CN114164285A

CN114164285A - 胞内劳森菌检测方法及其引物组合

Info

Publication number: CN114164285A
Application number: CN202111408480.1A
Authority: CN
Inventors: 张浩吉; 李复坤; 钟梦龙; 王龙; 刘淑扬; 陈祥杰; 支康发
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2041-11-19
Also published as: CN114164285B

Abstract

本发明目的在于提供一种胞内劳森菌检测方法及其引物组合。所述引物组合如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示。所述双交叉扩增引物组合能够应用于胞内劳森菌检测体系中。所述胞内劳森菌检测体系特异性良好，能够排除大肠杆菌、猪链球菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的干扰；灵敏度高，能检测到3.69×10¹copies/μL的DNA量，相较于普通PCR灵敏度高约100倍；稳定可靠，同样批次的样品，普通PCR检出的阳性率为27.3，本检测体系检出阳性率41.9％，与实际情况相符。

Description

胞内劳森菌检测方法及其引物组合

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及胞内劳森菌检测方法及其引物组合。

背景技术

胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)是一种专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，具有耐酸特性，体外有单极鞭毛，借助这种鞭毛可以实现在宿主细胞外的快速移动。该菌对外界环境有较强的抵抗力，可在5-15℃的环境下存活1-2周，低于5℃时可存活达22周。胞内劳森菌导致的增生性肠炎最早被发现于1931年，研究者在猪回肠和结肠中发现了肠上皮细胞退化和腺瘤样增生，以及其中的杯状细胞转变为分化的、不含黏液的细胞现象。但当时并未确定病原，直到1973年，英国爱丁堡皇家(Dick)兽医研究学院的研究人员利用电子显微镜在患病猪的肠上皮细胞中发现了一种不规则弯曲的细菌。随后，有研究者通过荧光标记被感染猪的血清，然后利用这些血清对受感染猪的肠道上皮细胞进行染色，最后在这些上皮细胞的顶端胞浆内发现了一些特定信号，并最终在1989年确定了这种细菌在肠道上皮细胞中增殖。通过分析该菌16S rDNA序列系统发育进程，将其划归为脱硫弧菌科(Desulfovibriona ceae)劳森菌属(Lawsonia)，对其基因型和表型进一步研究后，最终将它命名为胞内劳森菌，是迄今为止劳森菌属的唯一种。世界各地相继报道了关于动物感染胞内劳森菌的病例，且该菌的阳性率较高。在丹麦、德国、西班牙、荷兰和英国等地采集的1791个血清样本经酶联免疫吸附试验(ELISA)测定，阳性率达到31.6％。美国、印度、日本、泰国、朝鲜、中国等国家家畜感染该菌的比例也相当高，由此可见胞内劳森菌导致的增生性肠炎俨然成为一种世界性疾病。2008年，我国广西首次从猪肠道黏膜中分离到了胞内劳森菌，并利用PCR对断奶仔猪和育肥猪进行了一次检测，阳性率分别为14％和16％。2011年，WuZ.X.等对采集自全国14个商业化养猪场的1064份血清进行了胞内劳森菌抗体检测，其中华北地区，来自北京、河北和天津的血清阳性率分别为61％、60％和51％；华中地区的河南、湖北分别为63％、73％；华南地区的广东、广西分别为47％、35％，较2008年有明显上升。澳大利亚统计了该病造成的损失，每年每头受感染动物的平均损失为3-11美元，在欧洲，该病在生长育肥猪中造成的损失达到每头1欧元以上。随着我国生猪养殖规模化程度越来越高，持续升高的感染率给我国养殖业带来的危害也会愈加严重。

针对胞内劳森菌的检测，国内外先后研制出数种方法。总体可分为三大类。一是组织病理学检测，主要用于检测猪肠道的病变、菌体在肠道内的存在情况，如Wathin-Starry银染技术、苏木素-伊红染色(H&E)、Ziehl-Neelsen法等；二是血清学检测，用以检测猪血清中存在的阳性抗体，普遍使用的有免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光抗体试验(IFAT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等；第三类是分子生物学检测，用PCR、RT-PCR、LAMP等检测样品中胞内劳森菌核酸的存在与否。其中组织病理学无需昂贵仪器设备，但操作要求高，而且确诊有一定难度；血清学检测中IFAT和IPMA可用于活体诊断，但常常会有主观判断影响，国外虽有ELISA检测试剂盒，但价格昂贵，不适合临床使用；常规的分子生物学诊断如PCR和RT-PCR具有灵敏度高、特异性好的特点，但其对操作人员的技术和仪器设备的要求较高；LAMP检测普遍存在假阳性问题，检测结果争议性较大。

发明内容

本发明目的在于提供一种胞内劳森菌检测方法及其引物组合，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

本发明的第一目的在于提供一种双交叉扩增引物组合，包括：

交叉引物2a1s：

5'-GTAGACGACTGCCTCGATTG-AGTCTGCAACTCGACTCCAT-3'(SEQ ID NO.1)；

交叉引物1s2a：

5'-AGTCTGCAACTCGACTCCAT-GTAGACGACTGCCTCGATTG-3'(SEQ ID NO.2)；

剥离引物3s：5'-GCATCTCAGTCCGGATTGG-3'(SEQ ID NO.3)；

剥离引物4a：5'-CTTGTTACGACTTCACCCCA-3'(SEQ ID NO.4)。

交叉引物等温扩增技术(CPA)可以根据体系中交叉引物数量的不同，分为单交叉扩增(Single crossing CPA)和双交叉扩增(Double crossing CPA)两种。上述四段引物序列是针对胞内劳森菌的16S rRNA基因序列，基于双交叉扩增设计的。将所述双交叉扩增引物组合应用于CPA检测中，寡聚核苷酸链能依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使DNA的循环扩增能不断实现。

本发明的第二目的在于提供一种胞内劳森菌检测体系，包括如第一目的所述的双交叉扩增引物组合。

进一步，所述检测体系还包括甜菜碱、dNTP mix、缓冲溶液、MgSO₄、DNA聚合酶和水。

优选地，所述DNA聚合酶为Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶。

优选地，所述缓冲溶液为10×ThermoPolbuffer。

上述检测体系能够在60min内完成扩增，后续可利用琼脂糖凝胶电泳法、肉眼观察法或SYBR GreenⅠ染料法分别进行鉴定。由于扩增程温度过恒定，且扩增所需时间较短，即检测门槛较低，便于推广到各种场合进行实地检测。

本发明的第三目的在于提供一种胞内劳森菌检测试剂盒，包括前述的双交叉扩增引物组合或胞内劳森菌检测体系。

进一步，所述试剂盒还包括阳性对照质粒，所述阳性对照质粒含有胞内劳森菌N343基因的675036位至676433位，总长1398bp的片段，可用于对照试剂盒中的检测体系是否正确扩增出标靶序列片段。

所述阳性对照质粒的制备过程包括以下步骤：

1)使用检测引物PF:5'-GATAATCTACCTTCGAGACGG-3'(SEQ ID NO.5)和检测引物PR:5'-CTTGTTACGACTTCACCCCA-3'(SEQ ID NO.6)扩增胞内劳森菌的16S rDNA基因片段，获得上述1398bp的核苷酸片段；

2)将获得的所述核苷酸片段纯化处理后连接到pMD-19T载体上，经过测序鉴定无误，即为所述阳性对照质粒。

本发明包括以下有益效果：

本发明提供的双交叉扩增引物组合能够应用于胞内劳森菌检测体系中。所述胞内劳森菌检测体系特异性良好，能够排除大肠杆菌、猪链球菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的干扰；灵敏度高，能检测到3.69×10¹copies/μL的DNA量，相较于普通PCR灵敏度高约100倍；稳定可靠，同样批次的样品，普通PCR检出的阳性率为27.3，本检测体系检出阳性率41.9％，与实际情况相符。

附图说明

图1是实施例2中CPA反应体系的检测结果图；

图2是实施例2中优化剥离引物与交叉引物组合的电泳图；

图3是实施例2中优化dNTP mix浓度的电泳图；

图4是实施例2中优化镁离子浓度的电泳图；

图5是实施例2中优化Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶的电泳图；

图6是实施例2中优化反应温度的电泳图；

图7是实施例2中优化反应时间的电泳图；

图8是实施例3中验证胞内劳森菌特异性的电泳图；

图9是实施例4中检测所述CPA反应体系灵敏度的电泳图；

图10是实施例4中检测常规PCR反应体系灵敏度的电泳图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、阳性对照质粒的制备

