CN104328204B - 艰难梭菌ab毒素的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。本发明是根据艰难梭菌特异性保守基因tcdA和tcdB设计引物，然后以待测物的基因组DNA为模板，在获得引物的引导下进行LAMP扩增，再通过反应液的颜色变化或反应液浊度变化同步定性检测待测样品中的艰难梭菌产毒株。本发明可以在等温条件下快速、方便、同步、高效、高特异、高灵敏地检测到艰难梭菌产毒株，不需要复杂仪器，为艰难梭菌的检测及毒素分型提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位及各疾病预防控制中心筛查和检测艰难梭菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒，属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法技术领域。
背景技术
艰难梭菌（Clostridiumdifficile，Cd）为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，广泛分布于水、土壤等自然环境及动物和人的粪便中。艰难梭菌是一种条件致病菌，本身没有侵袭性，当人体肠道正常微环境遭到破坏时，部分产毒细菌通过分泌毒素A、毒素B以及二元毒素引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至致死性伪膜性肠炎，统称为艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection,CDI)。在医院获得感染性腹泻所明确的病原体中，以艰难梭菌最为常见；在抗生素相关性腹泻病因中，艰难梭菌亦占15%~25%。而伪膜性肠炎则几乎100%由艰难梭菌所致。CDI具有复发率高、耐药率高、难治率高、死亡率高、医疗费用高等特点。
艰难梭菌可分为产毒株和不产毒株，不产毒株不引起临床症状。艰难梭菌产毒株主要分泌毒素A和毒素B，分别由tcdA和tcdB编码，而tcdA和tcdB受tcdR、tcdC、tcdE调节。毒素A又称肠毒素，易使回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分泌和出血性坏死；毒素B又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。毒素B的毒力较毒素A强10倍。一般认为毒素A在艰难梭菌感染的发病中起重要作用，毒素B只起辅助作用，并不能单独导致感染。然而，近年来有研究表明，毒素B对于艰难梭菌感染的发生、发展至关重要，只产生毒素A的艰难梭菌菌株是没有毒性的（SavidgeTC,PanWH,NewmanP,O'brienM,AntonPM,PothoulakisC.ClostridiumdifficiletoxinBisaninflammatoryenterotoxininhumanintestine.Gastroenterology.2003;125(2)：413-420.）。在艰难梭菌感染患者的粪便中已发现毒素A阴性、毒素B阳性的菌株；而毒素A阳性，毒素B阴性的菌株尚未被发现，表明毒素B可以单独致病。据国外综合医院统计，A(+)B(+)占艰难梭菌的57%，A(-)B(+)占34%，A(-)B(-)占9%。而A(-)B(+)占艰难梭菌产毒株的10%，临床症状比A(+)B(+)更严重，可出现脱水、低血压性休克、死亡率较高，耐药性更高（WilkinsTD,LyerlyDM.Clostridiumdifficiletesting：after20years,stillchallenging.JClinMicrobiol.2003;41(2)：531-534.）。随着全球范围内艰难梭菌感染的暴发流行增多，艰难梭菌感染快速而特异的实验室检测对于疾病感染的控制和临床诊治显得迫切重要。而选择tcdA和tcdB作为检测艰难梭菌的目的基因，能全面、特异的鉴定临床产毒株型艰难梭菌。
目前，粪便中艰难梭菌实验室检测包括作为检测“金标准”的艰难梭菌毒素检测及细胞毒素中和试验，但因培养条件及技术要求高、耗时长，难以用于临床常规检测。国内外广泛应用的酶联免疫试验(EIA)则快速、特异，不敏感；而乳胶凝集试验(GDH)则快速、敏感，但该方法存在交叉反应、假阳性率高，特异性差等缺点。利用普通PCR可检测艰难梭菌，但因实验设备要求高、操作复杂、速度慢，扩增完成后，需要对产物进行电泳、显影等一些繁琐步骤，不适合基层医院及现场快速检测的应用。因此，寻找快速、特异、敏感的艰难梭菌检测方法是艰难梭菌感染研究领域的热点。
随着分子诊断技术的不断进步，T.Notomi(NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,etal.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes2000;28(12)：63.)发明的一种新型核酸扩增技术—环介导恒温扩增技术（LAMP），该技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在恒温（63~67℃）的条件下，利用高活性链置换DNA聚合酶（BstDNA聚合酶），使得链置换DNA合成在不停地自我循环，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物—白色的焦磷酸镁沉淀产生，从而实现对目的基因的快速检测。该方法检测时间短（30~60min），无需特殊仪器，操作简便，配合相应显色试剂还能实现肉眼判别结果。LAMP方法目前已成功应用于细菌、病毒及寄生虫的定性和定量检测、胎儿性别鉴定和其他方面，成为常用的临床快速检验方法之一。2005年，日本HaruKato等（Kato,H.andT.Yokoyama,etal.