KR101521381B1 - 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 새우조기폐사증후군을 진단하는 방법 및 키트는 리얼타임 PCR을 이용하고, 새우 환경 샘플 등으로부터 새우조기폐사증후군의 원인균인 비브리오 파라헤모라이티쿠스를 표적 유전자인 tlh 유전자를 이용하여 종 수준에서 확인할 수 있고 tdh 유전자 및 trh 유전자를 이용하여 병원성 여부의 판정이 가능하면서도 새우 양식 환경 등에서 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 조기에 예측하기 위한 정량적 분석도 가능하다.
Description
본 발명은 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 새우조기폐사증후군을 진단하는 방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 새우 양식장 등에서의 새우조기폐사증후군의 발병을 방지하고 확산을 조기에 차단할 수 있는 새우조기폐사증후군을 진단하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 새우 환경 샘플 등으로부터 새우조기폐사증후군의 원인균을 종 수준에서 확인할 수 있고 병원성 여부의 판정이 가능하면서도 새우 양식 환경 등에서 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 조기에 예측하기 위해 정량적 분석이 가능한 새우조기폐사증후군을 진단하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
또한, 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 새우조기폐사증후군 감염이 의심되는 환경 샘플 내에 존재할 수 있는 새우조기폐사증후군 원인균을 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출하여, 감염 초기에 새우조기폐사증후군을 조기에 진단함으로써 방역 당국에 의한 적절한 초기 대처를 가능케 하고 새우조기폐사증후군 확산의 위험을 사전에 차단할 수 있는 새우조기폐사증후군을 진단하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
최근 수년간 양식 새우류의 대규모 폐사를 일으키는 병원체가 큰 문제가 되었다. 이는 새우조기폐사증후군(EMS, Early Mortality Syndrome) 또는 급성간췌장궤사증후군(AHPNS, Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome)이라 불리며, 새우 양식의 초기단계에 감염되어 100% 가까운 폐사율을 보인다. 새우조기폐사증후군은 양식장에 입식 시 30일 이내에 병원체에 의해 발생하는 대량 폐사를 포괄적으로 통칭하는데, 홍다리얼룩새우와 흰다리새우에서 감염 사례가 많고 대하도 감수성은 낮지만 피해가 있는 것으로 관찰되었다.
2012년까지 이러한 새우조기폐사증후군의 원인체가 알려지지 않았지만 2013년 미국 아리조나대학에서 해수에 존재하는 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)라는 박테리아가 새우 초기단계 양식에서 높은 페사율을 보이는 원인체라는 것을 밝혀냈다. 아리조나대학에서는 비브리오 파라헤모라이티쿠스를 임의적으로 감염시킨 결과, 새우조기폐사증후군 감염시 보이는 증상을 보이며 폐사하는 것을 실험적으로 재현하였다.
비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)는 장염 비브리오균이라고도 불리며, 1개의 편모를 가지는 간균으로 활발한 운동성을 보인다. 통성혐기성 균으로 2~3% 농도의 식염을 포함하는 배지에서 배양되며 사람 또는 토끼의 혈구를 용혈시키는 특징을 가진다. 일반적으로 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)에 오염된 어패류를 취식하였을 때 급성 소장염을 일으키는데, 7~9월에 호발하며 10~24시간의 잠복기를 가진다.
2013년에 태국에서는 이러한 새우조기폐사증후군으로 인해 연간 새우생산량의 50% 가까운 감소량을 보였으며, 중국, 베트남 등에서도 이러한 새우조기폐사증후군으로 인한 손실이 커 전 세계적으로 양식 새우의 생산량이 매우 큰 폭으로 감소하여 양식 새우류의 판매가가 30% 이상 상승하는 결과를 초래하였다.
이러한 새우조기폐사증후군에 대한 대처방안으로서 발생국에서 비발생국으로의 활새우 이동 금지를 권장하고 있으며, 감염국가의 구획화, 비감염지역으로의 이동제한, 감염지역 새우에 대한 완충지역 설정, 격리(1~2개월) 및 추적 감시를 제안하고 있다. 동남아시아 국가에서는 새우조기폐사증후군 발생과 전파방지를 위한 긴급조치를 취하고 있는데, 새우 양식국에서는 질병감시, 초기대처 계획 등을 수립하고 있고, 새우 수입국가 중 일부에서는 중국, 말레이시아, 태국 및 베트남으로부터 냉동 새우 및 부산물의 수입을 제한하고 있다.
현재까지 국내에서는 새우조기폐사증후군의 보고 사례가 없으나, 동남아시아 국가로부터 새우를 수입하는 우리나라에 새우조기폐사증후군이 유입 발병할 경우 국내 새우 양식업계의 피해는 막대할 것으로 추정된다.
이러한 이유로 새우조기폐사증후군의 발병을 막기 위해서 지속적으로 양식장에서는 환경에 대한 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 감염 가능성 여부를 확인할 필요가 있다. 또한, 새우조기폐사증후군의 폐사율은 100%에 달하며, 감염의 확산이 매우 빨라 정확한 원인균 종 동정과 함께 원인균의 병원성 여부의 확인도 필요하다. 특히, 일반 해수에서도 비브리오 파라헤모라이티쿠스가 존재하기 때문에 단순히 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 동정 사실 만으로는 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 예측하기 어렵다. 따라서, 양식장 환경 등에 대한 비브리오 파라헤모라이티쿠스 병원성 여부의 확인과, 새우조기폐사증후군의 발병을 위해 필요한 일정 수준 이상의 비브리오 파라헤모라이티쿠스가 새우 양식 환경에 존재하는지도 확인할 필요가 있다.
그러나, 종래기술에서는 이러한 새우조기폐사증후군의 발병을 방지하고 확산을 조기에 차단하기 위해 새우 환경 샘플 등으로부터 원인균의 동정, 병원성 여부 확인 및 원인균의 정량적 분석이 가능한 기술의 제공에 대해서는 큰 관심을 두고 있지 않았다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허공보 제10-1178466호에서는 사람에게 식중독을 일으키는 콜레라세균, 비브리오장염세균 및 비브리오패혈증세균의 타겟 유전자에 대한 실시간 DNA 효소중합연쇄반응(real-time PCR)을 실시하여 타겟 종을 확인하는 기술을 개시하고 있으나, 이는 식중독 발생시 식중독 원인균을 검사하기 위한 기술의 제공에 목적이 있는 것이고, 실제 새우조기폐사증후군의 원인균의 동정외에, 양식장 환경 등에 대한 비브리오 파라헤모라이티쿠스 병원성 여부의 확인과, 새우조기폐사증후군의 발병을 위해 필요한 일정 수준 이상의 비브리오 파라헤모라이티쿠스가 새우 양식 환경 등에 존재하는지를 확인하기 위한 것은 아니었다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 새우 환경 샘플 등으로부터 새우조기폐사증후군의 원인균인 비브리오 파라헤모라이티쿠스를 종 수준에서 확인할 수 있고 병원성 여부의 판정이 가능하면서도 새우 양식 환경 등에서 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 예측하기 위한 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 정량적 분석이 가능한 기술의 제공이 요구되고 있다고 할 수 있다.
