CN103540668A - 检测10种海域致病菌的基因芯片 - Google Patents

检测10种海域致病菌的基因芯片 Download PDF

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dna
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苏秀榕
周君
李太武
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Abstract

本发明公开了检测10种海域致病菌的基因芯片，包括固相载片，固相载片上设有质控探针和检测探针，检测探针的核苷酸序列组份为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.27所示，可以同时检测出阴沟肠杆菌、迟缓爱德华菌、粪链球菌、强壮弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌和黄海希瓦氏菌，而且不需要活的细菌，只要有DNA即可；具有高通量、平行性、微型化、自动化、快速灵敏、定量、样品用量少等显著优点。

Description

检测10种海域致病菌的基因芯片
技术领域
本发明涉及细菌基因芯片，具体涉及检测10种海域致病菌的基因芯片。
背景技术
随着人类对海洋开发力度的加大，海域生态环境承载的压力也与日俱增，而由于病原微生物在海洋环境中的存在与适宜条件下的大量繁殖，影响了人类对海洋的开发与利用活动，影响了近岸海域的海洋功能，也对人体健康造成了潜在的威胁。首先如人、畜共患致病菌通过食用海产品等途径感染人类，严重危及人类的健康和生命安全，因海产品中的霍乱弧菌和副溶血弧菌等引发的霍乱和腹泻等事件频发。其次，由于滨海游泳、水上运动、旅游、度假等休闲娱乐活动而传播的细菌性疾病，已成为严重的公众健康问题。还有我国沿海有600多个大型排污口，约84%的入海排污口超标排放污染物。而船舶排放压舱水及受到污损的船体、锚链等也是造成地理性隔离水体间有害生物传播的最主要途径。有些致病微生物的抗性远远超过陆生微生物，也是引发大多数感染性疾病的病原体，它给人类带来的灾难有时甚至是毁灭性的。因此，致病菌的快速、准确、灵敏、特异的诊断技术是有效预防感染性疾病发生，控制其暴发性传播的前提和关键。因为自然环境中仅有小于1%左右的微生物可培养，而基因芯片不需要活的细菌，只要有DNA即可；基因芯片具有高通量、平行性、微型化、自动化、快速灵敏、定量、样品用量少等显著特点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高通量、检测灵敏的检测10种海域致病菌的基因芯片。
本发明的技术方案是检测10种海域致病菌的基因芯片，包括固相载片，所述固相载片上设有质控探针和检测探针，所述检测探针如下：阴沟肠杆菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，迟缓爱德华菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，粪链球菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，强壮弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，哈维氏弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示，副溶血弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，灿烂弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17所示，创伤弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18、SEQID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示，鳗弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示，黄海希瓦氏菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示。
所述质控探针HEX的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，PC的核苷酸序列如SEQ IDNO.29所示，NC的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
与现有技术相比本发明优点在于检测10种海域致病菌的基因芯片，包括固相载片，固相载片上设有质控探针和检测探针，检测探针的核苷酸序列组份为SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.27所示，可以同时检测出阴沟肠杆菌、迟缓爱德华菌、粪链球菌、强壮弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌和黄海希瓦氏菌，而且不需要活的细菌，只要有DNA即可；具有高通量、平行性、微型化、自动化、快速灵敏、定量、样品用量少等显著优点。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一、固相载体（基片）的选取
常用的固相载体包括尼龙膜、硝酸纤维素膜、玻璃片和各种有机高分子制作的薄膜等，本实施例所使用的为75.5mm×25.2mm×1.0mm的玻璃片作为基片，要求外观无划痕、无缺损，玻璃片表面要经过化学修饰后，才能将DNA探针固定在基片上，现有的玻璃片表面化学修饰主要有氨基修饰、醛基修饰和巯基修饰。本实施例选择对玻璃片进行醛基修饰，为北京博奥生物有限公司的产品。
二、探针的制备
1、质控探针的设计：在芯片设计时采用了表l所示的质控探针，探针均在NCBI中进行了比对，和己知基因无明显同源性，也可市售其它质控探针，只要与己知基因无明显同源性即可。
表1：质控探针表
