CN105177166A - 猪胞内劳森氏菌的lamp与pcr非诊断检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉一种猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法，本发明通过在线软件，根据引物设计原理，针对胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列设计了PCR和LAMP特异性引物，在进行反应条件优化后成功建立了胞内劳森氏菌的PCR和LAMP检测方法。通过对灵敏度试验、临床样本检测试验和复核检测试验进行对比，结果表明，建立的LAMP方法灵敏度可达1.39x101copies/μl，而建立的PCR检测方法灵敏度仅为1.39x104copies/μl，特异性和重复性检测结果表明，该两种方法均具有良好的特异性和较高的重复性，表明建立的PCR方法和LAMP方法简便、快速、准确，可以用于猪胞内劳森氏菌的临床检测。

Description

猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法。
背景技术
猪增生性肠炎(Porcineproliferativeenteropathy,PPE)是由于猪感染胞内劳森氏菌引起的一种急性传染性肠道出血性的消耗性疾病，在1931年Bieste和Sohwarce首次报道了该病，1974年Rowland等证实了该病，是当今世界上流行最广的猪病之一。虽然，感染PPE引起的死亡率不高，但由于其主要发病为慢性，使得患病猪的生长缓慢，平均日增重和饲料利用率明显下降，且淘汰率上升，给猪场造成了严重的经济损失。猪增生性肠炎是近年来世界各国养猪的常见病，在养猪业发达的国家和地区，由于饲料中禁用或限用抗生素，导致PPE发病率逐年上升。在我国，临床PPE疑似病例有逐渐增多的趋势，但我国对此病的研究还处于起步阶段，缺乏对该病的整体掌握。
虽然我国早已证实本病的存在，但我国对该病仍未有足够的认识，关于该病的研究仍然比较薄弱，处于起始阶段。随着我国养猪业的养殖方式及规模的变化，该病对养猪业的危害日趋严重，亟需对该病给与高度的重视，因此建立一种适用于基层、野外的快速、方便、准确的检测方法显得尤为重要。
目前，对猪增生性肠炎的诊断方法主要有用适宜的细胞系，如IEC-18大鼠肠细胞或IPEC-12猪肠细胞来分离病原菌，或是利用PCR、组织病理学诊断及ELISA等技术对病猪血清和粪便进行诊断。其中PCR是目前最常用的猪增生性肠炎活体诊断方法，它具有灵敏度高、特异性好的特点，但是它所需的费用及对操作人员的技术、实验仪器设备的要求较高。Elanco公司的FIRST试剂盒虽然能够快速、精准的检测粪便中胞内劳森氏菌的存在，但是其成本昂贵，且未在中国上市。然而，环介导等温扩增(LAMP)作为一种崭新的DNA扩增方法，具有简单、快速、特异性强、需要时间短、设备要求简单的特点，具有替代PCR方法的可能性。本发明就使用LAMP、PCR方法检测PPE的反应体系和反应条件进行探讨，最终建立快速检测PPE的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，设计一种猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法，能够简单有效的检测，用于快速诊断检测猪胞内劳森氏菌的感染，具有简单、快速、特异性强、需要时间短、设备要求简单的特点，能够加快猪胞内劳森氏菌的检测效率和减低成本，减少猪胞内劳森氏菌在猪养殖过程中造成的损失。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法，该方法通过在线软件，根据引物设计原理，针对胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列设计了PCR和LAMP特异性引物，进行胞内劳森氏菌的LAMP与PCR检测。通过对灵敏度试验、临床样本检测试验和复核检测试验进行对比，结果表明，建立的LAMP方法灵敏度可达1.39x101copies/μl，而建立的PCR检测方法灵敏度仅为1.39x104copies/μl，特异性和重复性检测结果表明，该两种方法均具有良好的特异性和较高的重复性，表明建立的PCR方法和LAMP方法简便、快速、准确，可以用于猪胞内劳森氏菌的临床检测。
