CN102839217A - 胞内劳森氏菌环介导等温扩增检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胞内劳森氏菌环介导等温扩增检测方法及其试剂盒。本发明试剂盒含有环介导等温扩增（LAMP）反应液、BstDNA聚合酶和SYBRGreenI荧光染料显色剂。利用试剂盒通过对样品中DNA的提取、胞内劳森氏菌环介导等温扩增和显色检测三个环节，从而检测出胞内劳森氏菌。通过灵敏性试验证明，本方法可对95.6pg?μL^-1的DNA模板进行高效扩增，显示出本方法高度的灵敏性。解决了现有技术中检测步骤繁琐、成本较高、不适于临场检测的问题，提供了一种使用仪器简单、成本低、检测快速、敏感，适于基层现场检测胞内劳森氏菌的方法及其试剂盒。

Description

胞内劳森氏菌环介导等温扩增检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用环介导等温扩增（LAMP）技术进行胞内劳森氏菌快速检测的方法，并涉及一种用于检测胞内劳森氏菌的试剂盒。

背景技术

   胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis, LI）是引起猪增生性肠炎(porcine proliferative  enteritis，PPE)的病原菌，该病是近年来新流行的，以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞发生腺瘤样增生为特征的接触性传染病。PPE对机体吸收营养和转化饲料能力造成根本性和持久性的破坏，是危害生长肥育猪最严重的细菌性疾病之一。据报道，在美国该病导致发病猪日增重平均下降37%～42%，每增重1公斤体重饲料摄入量增加27%～37%，发病猪每头损失5～8美元。PPE已在全球猪场流行，发病率有升高的趋势，是目前猪场主要肠道性疾病之一。PPE的病原菌胞内劳森氏菌（LI），具有革兰氏阴性菌的胞壁结构和原核生物的胞浆结构，外层细胞壁由3层波纹状膜所组成，革兰氏染色阴性，抗酸染色阳性，能被Levaditi Silver或Warthin—Starry镀银染色法着色，用改良的Ziehl—Neelsen染色法细菌被染成红色。胞内劳森氏菌微需氧，不产芽胞，基因组已测序，基因组序列全长1719350bp，编码阅读框(ORF)共1346个，GC含量仅33％左右。不同动物来源的胞内菌可能是相同病原。

     现有的胞内劳森氏菌检测方法除了对病变肠道进行组织学检查外，主要还有免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)等方法，这些方法各有优势，但也有不足，或所需时间过长、或步骤繁琐、或成本较高。环介导等温核酸扩增技术（LAMP）是由T.Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术（Notomi，T.,et al.,Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000,28,e63.）,该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、高特异地扩增靶序列，方法方便、成本低，尤其适于临场检测，应用性强。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。目前尚未见有应用环介导等温扩增方法检测胞内劳森氏菌的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用环介导等温扩增技术，建立检测引起猪增生性肠炎的病原菌——胞内劳森氏菌的方法及其试剂盒，解决现有检测步骤繁琐、成本较高、不适于临场检测的问题，提供一种使用仪器简单、成本低、检测快速、敏感，适于基层现场检测的方法及其试剂盒，从而为现代生猪养殖中的疾病诊断提供指导和科学依据。

本发明所采用的技术方案是：一种胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测试剂盒，包括以下成分：

（1）环介导等温扩增（LAMP）反应液：

包括0.2 μM 的上游外引物、0.2 μM的下游外引物、1.6 μM的上游内引物、1.6 μM的下游内引物、1 M甜菜碱、6 mM硫酸镁、1.6mM dNTP、10×Thermopol反应缓冲液，其中引物序列为：

上游外引物F3：5'-AGCTAACGCGTTAAGCACC-3'

下游外引物B3：5'-CTTAACCCAACACCTCACGG-3'

上游内引物FIP：5'-CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA-3'下游内引BIP： 5'-ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG-3'

（2）聚合酶：每微升为8个活性单位的Bst DNA聚合酶；

（3）显色剂：SYBR Green I 荧光染料。

本发明的另一技术方案是：

一种胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测试剂盒检测胞内劳森氏菌的方法，包括以下步骤：

（1）待检样品DNA的提取

提取待检样品胞内劳森氏菌的DNA，其中提取的样品DNA在紫外分光光度计上检测，其 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 应在1.6～2.0范围内，浓度应在10～100ng/μL范围内；

（2）胞内劳森氏菌环介导等温扩增

A. 在反应管中建立18μL的LAMP 反应液；

B. 向上述反应管中加入1μL 8U的Bst DNA聚合酶和1μL 胞内劳森氏菌 DNA模板；

C．将上述反应管置于水浴涡中65℃恒温扩增60 min；

D. 将水浴温度调到80℃放置2min从而终止反应，3～5min后取出待检；

（3）显色检测

在待检的每个反应管中加入1 μL 的SYBR GreenI染料，室温放置，肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品中含有胞内劳森氏菌，反应液颜色变为黄色，则说明待检样品中不含有胞内劳森氏菌。

   本发明的有点在于：本发明是根据胞内劳森氏菌16SrRNA基因中较为保守的六个序列片段设计的两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为胞内劳森氏菌所共有的，以保证检测不同来源的胞内劳森氏菌的可靠性。本发明采用环介导等温扩增技术，该技术特异性强，比PCR技术更为敏感，但不需要昂贵的PCR仪，只需要普通的水浴涡即可，且反应结果不需要电泳后用凝胶成像系统观察，使用荧光染料肉眼观察即可，简单、快速，特别适合用于基层临床检测。

  总之，环介导等温扩增技术，因其具有敏感、特异、快速、可靠、简便的特点，使得它与其它诊断技术相比，更适合于临床实验室诊断。本发明建立的胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测方法，可提高临床诊断的速度和准确性，且操作简单，成本低廉，适合基层使用，能有效诊断该菌引起的猪增生性肠炎病，该病得以控制后，将显著提高生猪出栏率、降低生猪死亡率，提高生猪产业的经济效益。