使用检测引物PF和PR扩增胞内劳森菌活疫苗的16S rDNA基因片段，将该纯化产物连接到pMD-19T载体上，经测序鉴定后，形成阳性对照质粒。利用微量荧光分光光度计测定制备的胞内劳森菌质粒浓度，利用SnapGene软件计算出质粒的拷贝数后，将标准重组质粒进行10倍梯度稀释，-20℃保存备用。

实施例2、CPA反应体系的建立及条件优化

以阳性对照质粒为模板，初步的CPA反应体系如表1所示，反应温度初步定为65℃，反应时间为60min。

表1 CPA反应体系

反应完成后，取5μL反应产物，利用琼脂糖凝胶电泳法、肉眼观察法和SYBR GreenⅠ染料法分别进行鉴定的结果如图1所示。图1(a)是胞内劳森菌CPA产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M号泳道为DL1000 marker；N号泳道为阴性对照；P号泳道为阳性对照。P号泳道出现了CPA特有的梯形条带，检测结果为阳性。图1(b)是胞内劳森菌CPA产物肉眼观察判断结果，右侧离心管为阴性对照；左侧离心管为阳性对照。可见右侧离心管中液体澄清，证明无扩增产物；左侧离心管中产生白色沉淀，代表扩增成功，为阳性检测结果的标志。图1(c)是胞内劳森菌CPA产物荧光染料法判断结果；右侧离心管为阴性对照；左侧离心管为阳性对照。在紫外光照射的环境下，左侧离心管呈现荧光是检测结果阳性的标志，右侧离心管无变化为检测结果阴性的标志。

为优化CPA反应体系中各项参数，采用控制变量法，对反应体系中的引物浓度浓度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶浓度、扩增温度和扩增时间进行优化，确定最佳反应体系和条件。经3％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶自动成像分析系统中有梯形条带且最清晰明亮的即可作为最佳反应条件。

(1)剥离引物与交叉引物组合优化。

实验设置6组，每组剥离引物与交叉引物浓度之比分别为0.1μM:1.0μM(1号泳道)、0.2μM:1.2μM(2号泳道)、0.3μM:1.4μM(3号泳道)、0.4μM:1.6μM(4号泳道)、0.5μM:1.8μM(5号泳道)、0.6μM:2.0μM(6号泳道)。结果如图2所示，4号泳道的条带最为清晰明亮，即剥离引物3s/4a浓度为0.4μM，交叉引物2a1s/1s2a浓度为1.6μM时，为本研究建立的CPA最优引物浓度组合。

(2)dNTP mix浓度的优化。

实验设置6组，每组dNTP mix浓度分别为0.6mM(1号泳道)、0.8mM(2号泳道)、1.0mM(3号泳道)、1.2mM(4号泳道)、1.4mM(5号泳道)、1.6mM(6号泳道)。结果如图3所示，3号泳道的条带最为清晰明亮，即dNTP mix浓度为1mM时为本研究建立的CPA最佳反应浓度。

(3)镁离子浓度的优化。

实验设置6组，每组镁离子浓度分别为5mM(1号泳道)、6mM(2号泳道)、7mM(3号泳道)、8mM(4号泳道)、9mM(5号泳道)、10mM(号6泳道)。结果如图4所示，2号泳道的条带最为清晰明亮，即镁离子浓度为6mM时为本研究建立的CPA最佳反应浓度。

(4)Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶的优化。

实验设置6组，每组Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶(8000U/mL)的量分别为2U(1号泳道)、4U(2号泳道)、6U(3号泳道)、8U(4号泳道)、10U(5号泳道)、12U(6号泳道)。结果如图5所示，4号泳道的条带最为清晰明亮，由此断定Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶的添加量为8U时为本研究建立的CPA最佳反应量。

(5)反应温度的优化。

实验设置6组，每组的反应温度分别为61℃(1号泳道)、63℃(2号泳道)、65℃(3号泳道)、67℃(4号泳道)、69℃(5号泳道)、71℃(6号泳道)。结果如图6所示，2号泳道的条带最为清晰明亮，即63℃时为本研究建立的CPA最佳反应温度。

(6)反应时间的优化。

实验设置6组，6个组的反应时间分别为15min(1号泳道)、30min(2号泳道)、45min(3号泳道)、60min(4号泳道)、75min(5号泳道)、90min(6号泳道)。结果如图7所示，4、5、6号泳道的条带相较于其他泳道更为清晰明亮，所以从节省实验时间的角度考虑，选择60min作为本研究建立的CPA最佳反应时间。

