CN113528683A - 一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量pcr引物对、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法，所述引物对包括上游引物和下游引物，其核酸序列如下所示：上游引物：GCTGTGGATTGGGAGAAATC(SEQ ID NO.1)；下游引物：CAAGTTGACCAGCCTCTGC(SEQ ID NO.2)。本发明还建立了一种胞内劳森菌绝对荧光定量PCR检测方法，该方法包括利用所述的引物对，进行荧光定量PCR检测。与传统方法相比，基于核酸特异性序列分子方法的实时荧光定量PCR具有快速、敏感、特异且稳定的优点。本发明可用于临床样品中低含量胞内劳森菌的快速和特异检测，可通过定量方法检测胞内劳森菌含量，从而为了解胞内劳森菌在猪体内的变化规律，以及为猪增生性回肠炎的诊断、流行病学调查及胞内劳森菌致病机制研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于胞内劳森菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法。
背景技术
猪回肠炎，又称猪增生性回肠炎(porcine proliferative enteritis，PPE)，是由胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis，L.intracellularis)感染引起的一种接触性肠道传染病，主要影响猪群生长速度，给养猪业带来严重经济损失，已成为现代养猪业中一种重要的肠道疾病。PPE在欧洲和美国等地发病率可达50％-70％，在韩国、泰国、马来西亚等国家，PPE阳性率达100％，仅美国养猪业一年因PPE造成的损失就不低于2000万美元，英国一年因PPE损失约400万英镑。在欧洲，由于抗生素和添加剂明令禁止使用，使得当地回肠炎的危害性已大大超过了呼吸道疾病。从2005年来，PPE已成为中国华南、华东地区规模化养猪场的一种常见病，检测结果表明，3-4周龄和8-10周龄猪群PPE阳性率一般低于50％，而从18-24周龄PPE阳性率高达50％-70％，后备母猪和经产母猪阳性率分别为60％-80％。由于抗生素的滥用，使得细菌产生耐药性，这将对PPE的防控构成严重威胁。
高效、简便的检测技术是有效防治养殖场传染病的必要条件，一种能够快速、准确、定量的检测样品中胞内劳森菌的检测方法将对该病的诊断及防控带来重大意义。对于PPE的诊断，国际普遍使用的诊断方法主要分为特异性诊断和非特异性诊断两大类。其中，以组织病理学诊断为主的非特异性诊断方法有Warthin-Staixy银染技术、苏木素－伊红染色(H&E)、Ziehl-Neelsen法等；特异性的诊断方法包括血清学、分子生物学和组织学的诊断，包括间接免疫荧光光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化(IHC)、原位杂交(ISH)等技术。目前，中国国内主要是通过常规PCR、多重PCR等分子生物学方法间接地检测样品中LI的核酸。常规的聚合酶链式反应(PCR)通过目的基因的扩增可使用少量的样品得到准确可靠的结果，具有操作简便、设备要求不高、反应迅速且能进行大批量检测的优点，成为了现代养猪业中检测胞内劳森菌的常用方法，，但由于该方法灵敏性低，无法对临床样品中的细菌进行定量等缺点，从而无法真实反应猪群的感染情况，鉴于此，建立一种准确、可靠、可定量的检测临床样品中胞内劳森菌的检测方法对于PPE的有效防控具有重要意义。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法，为PPE的诊断、流行病学调查及胞内劳森菌的定量检测等工作奠定基础。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下所示：
上游引物：GCTGTGGATTGGGAGAAATC(SEQ ID NO.1)；
下游引物：CAAGTTGACCAGCCTCTGC(SEQ ID NO.2)。
所述绝对荧光定量PCR引物对是根据猪源胞内劳森菌aspA基因序列，通过引物设计软件设计，并进行验证获得。
一种用于检测胞内劳森菌的试剂盒，所述试剂盒包含所述的引物对。
一种检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，包括利用所述的引物对，进行荧光定量PCR检测。
优选的，所述绝对荧光定量PCR方法包括以下步骤：
(1)提取胞内劳森菌感染猪回肠样品中的基因组DNA；
(2)利用权利要求1所述的引物对，PCR扩增aspA基因；
(3)利用步骤(2)扩增所得目的基因片段，构建重组阳性质粒aspA-pMD18-T/DH5α；
(4)以构建的aspA-pMD19-T/DH5α重组质粒作为阳性标准品，进行qPCR反应，制备标准曲线；
(5)提取待测样品基因组DNA，随后以其为模板进行qPCR反应，反应体系同步骤(4)，将得到的CT值代入步骤(4)所得标准曲线，从而计算出待测样品中胞内劳森菌的基因拷贝数。
