CN101475986B - 一种对多种弧菌进行基因检测的共检芯片及其检测与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对多种弧菌进行基因检测的共检芯片及其检测与应用。提供了鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌和费氏弧菌的每一种弧菌相对应16S rRNA探针序列、热休克蛋白hsp60探针序列、毒力基因探针序列、16S rRNA正向引物序列、16S rRNA反向引物序列、热休克蛋白hsp60正向引物序列、热休克蛋白hsp60反向引物序列、毒力基因正向引物序列和毒力基因反向引物序列。本发明具有特异、灵敏和高通量的特性，可同时对6种细菌毒力基因进行检测，作为病害预警的重要检测手段应用于水产动物临床诊断将有效地指导生产。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体讲是一种用于检测水生生物细菌分离物中的鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌和费氏弧菌DNA的基因芯片，以及利用所述诊断性基因芯片制备方法进行细菌病的检测。
背景技术
目前，细菌检测方法的报道有很多，除了传统的生理生化检测结合16S rRNA测序之外，还有免疫学检测如间接荧光抗体技术、核酸印迹杂交及PCR检测等方法。传统的细菌培养方法及生化鉴定，操作繁琐、且需要数天才能得到结果，免疫学方法荧光抗体技术从制样到完成检测只需3～4h，缺点是免疫检测需要制备抗血清。探针杂交技术也存在特异性和灵敏度的问题。常规PCR一次只能检出一种致病菌，对分离的大量未知菌，或多种细菌感染的样品则显的无从下手。
基因芯片是20世纪90年代发展起来的分子生物学技术，广泛应用于疾病的基因诊断，基因表达分析、基因组研究、药物筛选、微生物检测等领域，影响着生命科学许多领域的研究方法和途径。基因芯片用于海水养殖动物病害的诊断尚处于起步阶段。目前，未见应用该技术同时对水生生物鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌和费氏弧菌进行检测的相关基因芯片应用的报道。本发明基因芯片技术具有高通量、快速、平行核酸序列测定及定量分析的特性，可同时检测大量样品，通过程序化操作，直接用肉眼就可判断结果，可使防治细菌病的有效性得到大幅度提高。对我国海水养殖生物病害监测控制将产生深远影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测水生生物鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌和费氏弧菌的共检基因芯片及其检测方法。该技术鉴定病原菌具有快速、灵敏、高通量的特点，是现有细菌毒力株鉴定技术的突破。
本发明基因检测的共检芯片利用在细菌分类学上具有重要意义的16S rRNA基因和热休克蛋白hsp60基因作为检测的靶分子，并在其间设计检测探针，建立一套针对多种弧菌的基因芯片快速检测技术。鉴于有些同属同种不同株的细菌鉴定只限于16S rRNA的基因鉴别是不能将它们有效区分开的，而不同株的细菌在是否致病及致病力强弱上有很大差别，而且毒力基因的存在与否对于菌株的鉴别很重要，必需分别采用各自毒力相关基因为模板，设计引物和探针，来进行菌的区分检测。考虑到基因芯片的平行性和无限延展性，利用该技术设计出细菌毒力基因的探针和引物，以便能较快检测出至少由一种或几种细菌。
因此，本发明的基因芯片提供了一种对多种弧菌进行基因检测的共检芯片，其特征在于该基因芯片包括鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌和费氏弧菌的每一种弧菌相对应16S rRNA探针序列、热休克蛋白hsp60探针序列与相应于各个毒力基因的探针序列、16S rRNA正向引物序列、16S rRNA反向引物序列、热休克蛋白hsp60正向引物序列、热休克蛋白hsp60反向引物序列以及相应于各个毒力基因的正向引物序列和反向引物序列，且每一种弧菌相对应的探针都固定于固相载体尼龙膜或硝酸纤维素膜上.