本发明中，针对胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列设计和筛选2对LAMP引物，分别是内引物FIP和BIP、外引物F3和B3；FIP由F2和F1c构成，F1c与F1互补；BIP由B2和B1c构成，B1c与B1互补；
特异性扩增引物包括以下引物：
本发明中根据Genbank上已发表的猪胞内劳森氏菌特异性序列(登录号：gb/AM18025.2.1)，设计一对特异性引物扩增一段329bp的目的片段。LAMP技术稳定性的关键因素在于2对特异性引物，根据LAMP引物设计原理，本试验采用PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/e/)在线软件，针对胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列设计和筛选2对LAMP引物。所有引物经BLAST序列分析，由上海生工生物工程股份有限公司合成，按合成说明书进行引物稀释，-20℃保存备用。
优选的，LAMP检测的反应体系为25μl：MgCl2(25mM)4μl，ThermoPolbuffer(10x)2.5μl，甜菜碱(8M)2.5μl，dNTP(10mM)1.5μl，BstDNA聚合酶(8U)1μl，内引物FIP(50μM)、BIP(50μM)各1μl，外引物F3(5μM)、B3(5μM)各0.5μl，质粒DNA模版1μl，加ddH2O补至25μl；反应温度为63℃，反应时间为50min，80℃终止反应10min；将反应产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳后，通过是否产生清晰的条带判断是否含有猪胞内劳森氏菌。
优选的，PCR检测方法中，PCR反应条件为：94℃5min；93℃45s、57℃45s、72℃45s、35个循环；72℃10min终止反应。
本发明的优点和有益效果在于：
猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法，能够简单有效的检测，用于快速诊断检测猪胞内劳森氏菌的感染，具有简单、快速、特异性强、需要时间短、设备要求简单的特点，能够加快猪胞内劳森氏菌的检测效率和减低成本，减少猪胞内劳森氏菌在猪养殖过程中造成的损失。
试验结果表明，本发明建立的LAMP方法灵敏度可达1.39x101copies/μl，而建立的PCR检测方法灵敏度仅为1.39x104copies/μl，特异性和重复性检测结果表明，该两种方法均具有良好的特异性和较高的重复性，表明建立的PCR方法和LAMP方法简便、快速、准确，可以用于猪胞内劳森氏菌的临床检测。
附图说明
图1是本发明实施例中PCR引物验证结果，其中M:DNA相对分子质量标准DL500；1：阳性对照；2：阴性对照。
图2是本发明实施例中LAMP引物验证结果，其中M:DNA相对分子质量标准DL500；1：阳性对照；2：阴性对照。
图3是本发明实施例中LAMP反应温度的优化结果，其中M：DNA相对分子质量标准DL500；1：60℃扩增产物；2：61℃扩增产物；3：62℃扩增产物；4：63℃扩增产物；5：64℃扩增产物；6：65℃扩增产物；7：阴性对照。
图4是本发明实施例中LAMP反应时间的优化结果，其中M：DNA相对分子质量标准DL500；1：反应30分钟扩增产物；2：反应40分钟扩增产物；3：反应50分钟扩增产物；4：反应60分钟扩增产物；5：阴性对照。
图5是本发明实施例中内外引物浓度比例的优化结果，其中M：DNA相对分子质量标准DL500；1：外引物/内引物为1：1；2：外引物/内引物为1：2；3：外引物/内引物为1：4；4：外引物/内引物为1：6；5：外引物/内引物为1：8；6：外引物/内引物为1：10；7：外引物/内引物为1：12；8：外引物/内引物为1：14。
图6是本发明实施例中dNTP浓度的优化结果，其中M：DNA相对分子质量标准DL500；1：dNTP终浓度为0.3mM；2：dNTP终浓度为0.4mM；3：dNTP终浓度为0.5mM；4：dNTP终浓度为0.6mM；5：dNTP终浓度为0.7mM；6：dNTP终浓度为0.8mM。
图7是本发明实施例中Mg2+浓度的优化结果，其中M：DNA相对分子质量标准DL500；1：Mg2+终浓度2mM；2：Mg2+终浓度3mM；3：Mg2+终浓度4mM；4：Mg2+终浓度5mM；5：Mg2+终浓度6mM；6：Mg2+终浓度7mM；7：阴性对照。
图8是本发明实施例中反应中甜菜碱的作用验证结果，其中M：DNA相对分子质量标准DL500；1：反应体系中加入0μl的甜菜碱；2：反应体系中加入0.5μl的甜菜碱；3：反应体系中加入1.5μl的甜菜碱；4：反应体系中加入2.5μl的甜菜碱；5：反应体系中加入3.5μl的甜菜碱；6：反应体系中加入4.5μl的甜菜碱。