进一步优选的：
步骤(2)中，利用权利要求1所述的引物对PCR扩增aspA基因，反应体系包括：2×Taq Mix、ddH2O、权利要求1所述引物对、DNA模板；反应程序为：92-98℃预变性4-6min，92-98℃变性25-35s，50-60℃退火25-30s，68-74℃延伸0.5-1.5min，共28-32个循环，68-74℃延伸8-12min。
步骤(4)中，所述标准曲线的制备方法包括如下：
标准品的浓度可按下列公式折算为拷贝数
提取阳性重组质粒aspA-pMD19-T/DH5α后测定浓度，换算成拷贝数，并10倍比连续稀释5个稀释倍数，作为标准阳性模板进行qPCR反应，反应结束后，以标准品的CT值为横坐标，标准品的拷贝数的Log值为纵坐标，进行线性拟合，绘制标准曲线。
步骤(4)中，所述qPCR反应的反应体系包括：模板，权利要求1所述引物对，ROXReferenceDyeⅡ，2×SYBRGreenIMix，ddH2O；程序包括：92-98℃预变性25-35s，92-98℃变性4-6s，55-65℃退火28-32s，反应程序共38-42个循环。
胞内劳森菌aspA基因在胞内劳森菌黏附、侵袭宿主细胞中起重要作用。研究表明，aspA基因编码的蛋白为天门冬氨酸酶，它是细菌在生长过程中利用天门冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸等作为碳源的重要代谢酶，其在细菌氨基酸代谢和抵抗外界环境胁迫中发挥着很重要的作用。例如在胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)中，aspA蛋白可以提高其在氧缺乏条件下的生存能力。胞内劳森菌引起猪的回肠炎，其多存活于猪的回肠、空肠等缺乏氧气的环境中，且aspA催化天门冬氨酸发生脱氨基作用，产生的氨基可以排放至菌体所处的胞内环境中，提高菌体生存环境的pH值，从而提高了菌株在酸性条件下的生存能力。因此选择该基因作为目标基因，建立的荧光定量检测方法。
因此，本发明旨在建立一种能够定量检测临床样品中猪源胞内劳森菌的绝对定量PCR方法。首先，根据GenBank中胞内劳森菌aspA基因序列设计特异性引物，随后，将aspA基因与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，构建阳性重组质粒aspA-pMD19-T/DH5α。最后，通过对反应体系和条件的优化，建立了针对胞内劳森菌aspA基因的标准曲线。同时，对其灵敏性、特异性、重复性进行验证。结果表明，建立的胞内劳森菌实时绝对荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性好、重复性稳定，可用于临床样品中胞内劳森的测定，该结果对胞内劳森菌的诊断与防控方案的制定具有重要意义。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1、SYBR Green I染料法建立的实时荧光定量检测，具有引物设计方便、成本较低等特点，适合疫病检测方法采用。
2、绝对荧光定量PCR比普通PCR相比优势在于，荧光定量能够对样品中胞内劳森菌进行定量；此外，绝对荧光定量PCR不需要通过凝胶电泳观察结果，节约时间，同时可避免交叉污染。
3、本发明建立的绝对荧光定量PCR方法属于绝对定量，该定量方法与相对定量相比，具有获得基因绝对数量且不同试验结果可相互对比等优点。
4、胞内劳森菌的aspA基因与细菌的毒力和侵袭力相关，对于研究胞内劳森菌黏附、侵袭宿主细胞具有重要意义。
5、胞内劳森菌引起猪的回肠炎，其多存活于猪的回肠、空肠等缺乏氧气的环境中，aspA可以提高其在氧缺乏条件下的生存能力；且aspA催化天门冬氨酸发生脱氨基作用，产生的氨基可以排放至菌体所处的胞内环境中，提高菌体生存环境的pH值，从而提高了菌株在酸性条件下的生存能力。因此选择该基因作为目的基因，建立的荧光定量检测方法可以准确的对临床样品中的胞内劳森菌进行定量检测。
附图说明
图1为胞内劳森菌aspA基因PCR扩增结果；其中，M：DNA Marker；1：aspA基因扩增片段；
图2为aspA-pMD19-T/DH5α重组质粒的扩增曲线图；
图3为aspA-pMD19-T/DH5α重组质粒的熔解曲线图；
图4为aspA-pMD19-T/DH5α重组质粒的标准曲线图；
图5为绝对荧光定量PCR的特异性检测图；
图6为绝对荧光定量PCR的灵敏性检测图；
图7为普通PCR的灵敏性检测图；其中，M：DNA Marker2000；1-7：分别为10－1～10-7倍比稀释的aspA-pMD19-T/DH5α重组质粒；8：阴性对照；
图8为绝对荧光定量PCR的重复性检测图。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
本发明所用的材料来源：
猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、猪流行性腹泻病毒PEDV均为本实验室保存，或者也可以通过购买得到；
2×Taq PCR mix，pMD19-T载体，DNA Marker2000，大肠杆菌感受态细胞DH5α，均购自Takara公司；