上述毒力基因包括鳗弧菌毒力基因virA、毒力基因vah、毒力基因virC、毒力基因flaA、毒力基因empA和毒力基因angM共6种毒力基因；哈维氏弧菌毒力基因pap6和毒力基因hemoluticus共2种毒力基因；溶藻胶弧菌毒力基因tlh和毒力基因ompK共2种毒力基因；副溶血弧菌毒力基因trh、毒力基因tdh和毒力基因vppC共3种毒力基因；灿烂弧菌毒力基因aerv、毒力基因als和毒力基因vsm共3种毒力基因；费氏弧菌毒力基因Ampc。上述每一种毒力基因的探针序列和正向引物及反向引物序列如下：
(1)鳗弧菌16S rRNA探针序列P对应于表1中序号3，鳗弧菌16S rRNA正向引物序列F对应于表1中序号1，16S rRNA反向引物序列A对应于表1中序号2；
其中，所述的鳗弧菌热休克蛋白hsp60探针序列P对应于表1中序号6，鳗弧菌热休克蛋白hsp60正向引物序列F对应于表1中序号4，鳗弧菌热休克蛋白hsp60反向引物序列A对应于表1中序号5；
其中，所述的鳗弧菌毒力基因virA探针序列P对应于表1中序号9，鳗弧菌毒力基因virA正向引物序列F对应于表1中序号7，鳗弧菌毒力基因virA反向引物序列A对应于表1中序号8；
其中，所述的鳗弧菌毒力基因vah探针序列P对应于表1中序号12，鳗弧菌毒力基因vah正向引物序列F对应于表1中序号10，鳗弧菌毒力基因vah反向引物序列A对应于表1中序号11；
其中，所述的鳗弧菌毒力基因virC探针序列P对应于表1中序号15，鳗弧菌毒力基因virC正向引物序列F对应于表1中序号13，鳗弧菌毒力基因virC反向引物序列A对应于表1中序号14；
其中，所述的鳗弧菌毒力基因flaA探针序列P对应于表1中序号18，鳗弧菌毒力基因flaA正向引物序列F对应于表1中序号16，鳗弧菌毒力基因flaA反向引物序列A对应于表1中序号17；
其中，所述的鳗弧菌毒力基因empA探针序列P对应于表1中序号21，鳗弧菌毒力基因empA正向引物序列F对应于表1中序号19，鳗弧菌毒力基因empA反向引物序列A对应于表1中序号20；
其中，所述的鳗弧菌毒力基因angM探针序列P对应于表1中序号24，鳗弧菌毒力基因angM正向引物序列F对应于表1中序号22，鳗弧菌毒力基因angM反向引物序列A对应于表1中序号23；
(2)哈维氏弧菌16S rRNA探针序列P对应于表1中序号51，哈维氏弧菌16S rRNA正向引物序列F对应于表1中序号49，哈维氏弧菌16S rRNA反向引物序列A对应于表1中序号50；
其中，哈维氏弧菌热休克蛋白hsp60探针序列P对应于表1中序号54，哈维氏弧菌热休克蛋白hsp60正向引物序列F对应于表1中序号52，哈维氏弧菌热休克蛋白hsp60反向引物序列A对应于表1中序号53；
其中，哈维氏弧菌毒力基因pap6探针序列P对应于表1中序号57；哈维氏弧菌毒力基因pap6正向引物序列F对应于表1中序号55；哈维氏弧菌毒力基因pap6反向引物序列A对应于表1中序号56；
其中，哈维氏弧菌毒力基因hemoluticus探针序列P对应于表1中序号60，哈维氏弧菌毒力基因hemoluticus正向引物序列F对应于表1中序号58，哈维氏弧菌毒力基因hemoluticus反向引物序列A对应于表1中序号59；
(3)溶藻胶弧菌热休克蛋白hsp60探针序列P对应于表1中序号42，溶藻胶弧菌热休克蛋白hsp60正向引物序列F对应于表1中序号40，溶藻胶弧菌热休克蛋白hsp60反向引物序列A对应于表1中序号41，
其中，溶藻胶弧菌毒力基因tlh探针序列P对应于表1中序号45，溶藻胶弧菌毒力基因tlh正向引物序列F对应于表1中序号43，溶藻胶弧菌毒力基因tlh反向引物序列A对应于表1中序号44；
其中，溶藻胶弧菌毒力基因ompK探针序列对应于表1中序号48，溶藻胶弧菌毒力基因ompK正向引物序列F对应于表1中序号46，溶藻胶弧菌毒力基因ompK反向引物序列A对应于表1中序号47；
(4)副溶血弧菌16S rRNA探针序列P对应于表1中序号27，副溶血弧菌16S rRNA正向引物序列F对应于表1中序号25，1副溶血弧菌6S rRNA反向引物序列A对应于表1中序号26；
其中，副溶血弧菌热休克蛋白hsp60探针序列P对应于表1中序号30，副溶血弧菌热休克蛋白hsp60正向引物序列F对应于表1中序号28，副溶血弧菌热休克蛋白hsp60反向引物序列A对应于表1中序号29；
其中，副溶血弧菌毒力基因trh探针序列P对应于表1中序号33，副溶血弧菌毒力基因trh正向引物序列F对应于表1中序号31，副溶血弧菌毒力基因trh反向引物序列A对应于表1中序号32；
其中，副溶血弧菌毒力基因tdh探针序列P对应于表1中序号36，副溶血弧菌毒力基因tdh正向引物序列F对应于表1中序号34，副溶血弧菌毒力基因tdh反向引物序列A对应于表1中序号35；
其中，副溶血弧菌毒力基因vppC探针序列P对应于表1中序号39，副溶血弧菌毒力基因vppC正向引物序列F对应于表1中序号37，副溶血弧菌毒力基因vppC反向引物序列A对应于表1中序号38；
(5)灿烂弧菌16S rRNA探针序列P对应于表1中序号69，灿烂弧菌16S rRNA正向引物序列F对应于表1中序号67，灿烂弧菌16S rRNA反向引物序列A对应于表1中序号68；