본 발명은 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 새우 양식장 등에서의 새우조기폐사증후군의 발병을 방지하고 확산을 조기에 차단할 수 있는 새우조기폐사증후군을 진단하는 방법 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 새우 환경 샘플 등으로부터 새우조기폐사증후군의 원인균을 종 수준에서 확인할 수 있고 병원성 여부의 판정이 가능하면서도 새우 양식 환경 등에서 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 조기에 예측하기 위해 정량적 분석이 가능한 새우조기폐사증후군을 진단하는 방법 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 새우조기폐사증후군 감염이 의심되는 환경 샘플 내에 존재할 수 있는 새우조기폐사증후군 원인균을 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출하여, 감염 초기에 새우조기폐사증후군을 조기에 진단함으로써 방역 당국에 의한 적절한 초기 대처를 가능케 하고 새우조기폐사증후군 확산의 위험을 사전에 차단할 수 있는 새우조기폐사증후군을 진단하는 방법 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 발명의 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자는 리얼타임 PCR을 이용하여 새우 환경 샘플 등으로부터 새우조기폐사증후군의 원인균인 비브리오 파라헤모라이티쿠스를 표적 유전자인 tlh 유전자를 이용하여 종 수준에서 확인할 수 있고 tdh 유전자 및 trh 유전자를 이용하여 병원성 여부의 판정이 가능하면서도 새우 양식 환경 등에서 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 조기에 예측하기 위해 정량적 분석이 가능한 기술을 제공하기에 이르렀다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "새우"란 갑각류 중 장미류(長尾類)에 속하는 종류로서 민물새우 및 바다새우를 포괄하고, 새우 성체 뿐만아니라, 유생, 알, 가공물, 부산물 또는 분말가루 등을 모두 포함하는 개념으로 사용된다.
또한, 새우조기폐사증후군을 일으키는 병원성 미생물의 검출 대상이 되는 검체는 새우가 서식하는 환경 샘플(새우 환경 샘플이라고 약칭함), 예를 들어 양식장의 염수 또는 새우가 서식하는 장소의 해수 등일 수 있고, 새우 자체, 그 밖에 병원성 미생물이 검출가능한 다양한 새우 환경 샘플일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "리얼타임(real-time) PCR"이란 형광물질(fluorescent material)을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 이러한 리얼타임(real-time) PCR은 SYBR 그린(SYBR Green)을 사용하는 방법과 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로 나누어진다.
SYBR 그린(SYBR green) 기법은 리얼타임 PCR 증폭 과정에서 증폭된 DNA에 SYBR 그린 염색약이 끼어들어가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광신호를 발생하게 되고 이러한 형광신호를 검출하여 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 또한, 이중 표지된 프로브(dual labeled probe)를 이용한 리얼타임 PCR 기법은 5'말단에 형광물질이 표지되어 있고 3'말단에 소광물질(Quencher)이 표지된 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로서, 이중 표지된 프로브에 의한 형광신호를 통해 이중 표지된 프로브가 표적 유전자의 PCR 증폭 산물과 어닐링되었는지 여부를 확인할 수 있고, 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 본 발명에서는 상기 방법 이외에 TaqMan 프로브법 등 당업계에 알려진 리얼타임 PCR이 적용가능함은 물론이다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법은,
검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
상기 준비한 유전자 샘플을 주형으로 사용하고, 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 종 동정을 위한 tlh (thermolabile hemolysin) 유전자에 특이적인 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 10 및 11의 프라이머 쌍, 및 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과, 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 병원성 확인을 위한 tdh (thermostable direct hemolysin virulence factor) 유전자에 특이적인 서열번호 16 및 17의 프라이머 쌍, 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍, 및 서열번호 22 및 23의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과, 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 병원성 확인을 위한 trh (thermostable direct hemolysin-related hemolysin) 유전자에 특이적인 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍, 서열번호 28 및 29의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍, 및 서열번호 34 및 35의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과, 그리고 증폭되는 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자와 관련하여 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여, 상기 검체의 유전자 샘플 내의 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자를 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자의 증폭 후, 상기 표지물질을 이용하여 산출된 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자 증폭량에 기초하여, 검체 내의 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 존재 여부, 존재량, 병원성 여부 및 병원성 정도를 정량적으로 측정하는 단계와,
상기 정량적으로 측정된 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 존재 여부, 존재량, 병원성 여부 및 병원성 정도에 기초하여 검체 내의 새우조기폐사증후군 감염 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자의 증폭량을 산출할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법은,
증폭 전, 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자를, 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자에 각각 대응되는 프라이머 쌍과, 증폭되는 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자와 관련하여 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자 각각의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자 각각을 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내의 새우조기폐사증후군 감염 여부를 정량적으로 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법에 있어서, 상기 표지물질은,
상기 tlh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12 및 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단과,
상기 tdh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 18, 서열번호 21 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단과,
상기 trh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
이와 관련하여 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 사용하는 것이 바람직하며, 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 사용하여 1개의 검사 튜브에서 새우조기폐사증후군과 관련된 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자의 3개의 표적 유전자를 한번에 검출할 수 있는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 새우조기폐사증후군 진단을 위한 리얼타임 PCR 증폭키트는, 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 종 동정을 위한 tlh (thermolabile hemolysin) 유전자에 특이적인 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 10 및 11의 프라이머 쌍, 및 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과, 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 병원성 확인을 위한 tdh (thermostable direct hemolysin virulence factor) 유전자에 특이적인 서열번호 16 및 17의 프라이머 쌍, 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍, 및 서열번호 22 및 23의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과, 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 병원성 확인을 위한 trh (thermostable direct hemolysin-related hemolysin) 유전자에 특이적인 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍, 서열번호 28 및 29의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍, 및 서열번호 34 및 35의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍, 그리고 DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 포함한다.