图9是本发明实施例中胞内劳森氏菌LAMP检测确立图，其中M：DNA相对分子质量标准DL500；1：LAMP反应产物；2：阴性对照产物。
图10是本发明实施例中胞内劳森氏菌LAMP可视化检测结果：A为浑浊度检测，B为SYBRGreenI荧光染料检测；其中1：LAMP阳性反应产物；2：阴性对照。
图11是本发明实施例中PCR退火温度的优化检测结果；其中M：DNA相对分子质量标准DL500；1：52℃；2：53℃；3：54℃；4：55℃；5：56℃；6：57℃；7：58℃；8：59℃。
图12是本发明实施例中胞内劳森氏菌的灵敏度试验结果，其中A为胞内劳森氏菌LAMP灵敏度试验，B为胞内劳森氏菌PCR灵敏度试验；其中M：DNA相对分子质量标准DL500；1：1.39x106拷贝；2：1.39x105拷贝；3：1.39x104拷贝；4：1.39x103拷贝；5：1.39x102拷贝；6：1.39x101拷贝；7：1.39x100拷贝；8：阴性对照。
图13是本发明实施例中特异性试验结果，其中A为LAMP特异性试验，B为PCR特异性试验；其中M：DNA相对分子质量标准DL500；1：胞内劳森氏菌；2：E.coli；3：Salmonella；4：PEDV；5：PRV；6：阴性对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例
1.1本实施例的实施目的：
针对现在胞内劳森氏菌对猪养殖过程所构成的危害所造成的经济损失，目的在于提供一种简单有效的检测方法，用于快速诊断、检测猪胞内劳森氏菌的感染。
本实施例中含胞内劳森氏菌的组织材料由四川农业大学微生物与免疫学实验室保存。该胞内劳森氏菌的组织材料是采集的胞内劳森氏菌阳性猪回肠粘膜材料。
1.2.1猪胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列扩增：
根据Genbank上已发表的猪胞内劳森氏菌特异性序列(登录号：gb/AM18025.2.1)，设计一对特异性引物扩增一段329bp的目的片段。LAMP技术稳定性的关键因素在于2对特异性引物，根据LAMP引物设计原理，本试验采用PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/e/)在线软件，针对胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列设计和筛选2对LAMP引物，分别是内引物FIP和BIP、外引物F3和B3，FIP由F2和F1c(与F1互补)构成；BIP由B2和B1c(与B1互补)构成。所有引物经BLAST序列分析，由上海生工生物工程股份有限公司合成，按合成说明书进行引物稀释，-20℃保存备用。
表1LAMP引物和PCR引物
Table1PrimerssequencesofcolorimetricLAMPandPCRusedinthisstudy
1.2.2质粒模板的制备
1)阳性模板的制备
将实验室保存的胞内劳森氏菌在冰上复苏，取1ml菌液加入10mlLB溶液中，并置于37℃水浴摇床中过夜。用质粒提取试剂盒(plasmidkit)提取质粒，-20℃保存备用。同时，送出一管抽提的质粒，测序，登录GenBank比对序列。
2)质粒浓度的测定
利用核酸蛋白仪测定已制备的胞内劳森氏菌质粒的OD260值，根据公式换算出质粒的拷贝数，计算公式如下：
Copies/μl＝(6.02x1023)x(ng/μlx10-9)/DNAlengthx660
(Length19T载体＝2692)
利用核算蛋白粉洗衣测定已经制备的胞内劳森氏菌质粒的OD260值，根据公示换算出质粒模版浓度为1.39x1010copies/μl。
3)临床粪便样本DNA的制备
以收集的胞内劳森氏菌疑似样品采用GuSCN-diatomaceousearth抽提DNA[57]。用灭菌棉拭子取粪便0.2～0.3g于1.5ml的EP管中，加入1mlLysisBuffer，涡旋混匀，室温下作用1h，每隔15min涡旋混匀一次，12000r/min离心4min；取上清，加入100μlDE悬液，涡旋振荡，静置吸附5min，离心，弃上清，加入200μlwashBuffer，涡旋振荡，离心，弃上清，重复一遍。沉淀以500μl75％酒精洗涤两遍。预冷丙酮洗涤一遍。56℃烘干，加入PCRBuffer水浴，洗脱DNA，离心，取上清作为反应模版。
4)引物的验证