其中，灿烂弧菌毒力基因aerv探针序列P对应于表1中序号72，灿烂弧菌毒力基因aerv正向引物序列F对应于表1中序号70，灿烂弧菌毒力基因aerv反向引物序列A对应于表1中序号71；
其中，灿烂弧菌毒力基因als探针序列P对应于表1中序号75，灿烂弧菌毒力基因als正向引物序列F对应于表1中序号73，灿烂弧菌毒力基因als反向引物序列A对应于表1中序号74；
其中，灿烂弧菌毒力基因vsm探针序列P对应于表1中序号78，灿烂弧菌毒力基因vsm正向引物序列F对应于表1中序号76，灿烂弧菌毒力基因vsm反向引物序列A对应于表1中序号77；
(6)费氏弧菌16S rRNA探针序列P对应于表1中序号63，费氏弧菌16S rRNA正向引物序列F对应于表1中序号61，费氏弧菌16S rRNA反向引物序列A对应于表1中序列62，
其中，费氏弧菌毒力基因Ampc探针序列P对应于表1中序号66，费氏弧菌毒力基因Ampc正向引物序列F对应于表1中序号64，费氏弧菌毒力基因Ampc反向引物序列A对应于表1中序号65；
表1
F是正向引物序列；A是反向引物序列；P是探针序列
本发明基因芯片是将商业性合成的鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌和费氏弧菌的每种弧菌的16S rRNA和热休克蛋白hsp60探针；鳗弧菌6种毒力基因(毒力基因virA、毒力基因vah、毒力基因virC、毒力基因flaA、毒力基因empA、毒力基因angM)、哈维氏弧菌2种毒力基因(毒力基因pap6、毒力基因hemoluticus)、溶藻胶弧菌2种毒力基因(毒力基因tlh、毒力基因ompK)、副溶血弧菌3种毒力基因(毒力基因trh、毒力基因tdh、毒力基因vppC)、灿烂弧菌3种毒力基因(毒力基因aerv、毒力基因als、毒力基因vsm)和费氏弧菌毒力基因Ampc的每一种弧菌中相对应毒力基因探针，在固相载体-尼龙膜或硝酸纤维素膜上按预先设定好的顺序进行点样。
本发明所述的基因芯片检测方法包括以下步骤：(1)待检样品准备、(2)地高辛标记的PCR扩增、(3)预杂交、(4)利用杂交液进行杂交、(5)加入抗体、(6)显色并根据杂交点显示蓝色或蓝紫色与不显色来判断样品的阳性或阴性。
所述的步骤(1)待检样品准备：按照DNA抽提方法对待检样品的核酸进行提取，以提取的核酸DNA作为模板。
所述的步骤(2)地高辛标记的PCR扩增体系是：无菌去离子水30.5μL，10×reactionbuffer 5μL，MgCl2(20mM)3μL，PCR地高辛标记混合物5μL，正向引物(10μM)和反向引物(10μM)各2μL，Taq DNA聚合酶(5unit/μL)0.5μL，待检样品DNA 2μL，该反应体系总体积50μL。PCR扩增程序：94℃ 4min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 40s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
所述的步骤(3)(4)预杂交和利用杂交液进行杂交步骤中，采用的预杂交液是由以下体积比组份组成的：以标准柠檬酸盐溶液(SSC)定容1000份；20％的十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)：1～10份；10％的十二烷基硫酸钠(SDS)：1～5份，再溶解封闭剂(BlockingReagentII)10mg，杂交液是预杂交液组分中加入地高辛标记待检样品浓度为20ng/mL。
所述的步骤(6)显色并根据杂交点显示蓝色或蓝紫色与不显色来判断样品的阳性或阴性：显色结束后的芯片可根据杂交点出现的位置人工肉眼判读，若显示蓝色或蓝紫色杂交点，则表示该样品有相对应的弧菌检测结果阳性，若不显示任何颜色，则表示该样品有相对应的弧菌检测结果阴性。
本发明具有特异、灵敏和高通量的特性，直接用肉眼就可判断结果，可同时查明几种细菌，使防治细菌病的有效性得到大幅度提高，将有效地指导生产，监控疾病的发生和流行，作为病害预警的重要检测手段对我国海水养殖生物病害监测控制将产生深远影响.
具体实施方式
本发明的基因芯片提供了鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌和费氏弧菌的每一种弧菌相对应16S rRNA探针序列、热休克蛋白hsp60探针序列、16SrRNA正向引物序列、16S rRNA反向引物序列、热休克蛋白hsp60正向引物序列、热休克蛋白hsp60反向引物序列，此外，还包括鳗弧菌毒力基因virA、毒力基因vah、毒力基因virC、毒力基因flaA、毒力基因empA和毒力基因angM共6种毒力基因；哈维氏弧菌毒力基因pap6和毒力基因hemoluticus共2种毒力基因；溶藻胶弧菌毒力基因tlh和毒力基因ompK共2种毒力基因；副溶血弧菌毒力基因trh、毒力基因tdh和毒力基因vppC共3种毒力基因；灿烂弧菌毒力基因aerv、毒力基因als和毒力基因vsm共3种毒力基因；费氏弧菌毒力基因Ampc。每一种弧菌相对应的16S rRNA、热休克蛋白hsp60和毒力基因的探针及正向引物序列和反向引物序列见表1。
