CN108384837A - 一种基于荧光定量系统的lamp定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法，该方法利用荧光定量PCR仪就能实现LAMP定量，将LAMP技术与荧光定量技术结合，建立了一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法，该方法可以达到定量的目的，同时操作简单、灵敏度高、重复性好，使LAMP检测更加精准便捷。为实现LAMP精准定量开拓了一个新方向。
Description
技术领域
本发明属于基因定量领域，更具体地说，尤其涉及一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法。
背景技术
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是2000年由日本科学家Notomin提出的一种核酸扩增新技术。它利用Bst DNA 聚合酶及4-6条引物，可以在60-65℃环境下，通过链置换反应直接扩增目的片段，且反应时间仅需15-60min。LAMP技术近年已被大量推广用于病原微生物的检测。
目前LAMP技术多用于定性实验，也可通过浊度仪检测副产物焦磷酸镁沉淀，从而间接达到基因定量的目的，该方法所需浊度仪应用范围较窄，且仪器成本高。而实时荧光定量PCR（qPCR）是一项比较成熟的基因定量技术，目前市场存在多种用于该实验的荧光染料，如SYBR Green I，Evagreen，SYTO-82等。
本发明将LAMP技术与荧光定量技术结合，建立了一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法。该方法可以达到定量的目的，同时操作简单、灵敏度高、重复性好，使LAMP检测更加精准便捷。为实现LAMP精准定量开拓了一个新方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法，该方法利用荧光定量PCR仪实现LAMP定量，采用2种常用荧光染料测试LAMP反应，并对染料浓度进行筛选确定，具体包括以下内容：
Evagreen染料浓度的优化，该染料低浓度对PCR及LAMP抑制作用较小，优化浓度为：0.2X, 0.6X, 1.0X, 1.4X, 1.8X, 2.2X；
SYTO-82染料浓度的优化，SYTO-82是一种稳定性高，信噪比低的荧光染料，低浓度对PCR及LAMP抑制作用较小，优化浓度为：45μM, 35μM, 25μM, 15μM, 5μM, 2.5μM；
本发明建立的LAMP定量体系为：总体积20μL，包括：1x Thermopol buffer (20 mMTris-HCl，(pH8.8)，10 mM KCl，10 mM(NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1%.Triton X-100)，6 mMMgSO4，1.4 mM dNTPs，0.8 M 甜菜碱，0.2 μM外引物（tcdA-F3,tcdA-B3），1.6μM 内引物（tcdA-FIP,tcdA-BIP），0.8μM环引物（tcdA-LB），320 U/mL Bst DNA 聚合酶 0.2X-2.2XEvagreen 或2.5-45μM SYTO-82 ，模板DNA 1μL，ddH2O补足至20μL。LAMP荧光定量检测程序为：63℃ 15s； 63℃ 30s，63℃ 30s,60个循环；95℃ 2min;25℃ 2min。95℃ 2 min处理使酶失活，可以有效降低污染率，25℃ 2 min使反应体系恢复至室温，避免下机时离心管盖弹开，造成气溶胶污染。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明将LAMP技术与荧光定量技术结合，建立了一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法，该方法可以达到定量的目的，同时操作简单、灵敏度高、重复性好，使LAMP检测更加精准便捷，为实现LAMP精准定量开拓了一个新方向。
附图说明：
图1：不同浓度荧光染料Evagreen测试LAMP荧光图
图2：不同浓度荧光染料SYTO-82测试LAMP荧光图
图3：Evagreen测试艰难梭菌荧光图
图4：SYTO-82测试艰难梭菌荧光图
图5：Evagreen 测试艰难梭菌标准曲线
图6：SYTO-82测试艰难梭菌标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法，该方法利用荧光定量PCR仪实现LAMP定量，对qLAMP所用染料浓度进行筛选，并基于该染料，建立检测艰难梭菌tcdA基因标准曲线具体包括以下内容：
具体实施例1：qLAMP使用Evagreen染料和SYTO-82染料浓度优化
实验材料：艰难梭菌(Clostridium difficile, ATCC 43255)过夜培养，提取DNA备用。所用引物如下：
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实验方法：Evagreen染料浓度的优化，优化浓度梯度为：0.2X, 0.6X, 1.0X, 1.4X,1.8X, 2.2X；
SYTO-82染料浓度的优化，LAMP优化浓度梯度为：45μM, 35μM, 25μM, 15μM, 5μM, 2.5μM；
染料优化LAMP定量体系为：总体积20μL，包括：1x Thermopol buffer (20 mM Tris-HCl，(pH8.8)，10 mM KCl，10 mM(NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1%.Triton X-100)，6 mM MgSO4，1.4 mM dNTPs，0.8 M 甜菜碱，0.2 μM外引物（tcdA-F3,tcdA-B3），1.6 μM 内引物（tcdA-FIP,tcdA-BIP），0.8 μM环引物（tcdA-LB），320 U/mL Bst DNA 聚合酶0.2X-2.2X Evagreen或2.5-45μM SYTO-82，艰难梭菌DNA 1 μL，ddH2O补足至20μL。LAMP荧光定量检测程序为：63℃ 15s； 63℃ 30s，63℃ 30s，60个循环；95℃ 2min；25℃ 2min。
结果：2种荧光染料均显示，浓度越低，对体系抑制作用越小，反应时间也越短；同时荧光强度也越弱。综合考虑染料抑制作用和荧光强度，Evagreen染料最适浓度为1X,SYTO-82的最适浓度为15 μM。
具体实施例2：基于Evagreen染料和SYTO-82染料，建立检测艰难梭菌tcdA基因标准曲线。