组织细胞通用型DNA提取试剂盒SteadyPure Universal Genomic DNAExtraction Kit，ROX Reference DyeⅡ，2×SYBR GreenI Mix均购自AG生物有限公司；
其他未列出的试剂都是能通过正规商业渠道购买；
实施例1
一、猪回肠组织样品胞内劳森菌DNA的提取：
(1)取-80℃冻存的约25mg猪回肠样品，置于2ml离心管中，用剪刀尽可能地剪成碎块
(2)加入180μL的Buffer LS-2、20μL的Proteinase K和10μL的RNase A(10mg/ml)，于56℃水浴温浴至组织完全裂解。(需要约2～3小时，可时常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解)
(3)12000rpm离心2分钟，去除杂质。
(4)向裂解液中加入200μL Buffer BS-2和200μL 100％乙醇，充分吸打混匀。
(5)将上述溶液转移至Universal DNA Mini Column中，室温静置1min后，室温下12000rpm离心1分钟，弃滤液。
(6)向Mini Column中加入500μL的Buffer WA，室温12000rpm离心1分钟，弃滤液。
(7)向Mini Column中加入750μL的Buffer WB，室温12000rpm离心1分钟，弃滤液。
(8)向Mini Column中加入750μL的Buffer WB，室温12000rpm离心1分钟，弃滤液。
(9)将Mini Column安置于新的2.0ml Collection Tube上，室温12000rpm离心2分钟。
(10)将Mini Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Mini Column膜的中央处加入50μL ddH2O，室温静置5分钟，然后室温12000rpm离心2分钟洗脱DNA。置于-80℃冰箱保存。
二、引物的设计与合成
根据GenBank中已发表的猪源胞内劳森菌aspA基因序列，科学合理的设计一段包含aspA基因的序列，扩增片段大小为167bp的上下游引物，引物序列如下：F：GCTGTGGATTGGGAGAAATC；R：CAAGTTGACCAGCCTCTGC；引物使用前用ddH2O溶解，并置于-20℃冰箱保存备用。
三、PCR扩增aspA基因
通过PCR扩增aspA基因，采用25μL反应体系：2×Taq Mix 12.5μL、ddH2O 8.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板2μL；反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，并用胶回收试剂盒回收扩增出的目的基因片段，测定其浓度置于-80℃保存。
四、重组阳性质粒aspA-pMD19-T/DH5α的构建；
将胶回收产物克隆至pMD19-T载体上，16℃连接过夜后，将重组质粒转化E.coliDH5α感受态细胞，即从-80℃冰箱取出1管E.coli DH5α感受态细胞，迅速放入冰上，待其融化后向其中加入全部连接产物，轻轻混匀，冰水浴中放置30min，42℃热击45s，冰水浴中放置1min，随后加入900μL LB液体培养基中，37℃，150rpm活化1h，转化液涂布于含LB固体板，37℃培养过夜。次日挑取单菌落，挑取白色菌落，提取质粒进行鉴定，经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的重组质粒aspA-pMD19-T/DH5α。
五、绝对荧光定量PCR方法的构建；
通过使用AG公司的SYBR Green I染料来进行绝对荧光定量PCR方法的建立，反应体系为20μL：模板1μL，上下游引物各0.4μL，ROX Reference DyeⅡ(4μM)0.4μL，2×SYBRGreen I Mix 10μL，ddH2O 7.8μL。上机前进行离心处理，设置程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，反应程序共40个循环。
六、绝对荧光定量PCR标准曲线的建立
标准品的浓度可按下列公式折算为拷贝数：
提取阳性重组质粒aspA-pMD19-T/DH5α后测定浓度，换算成拷贝数，并10倍比连续稀释5个稀释倍数，作为标准阳性模板进行qPCR反应，反应体系同上。反应结束后，以标准品的CT值为横坐标，标准品的拷贝数的Log值为纵坐标，进行线性拟合，绘制标准曲线，最终得到的线性方程为y＝-0.3087x+10.715，R2＝0.996。
七、待测样本的胞内劳森菌定量检测
对于待测样品中胞内劳森菌的检测，首先通过组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，随后以其为模板进行qPCR扩增，反应体系同上；随后将得到的CT值代入本发明建立的线性方程y＝-0.3087x+10.715(R2＝0.996)，从而获得待测样品中胞内劳森菌的基因拷贝数。