HEX GYCACAYGCGAYGGAYCGAGCYCCYYYAYCAYCGYYCCCACCYYAAYGCA
PC GCTGCCTCCCGTAGGAGT
NC GTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT
2、检测探针的设计：从NCBI中下载所需要的细菌的核酸序列，设计流程为下载序列，整理后导入数据库，提取所有细菌的通用引物所包括的序列，进行全局匹配，得到某指定细菌的特征区段，在特征区域设计种特异性探针，再进行引物特异性检验、性能评价和分级，调整Tm值和弃用特异性有问题的探针，最终得到表2所示的检测探针序列。在探针设计时考虑到以下原则：特异性位点尽量在探针中间，或略靠近探针3’端，Oligo揉针的长度一般在40bp左右，探针Tm值尽量在50-70℃之间。探针设计完后，与NCBI的核酸数据库进行比对，进行特异性的检验，并使用DNAStar软件检测是否有Hairpin或者dimer形成。
表2：检测探针表
EC1 aaggtgttgtggttaataaccacagcaattgacgttaccc 16s 阴沟肠杆菌
EC2 cggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgcggctcaacc 16s 阴沟肠杆菌
ET1 cgggcctcatgccatcagatgaacccagatgggattagct 16s 迟缓爱德华菌
ET2 tcttgacatccagcgaatcctgtagagatacgggagtgcc 16s 迟缓爱德华菌
EF1 cgtgggtaacctacccatcagagggggataacacttggaa 16s 粪链球菌
EF2 ggtaacctacccatcagagggggataacacttggaaacag 16s 粪链球菌
EF3 cgatgagtgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtg 16s 粪链球菌
VF1 cggaaacgagttagaaccttcggggaacgataacggcgtc 16s 强壮弧菌
VF2 gttatctgaaccttcgggggacgataacggcgtcgagcgg 16s 强壮弧菌
VF3 agttatcctgaacctttcgggggaacgataacggcgtcgt 16s 强壮弧菌
VH1 agaagtaggtagtttcaactacgggaggacagcctaccac 16s 哈维氏弧菌
VH2 ctgtctgagaaagtggttctgactatccaccgcggcggtc gyrb 哈维氏弧菌
VP1 agcactgattcgtttgacggacgcaggtgcgaagaacttc tlh 副溶血弧菌
VP2 gatactcacgccttgttcgagacgctaacttctgcgccag tlh 副溶血弧菌
VP3 tatcaagcttattgatgagcgcgaagcggacaagcaagac gyrb 副溶血弧菌
VS1 aacgacactaacaatccttcgggtgcgttaatgggcgtcg 16s 灿烂弧菌
VS2 agccggaaacgacaacattgaatcttcggaggatttgttg 16s 灿烂弧菌
VV1 ctcgatcatgagccaaccgctgaagagatcgctgcgcaac rpoS 创伤弧菌
VV2 gctgcgcaactggatattccggttgacgatgtgggcaaaa rpoS 创伤弧菌
VV3 caacgctggaagaggttgggcaagagattggtttaactcg rpoS 创伤弧菌
VV4 ttgtacgaagcgcccgtgtctgaaactggcgtaacggatt vvh 创伤弧菌
VV5 gtgaagtgaagtccgcagtggaatccttcatggcagacaa gyrb 创伤弧菌
VA1 aaggcctaccatgcaagtcgagcggcagcacagaggaact 16s 鳗弧菌
VA2 cggactaacaatgcaagtcgagcggcagcacagaggaact 16s 鳗弧菌
SM1 acactgggttctcaagctaacgcattaagtagaccgcctg 16s 黄海希瓦氏菌
SM2 tatccttacttgccagcgggtcatgccgggaactttaggg 16s 黄海希瓦氏菌
SM3 atccttacttgccagcgggtcatgccgggaactttaggga 16s 黄海希瓦氏菌
3、探针的合成：探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，要在醛基化表面固定的DNA分子必须具有5’氨基，具有通过6-12个碳原子间隔臂连接在5’核苷酸的磷酸基团上的一个伯氨基。
4、点样前的探针准备：合成好的探针先溶解在双蒸水中，终浓度为40uM，然后加入到晶芯基因芯片点样液（博奥生物有限公司生产）中。配制探针水溶液(30-60uM)，转5ul上述核酸溶液到384孔板或96孔板中，加入5uL2×基因芯片点样液，并用移液器充分混合后点样。探针和对照样品以点阵（微阵列）的形式分布在芯片上。每张芯片上有四个点阵。这样一张芯片可以同时检测四份样品。同时设置核酸固定阳性对照、实验阳性和阴性对照。芯片点制完成后，寡聚核苷酸探针健合发生于连接氨基上的非键电子对亲和进攻醛基基团上电正性的碳原子时。在湿度＜40%时发生了脱水，使得在氨基化DNA分子和芯片表面间形成共价键。
三、基因芯片制备
1、基因芯片的设计：将选定的检测探针和质控探针以表3所示的点阵形式分布在醛基基片上，每张芯片上有四个点阵，芯片的点样是由博奥生物有限公司生产的晶芯SmartArrayTM12阵列芯片点样系统完成的；制备完成后的芯片经晶芯LuxScanTM10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Power一90/900的扫描参数下扫描，在同一张芯片内，同一根针点样，点直径偏差小于20%。点阵整齐，无明显连点现象，即证明芯片合格，可以使用。
表3 探针排布
HEX PC NC
EC1 EC2 ET1 ET2
EF1 VF1 VP1 SM1