以1)中制备的胞内劳森氏菌质粒为模版，试验反应条件参照Notomi建立的LAMP方法，以及在已经发表的关于LAMP检测方法建立的基础上，对本实验设计的引物进行初步验证，反应条件在中制备的胞内劳森氏菌质粒为模版，试验反应条件参照Notomi建立的LAMP方法，以及在已经发表的关于LAMP检测方法建立的基础上，对本实验设计的引物进行初步验证，反应条件在优化前的体系(25μl体系)如下：2.5μlThermoPolbuffer(10x)，2μl甜菜碱(10M)，1μldNTPs(10M)，3μlMgCl2(25mM)，外引物F3、B3(5μM)各1μl，内引物FIP、BIP(50μM)各1μl，1μl质粒模版，1μlBstDNA聚合酶(8U)，加ddH2O补至25μl，反应温度为63℃，反应时间为1h，反应完成后取5μlLAMP产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察结果(图1)。
以1)中制备的胞内劳森氏菌质粒为模版，对本实验设计的引物进行初步验证，反应条件在优化前的体系(25μl体系)如下：12.5μlmix，9.5μlddH2O，1μlP1,1μlP2，1μl质粒模版；反应程序为：94℃预变性5min；93℃循环变性30s，53℃退火复性30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃终延伸5min后，4℃保存。取扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳，观察结果(图2)。
5)PCR产物的克隆和鉴定
经琼脂糖凝胶电泳后，切取目的片段用GelExtractionKit纯化回收，与pMD-19TSimpleVector连接后转化DH5α感受态细胞。在含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上37℃培养12～16h后挑取单个菌落，增菌后用Endo-freePlasmidMiniKit提取质粒，进行PCR分析鉴定，将筛选的阳性重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定，将包含有正确目的基因的阳性质粒保存于-70℃备用。
1.2.3LAMP反应条件的优化
1.2.3.1反应温度的优化
以反应温度为变量设置6组试验，对LAMP反应温度进行优化，温度分别为60℃～65℃进行扩增，并设置一组阴性对照。通过琼脂凝胶电泳结果表明，在60～64℃之间均能发生特异性扩增，说明此区间范围内的温度都能使酶有较好的活性，能够催化反应的进行，对温度具有较大的宽容度，在65℃时无条带，阴性对照组无条带，从结果图片上可判断63℃条带相对较亮，最终选择63℃作为反应的最适温度(图3)。
1.2.3.2反应时间的优化
以反应时间为变量设置4组试验，分别设置扩增时间为30min、40min、50min、60min，并设置一组阴性对照。通过琼脂凝胶电泳结果表明，反应扩增30min时无条带，反应扩增40min效果不太理想，阶梯状条带不清晰，而扩增50min和60min扩增条带明显，两者没有较大的差异(图4)，在保证LAMP反应特异性的基础上，考虑到反应效率，选择50min为最佳反应时间。
1.2.3.3内外引物浓度比例的优化
内引物和外引物的浓度比在LAMP反应中起着关键的作用，与特异性扩增效率直接相关。在探究适宜的内外引物浓度比例的条件优化过程中，设置8组对照试验，反应管中加入外引物与内引物的终浓度比例分别为1：1、1：2、1：4、1：6、1：8、1：10、1：12、1：14，反应在63℃进行50min的扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳结果可以得出(图5)，在各个外引物和内引物浓度比例中均有条带，在外引物与内引物的浓度比例为1：1、1：2、1：4、1：6时扩增的阶梯状条带较为模糊，从外引物与内引物的浓度比例为1：8开始，扩增的阶梯状条带开始清晰，且在1：8和1：10时最优。考虑到引物稀释和加样的方便性，选择外引物与内引物的浓度比例为1：10时为最佳的引物浓度比例。
1.2.3.4dNTP浓度的优化
以dNTP浓度为反应变量，反应体系中分别加入dNTP终浓度为0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM。反应在63℃进行50min后，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果显示(图6)，反应体系中dNTP的终浓度为0.3mM和0.8mM时无条带，在dNTP终浓度为0.4mM和0.7mM时，有扩增条带但较为模糊，在dNTP终浓度为0.5mM和0.6mM时，扩增条带最亮最清晰，为最优。所以选择0.6mM为反应的最佳dNTP浓度。