본 발명의 일실시예의 새우조기폐사증후군 진단을 위한 리얼타임 PCR 증폭키트에 있어서, 상기 표지물질은,
상기 tlh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12 및 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단과,
상기 tdh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 18, 서열번호 21 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단과,
상기 trh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 새우조기폐사증후군 진단을 위한 리얼타임 PCR 증폭키트는, 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 포함하는 것이 바람직하다. 이와 같이 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 포함하는 경우 1개의 검사 튜브에서 새우조기폐사증후군과 관련된 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자의 3개의 표적 유전자를 한번에 검출할 수 있는 장점이 있다.
한편, 본 발명에 있어서 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단은 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 (SYBR green), FAM, VIC, JOE, NED, HEX 및 TET 등과 같은 형광물질로 표지될 수 있고, 프로브의 다른쪽 말단, 예를 들어 3'말단은 IABkFQ, DABCYL, BHQ (BHQ-1, BHQ-2 등), EBQ 등과 같은 소광물질로 표지될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따르면, 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 새우 양식장 등에서의 새우조기폐사증후군의 발병을 방지하고 확산을 조기에 차단할 수 있다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 새우 환경 샘플 등으로부터 새우조기폐사증후군의 원인균을 종 수준에서 확인할 수 있고 병원성 여부의 판정이 가능하면서도 새우 양식 환경 등에서 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 조기에 예측하기 위해 정량적 분석이 가능한 장점이 있다.
특히, 본 발명은 일반 해수에서도 비브리오 파라헤모라이티쿠스가 존재하기 때문에 단순히 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 동정 사실 만으로는 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 예측하기 어려운 점을 감안하여, 양식장 환경 등에 대한 비브리오 파라헤모라이티쿠스 병원성 여부의 확인과, 새우조기폐사증후군의 발병을 위해 필요한 일정 수준 이상의 비브리오 파라헤모라이티쿠스가 존재하는지도 확인할 수 있는 장점이 있다.
추가로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 새우조기폐사증후군 감염이 의심되는 환경 샘플 내에 존재할 수 있는 새우조기폐사증후군 원인균을 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출하여, 감염 초기에 새우조기폐사증후군을 조기에 진단함으로써 방역 당국에 의한 적절한 초기 대처를 가능케 하고 새우조기폐사증후군 확산의 위험을 사전에 차단할 수 있다.
도 1은 VP-tlh-F4 및 VP-tlh-R4의 프라이머 쌍(서열번호 10 및 11의 프라이머 쌍)과, VP-tlh-P4 프로브(서열번호 12의 프로브)의 조합을 사용하여 tlh 유전자에 대해 리얼 타임 PCR을 실시한 결과로서, 표적 유전자인 tlh 유전자 플라스미드의 농도를 107 ~ 102 의 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 2는 표 1에 나타낸 5가지의 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 사용하여 107 카피수의 tlh 유전자 플라스미드의 농도를 갖는 시료에 대해 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 3은 VP-tdh-F1 및 VP-tdh-R1의 프라이머 쌍(서열번호 16 및 17의 프라이머 쌍)과, VP-tdh-P1 프로브 (서열번호 18의 프로브)의 조합을 사용하여 tdh 유전자에 대해 리얼 타임 PCR을 실시한 결과로서, 표적 유전자인 tdh 유전자 플라스미드의 농도를 107 ~ 102 의 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 4는 표 2에 나타낸 3가지의 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 사용하여 107 카피수의 tdh 유전자 플라스미드의 농도를 갖는 시료에 대해 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 5는 VP-trh-F2 및 VP-trh-R2의 프라이머 쌍(서열번호 28 및 29의 프라이머 쌍)과, VP-trh-P2의 프로브(서열번호 30의 프로브)의 조합을 사용하여 trh 유전자에 대해 리얼 타임 PCR을 실시한 결과로서, 표적 유전자인 trh 유전자 플라스미드의 농도를 107 ~ 102 의 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 6은 표 3에 나타낸 4가지의 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 사용하여 107 카피수의 trh 유전자 플라스미드의 농도를 갖는 시료에 대해 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 7은 다중 리얼타임 PCR 증폭 조건의 확립을 위해, FAM-EBQ로 표지된 tlh 유전자에 대한 프로브를 단독으로 사용하여 tlh 유전자를 리얼타임 PCR로 증폭한 결과 그래프이다.
도 8은 다중 리얼타임 PCR 증폭 조건의 확립을 위해, JOE-EBQ로 표지된 tdh 유전자에 대한 프로브를 단독으로 사용하여 tdh 유전자를 리얼타임 PCR로 증폭한 결과 그래프이다.
도 9는 다중 리얼타임 PCR 증폭 조건의 확립을 위해, 텍사스레드(TEXASRED)-EBQ로 표지된 trh 유전자에 대한 프로브를 단독으로 사용하여 trh 유전자를 리얼타임 PCR로 증폭한 결과 그래프이다.
도 10은 FAM-EBQ로 표지된 프로브, JOE-EBQ로 표지된 프로브 및 텍사스레드(TEXASRED)-EBQ로 표지된 프로브를 모두 사용하여 각각 106 카피수의 농도를 갖는 tlh 유전자 플라스미드, tdh 유전자 플라스미드 및 trh 유전자 플라스미드에 대해 다중 리얼타임 PCR을 수행하여 얻어진 결과 그래프이다.
도 2는 표 1에 나타낸 5가지의 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 사용하여 107 카피수의 tlh 유전자 플라스미드의 농도를 갖는 시료에 대해 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 3은 VP-tdh-F1 및 VP-tdh-R1의 프라이머 쌍(서열번호 16 및 17의 프라이머 쌍)과, VP-tdh-P1 프로브 (서열번호 18의 프로브)의 조합을 사용하여 tdh 유전자에 대해 리얼 타임 PCR을 실시한 결과로서, 표적 유전자인 tdh 유전자 플라스미드의 농도를 107 ~ 102 의 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 4는 표 2에 나타낸 3가지의 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 사용하여 107 카피수의 tdh 유전자 플라스미드의 농도를 갖는 시료에 대해 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 5는 VP-trh-F2 및 VP-trh-R2의 프라이머 쌍(서열번호 28 및 29의 프라이머 쌍)과, VP-trh-P2의 프로브(서열번호 30의 프로브)의 조합을 사용하여 trh 유전자에 대해 리얼 타임 PCR을 실시한 결과로서, 표적 유전자인 trh 유전자 플라스미드의 농도를 107 ~ 102 의 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 6은 표 3에 나타낸 4가지의 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 사용하여 107 카피수의 trh 유전자 플라스미드의 농도를 갖는 시료에 대해 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 7은 다중 리얼타임 PCR 증폭 조건의 확립을 위해, FAM-EBQ로 표지된 tlh 유전자에 대한 프로브를 단독으로 사용하여 tlh 유전자를 리얼타임 PCR로 증폭한 결과 그래프이다.
