行检测，该方法具有成本低、快速、准确等优点，一度成为真菌病毒检测的常用方法，但该方法易受到提取过程试剂残留的干扰，以及酶切条带比较模糊等缺点，不利于直观快速判断。
3、酶联免疫吸附法检测病毒，虽然该方法具有灵敏度较高、特异性较好等优点，但当提取的病毒浓度较低时，特异性等就比较差，应用时存在一定的局限性。
4、还有生物芯片等技术检测病毒，但生物芯片法存在检测成本较高、操作较复杂等不利因素。
5、本发明所提供的以秀珍菇RNA病毒基因组建立的RT-PCR检测方法，检测时间较短、灵敏度高、检测结果可靠、容易判断、重复性好等优点。基因是遗传的物质基础，不易受外界因素等的影响，同时得到的检测图谱具有特异性条带：563 bp 或521bp，其显性标记判断一目了然。
本发明可检测秀珍菇的菌种和子实体是否携带RNA病毒，菌种是生产的基础，菌种质量的好坏关系到种植的成败，本发明对秀珍菇菌种RNA病毒的检测，可避免在生产和科研上使用带RNA病毒的菌种，保证用种安全；对秀珍菇子实体RNA病毒的检测，可判断菌种或是间接判断环境中是否存在能感染秀珍菇的RNA病毒；此外，本发明对秀珍菇菌种脱毒技术的建立、秀珍菇无病毒品种培育等方面有较大的应用价值。
附图说明
图1为秀珍菇幼小子实体感染病毒，表现出子实体发黄、部分畸形，同时菌丝活力较弱，出现霉菌感染。
图2为秀珍菇成熟子实体感染病毒，较多子实体出现发黄、子实体较软，影响品质和商品外观。
图3为秀珍菇子实体RNA病毒检测，泳道1～4采用的引物组为Plp_vir1，标记片段大小为563 bp，表示含有RNA病毒，其中泳道1和2是‘金秀’子实体样品，泳道3和4是‘秀57’子实体样品；泳道5～8采用的引物组为Plp_vir2，标记片段大小为521 bp，表示含有RNA病毒，其中泳道5和6是‘金秀’子实体样品，泳道7和8是‘秀57’子实体样品；M表示分量为DL1000的DNA MARK，CK为空白对照。
图4为秀珍菇菌丝RNA病毒检测，泳道9和11采用的引物组为Plp_vir1，标记片段大小为563 bp，表示含有RNA病毒；泳道10和12采用的引物组为Plp_vir2，标记片段大小为521bp，表示含有RNA病毒；泳道9和10为‘金秀’的菌丝样品，泳道11和12是‘秀57’的菌丝样品，M表示分量为DL 2000的DNA MARK。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1：秀珍菇RNA病毒分子检测引物的设计
切取感染RNA病毒的秀珍菇子实体0.1～0.2g，应用RNA提取试剂盒（OMEGA的试剂盒，产品号：Plant RNA Kit R6827）提取总RNA，具体操作步骤依据产品说明书；提取的RNA经浓度和完整性检测后放-80℃保存备用，之后送北京诺禾致源科技股份有限公司进行二代测序，测序数据量为3～4G的干净数据（clean data），对这些基因组数据进行生物信息分析，从clean data中提取病毒相关的数据，并进行初步组装，对组装的序列应用Primer5或其它引物设计软件设计RNA病毒特异的引物，得到秀珍菇RNA病毒的检测引物组，该检测引物组的特点是对秀珍菇RNA病毒基因有特异扩增位点，得到的片段大小为563 bp 或521bp，而对秀珍菇的RNA无扩增效果。所设计的秀珍菇RNA病毒的检测引物组选自以下引物组Plp_vir1或引物组Plp_vir2：
引物组Plp_vir1：
正向引物序列：5'-TTTCCGATCAGGCCAATGAG-3'，
反向引物序列：5'-CCGCAGTTCCAGCCAAATAG-3'；
引物组Plp_vir2：
正向引物序列：5’-CCAACGCTTTGTCCGCATTC-3’，
反向引物序列：5’-ATGACGCCATATCCAAGTCC-3’。
实施例2：秀珍菇子实体RNA病毒分子检测
（1）秀珍菇子实体总RNA提取
秀珍菇厂提供的‘金秀’和‘秀57’两个品种子实体，取子实体0.08～0.15g，应用OMEGA的RNA提取试剂盒（产品号：Plant RNA Kit R6827）提取总RNA，具体操作步骤依据产品说明书。提取的RNA放-80℃保存备用或直接进行反转录，若放-80℃不超过7d。
（2）RNA的反转录
提取的RNA应用反转录试剂盒（可用北京全氏金生物公司的反转录试剂盒，产品号：AT311，或湖南艾科瑞生物工程有限公司的反转录试剂盒，产品号：AG11603）反转录成cDNA，具体操作步骤依据产品说明书。转录好的cDNA放-20℃保存备用或直接进行PCR检测。
（3）秀珍菇子实体RNA病毒特异性分子检测
PCR扩增反应体系：cDNA模板2μl，12.5μl Premix Taq（含染料），10μmol/L正向引物1μl，10μmol/L反向引物1μl，ddH2O 8.5 μl；
PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，56℃退火30sec，72℃延伸45 sec, 35个循环；72℃延伸10 min。
（4）PCR产物的电泳检测
取PCR产物5μl，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，同时使用DL 2000的DNA MARK作为片段大小的参照，于0.5×TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳30~40 min，电泳结束后，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图3所示，泳道1～4采用的引物组为Plp_vir1，标记片段大小为563 bp，其中泳道1和2是‘金秀’子实体样品，泳道3和4是‘秀57’子实体样品，表示携带有RNA病毒；泳道5～8采用的引物组为Plp_vir2，标记片段大小为521 bp，其中泳道5和6是‘金秀’子实体样品，泳道7和8是‘秀57’子实体样品，表示携带有RNA病毒；M表示分量为DL 1000的DNA MARK，CK为空白对照。
实施例3：秀珍菇菌丝体RNA病毒分子检测
（1）秀珍菇菌丝培养和收集
秀珍菇厂提供的‘金秀’和‘秀57’两个品种的菌种，将菌种转接至含PDA培养基的直径90 mm的平皿中，25℃恒温培养至菌落长至平皿面积的3/4～4/5，收集菌丝，以1皿为1份，保存于液氮备用或直接用于提取RNA。
（2）秀珍菇菌丝总RNA提取
应用OMEGA的RNA提取试剂盒（产品号：Plant RNA Kit R6827）提取总RNA，具体操作步骤依据产品说明书。提取的RNA放-80℃保存备用或直接进行反转录，若放-80℃不超过7d。
（3）RNA的反转录
提取的RNA应用反转录试剂盒（可用北京全氏金生物公司的反转录试剂盒，产品号：AT311，或湖南艾科瑞生物工程有限公司的反转录试剂盒，产品号：AG11603）反转录成cDNA，具体操作步骤依据产品说明书。转录好的cDNA放-20℃保存备用或直接进行PCR检测。
（4）秀珍菇菌丝RNA病毒特异性分子检测
PCR扩增反应体系：cDNA模板2μL，Premix Taq（含染料）12.5μl，10μmol/L正向引物1μl，10μmol/L反向引物1 μl，ddH2O 8.5μl；
PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，56℃退火30sec，72℃延伸50 sec, 35个循环;72℃延伸10 min。
（5）PCR产物的电泳检测
取PCR产物5μl，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，同时使用DL 2000的DNA MARK作为片段大小的参照，于0.5×TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳30~40 min，电泳结束后，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图4所示，泳道9和11采用的引物组为Plp_vir1，标记片段大小为563 bp；泳道10和12采用的引物组为Plp_vir2，标记片段大小为521 bp；泳道9和10为‘金秀’的菌丝样品，结果显示携带有RNA病毒，泳道11和12是‘秀57’的菌丝样品，结果显示携带有RNA病毒，M表示分量为DL 2000的DNA MARK。
本发明所使用的主要培养基、试剂和仪器如下：
PDA固体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然，121℃灭菌30min。
RNA提取试剂盒。
RNA反转录试剂盒。
0.5×TBE：44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3、1 mmol/L EDTA。
Premix Taq (Ex Taq Version 2.0)带染料的和PCR扩增试剂，均购自大连宝生物公司。
本发明所使用的主要主要仪器如下：
SW-CJ-1FB型单人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司。
灭菌锅：上海三申。
SPX-B-Z系列恒温培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。
冷冻离心机：Sigma 3K30。
PCR仪：Eppendorf AG22331 Hamburg。
掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机。
凝胶成像系统：TANON-2008。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种秀珍菇RNA病毒检测引物组及检测方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttccgatca ggccaatgag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgcagttcc agccaaatag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccaacgcttt gtccgcattc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgacgccat atccaagtcc 20