1.2.3.5镁离子浓度的优化
以镁离子浓度为反应变量，设置6组对照试验和一组阴性对照，反应体系中镁离子的终浓度分别为2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM。63℃条件下反应50min后，通过琼脂糖凝胶电泳来验证其结果。电泳结果表明(图7)，镁离子终浓度为2mM和3mM时，扩增条带不清晰，扩增效率较低；镁离子终浓度为4mM和5mM时，有很好的扩增效果，且差异不大；当镁离子终浓度为6mM和7mM时，扩增效率降低，扩增条带开始逐渐不清晰。有研究表明，当镁离子浓度过高会抑制扩增。因此选择镁离子终浓度为4mM。
1.2.3.6甜菜碱的作用
甜菜碱可以提高LAMP反应的扩增效率，在探究甜菜碱作用的试验中，设置6组对照试验，反应体系中加入甜菜碱(8M)的量分别为0μl、0.5μl、1.5μl、2.5μl、3.5μl、4.5μl。在63℃条件下反应50min后，通过琼脂糖凝胶电泳来验证其结果。电泳结果表明(图8)，在没有加入甜菜碱即甜菜碱加入量为0μl时，没有扩增条件出现，而随着甜菜碱加入量的增加，其扩增条带逐渐出现并越来越理想，其扩增效率得到了大大的提高，但在甜菜碱加入量为4.5μl时，有条带出现但不符合LAMP应有的条带，推测原因是甜菜碱的浓度过高会影响LAMP反应中的扩增。通过试验可知，甜菜碱对建立的胞内劳森氏菌LAMP检测方法具有很强的敏感性。根据结果选取加入2.5μl的甜菜碱(8mM)为最佳反应量。
1.2.4LAMP反应条件的确立
将1.2.2中制备的胞内劳森氏菌质粒DNA作为模版，利用优化后的LAMP反应条件对其进行检测，反应体系为25μl(表2)：MgCl2(25mM)4μl，ThermoPolbuffer(10x)2.5μl，甜菜碱(8M)2.5μl，dNTP(10mM)1.5μl，BstDNA聚合酶(8U)1μl，内引物FIP、BIP(50μM)各1μl，外引物F3、B3(5μM)各0.5μl，质粒DNA模版1μl，加ddH2O补至25μl。最佳反应温度为63℃，最佳反应时间为50min，80℃终止反应10min。将反应产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳后，出现清晰的阶梯状条带，而没有加入胞内劳森氏菌质粒DNA的样本作为阴性对照，没有阶梯状的扩增条带出现(图9)，试验证实了建立的胞内劳森氏菌LAMP检测方法的成功性和可行性。
表2LAMP反应体系
1.2.5胞内劳森氏菌LAMP可视化检测
LAMP反应阶段，随着反应的进行，dNTP析出的焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子结合，形成焦磷酸镁沉淀，一般情况下，生成的白色沉淀与反应液中双链DNA的量成正比，因此LAMP可视化检测，可以通过比较反应管中浑浊度判断是否发生特异性扩增，根据反应结果可以看出，阳性反应管较阴性反应管出现明显的浑浊现象，在自然光下肉眼就能进行判定(图10.A)。加入SYBRGreenⅠ染料后，在紫外灯照下，阳性反应管有绿色荧光出现，而阴性反应管无荧光出现(图10.B)。阴性对照为没有加入胞内劳森氏菌质粒DNA的反应管。
1.2.6PCR反应条件的优化及条件的确立
对PCR反应退火温度进行优化，通过试验结果可知，在52℃～59℃均能扩增出目的条带，结果显示，在56℃～58℃时扩增的条带最亮(图11)。最终选择57℃为反应的最佳退火温度。确定PCR反应条件为：94℃5min；93℃45s、57℃45s、72℃45s、35个循环；72℃10min。
1.2.7灵敏性试验
通过2.2中公式计算出胞内劳森氏菌质粒DNA浓度为1.39x1010copies/μl，将质粒进行10倍梯度稀释作为模版，用已经建立的胞内劳森氏菌LAMP检测方法和PCR方法分别对1.39x106copies/μl至1.39x100copies/μl的DNA模版进行灵敏度测试，对比两种检测方法的敏感性。试验结果表明LAMP检测方法能检测到1.39x101copies/μl的DNA量(图12A)，而PCR的最低检出量只能达到1.39x104copies/μl(图12B)。结果表明所建立的胞内劳森氏菌LAMP检测方法的灵敏度比常规PCR方法高1000倍，证实LAMP方法具有良好的灵敏性。