实施例3、CPA反应体系特异性分析

选取大肠杆菌、猪痢疾螺旋体、猪链球菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌进行特异性试验，将上述细菌的核酸样品以及实施例1制得的阳性对照质粒分别作为模板，采用优化后的CPA方法进行检测，根据琼脂糖凝胶电泳结果评估本研究建立的胞内劳森菌CPA反应体系的特异性。结果如图8所示，以大肠杆菌(2号泳道)、猪痢疾螺旋体(3号泳道)、猪链球菌(4号泳道)、金黄色葡萄球菌(5号泳道)及沙门氏菌(6号泳道)的核酸样品作为模板进行CPA反应呈阴性，仅以胞内劳森菌重组质粒(1号泳道)为模板进行CPA检测为阳性，表明建立的CPA反应体系特异性良好。

实施例4、CPA反应体系灵敏度分析。

将实施例1制备的已知拷贝数的胞内劳森菌阳性对照质粒，用双蒸水进行10倍的梯度稀释。将稀释后浓度为3.69×10⁶copies/μL-3.69×10⁰copies/μL的质粒作为模板。在排除外界条件干扰的情况下，采用实施例2优化后的CPA反应体系和常规PCR检测体系分别进行灵敏度试验。根据琼脂糖凝胶电泳结果对本研究建立的胞内劳森菌的CPA方法的灵敏度进行评估。检测结果见图9、图10。

图9是CPA反应体系的琼脂糖凝胶电泳图，M号泳道为DL1000 marker；N号泳道为阴性对照；1-7号泳道分别为：3.69×10⁶、3.69×10⁵、3.69×10⁴、3.69×10³、3.69×10²、3.69×10¹、3.69×10⁰copies/μL。图9的6号泳道的条带清晰可见，证明本研究建立的胞内劳森菌检测体系能检测到3.69×10¹copies/μL的DNA量。

图10是常规PCR检测体系的琼脂糖凝胶电泳图，M号泳道为DL1000 marker；N号泳道为阴性对照；1-7号泳道分别为：3.69×10⁶、3.69×10⁵、3.69×10⁴、3.69×10³、3.69×10²、3.69×10¹、3.69×10⁰copies/μL。图10的5、6、7号泳道均未显现条带，证明常规PCR仅能检测到3.69×10³copies/μL的量。

上述对比可以证明本研究建立的CPA比常规PCR灵敏度高约100倍。

实施例5、临床样品的检测。

采用实施例2优化后的CPA反应体系和常规PCR方法对采集自广东多地的267份猪粪便样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见表2：

表2

检测方法	样品量(份)	阳性(份)	阴性(份)	阳性率(％)
					CPA法	267	112	155	41.9
PCR法	267	73	194	27.3

从CPA检出阳性、PCR检出阴性的39份样品中随机选择5份进行克隆转化测序，结果表明全部为胞内劳森菌阳性样本。由此证明本发明所建立的胞内劳森菌检测体系的灵敏度高于常规PCR，更加适用于养猪企业的胞内劳森菌现场检测。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山科学技术学院

<120> 胞内劳森菌检测方法及其引物组合

<130> 2021

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtagacgact gcctcgattg agtctgcaac tcgactccat 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtctgcaac tcgactccat gtagacgact gcctcgattg 40

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcatctcagt ccggattgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttgttacga cttcacccca 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gataatctac cttcgagacg g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttgttacga cttcacccca 20

Claims

1.一种双交叉扩增引物组合，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的四段引物序列。

2.一种胞内劳森菌检测体系，其特征在于，包括如权利要求1所述的双交叉扩增引物组合。

3.根据权利要求2所述的检测体系，其特征在于，还包括甜菜碱、dNTP mix、缓冲溶液、MgSO₄、DNA聚合酶和水。

4.根据权利要求3所述的检测体系，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst 2.0WarmStartDNA聚合酶。

5.根据权利要求3所述的检测体系，其特征在于，所述缓冲溶液为10×ThermoPolbuffer。

6.一种胞内劳森菌检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的双交叉扩增引物组合或如权利要求2至5任一项所述的检测体系。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照质粒，所述阳性对照质粒含有由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物扩增所得的胞内劳森菌的16S rDNA基因片段。