(2005).RapidandsimplemethodfordetectingthetoxinBgeneofClostridiumdifficileinstoolspecimensbyloop-mediatedisothermalamplification.JClinMicrobiol43(12)：6108-12.）提出运用LAMP法针对tcdB基因设计6条引物检测艰难梭菌，通过浊度仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳判读结果，检测结果特异、敏感、快速，不足之处在于无法检测艰难梭菌是否携带tcdA基因，不利于艰难梭菌毒素分型，结果判读方式繁琐、需借助相关仪器，无法实现肉眼快速判读结果。刘畅等分别在2012年（刘畅，蒋栋能，蒲晓允.快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究[J].国际检验医学杂志.2012（20））和2013年（Liu,C.andD.N.Jiang,etal.(2013)."DNAdetectionofClostridiumdifficileinfectionbasedonreal-timeresistancemeasurement."GenetMolRes12(3)：3296-304.）提出：针对tcdA基因设计4条引物检测艰难梭菌，分别通过实时电阻测量和显色试剂判读结果，LAMP法特异、敏感、快速，适合现场和基层推广，不足之处在于无法检测艰难梭菌tcdB携带情况。目前缺乏针对艰难梭菌tcdA基因和tcdB基因设计特异性引物，通过显色试剂判读结果来实现快速、简便、特异、灵敏的同步检测艰难梭菌tcdA和tcdB。
发明内容
本发明的目的是提供一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及应用于该LAMP检测方法的专用引物。
本发明的另一目的在于提供一种同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒。
本发明的技术方案如下。
一种艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法，包括如下步骤：
（1）引物的设计：分别对艰难梭菌tcdA与tcdB重复序列通过BLAST软件进行同源性分析获得艰难梭菌特异保守序列，再根据艰难梭菌特异保守DNA序列，用软件PrimerdesignV4设计分别得到用于对艰难梭菌tcdA与tcdB进行LAMP检测的引物；
（2）LAMP扩增：以待测物的基因组DNA为模板，在步骤（1）获得引物的引导下进行LAMP扩增；所述待测物包括人及动物的粪便或培养分离的菌株；
（3）反应结束后进行结果判定：扩增反应前预先在反应液中添加钙黄绿素指示剂，反应后根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因，橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测扩增反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应液浊度上升表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因，浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因。
经上述艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法步骤（1）设计优化获得一种用于对艰难梭菌tcdA、tcdB进行LAMP检测的专用引物如下：
（1）用于对艰难梭菌tcdA进行LAMP检测的tcdA引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；第三组引物对：引物5（LF）与引物6（LB）；所述各引物序列如下：
F3：AGTTTGTTTACAGAACAAGAGTT
B3：ATTTTATCATTTCCCAACGGT
FIP：CCGCCAAAATTTTTTAGGGCTAATATTTTTATAGTCAGGAGTTGTTAAATCG
BIP：AGATGTTGATATGCTTCCAGGTATTTTCTAGTCCAATAGAGCTAGGTC
LF：CTTACTATGTCAGATGCTGCAGCTA
LB：AGATGCTGCAGCTAAATTTCCA
所述tcdA引物中三组引物对（FIP和BIP）:（LF和LB）:（F3和B3）的摩尔比为8:4:1；
（2）用于对艰难梭菌tcdB进行LAMP检测的tcdB引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；第三组引物对：引物5（LF）与引物6（LB）；所述各引物序列如下：
F3：GTATCAACTGCATTAGATGAAAC
B3：CCAAAGATGAAGTAATGATTGC
FIP：CTGCACCTAAACTTACACCATCTATCTTCCTACATTATCTGAAGGATT
BIP：GAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCGCTGTTGTTAAATTTACTGCC
LF：AATAGTTGCAATTATAGG
LB：AGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGG
所述tcdB引物中三组引物对（FIP和BIP）:（LF和LB）:（F3和B3）的摩尔比为8:4:1。
采用本发明的检测方法，以上述专用引物进行LAMP扩增反应条件可为：检测tcdA时，扩增反应体系在58-69℃下恒温60min；检测tcdB时，扩增反应体系在58-69℃下恒温60min；tcdA与tcdB同时检测时，扩增反应体系在58-69℃下恒温60min。
优选的，所述的LAMP扩增反应条件为：检测tcdA时，扩增反应体系在61℃下恒温60min；检测tcdB时，扩增反应体系在60℃下恒温60min；tcdA与tcdB同时检测时，扩增反应体系在60℃下恒温60min。