도 8은 다중 리얼타임 PCR 증폭 조건의 확립을 위해, JOE-EBQ로 표지된 tdh 유전자에 대한 프로브를 단독으로 사용하여 tdh 유전자를 리얼타임 PCR로 증폭한 결과 그래프이다.
도 9는 다중 리얼타임 PCR 증폭 조건의 확립을 위해, 텍사스레드(TEXASRED)-EBQ로 표지된 trh 유전자에 대한 프로브를 단독으로 사용하여 trh 유전자를 리얼타임 PCR로 증폭한 결과 그래프이다.
도 10은 FAM-EBQ로 표지된 프로브, JOE-EBQ로 표지된 프로브 및 텍사스레드(TEXASRED)-EBQ로 표지된 프로브를 모두 사용하여 각각 106 카피수의 농도를 갖는 tlh 유전자 플라스미드, tdh 유전자 플라스미드 및 trh 유전자 플라스미드에 대해 다중 리얼타임 PCR을 수행하여 얻어진 결과 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 종 동정을 위한 유전자 선정과 이에 특이적인 프라이머 및 프로브의 설계
비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 종 동정을 위해서 선행문헌과 GenBank 유전자 서열을 참조하였고, 그 결과 tlh (thermolabile hemolysin) 유전자를 종 동정 분자마커로 선정하였다.
그리고 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에서 AY289609.1의 유전자 서열을 참조하여 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 종 동정을 위한 tlh (thermolabile hemolysin) 유전자 증폭용 프라이머와, 증폭반응 결과물을 확인할 수 있는 형광표지가 된 프로브를 디자인하였다. tlh 유전자에 특이적인 프라이머와 프로브의 디자인에 있어서는 리얼타임 PCR 증폭산물이 150 bp 미만이 되도록 프라이머의 위치를 결정하였고, PCR 증폭산물 내의 20 내지 30 bp의 범위 내에서 프로브 서열을 결정하였다. 그리고, 각각의 프라이머와 프로브의 융해 온도(melting temperature)는 50℃ 내지 70℃의 범위가 되도록 디자인하였다.
비브리오 파라헤모라이티쿠스의 종 동정에 사용되는 tlh 유전자에 특이적인 리얼타임 PCR용 프라이머와 프로브는 아래의 표 1과 같고 이들 프라이머는 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다. 한편, 하기 표 1의 명칭란에서 F는 정방향 프라이머, R은 역방향 프라이머, P는 프로브를 나타내고, 마지막에 표시된 번호는 프라이머 쌍과 프로브의 각 조합을 나타낸다.
| 서열번호 | 명칭 | 염기서열 (5'→3') | 온도(℃) | 위치 | 증폭산물 |
| 서열번호 1 | VP-tlh-F1 | GCGTTGTGAAGCMACATTAG | 53.5 | 306-325 | 95 |
| 서열번호 2 | VP-tlh-R1 | TCCAGATCGTGTGGTTGTATG | 54.5 | 380-400 | |
| 서열번호 3 | VP-tlh-P1 | TGGCGAACGAGAACGCAGACATTA | 60.6 | 329-352 | |
| 서열번호 4 | VP-tlh-F2 | GCTGGTTCTTAGGTCACTTCTC | 55 | 518-539 | 131 |
| 서열번호 5 | VP-tlh-R2 | CCCTGTTAGCGCGATGTATT | 55.1 | 629-648 | |
| 서열번호 6 | VP-tlh-P2 | AACCTTCCGCTCTACAACTGGGC | 61.4 | 580-602 | |
| 서열번호 7 | VP-tlh-F3 | CTTCACCATTGACGGCTACT | 54.7 | 222-241 | 121 |
| 서열번호 8 | VP-tlh-R3 | GTTCTCGTTCGCCAAATCTAATG | 54.3 | 320-342 | |
| 서열번호 9 | VP-tlh-P3 | TTATCCGTCAGCGTTGTGAAGCMA | 59.9 | 296-319 | |
| 서열번호 10 | VP-tlh-F4 | GAGCCAACCTTATCACCAGAA | 54.6 | 64-84 | 88 |
| 서열번호 11 | VP-tlh-R4 | ACCAACAGCGAACATAGGTATAG | 54.3 | 129-151 | |
| 서열번호 12 | VP-tlh-P4 | TCAGCGTCTGAAGTGATCAGCACG | 61 | 91-114 | |
| 서열번호 13 | VP-tlh-F5 | ACCTATGTTCGCTGTTGGTATC | 54.7 | 133-154 | 108 |
| 서열번호 14 | VP-tlh-R5 | GTAGCCGTCAATGGTGAAGTAG | 55.3 | 219-240 | |
| 서열번호 15 | VP-tlh-P5 | CGAAAGATGATCCRGCGACCGATT | 60.2 | 167-190 |
실시예 2: 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 병원성 확인을 위한 유전자 선정과 이에 특이적인 프라이머 및 프로브의 설계
비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 병원성 확인을 위해 본 실시예에서는 tdh (thermostable direct hemolysin virulence factor) 유전자와 trh (thermostable direct hemolysin-related hemolysin) 유전자를 선정하였다. 각각의 병원성 유전자 참고 염기서열로서 AY044107.1과 DQ359748.1을 선정하여 실시예 1과 동일한 방법으로 프라이머와 프로브를 디자인하였다.