1.2.8特异性试验
用建立的LAMP方法和PCR方法检测胞内劳森氏菌。同时对已制备保存的E.coli、Salmonella、PEDV、PRV进行检测，以评估此次建立LAMP和PCR方法的特异性。从电泳结果图中可以清晰的看到胞内劳森氏菌LAMP阳性产物(图13A)和PCR阳性产物(图13B)在1.5％琼脂糖凝胶电泳后均出现了条带，而E.coli、Salmonella、PEDV、PRV并无条带出现。证实了此次试验建立的LAMP检测方法和PCR检测方法均具有良好的特异性。
1.2.9稳定性试验
针对胞内劳森氏菌建立的LAMP检测方法和PCR检测方法的稳定性试验，对评估所建立的该方法具有很重要的作用。在进行稳定性试验中，分别对不同批次提取的胞内劳森氏菌质粒DNA进行LAMP和PCR扩增，试验结果表明均能扩增出目的片段，证实了此次试验建立的LAMP检测方法和PCR检测方法均具有良好的稳定性。
1.2.10临床样本检测
用已建立的PCR检测，LAMP检测2种方法进行平行检测114份来自四川10个规模化养猪场采集的疑似PPE发病猪的粪便样本。
在已经完成的114份样品中，60份样品(52.6％)利用PCR检测方法和LAMP检测方法均检出为阳性；13份样品(11.4％)利用LAMP检测方法检出为阳性，而利用PCR检测方法检出为阴性；0份样品(0％)利用PCR检测方法检出为阳性，而利用LAMP检测方法检出为阴性；41份样品(36.0％)利用PCR检测方法和LAMP检测方法均检出为阴性。临床样本检测试验结果表明此次试验建立的LAMP检测方法阳性检出率高于PCR检测方法。
表3利用LAMP检测方法和PCR检测方法检测114份临床样品分析
Table3TheresultsofclinicaltestofLAMPmethodandPCRmethod
1.2.11FISRTtestTM试剂盒检测
应用FISRTtestTM试剂盒对采集的114份粪便样本进行复核检测(表4)，其中79份(69.3％)检出为阳性，35份(30.7％)检出为阴性。从统计结果分析可知，应用试剂盒检出的阳性率高于LAMP检测方法和PCR检测方法，其中LAMP检测方法检测结果和试剂盒检测方法检测结果更符合。在114份粪便样本中，73份样品利用LAMP检测方法和试剂盒检测方法均检出为阳性，6份样品利用试剂盒检出为阳性，而利用LAMP方法检出为阴性；0份样品利用LAMP方法检出为阳性，而利用试剂盒检出为阴性；60份样品利用PCR方法和试剂盒均检出为阳性，19份样品利用试剂盒检出为阳性，而利用PCR方法检出为影响；0份样品利用PCR方法检出为阳性，而利用试剂盒检出为阴性。利用试剂盒复核检测结果表明此次建立的LAMP检测方法阳性检出率高于PCR检测方法。
表4利用FISRTtestTM试剂盒检测114份临床样品分析
Table4TheresultsofclinicaltestofFISRTtestTMmethod
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法，其特征在于，该方法通过在线软件，根据引物设计原理，针对胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列设计了PCR和LAMP特异性引物，进行胞内劳森氏菌的LAMP与PCR检测。
2.如权利要求1所述的猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法，其特征在于，针对胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列设计和筛选2对LAMP引物，分别是内引物FIP和BIP、外引物F3和B3；FIP由F2和F1c构成，F1c与F1互补；BIP由B2和B1c构成，B1c与B1互补；
特异性扩增引物包括以下引物：
3.如权利要求2所述的猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法，其特征在于，LAMP检测的反应体系为25μl：MgCl2(25mM)4μl，ThermoPolbuffer(10x)2.5μl，甜菜碱(8M)2.5μl，dNTP(10mM)1.5μl，BstDNA聚合酶(8U)1μl，内引物FIP(50μM)、BIP(50μM)各1μl，外引物F3(5μM)、B3(5μM)各0.5μl，质粒DNA模版1μl，加ddH2O补至25μl；反应温度为63℃，反应时间为50min，80℃终止反应10min；将反应产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳后，通过是否产生清晰的条带判断是否含有猪胞内劳森氏菌。