本发明的检测方法中所述钙黄绿素指示剂的添加量为1μl（终反应体系26μl），所述钙黄绿素指示剂包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。
以上述专用引物进行LAMP扩增时采用的LAMP扩增反应总体系优选如下：待测物的基因组DNA2μl、20mMTris·HCl(pH8.8)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、0.1%Tween20，0.8M甜菜碱、8mMMgSO4、1.4mMdNTPeach、8UBstDNA聚合酶、专用引物、加双蒸水至总容量25μL；所述的专用引物及其加入量为：tcdA引物：40pmol（FIP和BIP）、20pmol（LF和LB）、5pmol（F3和B3），所述tcdA引物的引物对（FIP和BIP）、（LF和LB）、（F3和B3）中各条引物的混合比例优选为等量混合；tcdB引物：40pmol（FIP和BIP）、20pmol（LF和LB）、5pmol（F3和B3），所述tcdB引物的引物对（FIP和BIP）、（LF和LB）、（F3和B3）中各条引物的混合比例优选为等量混合。
一种同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，包含有上述用于对艰难梭菌tcdA和tcdB进行LAMP检测的专用引物。
所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含艰难梭菌的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系（如：双蒸水）。
优选的，所述试剂盒中包括：20mMTris·HCl(pH8.8)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4，0.1%Tween20、0.8M甜菜碱、8mMMgSO4、1.4mMdNTPeach、8UBstDNA聚合酶、tcdA引物、tcdB引物、钙黄绿素指示剂、艰难梭菌的基因组DNA和双蒸水；tcdA引物为：40pmol（FIP和BIP）、20pmol（LF和LB）、5pmol（F3和B3），tcdB引物为：40pmol（FIP和BIP）、20pmol（LF和LB）、5pmol（F3和B3）。
本发明相对于现有技术的有益效果如下：采取以上设计，本发明具有以下优点：
（1）高特异性：6条引物对艰难梭菌靶序列的8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；
（2）高灵敏度：灵敏度比普通PCR高10倍；
（3）结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果（钙黄绿素显色原理：钙黄绿素是金属离子指示剂，能指示反应液中Mg2+的变化，反应前在扩增加入钙黄绿素显色剂，反应后反应液颜色变绿色表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因（阳性），橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因（阴性）），或者直接用浊度仪判断结果（LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应），反应液浊度上升表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因（阳性），浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因（阴性）；
（4）操作简单：只要将检测样品（靶核酸）和检测试剂一起放入60-65℃恒温水浴锅或金属浴中60分钟后就可以判断结果；
（5）快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0.5mg/mL；
（6）同步：可同步检测tcdA和tcdB，快速检测艰难梭菌产毒株。
本发明可以在等温条件下快速、方便、同步、高效、高特异、高灵敏地检测到艰难梭菌产毒株，不需要复杂仪器，为艰难梭菌的检测及毒素分型提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测艰难梭菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
附图说明
图1为实施2艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果。
图2为实施2艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果。
图3为实施例3艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。
图4为实施例3艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。
图5为实施例3艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法特异性的钙黄绿素染色检测结果。
图6为实施例3艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法特异性的钙黄绿素染色检测结果。
图7为实施例4艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果。
图8为实施例4艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果。
图9为实施例4艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素染色检测结果。