비브리오 파라헤모라이티쿠스의 병원성 확인에 사용되는 tdh 유전자 및 trh 유전자에 특이적인 리얼타임 PCR용 프라이머와 프로브는 각각 아래의 표 2 및 표 3과 같고 이들 프라이머는 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다. 한편, 하기 표 2 및 표 3의 명칭란에서 F는 정방향 프라이머, R은 역방향 프라이머, P는 프로브를 나타내고, 마지막에 표시된 번호는 프라이머 쌍과 프로브의 각 조합을 나타낸다.
| 서열번호 | 명칭 | 염기서열(5'→3') | 온도(℃) | 위치 | 증폭산물 |
| 서열번호 16 | VP-tdh-F1 | ACGTCAGGTACTAAATGGYTGAC | 55.6 | 336-358 | 111 |
| 서열번호 17 | VP-tdh-R1 | TACGAACACAGCAGAATGRCC | 56.3 | 426-446 | |
| 서열번호 18 | VP-tdh-P1 | AATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAA | 60.7 | 398-421 | |
| 서열번호 19 | VP-tdh-F2 | CDCCGGTCAATGTARAGGTCTC | 56.9 | 244-265 | 134 |
| 서열번호 20 | VP-tdh-R2 | GTTCACAGTCATGTAGGATGTCA | 54.4 | 355-377 | |
| 서열번호 21 | VP-tdh-P2 | TGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGT | 59.7 | 317-344 | |
| 서열번호 22 | VP-tdh-F3 | CAGTATTCACAACGTCAGGTACTA | 54 | 328-348 | 121 |
| 서열번호 23 | VP-tdh-R3 | ACGAACACAGCAGAATGRCC | 56.9 | 426-445 | |
| 서열번호 24 | VP-tdh-P3 | ACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGG | 60.8 | 391-415 |
| 서열번호 | 명칭 | 염기서열(5'→3') | 온도(℃) | 위치 | 증폭산물 |
| 서열번호 25 | VP-trh-F1 | GCTCAAAATGGTTAAGCGCCTA | 55.9 | 257-278 | 162 |
| 서열번호 26 | VP-trh-R1 | CACCAACGAAATCACTAACAGAAG | 54.1 | 395-418 | |
| 서열번호 27 | VP-trh-P1 | ACACAATGGCTGCTCTTTCTGGCTA | 60.7 | 308-332 | |
| 서열번호 28 | VP-trh-F2 | CAGGTTCGGATGAGCTACTATTT | 54.3 | 104-126 | 99 |
| 서열번호 29 | VP-trh-R2 | YGTTTCGGTTTGTCCAGTAGT | 54.6 | 182-202 | |
| 서열번호 30 | VP-trh-P2 | ACTGAATCACCAGTTAACGCAATCGTTG | 59.4 | 151-178 | |
| 서열번호 31 | VP-trh-F3 | TTCACGACTTCAGGCTCAAA | 54.3 | 244-263 | 110 |
| 서열번호 32 | VP-trh-R3 | ACCGTTGAAAGGCCATCTT | 54.7 | 335-353 | |
| 서열번호 33 | VP-trh-P3 | ACACAATGGCTGCTCTTTCTGGCTA | 60.7 | 308-332 | |
| 서열번호 34 | VP-trh-F4 | CTACACAATGGCTGCTCTTTC | 53.9 | 306-326 | 142 |
| 서열번호 35 | VP-trh-R4 | CGTTACACTTGGCAATGATTCT | 53.5 | 426-447 | |
| 서열번호 36 | VP-trh-P4 | AGATGGCCTTTCAACGGTCTTCACA | 60.6 | 336-360 |
실시예 3: 리얼타임 PCR 증폭 조건 최적화를 위한
tlh
유전자,
tdh
유전자 및
trh
유전자의 합성
실시예 1 및 실시예 2에서 디자인된 프라이머와 프로브의 성능을 확인하기 위해서 tlh 유전자, tdh 유전자 및 trh 유전자에 대한 각 유전자 참조서열을 (주)바이오니아 유전자 합성 서비스를 통하여 클로닝 벡터에 삽입 후 정량하여 107 카피수 ~ 102 카피수의 농도로 TE 버퍼에 희석하여 준비하였다. 준비된 합성유전자는 실험 전까지 냉장보관하였다. 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 합성 tdh 유전자의 서열은 서열번호 37과 같고, 합성 trh 유전자의 서열은 서열번호 38과 같으며, 합성 tlh 유전자의 서열은 서열번호 39와 같다.
실시예 4: 합성유전자를 이용한 프라이머 및 프로브 성능 평가
실시예 3에서 준비된 합성유전자를 이용하여 각각의 유전자에 대한 프라이머 및 프로브 조합의 성능을 평가하였다. 단일 유전자 성능평가는 PikpReal 96(Thermo Scientific, 미국) 리얼타임(real-time PCR) 장비를 이용하여 수행하였다. 각각의 표적 유전자에 대한 리얼타임 PCR을 수행하기 위한 프라이머 농도는 최종 농도가 0.5 μM, 증폭반응 결과물을 확인할 수 있는 형광표지가 된 프로브는 최종 농도가 0.25 μM이 되도록 PCR 반응액에 첨가하였다. 또한, PCR 반응액에는 증폭대상이 되는 표적 유전자의 DNA 주형 1㎕, 2X 리얼타임 PCR 마스터 믹스(real-time PCR master mixture)(제이에스 바이오테크, 대한민국 경기도 소재)를 첨가한 후 PCR 반응액이 20㎕가 될 때까지 3차 증류수를 첨가하였다.
또한, 리얼 타임 PCR 증폭 반응결과물을 확인하고 이를 정량적으로 분석하기 위해 프로브는 형광물질 및 소광물질로 이중 표지되는데, 본 실시예에서는 5'말단에 형광물질인 FAM (최대 흡수파장: 495nm, 최대 방출 파장: 520nm)으로 표지하였고, 3'말단에는 소광물질인 BHQ-1을 표지하였다. 한편, 프로브를 표지하는 형광물질 및 소광물질로는 전술한 예시에 한정되는 것이 아니고, 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
리얼타임(real-time) PCR 방법은 이러한 형광물질과 소광물질을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있다. 리얼타임 PCR의 기본 원리는 중합효소와 형광공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광의 검출과 정량에 있다.
리얼타임 PCR에서의 정량은 PCR시 매 주기의 진행 상황을 감시하여 지수 증가기(exponential phase) 범위 내에서 실시간으로 증폭산물을 측정하는 방법으로서, 이때 중요한 개념이 Ct(threshold cycle) 또는 Cp(crossing point)라는 수치이다. 이 값은 전술한 이중 표지된 프로브에 의해 생기는 형광의 세기가 기본값(baseline level)을 넘어서 감지될 수 있을 정도로 두드러지게 증가하는 시점의 주기수이며, 이는 표적 유전자의 초기 주형량(본 발명의 경우 tlh 유전자, tdh 유전자 및 trh 유전자의 카피수)을 정확하게 반영한다. 따라서, tlh 유전자, tdh 유전자 및 trh 유전자를 포함하는 시료를 PCR 증폭하여 전체 PCR 증폭 기간에 대한 형광물질의 형광세기의 변화를 측정하고 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, tlh 유전자, tdh 유전자 및 trh 유전자가 존재하는지 여부와 시료 내에 포함된 이들 유전자의 초기 주형량을 정량적으로 분석할 수 있다.