4.如权利要求2所述的猪胞内劳森氏菌的LAMP与PCR非诊断检测方法，其特征在于，PCR检测方法中，PCR反应条件为：94℃5min；93℃45s、57℃45s、72℃45s、35个循环；72℃10min终止反应。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107576791A (zh) * 2017-09-13 2018-01-12 河南农业大学 一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒
CN114164285A (zh) * 2021-11-19 2022-03-11 佛山科学技术学院 胞内劳森菌检测方法及其引物组合

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102453762A (zh) * 2010-12-31 2012-05-16 中华人民共和国四川出入境检验检疫局 检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒和方法
CN102839217A (zh) * 2012-09-13 2012-12-26 龙岩学院 胞内劳森氏菌环介导等温扩增检测方法及其试剂盒
CN102994641A (zh) * 2012-12-14 2013-03-27 山东滨州沃华生物工程有限公司 一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102453762A (zh) * 2010-12-31 2012-05-16 中华人民共和国四川出入境检验检疫局 检测猪增生性肠病病原菌胞内劳森菌的试剂盒和方法
CN102839217A (zh) * 2012-09-13 2012-12-26 龙岩学院 胞内劳森氏菌环介导等温扩增检测方法及其试剂盒
CN102994641A (zh) * 2012-12-14 2013-03-27 山东滨州沃华生物工程有限公司 一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. F. JONES等: "Enhanced Detection of Intracellular Organism of Swine Proliferative Enteritis, Ileal Symbiont Intracellularis, in Feces by Polymerase Chain Reaction", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
H. NATHUES等: "Simultaneous Detection of Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli and Lawsonia intracellularis in Porcine Faeces and Tissue Samples by Multiplex-PCR", 《J. VET. MED.》 *
PARK BYUNG-YONG等: "RAPID AND SENSITIVE DETECTION OF LAWSONIA INTRACELLULARIS IN PIGS BY REAL-TIME LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION", 《ACTA VETERINARIA-BEOGRAD》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107576791A (zh) * 2017-09-13 2018-01-12 河南农业大学 一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒
CN114164285A (zh) * 2021-11-19 2022-03-11 佛山科学技术学院 胞内劳森菌检测方法及其引物组合
CN114164285B (zh) * 2021-11-19 2023-09-26 佛山科学技术学院 胞内劳森菌检测方法及其引物组合

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