EF2 VF2 VP2 SM2
EF3 VF3 VP3 SM3
VA1 VA2 VH1 VH2
VV1 VV2 VV3 VV4
VV5 VS1 VS2
NC PC HEX
四、基因芯片检测应用验证
1、样品选取：收集表4中10种细菌的标准菌株样品，从中提取样品的DNA。
表4：标准菌株采样菌株列表
Figure BDA0000399570420000041
2、引物的设计和合成：根据细菌16S rRNA、细菌解旋酶基因gyrB、副溶血弧菌的溶血素tlh基因，创伤弧菌的rpoS和vvh基因设计扩增引物。首先从NCBI数据库中下载基因及蛋白序列，利用序列分析软件MUSCLE对蛋白序列进行全局比对，寻找序列的保守区域，在保守区域设计引物（表5），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表5 PCR扩增引物表
Figure BDA0000399570420000051
其中N表示A/T/G/C，Y表示C/T，R表示A/G，H表示A/C/T，S表示G/C。引物设计之后，利用BLASTP，将引物设计的靶氨基酸序列与各细菌的蛋白序列进行比对，以确定PCR的效果及产物大小。
3、样品扩增：将每种菌各2份的20份样品分别用表5所示的5对引物以及表6、7所示的扩增体系和扩增参数进行PCR扩增反应，得到靶序列PCR产物。
表6 PCR扩增体系
组分 体积 终浓度
模板 1ul
引物F(10uM) 0.5ul 0.25uM
引物R(10uM) 0.5ul 0.25uM
dNTP(10mM) 0.4ul 0.2mM
rTaq(5U/ul) 0.2ul 1U/20ul
10*pcr buffer 2ul
高纯灭菌水 15.4ul
总体积 20ul
表7 PCR反应程序
Figure BDA0000399570420000052
程序结束后，将离心管取出，瞬时离心收集溶液于管底。
4、荧光标记PCR产物：将每个样品的PCR产物等量混合后取5μL至无菌洁净的0.2mL离心管中，作为模板，向每个样品管加入浓度为100μM的带有荧光素（cy3）标记的随机引物（9N）溶液3μL，并补水至19μL，震荡混匀，瞬时离心，将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性3min，立即放置冰上3min，按照表8在冰上制备荧光标记反应体系Mix，并向各管中加入6μL荧光标记反应体系Mix，震荡混匀，瞬时离心，将离心管放入PCR仪，运行按照表9设置的程序，进行荧光标记扩增，得到荧光标记产物。程序结束后，将样品置于冰上，然后进行下一步芯片杂交。
表8 荧光标记反应体系Mix(1个反应)
组分 加入体积
5×Klenow Buffer 2.5μL
klenow酶 1μL
dNTP(2.5mM) 2.5μL
表9 荧光标记反应程序
步骤 温度 反应时间
1 37℃ 1.5h
2 70℃ 10min
5、杂交：将4×杂交缓冲液在50℃融化，按表10配制杂交体系，95℃变性3min，立即放置冰上，备用。其中4×杂交缓冲液为博奥生物有限公司生产。
表10 杂交体系
组分 加入体积
4×杂交缓冲液 5μL
荧光标记产物 15μL
总体积 20μL
配制完杂交体系后，打开芯片杂交盒，将杂交盒平放桌面上，在杂交盒和底部凹槽内加入约80μL灭菌水，以防止杂交过程中杂交液大量挥发，将芯片正面朝上放入杂交盒内两个定位销之间，放上芯片盖片（有凸台的一面朝向芯片），上端先接触芯片，再缓缓盖下；样品管瞬时离心，用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入20μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜，不要震动盖片或芯片避免破坏液膜。将杂交盒的盖板扣上，确保槽板两端的定位销分别插入盖板两端的定位销孔中。扣上盖板后，分别将两个金属夹卡进两侧，注意：动作要平缓，不要让杂交盒有大的震动，以防止杂交液溅出点阵区域；另外，金属夹需要完全卡进，以确保杂交盒的密封性。之后，将杂交盒放入50℃水浴2h。
6、芯片清洗：杂交结束后，快速将芯片从杂交盒中拿出，将芯片转移到盛放洗液I（2×SSC，0.2%SDS）的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗4min，以洗去没有与探针特异结合的样品。洗液I清洗结束后，迅速将芯片转移到盛放洗液II（0.2×SSC）的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗4min。清洗后，放置于离心管中1500rpm离心1min。使样品与探针充分反应根据碱基互补配对的原则，在适当的反应条件下，带有荧光素标记的PCR产物与基因芯片上的互补探针杂交结合形成稳定的双链，通过扫描仪扫描可获得对应探针点的信号。
7、检测结果和分析：杂交结果用博奥生物有限公司开发的重要海域致病菌基因芯片检测系统软件软件进行了判读，判读结果为：
阴沟肠杆菌与其种特异性探针EC1、EC2杂交，其他探针未出现杂交信号。
粪链球菌与其种特异性探针EF1、EF2、EF3杂交，其他探针未出现杂交信号。
强壮弧菌与其种特异性探针VF1、VF2、VF3杂交，其他探针未出现杂交信号。
哈维氏弧菌与其种特异性探针VH1、VH2杂交，同时也与VF1、VF2、VF3杂交。
副溶血弧菌与其种特异性探针VP1、VP2、VP3，同时也与VF1、VF2、VF3杂交。
灿烂弧菌与其种特异性探针VS1、VS2杂交，其他探针未出现杂交信号。
创伤弧菌与其种特异性探针VV1、VV2、VV3、VV4、VV5杂交，其他探针未出现杂交信号。
鳗弧菌与其种特异性探针VA1、VA2杂交，其他探针未出现杂交信号。
黄海希瓦氏菌与其种特异性探针SM1、SM2、SM3杂交，其他探针未出现杂交信号。从以上实施例中可以看出本发明具有对重要海域致病菌进行高通量、微型化和自动化检测的优点，除强壮弧菌外，其他九个致病菌检测的特异性好。
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Ctcgatcatg agccaaccgc tgaagagatc gctgcgcaac     40
 