图10为实施例4艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素染色检测结果。
图11为实施例4艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果。
图12为实施例4艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1通过以下步骤实施本发明：
1、用于对艰难梭菌进行LAMP检测的引物设计
（1）用于对艰难梭菌tcdA进行LAMP检测的引物设计：从美国基因数据库检索获得艰难梭菌tcdA重复序列（GenBank：X92982.1）通过BLAST软件进行同源性分析得知是艰难梭菌特异保守序列（序列表中SEQIDNO：1），再根据该保守靶DNA序列，用软件PrimerdesignV4设计用于对艰难梭菌进行LAMP检测的引物，结果优化得到三组引物对，F3和B3为第一组，FIP和BIP为第二组，LF和LB为第三组，具体各条引物序列如表1。
表1用于对艰难梭菌进行LAMP检测的tcdA引物
（2）用于对艰难梭菌tcdB进行LAMP检测的引物设计：从美国基因数据库检索获得艰难梭菌tcdB重复序列（GenBank：KC292192.1）通过BLAST软件进行同源性分析得知是艰难梭菌特异保守序列（序列表中SEQIDNO：2），再根据该保守靶DNA序列，用软件PrimerdesignV4设计用于对艰难梭菌进行LAMP检测的引物，结果优化得到三组引物对，F3和B3为第一组，FIP和BIP为第二组，LF和LB为第三组，具体各条引物序列如表2。
表2用于对艰难梭菌进行LAMP检测的tcdB引物
2、艰难梭菌的LAMP检测：分别用实施例1获得的用于对艰难梭菌进行LAMP检测的tcdA引物（tcdA引物的序列见序列表中SEQIDNO：3）和tcdB引物（tcdB引物的序列见序列表中SEQIDNO：4）对艰难梭菌标准株API10463（来自南方医科大学南方医院消化内科，广东省胃肠疾病重点实验室）进行LAMP检测，步骤如下：
（1）以艰难梭菌标准株API10463的基因组DNA为模板，在实施例1获得的tcdA引物和tcdB引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25ulLAMP反应体系包括：待测物的基因组DNA2μl，20mMTris·HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.1%Tween20，0.8M甜菜碱，8mMMgSO4，1.4mMdNTPeach，8UBstDNA聚合酶，tcdA引物、tcdB引物（其中，tcdA引物及其加入量为：40pmol（FIP和BIP）、20pmol（LF和LB）、5pmol（F3和B3），各引物对中各条引物等量混合；tcdB引物及其加入量为：40pmol（FIP和BIP）、20pmol（LF和LB）、5pmol（F3和B3），所述引物对中各条引物等量混合）、加双蒸水ddH2O至总容量25μL；LAMP的扩增条件为：将反应体系置60-65℃，恒温60min；
（2）结果判定：扩增反应前预先在反应液中添加1μl的（终反应体系为26μl）含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰的钙黄绿素颜色指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，反应液颜色变绿色表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因（阳性），橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因（阴性）；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应液浊度上升表示待测样品中存在艰难梭菌待测毒素基因（阳性），浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌待测毒素基因（阴性）。
实施例2本发明艰难梭菌LAMP检测方法最佳温度筛选实验：采用实施例1的引物及扩增反应体系，在相同反应体系下，对不同反应条件（温度）下艰难梭菌的基因组DNA进行LAMP检测，以获得扩增反应的最佳反应温度。
经试验，本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果（如图1所示）：置58-69℃恒温60min反应条件下的最佳温度为61℃。本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法最佳温度筛选的浊度仪检测结果（如图2所示）：置58-69℃恒温60min反应条件下的最佳温度为60℃。如艰难梭菌tcdA和tcdB同时检测，最佳反应条件为：60℃，恒温60min。
实施例3本发明艰难梭菌的LAMP检测方法的特异性检测。
一、本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法的特异性检测：分别以巨大芽孢杆菌、沙鱼弧菌、嗜麦芽假单胞菌、结核杆菌、霍乱弧菌O139群、炭疽杆菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血性弧菌、肠致病性大肠杆菌、肠粘附性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、鼠疫耶尔森菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、白喉棒状杆菌、绿脓杆菌、B型流行性感冒嗜血杆菌、布氏不动杆菌（以上所有菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所）的基因组DNA为模板，以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳温度的艰难梭菌LAMP检测方法的特异性。