本发明共检芯片的具体制备如下。使用常用的引物设计软件(如Primer Primier 5.0或Omiga 2.0)按照引物和探针的设计要求进行设计。将设计好的引物和探针进行商业性合成(如上海生物工程有限公司)。然后，使用自动点样仪或手动点样仪将鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌和费氏弧菌的每种弧菌的16S rRNA和热休克蛋白hsp60探针；鳗弧菌6种毒力基因(毒力基因virA、毒力基因vah、毒力基因virC、毒力基因flaA、毒力基因empA、毒力基因angM)、哈维氏弧菌2种毒力基因(毒力基因pap6、毒力基因hemoluticus)、溶藻胶弧菌2种毒力基因(毒力基因tlh、毒力基因ompK)、副溶血弧菌3种毒力基因(毒力基因trh、毒力基因tdh、毒力基因vppC)、灿烂弧菌3种毒力基因(毒力基因aerv、毒力基因als、毒力基因vsm)和费氏弧菌毒力基因Ampc的每一种弧菌中相对应毒力基因探针，在固相载体-尼龙膜或硝酸纤维素膜上按预先设定好的顺序进行点样；最后，将点样后的固相载体在紫外仪中交联3分钟，使探针牢固地固定在载体上而得到。
利用本发明基因芯片的检测方法包括以下步骤：(1)待检样品准备、(2)地高辛标记的PCR扩增、(3)预杂交、(4)利用杂交液进行杂交、(5)加入抗体、(6)显色并根据杂交点显示蓝色或蓝紫色与不显色来判断样品的阳性或阴性。
步骤(1)待检样品准备：将水生生物细菌分离物(如海水鱼类)按照DNA抽提方法对待检样品的核酸进行提取，以提取的核酸DNA作为模板。
步骤(2)地高辛标记的PCR扩增：无菌去离子水30.5μL，10×reaction buffer 5μL，MgCl2(20mM)3μL，PCR地高辛标记混合物5μL，正向引物(10μM)和反向引物(10μM)各2μL，TaqDNA聚合酶(5unit/μL)0.5μL，待检样品DNA 2μL，该反应体系总体积50μL。PCR扩增程序：94℃ 4min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 40s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
步骤(3)预杂交和(4)利用杂交液进行杂交步骤中，采用的预杂交液是由以下组份组成的：以标准柠檬酸盐溶液(SSC)定容1000份；20％的十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)：5份；10％的十二烷基硫酸钠(SDS)：2份，再溶解封闭剂(Blocking ReagentII)10mg。在42℃预杂交2h，用预杂交液配制样品杂交液，杂交液中地高辛标记待检样品浓度为20ng/mL。在沸水中煮沸10min，然后立即在冰水中冷却2min；预杂交结束后倒出预杂交液，加入0.3mL经过变性的样品杂交液，封口后在42℃水浴中轻微晃动杂交2h。
步骤(5)加入抗体：杂交结束后取出膜，用2×SSC/0.1％SDS室温洗膜两次，每次5min；在42℃水浴中用3mL 0.1×SSC/0.1％SDS洗两次，每次15min；将膜放进2mL buffer I中(0.1mol/L Tris Base，0.15mol/LNaCl，pH 7.5)室温洗2min；用0.3ml block buffer II(1mLbuffer II含5mg封闭剂和1mL buffer I)室温封闭30min；加入6μL碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(1∶100)，反应30min。
步骤(6)显色并根据杂交点显示蓝色或蓝紫色与不显色来判断样品的阳性或阴性。将膜取出，用buffer I洗两次，每次15min；再用buffer III(0.1mol/L Tris Base，0.1mol/L NaCl，pH9.5，0.05mol/L MgCl2·6H2O)洗2min；放进显色液(NBT-BCIP)中暗处显色10-30min，不要摇晃，可短暂取出观察，待样品显色而本底刚好不显色时取出膜，在蒸馏水中浸泡30min终止显色，自然晾干。显色结束后的芯片可根据杂交点出现的位置人工肉眼判读，若显示蓝色或蓝紫色杂交点，则表示该样品有相对应的弧菌检测结果阳性，若不显示任何颜色，则表示该样品有相对应的弧菌检测结果阴性。
<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的鳗弧菌毒力基因empA相关数据，按引物设计的毒力基因empA正向引物F
<400>19
ttcctcgcag cctctatcag 20
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的鳗弧菌毒力基因empA相关数据，按引物设计的毒力基因empA反向引物A
<400>20
ttctgtaaca agatccgcac tc 22
<210>21