본 실시예에서는 tdh 유전자, trh 유전자 및 tlh 유전자의 각각의 합성 유전자(서열번호 37 내지 서열번호 39의 서열을 각각 포함하는 플라스미드)에 대해 전술한 바와 같은 리얼타임 PCR 증폭 조성 하에서, 95℃에서 5분간 변성 후 95℃ 10초, 60℃ 30초로 40회에 걸처 리얼타임 PCR을 반복하였다. 리얼타임 PCR 증폭반응이 한번씩 반복될 때마다 FAM 파장에서 형광값을 측정하였으며, 반응 사이클에 대한 형광세기는 PikoReal Software 2.1(Thermo Scientific, 미국)을 이용하여 분석하였고 그 결과는 도 1 내지 도 6에 도시하였다.
도 1 내지 도 6에서 확인되는 바와 같이, tlh 유전자, tdh 유전자 및 trh 유전자를 각각 리얼 타임 PCR로 증폭하는데 사용하기 위해 디자인된 표 1, 표 2 및 표 3의 프라이머 쌍들과 프로브들의 각 조합은 대응하는 각각의 표적 유전자를 유효하게 증폭시키고 증폭 사이클에 대한 형광세기의 곡선 역시 각 표적 유전자의 존재 여부 판단과 정량적 분석에 적합한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5:
tlh
유전자,
tdh
유전자 및
trh
유전자에 대한 다중 리얼 타임 PCR의 수행
본 실시예에서는 한 번의 리얼타임 PCR 반응으로 1개의 반응 튜브 내에서 3개의 유전자(tlh 유전자, tdh 유전자 및 trh 유전자) 존재 유무를 동시에 검출할 수 있는지를 확인하였고, 형광세기에 기초한 해당 유전자의 정량적 분석이 가능한지 여부도 확인하였다.
실시예 4와 실질적으로 동일하게 리얼타임 PCR 반응을 수행하되 각각의 유전자(tlh 유전자, tdh 유전자 및 trh 유전자) 증폭조건 중 가장 양호한 결과를 얻은 조건을 적용하였다. tlh 유전자에 대한 프브로는 5'말단에 FAM으로 표지하는 것을 유지하여 상기 적용된 조건의 적정성을 다시 한번 확인할 수 있도록 하였고, tdh 유전자에 대한 프로브는 5'말단에 JOE(최대 흡수 파장: 520nm, 최대 방출 파장: 548nm)로 표지하였으며 trh 유전자에 대한 프로브는 5'말단에 텍사스레드(TEXASRED)(최대 흡수 파장: 586nm, 최대 방출 파장: 605nm)로 표지하였다. 따라서, 상기 3개의 유전자 증폭산물로부터 검출되는 형광신호의 파장들은 서로 다르게 되어 한 번의 리얼타임 PCR 반응으로 1개의 반응 튜브 내에서 상기 3개의 유전자의 존재 유무의 검출 및 정량적 분석이 가능하게 된다.
또한, 본 실시예에서는 상기 3개의 유전자에 대한 프로브 각각에 대해 5'말단이 FAM, JOE, 텍사스레드로 표지됨에 따라 이러한 형광물질을 소광하는 소광물질은 BHQ-1 대신에 (주)바이오니아에서 개발하여 시판하는 EBQ(Excellent Bioneer Quencher)를 사용하여 3'말단을 표지하였다. 이때, FAM 및 JOE에 대응되는 소광물질로는 BHQ-1을 사용하고 텍사스레드에 대응되는 소광물질로는 BHQ-2를 사용할 수도 있다. 한편, 프로브를 표지하는 형광물질 및 소광물질로는 전술한 예시에 한정되는 것이 아니고, 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
다중 리얼타임 PCR 증폭 조건의 확립을 위해, tlh 유전자는 FAM-EBQ로 표지된 프로브, tdh 유전자는 JOE-EBQ로 표지된 프로브, 그리고 trh 유전자는 텍사스레드(TEXASRED)-EBQ로 표지된 프로브를 이용하여 개별적으로 리얼타임 PCR을 수행하였다. 실시예 4와 달리, 본 실시예에서는 리얼타임 PCR 장비로서 Exicycler 96[(주)바이오니아, 대한민국] 장비를 이용하였다.
그 결과는 도 7 내지 도 9에 도시되어 있다. 도 7 내지 도 9에서 확인되는 바와 같이, 상기 3개의 유전자 각각에 대응하는 프로브의 5'말단에 각각 형광물질인 FAM, JOE 및 텍사스레드를 표지하고 3'말단에 소광물질인 EBQ를 표지한 경우 실시예 4의 결과와 유사하게 상기 3개의 유전자 각각을 유효하게 증폭시키고 증폭 사이클에 대한 형광세기의 곡선 역시 각 유전자의 존재 여부 판단과 정량적 분석에 적합한 것을 확인할 수 있었다.
또한, FAM-EBQ로 표지된 프로브, JOE-EBQ로 표지된 프로브 및 텍사스레드(TEXASRED)-EBQ로 표지된 프로브를 모두 사용하여 각각 106 카피수의 농도를 갖는 tlh 유전자 플라스미드, tdh 유전자 플라스미드 및 trh 유전자 플라스미드에 대해 다중 리얼타임 PCR를 수행하였다. 그 결과 1개의 반응 튜브에서 3가지 발광파장을 갖는 3개의 반응물의 구분을 명확히 할 수 있었으며, 3개의 반응물의 위양성 혹은 위음성 결과가 나오지 않는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 새우조기폐사증후군 진단방법은 한 번의 리얼타임 PCR 반응으로 1개의 반응 튜브 내에서 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 종 동정 및 병원성 확인과 관련된 3개의 유전자(tlh 유전자, tdh 유전자 및 trh 유전자) 존재 유무를 동시에 검출할 수 있고, 형광세기에 기초하여 정량적 분석도 가능한 것을 알 수 있다(도 10 참조).