本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法对艰难梭菌特异性的浊度仪检测结果如图3所示，钙黄绿素染色检测结果如图5所示（1：巨大芽孢杆菌，2：沙鱼弧菌，3：嗜麦芽假单胞菌，4：结核杆菌，5：霍乱弧菌O139群，6：炭疽杆菌，7：肠出血性大肠杆菌，8：小肠结肠炎耶尔森氏菌，9：副溶血性弧菌，10：肠致病性大肠杆菌，11：肠粘附性大肠杆菌，12：肠侵袭性大肠杆菌，13：肠产毒性大肠杆菌，14：鼠疫耶尔森菌，15：肺炎链球菌，16：脑膜炎奈瑟菌，17：类鼻疽伯克霍尔德菌，18：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，19：鲍曼不动杆菌，20：大肠埃希氏菌，21：百日咳杆菌，22：流感嗜血杆菌，23：白喉棒状杆菌，24：绿脓杆菌，25：B型流行性感冒嗜血杆菌，26：布氏不动杆菌，27：阳性对照，28：阴性对照）。
图3浊度曲线显示只有阳性对照曲线（艰难梭菌）发生了上升，其他曲线均没有变化；图5中可以看出只有阳性对照（27号）显示出绿色，表明发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌tcdA，其余均未检测到艰难梭菌tcdA。钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的检测结果一致，说明本发明的艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌tcdA。
二、本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法的特异性检测：分别以巨大芽孢杆菌、沙鱼弧菌、嗜麦芽假单胞菌、结核杆菌、霍乱弧菌O139群、炭疽杆菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血性弧菌、肠致病性大肠杆菌、肠粘附性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、鼠疫耶尔森菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、白喉棒状杆菌、绿脓杆菌、B型流行性感冒嗜血杆菌、布氏不动杆菌（以上所有菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所）基因组DNA为模板，以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳温度艰难梭菌的LAMP检测方法的特异性。
本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法对艰难梭菌特异性的浊度仪检测结果如图4所示，钙黄绿素染色检测结果如图6所示（1：巨大芽孢杆菌，2：沙鱼弧菌，3：嗜麦芽假单胞菌，4：结核杆菌，5：霍乱弧菌O139群，6：炭疽杆菌，7：肠出血性大肠杆菌，8：小肠结肠炎耶尔森氏菌，9：副溶血性弧菌，10：肠致病性大肠杆菌，11：肠粘附性大肠杆菌，12：肠侵袭性大肠杆菌，13：肠产毒性大肠杆菌，14：鼠疫耶尔森菌，15：肺炎链球菌，16：脑膜炎奈瑟菌，17：类鼻疽伯克霍尔德菌，18：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，19：鲍曼不动杆菌，20：大肠埃希氏菌，21：百日咳杆菌，22：流感嗜血杆菌，23：白喉棒状杆菌，24：绿脓杆菌，25：B型流行性感冒嗜血杆菌，26：阳性对照，27：布氏不动杆菌，28：阴性对照）。
图4浊度曲线显示只有阳性对照曲线（艰难梭菌）发生了上升，其他曲线均没有变化；图6中可以看出只有阳性对照（26号）显示出绿色，表明发生了LAMP反应，检测到艰难梭菌tcdB，其余均未检测到艰难梭菌tcdB。钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的检测结果一致，说明本发明的艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到艰难梭菌tcdB。
实施例4本发明艰难梭菌的LAMP检测方法的灵敏度检测。
一、本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法的灵敏度检测：本实验测试本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测艰难梭菌tcdA的灵敏度，方法为：提取艰难梭菌标准株API10463总DNA，然后以10倍梯度（1倍、10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍）进行稀释，使1-10模板中总DNA的浓度分别为207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、0.00207pg/μl、0.000207pg/μl，11模板为阴性对照（去离子水），再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法（PCR方法所采用引物序列为NK1和NK2，如表3所示）进行灵敏度检测。
表3用于PCR方法的引物序列
。