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的鳗弧菌毒力基因empA相关数据，按探针设计的毒力基因empA探针P
<400>21
caggttgatg atccaagtct actagaacaa gctttatcca tgcaggc 47
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的鳗弧菌毒力基因angM相关数据，按引物设计的毒力基因angM正向引物F
<400>22
cctgaagttg agcctcgtaa g 21
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的鳗弧菌毒力基因angM相关数据，按引物设计的毒力基因angM反向引物A
<400>23
cgctttgatg ctgaagttga c 21
<210>24
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的鳗弧菌毒力基因angM相关数据，按探针设计的毒力基因angM探针P
<400>24
ttaagtcttt ctcgtcaata acctgttgta tggaaccatc agtaccctcg tt 52
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的16S rRNA正向引物F
<400>25
gcggcagcgg gaaagtag 18
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的16S rRNA反向引物A
<400>26
accgtgtctc agttccagtg 20
<210>27
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌不同菌株相关数据，按探针设计的16S rRNA探针P
<400>27
cctaacacat gcaagtggag cggaaacgag ttatctgaac cttcggg 47
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的热休克蛋白hsp60正向引物F
<400>28
gcaagcaatc gtcaatgaag g 21
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的热休克蛋白hsp60反向引物A
<400>29
aaggatgaat gggttgtcta gc 22
<210>30
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌不同菌株相关数据，按探针设计的热休克蛋白hsp60探针P
<400>30
ctgttgagtg taacgacacc aaatcaatcg ctcaggtggg tactatc 47
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌毒力基因trh相关数据，按引物设计的毒力基因trh正向引物F
<400>31
tccttctcct ggttccgatg 20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌毒力基因trh相关数据，按引物设计的毒力基因trh反向引物A
<400>32
atatgtccat tgccgctctc 20
<210>33
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌毒力基因trh相关数据，按探针设计的毒力基因trh探针P
<400>33
atacgatggc tgctctttct ggttataaac atggtacttc tacggtcttc a 51
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌毒力基因tdh相关数据，按引物设计的毒力基因tdh正向引物F
<400>34
catccgtcat tctggcaaag 20
<210>35
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌毒力基因tdh相关数据，按引物设计的毒力基因tdh反向引物A
<400>35
accttcatct tcaccaacaa ag 22
<210>36
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌毒力基因tdh相关数据，按探针设计的毒力基因tdh探针P
<400>36
aagactatac aatggcagcg gtgtctggct ataagagcgg tcattct 47
<210>37
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌毒力基因vppC相关数据，按引物设计要求而设计的毒力基因
vppC正向引物F
<400>37
gcaatgagcg agccagtag 19