상기 결과들을 종합하면, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 새우 환경 샘플 등으로부터 새우조기폐사증후군의 원인균인 비브리오 파라헤모라이티쿠스를 표적 유전자인 tlh 유전자를 이용하여 종 수준에서 확인할 수 있고 tdh 유전자 및 trh 유전자를 이용하여 병원성 여부의 판정이 가능하면서도 새우 양식 환경 등에서 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 조기에 예측하기 위한 정량적 분석도 가능하다고 할 수 있다.
특히, 본 발명은 양식장 환경 등에 대한 비브리오 파라헤모라이티쿠스 병원성 여부의 확인과, 새우조기폐사증후군의 발병을 위해 필요한 일정 수준 이상의 비브리오 파라헤모라이티쿠스가 존재하는지도 확인할 수 있다. 이러한 본 발명의 효과는 일반 해수에서도 비브리오 파라헤모라이티쿠스가 존재하기 때문에 단순히 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 동정 사실 만으로는 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 예측하기 어려운 점을 감안한다면 매우 의미가 있는 것이라고 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 새우조기폐사증후군 감염이 의심되는 환경 샘플 내에 존재할 수 있는 새우조기폐사증후군 원인균을 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출하여, 감염 초기에 새우조기폐사증후군을 조기에 진단함으로써 방역 당국에 의한 적절한 초기 대처를 가능케 하고 새우조기폐사증후군 확산의 위험을 사전에 차단할 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> YOON, HYUN KYU
<120> Method and kit for diagnosing early mortality syndrome of shrimps
using real-time PCR
<130> P13-0079KR
<160> 39
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-F1 primer
<400> 1
gcgttgtgaa gcmacattag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-R1 primer
<400> 2
tccagatcgt gtggttgtat g 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-P1 probe
<400> 3
tggcgaacga gaacgcagac atta 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-F2 primer
<400> 4
gctggttctt aggtcacttc tc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-R2 primer
<400> 5
ccctgttagc gcgatgtatt 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-P2 probe
<400> 6
aaccttccgc tctacaactg ggc 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-F3 primer
<400> 7
cttcaccatt gacggctact 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-R3 primer
<400> 8
gttctcgttc gccaaatcta atg 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-P3 probe
<400> 9
ttatccgtca gcgttgtgaa gcma 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-F4 primer
<400> 10
gagccaacct tatcaccaga a 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-R4 primer
<400> 11
accaacagcg aacataggta tag 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-P4 probe
<400> 12
tcagcgtctg aagtgatcag cacg 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-F5 primer
<400> 13
acctatgttc gctgttggta tc 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-R5 primer
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gtagccgtca atggtgaagt ag 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tlh-P5 probe
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cgaaagatga tccrgcgacc gatt 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> VP-tdh-F1 primer
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acgtcaggta ctaaatggyt gac 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tdh-R1 primer
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tacgaacaca gcagaatgrc c 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tdh-P1 probe
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aatggcagcg gtgtctggct ataa 24
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tdh-F2 primer
<400> 19
cdccggtcaa tgtaraggtc tc 22
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tdh-R2 primer
<400> 20
gttcacagtc atgtaggatg tca 23
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tdh-P2 probe
<400> 21
tggtcaatca gtattcacaa cgtcaggt 28
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tdh-F3 primer
<400> 22
cagtattcac aacgtcaggt acta 24
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tdh-R3 primer
<400> 23
acgaacacag cagaatgrcc 20
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-tdh-P3 probe
<400> 24
actatacaat ggcagcggtg tctgg 25
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-F1 primer
<400> 25
gctcaaaatg gttaagcgcc ta 22
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-R1 primer
<400> 26
caccaacgaa atcactaaca gaag 24
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-P1 probe
<400> 27
acacaatggc tgctctttct ggcta 25
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-F2 primer
<400> 28
caggttcgga tgagctacta ttt 23
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-R2 primer
<400> 29
ygtttcggtt tgtccagtag t 21
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-P2 probe
<400> 30
actgaatcac cagttaacgc aatcgttg 28
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-F3 primer
<400> 31
ttcacgactt caggctcaaa 20
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-R3 primer
<400> 32
accgttgaaa ggccatctt 19
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-P3 probe
<400> 33
acacaatggc tgctctttct ggcta 25
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-F4 primer
<400> 34
ctacacaatg gctgctcttt c 21
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-R4 primer
<400> 35
cgttacactt ggcaatgatt ct 22
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP-trh-P4 probe
<400> 36
agatggcctt tcaacggtct tcaca 25
<210> 37
<211> 668
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic tdh gene
<400> 37
aattattcag tttgcttctt tggttttttt agttttcata acacccgtca ttctggcaaa 60
gttattaatc aattcatggt ttttttatga aacaccaata ttttgcaaaa aaatcatttt 120
tatttatatc catgttggct gcattcaaaa catctgcttt tgagcttcca tctgtccctt 180
ttcctgcccc cggttctgat gagatattgt ttgttgttcg agatacaact tttaataccc 240
aagctccggt caatgtaaag gtctctgact tttggacaaa ccgtaatgta aaaagaaaac 300
cgtacgaaga tgtttatggt caatcagtat tcacaacgtc aggtactaaa tggttgacat 360
cctacatgac tgtgaacatt aatgataaag actatacaat ggcagcggtg tctggctata 420
agagcggtca ttctgctgtg ttcgtaaaat cagatcaagt acaacttcaa cattcctata 480
attctgtagc taactttgtt ggtgaagatg aaggttctat tccaagtaaa atgtatttgg 540
atgaaactcc agaatatttt gttaatgtag aagcatatga gagtggtagt ggtaatatat 600
tggtaatgtg tatatccaac aaagaatcgt tttttgaatg taaacatcaa caataaaaat 660
aaaaagcc 668
<210> 38
<211> 567
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic trh gene
<400> 38
atgaaactaa gactctactt tgccttcagt ttgctattgg cttcgatatt ttcagtatct 60
aaatcattcg cgattgacct gccatccata ccttttcctt ctccaggttc ggatgagcta 120
ctatttgtcg ttagaaatac aacaataaaa actgaatcac cagttaacgc aatcgttgat 180
gactactgga caaaccgaaa cataaaacga aaaccatata aaagcgttca cggtcaatct 240
attttcacga cttcaggctc aaaatggtta agcgcctata tgacggtaaa tattaatgga 300
aataactaca caatggctgc tctttctggc tataaagatg gcctttcaac ggtcttcaca 360
aaatcagaaa aaacaagcct aaatcagaac tattcttctg ttagtgattt cgttggtgag 420
aatgaagaat cattgccaag tgtaacgtat ttggatgaaa cgccagaata tttcgtcaat 480
gtcgaagcat atgagagcgg aaatgggcat atgtttgtta tgtgcatttc caataaatca 540
tcatttgatg aatgtatgtc acaaata 567
<210> 39
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic tlh gene
<400> 39
atgatgaaaa aaacaatcac actattaact gcattactcc cgcttgcttc tgcagttgcc 60
gaagagccaa ccttatcacc agaaatggtt tcagcgtctg aagtgatcag cacgcaagaa 120