八、绝对荧光定量PCR检测方法灵敏性、特异性及重复性的鉴定
将已测定质量浓度的重组质粒aspA-pMD19-T/DH5α通过公式换算成拷贝数，并10倍比连续稀释5个稀释倍数，进行绝对荧光定量PCR扩增检测其灵敏性；将猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、猪流行性腹泻病毒PEDV作为对照对所建立的新方法的特异性进行检测，按照扩增体系运行程序，同时设胞内劳森菌阳性对照及去离子水的阴性对照，检测结果体现出绝对荧光定量PCR方法的特异性；以重组质粒aspA-pMD19-T/DH5α为模板，对质粒进行10倍比稀释(稀释倍数为102-106)进行重复性试验，观察不同组内的变异情况，结果(表1)显示，各次重复均有扩增信号出现，建立的绝对定量PCR的变异系数(CV)均小于1.2％，体现出绝对荧光定量PCR方法的重复性优异。
表1
实施例2绝对荧光定量PCR检测方法在临床样品中的初步检测应用。
将临床采集的178份PPE疑似样品，分别用IFA和绝对荧光定量PCR进行检测，结果(表2)表明，178份病料IFA检测出93份阳性样品，3个不同地区屠宰场的阳性检出率分别为54.2％、57.9％和42.9％；而qPCR方法检测出99份阳性样品，屠宰场的阳性检出率分别为56.9％、61.4％和47％，说明建立的检测方法可以用于临床应用。
表2
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgtggatt gggagaaatc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caagttgacc agcctctgc 19
Claims (8)
1.一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，其核酸序列如下所示：
上游引物：GCTGTGGATTGGGAGAAATC(SEQ ID NO.1)；
下游引物：CAAGTTGACCAGCCTCTGC(SEQ ID NO.2)。
2.根据权利要求1所述的用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述绝对荧光定量PCR引物对是根据猪源胞内劳森菌aspA基因序列，通过引物设计软件设计，并进行验证获得。
3.一种用于检测胞内劳森菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物对。
4.一种检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的引物对，进行荧光定量PCR检测。
5.根据权利要求4所述的检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，所述绝对荧光定量PCR方法包括以下步骤：
(1)提取胞内劳森菌感染猪回肠样品中的基因组DNA；
(2)利用权利要求1所述的引物对，PCR扩增aspA基因；
(3)利用步骤(2)扩增所得目的基因片段，构建重组阳性质粒aspA-pMD18-T/DH5α；
(4)以构建的aspA-pMD19-T/DH5α重组质粒作为阳性标准品，进行qPCR反应，制备标准曲线；
(5)提取待测样品基因组DNA，随后以其为模板进行qPCR反应，反应体系同步骤(4)，将得到的CT值代入步骤(4)所得标准曲线，从而计算出待测样品中胞内劳森菌的基因拷贝数。
6.根据权利要求5所述的检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(2)中，利用权利要求1所述的引物对PCR扩增aspA基因，反应体系包括：2×Taq Mix、ddH2O、权利要求1所述引物对、DNA模板；反应程序为：92-98℃预变性4-6min，92-98℃变性25-35s，50-60℃退火25-30s，68-74℃延伸0.5-1.5min，共28-32个循环，68-74℃延伸8-12min。
7.根据权利要求5所述的检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(4)中，所述标准曲线的制备方法包括如下：
标准品的浓度可按下列公式折算为拷贝数：
提取阳性重组质粒aspA-pMD19-T/DH5α后测定浓度，换算成拷贝数，并10倍比连续稀释5个稀释倍数，作为标准阳性模板进行qPCR反应，反应结束后，以标准品的CT值为横坐标，标准品的拷贝数的Log值为纵坐标，进行线性拟合，绘制标准曲线。
8.根据权利要求5所述的检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(4)中，所述qPCR反应的反应体系包括：模板，权利要求1所述引物对，ROXReferenceDyeⅡ，2×SYBRGreenIMix，ddH2O；程序包括：92-98℃预变性25-35s，92-98℃变性4-6s，55-65℃退火28-32s，反应程序共38-42个循环。
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