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌毒力基因vppC相关数据，按引物设计的毒力基因vppC反向引
物A
<400>38
gttggtggtt gtgaacgatt c 21
<210>39
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的副溶血弧菌毒力基因vppC相关数据，按探针设计的毒力基因vppC探针P
<400>39
gtcacagaga aagttgaaca tcatcagcac gaacacggtg tagaaac 47
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的溶藻胶弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的热休克蛋白hsp60正向引物F
<400>40
agaagcaatg gagcgtgtg 19
<210>41
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的溶藻胶弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的热休克蛋白hsp60反向引物A
<400>41
atgataagca gtggacgaga tg 22
<210>42
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的溶藻胶弧菌不同菌株相关数据，按探针设计的热休克蛋白hsp60探针P
<400>42
ggttacctgt ctccttactt catcaacaac caagaatcag gcagtgt 47
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的溶藻胶弧菌毒力基因tlh相关数据，按引物设计的毒力基因tlh正向引物F
<400>43
ttgatgacac tgcctgatgc 20
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的溶藻胶弧菌毒力基因tlh相关数据，按引物设计的毒力基因tlh反向引物A
<400>44
acagaggatg aacggttgat g 21
<210>45
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的溶藻胶弧菌毒力基因tlh相关数据，按探针设计的毒力基因tlh探针P
<400>45
ggctacaaca tcgcattgtt tgatacacac gcactgtttg agaagtta 48
<210>46
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的溶藻胶弧菌毒力基因ompK相关数据，按引物设计的毒力基因ompK正向
引物F
<400>46
agttatggcg gcagattact c 21
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的溶藻胶弧菌毒力基因ompK相关数据，按引物设计的毒力基因ompK反向
引物A
<400>47
ttgaactgga ccgaaagata gg 22
<210>48
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的溶藻胶弧菌毒力基因ompK相关数据，按探针设计的毒力基因ompK探针P
<400>48
cgtatttaac ctagcgacta aagataacca agataagtca atcgagaacg gcg 53
<210>49
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的16S rRNA正向引物F
<400>49
agtcgtgagg aaggtagtgt ag 22
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的16S rRNA反向引物A
<400>50
ccacaacctc caagtagaca tc 22
<210>51
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌不同菌株相关数据，按探针设计的16S rRNA探针P
<400>51
caacctcgga atagcatttg aaactggcag actagagtac tgtagag 47
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的热休克蛋白hsp60正向引物F
<400>52
agcagttatc gcagcagttg 20
<210>53
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的热休克蛋白hsp60反向引物A
<400>53
tggaagaagt tcacggatgt tc 22
<210>54