本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图7所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、0.00207pg/μl、0.000207pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水）），代号1-5号样品浊度上升表示检测到艰难梭菌tcdA，表明本发明引物组合对艰难梭菌的最低检测灵敏度为20.7pg/μl；钙黄绿素染色检测结果如图9所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、0.00207pg/μl、0.000207pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水）），其中1-5号试管显示出绿色，检测到艰难梭菌tcdA，表明本发明引物组合对艰难梭菌的最低检测灵敏度为20.7pg/μl；PCR检测结果如图11所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、0.00207pg/μl、0.000207pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水），M：DNAmarkerD2000），其中1-4号样品有条带出现，表明PCR方法的检测灵敏度为207pg/μl。比较可知，本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测方法可检测到20.7pg/μl，而普通PCR方法仅能检测到207pg/μl，而且钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明艰难梭菌tcdA的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。
二、本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法的灵敏度检测：本实验测试本发明LAMP检测方法与普通PCR方法检测艰难梭菌tcdB的灵敏度，提取艰难梭菌标准株API10463总DNA和10倍梯度稀释方法与上述检测艰难梭菌tcdB的灵敏度操作相同，再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法（PCR方法所采用引物序列NK104和NK105，如表4所示）进行灵敏度检测。
表4用于PCR方法的引物序列
。
本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图8所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、0.00207pg/μl、0.000207pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水）），代号1-5号样品浊度上升表示检测到艰难梭菌tcdB，表明本发明引物组合对艰难梭菌的最低检测灵敏度为20.7pg/μl；钙黄绿素染色检测结果如图10所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、0.00207pg/μl、0.000207pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水）），其中1-5号试管显示出绿色，检测到艰难梭菌tcdB，表明本发明引物组合对艰难梭菌的最低检测灵敏度为20.7pg/μl；PCR检测结果如图12所示（代号1-10模板对应浓度分别为：207ng/μl、20.7ng/μl、2.07ng/μl、207pg/μl、20.7pg/μl、2.07pg/μl、0.207pg/μl、0.0207pg/μl、0.00207pg/μl、0.000207pg/μl，11号模板为阴性对照（去离子水），M：DNAmarkerD2000），其中1-4号样品有条带出现，表明PCR方法的检测灵敏度为207pg/μl。比较可知，本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测方法可检测到20.7pg/μl，而普通PCR方法仅能检测到207pg/μl，而且钙黄绿素染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明艰难梭菌tcdB的LAMP检测法比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。
实施例5用于艰难梭菌的LAMP检测的试剂盒：将20mMTris·HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.1%Tween20，0.8M甜菜碱，8mMMgSO4，1.4mMdNTPeach，8UBstDNA聚合酶，tcdA引物、tcdB引物（其中，tcdA引物及其加入量为：40pmol（FIP和BIP）、20pmol（LF和LB）、5pmol（F3和B3），各引物对中各条引物等量混合；tcdB引物及其加入量为：40pmol（FIP和BIP）、20pmol（LF和LB）、5pmol（F3和B3），各引物对中各条引物等量混合）、钙黄绿素指示剂（用染色法检测时使用）以及作为阳性对照的艰难梭菌的基因组DNA2μl、作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系（双蒸水）共同包装，再配以产品使用说明书（记载染色法和浊度法两种检测方法），得到同时用于检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒。
<110>申请人名称：南方医科大学南方医院
<120>艰难梭菌AB毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒
<160>4
<210>1
<211>1991
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>8001
<212>DNA
<213>人工序列
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gaaatctggagaatggaaggtggttcaggtcatactgtaactgatgatatagatcacttc1260
ttttcagcaccatcaataacatatagagagccacacttatctatatatgacgtattggaa1320