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 19
Gctgcgcaac tggatattcc ggttgacgat gtgggcaaaa     40
 
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 20
Caacgctgga agaggttggg caagagattg gtttaactcg     40
 
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 21
Ttgtacgaag cgcccgtgtc tgaaactggc gtaacggatt     40
 
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 22
Gtgaagtgaa gtccgcagtg gaatccttca tggcagacaa     40
 
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 23
Aaggcctacc atgcaagtcg agcggcagca cagaggaact     40
 
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 24
Cggactaaca atgcaagtcg agcggcagca cagaggaact     40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 25
Acactgggtt ctcaagctaa cgcattaagt agaccgcctg     40
 
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 26
Tatccttact tgccagcggg tcatgccggg aactttaggg     40
 
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 27
Atccttactt gccagcgggt catgccggga actttaggga     40
 
<210>28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 28
Gycacaygcg ayggaycgag cyccyyyayc aycgyyccca ccyyaaygca     50
 
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 29
GCTGCCTCCC GTAGGAGT     18
 
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 30
GTTGCTTCTG GAATGAGTTT GCT     23
 
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 31
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG     20
 
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 32
GGTTACCTTG TTACGACTT     19
 
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 33
AAGCGHCCNG SNATGTAYAT HGG     23
 
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 34
CCNGCNGART CNCCYTCNAC    20
 
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 35
TTCCAACTTC AAACCGAACT ATGAC     25
 
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 36
ATTCCAGTCG ATGCGAATAC GTTG     24
 
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 37
AAAGCGGATT ATGCAGAAGC ACTG     24
 
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 38
GCTACTTTCT AGCATTTTCT CTGC     24
 
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 39
CTGGCACTGC  TTGATTTG     18
 
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<400> 40
TCAGAACTTC  ACGGAGGC    18
 
 

Claims (2)

1.检测10种海域致病菌的基因芯片，包括固相载片，所述固相载片上设有质控探针和检测探针，其特征在于所述检测探针如下：阴沟肠杆菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，迟缓爱德华菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，粪链球菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，强壮弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，哈维氏弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，副溶血弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，灿烂弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，创伤弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示，鳗弧菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示，黄海希瓦氏菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示。
2.如权利要求1所述的检测10种海域致病菌的基因芯片，其特征在于所述质控探针HEX的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，PC的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，NC的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
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