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌不同菌株相关数据，按探针设计的热休克蛋白hsp60探针P
<400>54
catctctgcg aactctgact caagcgtagg taacatcatt gctgaag 47
<210>55
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌毒力基因pap6相关数据，按引物设计的毒力基因pap6正向引
物F
<400>55
acggcaggtg agcaacag 18
<210>56
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌毒力基因pap6相关数据，按引物设计的毒力基因pap6反向引
物A
<400>56
ggtcttgtgg ttctggattt gg 22
<210>57
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌毒力基因pap6相关数据，按探针设计的毒力基因pap6探针P
<400>57
ccagcaacac cttcagatta cgactgttca tcgaccaata tgggtaa 47
<210>58
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌毒力基因hemoluticus相关数据，按引物设计的毒力基因
hemoluticus正向引物F
<400>58
ggtcagtgcc tctcaagtaa g 21
<210>59
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌毒力基因hemoluticus相关数据，按引物设计的毒力基因
hemoluticus反向引物A
<400>59
ggtcgttgct ccagatagta tg 22
<210>60
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的哈维氏弧菌毒力基因hemoluticus相关数据，按探针设计的毒力基因
hemoluticus探针P
<400>60
agttacttca cgcttgatgg ctactggtgg agttcggttt ctttcaa 47
<210>61
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的费氏弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的16S rRNA正向引物F
<400>61
gcctgggaat atgccttagt g 21
<210>62
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的费氏弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的16S rRNA反向引物A
<400>62
ggtgcttctt ctgtaggtaa cg 22
<210>63
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的费氏弧菌不同菌株相关数据，按探针设计的16S rRNA探针P
<400>63
gggataacta ttggaaacga tagctaatac cgcataatgt cttcggacca 50
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的费氏弧菌毒力基因Ampc相关数据，按引物设计的毒力基因Ampc正向引
物F
<400>64
cctgcgtgct attggtgatg 20
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的费氏弧菌毒力基因Ampc相关数据，按引物设计的毒力基因Ampc反向引
物A
<400>65
ccatactgcg gctgtaatgc 20
<210>66
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的费氏弧菌毒力基因Ampc相关数据，按探针设计的毒力基因Ampc探针P
<400>66
gtctcaaaca ctcaacgctt tgttatttgg taacacttta aacccacagg atg 53
<210>67
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的16S rRNA正向引物F
<400>67
gcggaaacga caacattgaa tc 22
<210>68
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌不同菌株相关数据，按引物设计的16S rRNA反向引物A
<400>68
gccattacct caccaactag c 21
<210>69
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌不同菌株相关数据，按探针设计的16s rRNA探针P