具体实施方式：

下列实例进一步说明本发明，但不应当作为本发明的限制。

实施例1：

胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测试剂盒组分的配制：

（1）环介导等温扩增（LAMP）反应液：

在配制LAMP反应液前首先进行扩增引物设计：根据Genbank公布的胞内劳森氏菌的基因序列，在其序列保守区域设计了2对引物，引物序列为：

上游外引物F3：5'-AGCTAACGCGTTAAGCACC-3'

下游外引物B3：5'-CTTAACCCAACACCTCACGG-3'

上游内引物FIP：5'-CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA-3'下游内引BIP： 5'-ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG-3'

进而配制反应液，组分包括0.2 μM 的上游外引物F3、0.2 μM的下游外引物B3、1.6 μM的上游内引物FIP、1.6 μM的下游内引物BIP、1 M甜菜碱、6 mM硫酸镁、1.6mM dNTP、10×Thermopol反应缓冲液；

（2）聚合酶：每微升为8个活性单位的Bst DNA聚合酶；

（3）显色剂：SYBR Green I 荧光染料。

LAMP反应液最佳体系为18μL，成分组成如下：

0.2μM 的上游外引物F3 0.4μL、0.2 μM的下游外引物B3 0.4μL、1.6 μM的上游内引物FIP 0.5μL、1.6 μM的下游内引物BIP 0.5μL、1 M甜菜碱5μL、6 mM硫酸镁0.3μL、1.6mM dNTP 2.5μL、10×Thermopol反应缓冲液2μL。

实施例2：利用胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测试剂盒检测胞内劳森氏菌：

（1）待检样品DNA的提取

样品1为胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis, LI），菌种来源龙岩学院动物医学研究所。

样品2为疑似猪增生性肠炎(porcine proliferative  enteritis，PPE)的病料组织，病例来源龙岩市某猪场。

采用购至福州晶泰生物技术有限公司的DNA提取试剂盒对样品1和样品2进行DNA的提取。其中提取的样品DNA在紫外分光光度计上检测，其 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 应在1.6～2.0范围内，浓度应在10～100ng/μL范围内。

（2）胞内劳森氏菌环介导等温扩增

A. 在反应管中建立18μL的LAMP 反应液；

B. 向上述反应管中加入1μL 8U的Bst DNA聚合酶和1μL 胞内劳森氏菌 DNA模板；

C．将上述反应管置于水浴涡中65℃恒温扩增60 min；

D. 将水浴温度调到80℃放置2min从而终止反应，3～5min后取出待检；

（3）显色检测

在待检的每个反应管中加入1 μL 的SYBR GreenI染料，室温放置，肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品中含有胞内劳森氏菌，反应液颜色变为黄色，则说明待检样品中不含有胞内劳森氏菌。

 

（4）灵敏度试验：

将胞内劳森氏菌的DNA 从10⁰～10^-7进行10倍梯度稀释，原始的浓度为956 ng·μL^-1，稀释成95.6 ng·μL^-1、9.56 ng·μL^-1、956 pg·μL^-1、95.6 pg·μL^-1、9.56pg·μL^-1、956fg·μL^-1与95.6fg·μL^-1,分别取1μL进行LAMP扩增，以检测该方法的敏感性。试验结果表明，LAMP法测定胞内劳森氏菌 DNA模板的灵敏度可达到95.6 pg·μL^-1。

Claims (3)

1.一种胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括以下成分：

（1）环介导等温扩增（LAMP）反应液：

包括0.2 μM 的上游外引物、0.2 μM的下游外引物、1.6 μM的上游内引物、1.6 μM的下游内引物、1 M甜菜碱、6 mM硫酸镁、1.6mM dNTP、10×Thermopol反应缓冲液，其中引物序列为：

上游外引物F3：5'-AGCTAACGCGTTAAGCACC-3'

下游外引物B3：5'-CTTAACCCAACACCTCACGG-3'

上游内引物FIP：5'-CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA-3'下游内引BIP： 5'-ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG-3'

（2）聚合酶：每微升为8个活性单位的Bst DNA聚合酶；

（3）显色剂：SYBR Green I 荧光染料。

2.根据权利要求1所述的一种胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测试剂盒，其特征在于所述LAMP反应液体系为18μL，成分组成如下：

0.2μM 的上游外引物0.4μL、0.2 μM的下游外引物0.4μL、1.6 μM的上游内引物0.5μL、1.6 μM的下游内引物0.5μL、1 M甜菜碱5μL、6 mM硫酸镁0.3μL、1.6mM dNTP 2.5μL、10×Thermopol反应缓冲液2μL。

3.根据权利要求1所述的一种胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测试剂盒检测胞内劳森氏菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）待检样品DNA的提取

提取待检样品胞内劳森氏菌的DNA，其中提取的样品DNA在紫外分光光度计上检测，其 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 应在1.6～2.0范围内，浓度应在10～100ng/μL范围内；

（2）胞内劳森氏菌环介导等温扩增

A. 在反应管中建立18μL的LAMP 反应液；

B. 向上述反应管中加入1μL 8U的Bst DNA聚合酶和1μL 胞内劳森氏菌 DNA模板；

C．将上述反应管置于水浴涡中65℃恒温扩增60 min；

D. 将水浴温度调到80℃放置2min从而终止反应，3～5min后取出待检；

（3）显色检测

在待检的每个反应管中加入1 μL 的SYBR GreenI染料，室温放置，肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品中含有胞内劳森氏菌，反应液颜色变为黄色，则说明待检样品中不含有胞内劳森氏菌。