aaccaaacct atacctatgt tcgctgttgg tatcgcacca gctactcgaa agatgatccg 180
gcgaccgatt gggaatgggc aaaaaacgaa gatggtagct acttcaccat tgacggctac 240
tggtggagct ccgtttcatt taaaaacatg ttctacacca acacgtcgca aaacgttatc 300
cgtcagcgtt gtgaagccac attagatttg gcgaacgaga acgcagacat tacgttcttc 360
gccgctgaca atcgcttctc atacaaccac acgatctgga gcaacgacgc agcaatgcag 420
ccagatcaaa tcaacaaagt ggttgcactc ggtgacagct tgtctgatac aggcaacatc 480
tttaacgcat cacaatggcg cttccctaac ccgaacagct ggttcttagg tcacttctcc 540
aacggttttg tgtggacaga atacattgcc aaagcgaaga accttccgct ctacaactgg 600
gcagttggcg gcgcggctgg tgagaaccaa tacatcgcgc taacaggggt tggtgagcaa 660
660
Claims (9)
- 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
상기 준비한 유전자 샘플을 주형으로 사용하고, 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 종 동정을 위한 tlh (thermolabile hemolysin) 유전자에 특이적인 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 10 및 11의 프라이머 쌍, 및 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과, 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 병원성 확인을 위한 tdh (thermostable direct hemolysin virulence factor) 유전자에 특이적인 서열번호 16 및 17의 프라이머 쌍, 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍, 및 서열번호 22 및 23의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과, 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 병원성 확인을 위한 trh (thermostable direct hemolysin-related hemolysin) 유전자에 특이적인 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍, 서열번호 28 및 29의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍, 및 서열번호 34 및 35의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과, 그리고 증폭되는 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자와 관련하여 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여, 상기 검체의 유전자 샘플 내의 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자를 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자의 증폭 후, 상기 표지물질을 이용하여 산출된 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자 증폭량에 기초하여, 검체 내의 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 존재 여부, 존재량, 병원성 여부 및 병원성 정도를 정량적으로 측정하는 단계와,
상기 정량적으로 측정된 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 존재 여부, 존재량, 병원성 여부 및 병원성 정도에 기초하여 검체 내의 새우조기폐사증후군 감염 여부를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 표지물질은,
상기 tlh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12 및 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단과,
상기 tdh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 18, 서열번호 21 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단과,
상기 trh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단에 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자의 증폭량을 산출하는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법. - 제2항에 있어서,
증폭 전, 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자를, 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자에 각각 대응되는 프라이머 쌍과, 증폭되는 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자와 관련하여 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자 각각의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자 각각을 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내의 새우조기폐사증후군 감염 여부를 정량적으로 측정하는 단계를 더 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법. - 삭제
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 사용하는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법. - 제5항에 있어서,
서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 사용하여 1개의 검사 튜브에서 새우조기폐사증후군과 관련된 상기 tlh 유전자, 상기 tdh 유전자 및 상기 trh 유전자를 한번에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법. - 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 종 동정을 위한 tlh (thermolabile hemolysin) 유전자에 특이적인 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 10 및 11의 프라이머 쌍, 및 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과, 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 병원성 확인을 위한 tdh (thermostable direct hemolysin virulence factor) 유전자에 특이적인 서열번호 16 및 17의 프라이머 쌍, 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍, 및 서열번호 22 및 23의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍과, 비브리오 파라헤모라이티쿠스의 병원성 확인을 위한 trh (thermostable direct hemolysin-related hemolysin) 유전자에 특이적인 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍, 서열번호 28 및 29의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍, 및 서열번호 34 및 35의 프라이머 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 쌍, 그리고 DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 포함하고,
상기 표지물질은,
상기 tlh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12 및 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단과,
상기 tdh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 18, 서열번호 21 및 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단과,
상기 trh 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브로서 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33 및 서열번호 36의 올리고뉴클레오티드들과 이들 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브의 한쪽 말단에 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 새우조기폐사증후군 진단을 위한 리얼타임 PCR 증폭키트. - 삭제
- 제7항에 있어서,
서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 포함하는 것을 특징으로 하는 새우조기폐사증후군 진단을 위한 리얼타임 PCR 증폭키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140010420A KR101521381B1 (ko) | 2014-01-28 | 2014-01-28 | 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법 및 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140010420A KR101521381B1 (ko) | 2014-01-28 | 2014-01-28 | 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법 및 키트 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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|---|---|---|---|
| KR1020140010420A KR101521381B1 (ko) | 2014-01-28 | 2014-01-28 | 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법 및 키트 |
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116024361A (zh) * | 2023-02-02 | 2023-04-28 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种用于检测对虾玻璃苗致病弧菌的引物及试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040265822A1 (en) * | 2001-08-03 | 2004-12-30 | Takeshi Koizumi | Method of detecting, identifying and counting enteritis vibrio using gene (rpod) sequences encoding rna polymerase sigma 70 factor |
| CN101475986A (zh) * | 2009-01-20 | 2009-07-08 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种对多种弧菌进行基因检测的共检芯片及其检测与应用 |
| CN102605055A (zh) * | 2012-02-23 | 2012-07-25 | 浙江省疾病预防控制中心 | 副溶血性弧菌多重定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
-
2014
- 2014-01-28 KR KR1020140010420A patent/KR101521381B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GenBank:JF730305.1 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116024361A (zh) * | 2023-02-02 | 2023-04-28 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种用于检测对虾玻璃苗致病弧菌的引物及试剂盒 |
| CN116024361B (zh) * | 2023-02-02 | 2024-01-26 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种用于检测对虾玻璃苗致病弧菌的引物及试剂盒 |
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