<400>69
gggataacca ttggaaacga tggctaatac cgcataatgc ctacggg 47
<210>70
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌毒力基因aerv相关数据，按引物设计的毒力基因aerv正向引物F
<400>70
tgtatgtcgc tctggctatc g 21
<210>71
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌毒力基因aerv相关数据，按引物设计的毒力基因aerv反向引物A
<400>71
actcgctacc ttctggaact g 21
<210>72
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌毒力基因aerv相关数据，按探针设计的毒力基因aerv探针P
<400>72
ttctgttatc cgaacaatga ccagtctgag attccaaact actctgct 48
<210>73
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌毒力基因als相关数据，按引物设计的毒力基因als正向引物F
<400>73
tcacgaatct tggcggtaat g 21
<210>74
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌毒力基因als相关数据，按引物设计的毒力基因als反向引物A
<400>74
cggttgctgc tgtgttgg 18
<210>75
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌毒力基因als相关数据，按探针设计的毒力基因als探针P
<400>75
cagaccaact gttgaatgct attacccttg ttgttacctc tgggttt 47
<210>76
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌毒力基因vsm相关数据，按引物设计的毒力基因vsm正向引物F
<400>76
actcaagtgt tcggttccat g 21
<210>77
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌毒力基因vsm相关数据，按引物设计的毒力基因vsm反向引物A
<400>77
cgtcggcaca gttgtagc 18
<210>78
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Genbank登录的灿烂弧菌毒力基因vsm相关数据，按探针设计的毒力基因vsm探针P
<400>78
atcctctatg ccagaacgcc ctttctactt tattgatgcc acgactg 47。
Claims (2)
1.一种对多种弧菌进行基因检测的共检芯片，其特征在于该基因芯片包括鳗弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌和费氏弧菌的每一种弧菌相对应16S rRNA探针序列、热休克蛋白hsp60探针序列与相应于各个毒力基因的探针序列、16S rRNA正向引物序列、16S rRNA反向引物序列、热休克蛋白hsp60正向引物序列、热休克蛋白hsp60反向引物序列以及相应于各个毒力基因的正向引物序列和反向引物序列，如下列表1，且每一种弧菌相对应的探针都固定于固相载体尼龙膜或硝酸纤维素膜上；
其中，F是正向引物序列；A是反向引物序列；P是探针序列。
2.利用权利要求1所述的共检芯片进行检测的方法，依次包括以下步骤：(1)待检样品准备、(2)地高辛标记的PCR扩增、(3)预杂交、(4)利用杂交液进行杂交、(5)加入抗体和(6)显色并根据杂交点显示蓝色或蓝紫色与不显色来判断样品的阳性或阴性，其特征在于步骤(2)中的地高辛标记的PCR扩增体系是：无菌去离子水30.5μL，10×reaction buffer 5μL，20mM的MgCl2 3μL，PCR地高辛标记混合物5μL，10μM的正向引物和10μM的反向引物各2μL，5unit/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，待检样品DNA 2μL，该反应体系总体积50μL。PCR扩增程序：94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保温，上述的杂交液是由以下体积比组份组成的：以标准柠檬酸盐溶液定容1000份；20％的十二烷基肌氨酸钠：1～10份；10％的十二烷基硫酸钠：1～5份，再溶解封闭剂10mg，杂交液中地高辛标记待检样品浓度为20ng/mL。
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