gtacaaaaagaagaacttgatttgtcaaaagatttaatggtattacctaatg
Claims (8)
1.一种用于艰难梭菌AB毒素的LAMP检测的专用引物组，分别对艰难梭菌tcdA与tcdB重复序列通过BLAST软件进行同源性分析获得艰难梭菌特异保守序列，再根据艰难梭菌特异保守DNA序列，用软件PrimerdesignV4设计得到，其特征在于：
（1）用于对艰难梭菌tcdA进行LAMP检测的tcdA引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1F3与引物2B3；第二组引物对：引物3FIP与引物4BIP；第三组引物对：引物5LF与引物6LB；所述各引物序列如下：
F3：AGTTTGTTTACAGAACAAGAGTT
B3：ATTTTATCATTTCCCAACGGT
FIP：CCGCCAAAATTTTTTAGGGCTAATATTTTTATAGTCAGGAGTTGTTAAATCG
BIP：AGATGTTGATATGCTTCCAGGTATTTTCTAGTCCAATAGAGCTAGGTC
LF：CTTACTATGTCAGATGCTGCAGCTA
LB：AGATGCTGCAGCTAAATTTCCA
所述tcdA引物中三组引物对FIP和BIP:LF和LB:F3和B3的摩尔比为8:4:1；
（2）用于对艰难梭菌tcdB进行LAMP检测的tcdB引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1F3与引物2B3；第二组引物对：引物3FIP与引物4BIP；第三组引物对：引物5LF与引物6LB；所述各引物序列如下：
F3：GTATCAACTGCATTAGATGAAAC
B3：CCAAAGATGAAGTAATGATTGC
FIP：CTGCACCTAAACTTACACCATCTATCTTCCTACATTATCTGAAGGATT
BIP：GAGCTAAGTGAAACGAGTGACCCGCTGTTGTTAAATTTACTGCC
LF：AATAGTTGCAATTATAGG
LB：AGACAAGAAATAGAAGCTAAGATAGG
所述tcdB引物中三组引物对FIP和BIP:LF和LB:F3和B3的摩尔比为8:4:1。
2.根据权利要求1所述的专用引物组，其特征在于：以引物进行LAMP扩增的反应条件为：检测tcdA时，在58-69℃恒温60min；检测tcdB时，在58-69℃恒温60min；tcdA与tcdB同时检测时，在58-69℃恒温60min。
3.根据权利要求2所述的专用引物组，其特征在于：所述LAMP扩增的反应条件为：检测tcdA时，在61℃恒温60min；检测tcdB时，在60℃恒温60min；tcdA与tcdB同时检测时，在60℃恒温60min。
4.根据权利要求1所述的专用引物组，其特征在于：以所述的专用引物组进行LAMP扩增时采用的LAMP扩增反应总体系如下：待测物的基因组DNA2μl、20mMTris·HClpH8.8、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、0.1%Tween20，0.8M甜菜碱、8mMMgSO4、1.4mMdNTPeach、8UBstDNA聚合酶、专用引物组、加双蒸水至总容量25μL；所述专用引物组及其加入量为：tcdA引物：40pmolFIP和BIP、20pmolLB和LF，5pmolF3andB3；检测tcdB时，tcdB引物：40pmolFIP和BIP、20pmolLB和LF，5pmolF3andB3；在LAMP扩增前加入钙黄绿素指示剂，所述钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，所述钙黄绿素指示剂包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。
5.一种同时检测艰难梭菌tcdA和tcdB的LAMP试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的专用引物组。
6.根据权利要求5所述的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含艰难梭菌的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系。
7.根据权利要求5所述的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括：20mMTris·HClpH8.8、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4，0.1%Tween20、0.8M甜菜碱、8mMMgSO4、1.4mMdNTPeach、8UBstDNA聚合酶、tcdA引物、tcdB引物、钙黄绿素指示剂、艰难梭菌的基因组DNA和双蒸水；tcdA引物为：40pmolFIP和BIP、20pmolLF和LB、5pmolF3和B3，tcdB引物为：40pmolFIP和BIP、20pmolLF和LB、5pmolF3和B3。
8.根据权利要求5~7中任一项所述的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒可同步定性检测艰难梭菌tcdA和tcdB。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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| CN102952886A (zh) * | 2012-11-28 | 2013-03-06 | 中华人民共和国张家港出入境检验检疫局 | 艰难梭菌肠毒素a、b双重荧光定量pcr检测方法及检测用试剂盒 |
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