Claims (3)

1.一种秀珍菇RNA病毒的检测引物组，其特征在于：所述检测引物组选自以下引物组Plp_vir1或引物组Plp_vir2：
引物组Plp_vir1：
正向引物序列：5'-TTTCCGATCAGGCCAATGAG-3'，
反向引物序列：5'-CCGCAGTTCCAGCCAAATAG-3'；
引物组Plp_vir2：
正向引物序列：5’-CCAACGCTTTGTCCGCATTC-3’，
反向引物序列：5’-ATGACGCCATATCCAAGTCC-3’。
2.一种秀珍菇RNA病毒的检测方法，其特征在于：首先提取待测秀珍菇样品的总RNA，通过反转录成cDNA，然后以反转录的cDNA为模板，以权利要求1所述的检测引物组作为引物进行RT-PCR扩增，凝胶电泳检测扩增产物，并对电泳结果进行判断，确定待测秀珍菇样品是否携带RNA病毒。
3.根据权利要求2所述的秀珍菇RNA病毒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）提取待测秀珍菇样品的总RNA；
（2）将步骤（1）提取的秀珍菇总RNA反转录成cDNA；
（3）以步骤（2）所得cDNA为模板，建立秀珍菇RNA病毒的RT-PCR检测；
PCR扩增体系总体积25μl：cDNA模板1.5～3μl，Premix Taq 12.5μl ，10 μmol/L正向引物1μl，10 μmol/L反向引物1μl，ddH2O 7.5～9μl；
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，56℃退火30sec，72 ℃延伸45sec, 30～35个循环；72 ℃延伸10min；
根据凝胶电泳检测的DNA图谱，若用引物组Plp_vir1扩增出563 bp的特异DNA条带，或用引物组Plp_vir2扩增出521 bp的特异DNA条带，则表示待测秀珍菇样品携带RNA病毒，若采用引物组Plp_vir1和引物组Plp_vir2均未扩增出特异DNA条带，则表示待测秀珍菇样品不携带RNA病毒。
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柯斌榕;卢政辉;吴小平;陈发川;兰清秀;: "秀珍菇退化菌株生物学特征比较及dsRNA病毒检测", 南方农业学报, no. 01, pages 98 - 103 *

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