实验材料：艰难梭菌(Clostridium difficile, ATCC 43255)过夜培养，提取DNA备用，分别用2种常用的荧光染料： Evagreen和SYTO-82对艰难梭杆菌tcdA基因进行荧光定量实验。所用引物如下：
tcdA-F3：GCCATATTYTTTAGATTCAGACAA
tcdA-B3：CTAAAAAAAGAAYTAGAAGCTAAGG
tcdA-FIP：GCTGGTATATCTGCRGGAATACYTRTTTACCACTGAAGTTGCCTT
tcdA-BIP：TTCAGCACCTATTCCAACAATTGAGGGTGTTTTAGCAATAAATATGTCA
tcdA-LB：AGCTACMGTTGCAGCTATAGA
实验方法：提取艰难梭菌DNA，并稀释DNA样本至10ng/μL，1ng/μL, 100pg/μL, 10pg/μL, 1pg/μL, 100fg/μL, 10fg/μL, 1fg/μL。以这些样本为模板，分别以荧光染料浓度分别为Evagreen 1X, SYTO-82 15μM进行荧光定量扩增。
LAMP定量体系为：总体积20μL，包括：1x Thermopol buffer (20 mM Tris-HCl，(pH8.8)，10 mM KCl，10 mM(NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1%.Triton X-100)，6 mM MgSO4，1.4mM dNTPs，0.8 M 甜菜碱，0.2 μM外引物（tcdA-F3,tcdA-B3），1.6 μM 内引物（tcdA-FIP,tcdA-BIP），0.8 μM环引物（tcdA-LB），320 U/mL Bst DNA 聚合酶，1X Evagreen 或15 μMSYTO-82，艰难梭菌DNA 1 μL，ddH2O补足至20μL。LAMP荧光定量检测程序为：63℃ 15s；60个循环：63℃ 30s，63℃ 30s；95℃ 2min；25℃ 2min。
结果:2种荧光染料测试结果均显示以该方法对艰难梭菌检测的最低检测限为1pg/ul。且标准曲线R2＞0.950。
Evagreen 测试艰难梭菌的标准曲线线性方程为：y= -0.941ln(x)+ 26.163，R²=0.9694。其中：x为模板DNA浓度，y为CT值，R2为线性相关系数。从结果来看，R2为0.9694，这表明建立的基于Evagreen LAMP定量检测艰难梭菌是可行的。
SYTO-82 测试艰难梭菌的标准曲线线性方程为：y= -1.093ln(x)+ 28.271，R =0.9743。其中：x为模板DNA浓度，y为CT值，R2为线性相关系数。从结果来看，R2为0.9743，这表明建立的基于SYTO-82 LAMP定量检测艰难梭菌是可行的。
综上所述，基于荧光定量系统的LAMP定量是可行的。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法，该方法利用荧光定量PCR仪实现LAMP定量，采用2种常用荧光染料测试LAMP反应，并对染料浓度进行筛选确定，具体包括以下内容：
Evagreen染料浓度的优化，该染料低浓度对PCR及LAMP抑制作用较小，优化浓度梯度为：0.2X, 0.6X, 1.0X, 1.4X, 1.8X, 2.2X；
SYTO-82染料浓度的优化，SYTO-82是一种稳定性高，信噪比低的荧光染料，低浓度对PCR及LAMP抑制作用较小，优化浓度梯度为：45μM, 35μM, 25μM, 15μM, 5μM, 2.5μM；
本发明建立的LAMP定量体系为：总体积20μL，包括：1x Thermopol buffer (20 mMTris-HCl，(pH8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1%.Triton X-100)，6 mMMgSO4，1.4 mM dNTPs，0.8 M 甜菜碱，0.2μM外引物（tcdA-F3,tcdA-B3），1.6μM 内引物（tcdA-FIP,tcdA-BIP），0.8μM环引物（tcdA-LB），320 U/mL Bst DNA 聚合酶，0.2X-2.2XEvagreen 或2.5-45μM SYTO-82，模板DNA 1μL，ddH2O补足至20μL；
LAMP荧光定量检测程序为：63℃ 15s； 63℃ 30s，63℃ 30s，60个循环；95℃ 2min；25℃，2min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Xiao Chuanxing Inventor after: Wang Qizhi Inventor after: Yang Luxi Inventor after: Ke Xiquan Inventor after: Li Dapeng Inventor after: Li Xiaoyan Inventor before: Yang Luxi Inventor before: Li Xiaoyan |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20190709 Address after: Room W606A, Taiwanese Science and Technology Enterprise Development Center, No. 88 Xiangxing Road, Torch High-tech Zone, Xiamen City, Fujian Province, 361000 Applicant after: XIAMEN LANTE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Applicant after: THE FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF BENGBU MEDICAL College Address before: Room W606A, Taiwanese Science and Technology Enterprise Development Center, No. 88 Xiangxing Road, Torch High-tech Zone, Xiamen City, Fujian Province, 361000 Applicant before: XIAMEN LANTE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180810 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |