CN101691608B - 水产品养殖致病菌的基因芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水产品养殖致病菌的基因芯片，包括经化学修饰的固相载体，在固相载体上点阵分布有检测探针和质控探针，检测探针包括待测弧菌属、霍乱弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血性弧菌、诺卡氏菌属、鰤鱼诺卡氏菌、气单胞菌属、嗜水性气单胞菌、链球菌属、海豚链球菌的特异性16S rDNA序列和/或gyrB基因序列，质控探针为PCR阳性、芯片固定阳性对照、芯片杂交阴性对照、芯片杂交阳性对照和芯片杂交空白对照；这样该基因芯片具有体积少和高通量的优点，能同时检测弧菌属、诺卡氏菌属、气单胞菌属和链球菌属的已知和未细菌，也能检测具体的多个种类的细菌，并且检测上述细菌快捷和特异，加上检测软件后就可以自动化检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因芯片，具体涉及水产品养殖致病菌的基因芯片。
背景技术
由于自然资源的逐渐稀缺和人们的需求增强，目前多数水产品进行了人工养殖，由于水产品在养殖过程中密度较大、水体富营养化和水体流动性较差，使得各种致病菌繁殖和传染性增大，成为水产品养殖的重要难题，目前对水产品养殖中致病菌检测手段较缺乏，养殖户们只好采用茛据经验和对各种致病菌都预防和杀灭的方式洒药，不能对症下药，既造成了药品浪费，又达不到杀灭致病菌的应有药量。
基因芯片包括以硅片、玻片、金属片、陶瓷片、聚丙烯或尼龙膜等基片作为固相载体，经氨基、醛基或巯基的表面化学修饰，将寡聚核苷酸(DNA、cDNA、rDNA片段)、多肽和细胞等生物大分子的检测探针及对照样品以点阵(微阵列)的形式分布在固相载体上。目前已有家禽和家畜疫病珍断的基因芯片，如公告号为CN1181210，授权公告日为2004年12月22日，名称为家禽和/或家畜疫病诊断性基因芯片及其用途的中国发明专利，和公告号为CN1260371，授权公告日为2006年6月21日，名称为猪繁殖障碍综合症的基因芯片及其用途的中国发明专利，就公开了检测猪、鸡的各种疾病的基因芯片。但目前没有对水产品致病菌进行高通量、微型化和自动化检测的基因芯片的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对水产品致病菌的检测具有高通量、微型化和自动化的基因芯片；该基因芯片能快速检测判读多个属和种的致病菌。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：水产品养殖致病菌的基因芯片，包括经化学修饰的固相载体，在所述固相载体上点阵分布有检测探针和质控探针，所述检测探针包括待测弧菌属、霍乱弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血性弧菌、诺卡氏菌属、鰤鱼诺卡氏菌、气单胞菌属、嗜水性气单胞菌、链球菌属、海豚链球菌的特异性16S rDNA序列和/或gyrB基因序列，所述质控探针为PCR质控阳性寡聚核苷酸序列SEQ ID NO：39、芯片固定阳性对照寡聚核苷酸序列SEQ ID NO：40、芯片杂交阴性对照寡聚核苷酸序列SEQ ID NO：41、芯片杂交阳性对照寡聚核苷酸序列SEQ ID NO：42和芯片杂交空白对照，待测弧菌属的为SEQ ID NO：1序列和SEQ ID NO：2序列，待测霍乱弧菌的为SEQ ID NO：3序列和SEQ ID NO：4序列，待测哈维氏弧菌的为SEQ ID NO：5序列，待测溶藻弧菌的为SEQ ID NO：6序列和SEQ ID NO：7序列，待测鳗弧菌的为SEQ ID NO：8序列、SEQ ID NO：9序列、SEQ ID NO：10序列和SEQ ID NO：11序列，待测副溶血性弧菌的为SEQ ID NO：12序列，待测诺卡氏菌属的为SEQ ID NO：13序列和SEQ ID NO：14序列，待测鰤鱼诺卡氏菌属的为SEQ ID NO：15序列和SEQID NO：16序列，待测气单胞菌属的为SEQ ID NO：17序列和SEQ ID NO：18序列，待测嗜水性气单胞菌属的为SEQ ID NO：19序列，待测链球菌属的为SEQ ID NO：20序列和SEQ ID NO：21序列，待测海豚链球菌的为SEQ ID NO：22序列和SEQ ID NO：23序列。
所述检测探针还包括待测河流弧菌、创伤弧菌、苏伯利气单胞菌、黄杆菌属、嗜冷黄杆菌和变形杆菌属的特异性16S rDNA序列和/或gyrB基因序列，待测河流弧菌的为SEQ ID NO：24序列、SEQ ID NO：25序列和SEQ ID NO：26序列，待测创伤弧菌的为SEQ ID NO：27序列、SEQ ID NO：28序列和SEQ ID NO：29序列，待测苏伯利气单胞菌的为SEQ ID NO：30序列，待测黄杆菌属的为SEQ ID NO：31序列和SEQ ID NO：32序列，待测嗜冷黄杆菌的为SEQ ID NO：33序列、SEQ ID NO：34序列、SEQ ID NO：35序列和SEQ ID NO：36序列，待测变形杆菌属的为SEQ ID NO：37序列和SEQ ID NO：38序列；这样使基因芯片所检测的细菌又增加了2个属和4个菌种，基本上覆盖了水产品养殖中的常见和非常见的致病菌。
上述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37和SEQ ID NO：38为16S rDNA序列。16S rRNA为所有细菌共有，是细菌进化过程中最为保守的基因，16S rRNA基因大小适中，约1.5Kb左右，含有高度保守的基因片段，同时在不同的菌株间也含有变异的核酸片段。因其既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术快速得到核酸序列，已成为理想的基因鉴定靶序列，具有属或种的特异性。
上述SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35属于gyrB基因序列。gyrB基因为DNA解旋酶B亚基蛋白(gyrB)基因，其广范存在于各类细菌中，在水平层次上无相互转移现象，不随着环境的变换而变化，且在进化上比核糖体基因出现的还要早些，所以同样可作为基因分类器(Yamamotoand Harayama，1995，1996；Suzuki et al.，2001；Yamamoto et al.，1999)。
所述化学修饰为醛基修饰。
所述的基因芯片在水产品养殖致病菌的检测中应用。
所述基因芯片用于水产品养殖致病菌检测的过程由检测系统软件自动检测，使结果分析和报告输出一体化，达到简便快捷的优点；检测系统软件由博奥生物公司开发提供。
与现有技术相比，本发明的优点在于水产品养殖致病菌的基因芯片，包括经化学修饰的固相载体，在固相载体上点阵分布有检测探针和质控探针，检测探针包括待测弧菌属、霍乱弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血性弧菌、诺卡氏菌属、鰤鱼诺卡氏菌、气单胞菌属、嗜水性气单胞菌、链球菌属、海豚链球菌的特异性16S rDNA序列和/或gyrB基因序列，质控探针为PCR质控阳性寡聚核苷酸序列SEQ ID NO：39、芯片固定阳性对照寡聚核苷酸序列SEQ ID NO：40、芯片杂交阴性对照寡聚核苷酸序列SEQID NO：41、芯片杂交阳性对照寡聚核苷酸序列SEQ ID NO：42和芯片杂交空白对照；这样该基因芯片具有体积小的优点；该基因芯片能快速检测判读多个属和种的致病菌，因此检测上述细菌快捷和特异；加上检测软件后就可以自动化检测。因此本发明具有高通量、微型化和自动化检测的优点。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一、固相载体(基片)的选取
固相载体包括尼龙膜、纤维素膜、玻片、金属片、硅片、陶瓷片、各种有机高分子制作的薄膜等，我们选择尺寸为75.5mm×25.2mm×1.0mm的玻片作为基片；根据大批量的玻片测定结果和点样仪对点样基片的要求，要求长宽尺寸误差≤±0.2mm，厚度误差≤±0.05mm。同时要求外观无划痕、无缺损。
二、基片表面化学修饰
玻片表面要经过化学修饰后，才能牢固地固定DNA，现有的玻片表面化学修饰主要有氨基修饰、醛基修饰和巯基修饰。我们选择醛基修饰得醛基基片，具体制作过程为硅羟基化的玻片用3-氨丙基三乙氧基硅烷处理，使玻片表面带上一层末端氨基，然后用戊二醛处理，戊二醛分子两端的醛基可以和玻片表面的氨基形成希夫碱，将它们以长链碳桥的形式连接起来。再用NaBH4或NaCNBH3还原希夫碱形成稳定的双键。
三、醛基基片性能检测
亲疏水性能检测：通过接触角测量仪检测水在基片表面的接触角情况，接触角在55°±5°范围的基片此项检测指标合格。
基片背景检测：制备完成后的基片经晶芯
LuxScanTM 10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Power＝90/900的参数下扫描，其Cy3通道荧光背景≤1000；Cy5通道荧光背景≤300为荧光背景合格基片。
固定能力的检测：主要是通过固定在醛基基片表面的激发波长为532nm的荧光标记Oligo样品和要杂交的Oligo样品分别判断醛基基片的表面化学特性和生物样品固定能 力等指标；对于2.5uM激发波长为532nm的荧光标记的Oligo样品，在固定化处理后经晶芯 
LuxScanTM 10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Power＝90/750的扫描参数下，Cy3通道荧光背景≥10000，且杂交后10.0uM的PBH(一种Oligo样品)Cy3通道信号≥15000的基片，其固定能力合格。
四、探针的制备
1质控探针的设计
在芯片设计时采用了表1所示的质控探针，这些探针均在NCBI中进行了BLAST比对，和已知基因无明显同源性。
表1：质控探针表
2检测探针的设计：从RDPII(http://rdp.cme.msu.edu/)中下载所需要的细菌的核酸序列，分析流程为下载序列数据，整理后导入数据库，抽取所有细菌的通用引物所包括的序列，进行全局联配，根据联配图得到某指定细菌的特征区段，在特征区域设计种特异性探针，再进行引物特异性检验、性能评价和分级，调整Tm值和弃用特异性有问题的探针，最终得到表2所示的检测探针序列。
在探针设计时考虑到以下原则：特异性位点尽量在探针中间，或略靠近探针3′端，Oligo探针的长度一般在20bp左右，探针Tm值尽量在50-70℃之间。探针设计完后，与NCBI的核酸数据库进行比对，进行特异性的检验，并使用Primer premier 5检测是否有Hairpin或者dimer形成。
表2：检测探针表
3探针的合成：探针在英俊生物技术有限公司合成。要在醛基化表面固定的DNA分子必须具有一个伯氨基-5’-氨基，又称为连接氨基，具有通过6-12个碳原子间隔臂连接在5’核苷酸的磷酸基团上的一个伯氨基。而为了使探针分子在芯片上伸展开来，利 于靶标探针的杂交，故合成时在每个探针的5’加上一个氨基和15个T。
4点样前的探针准备：合成好的探针先溶解在双蒸水中，终浓度为40uM，然后加入到晶芯
基因芯片点样液(博奥生物，产品目录号：440010)中。配制探针水溶液(30-60uM)，转5ul上述核酸溶液到384孔板或96孔板中，加入5ul 2×基因芯片点样液，并用移液器充分混合后，即可用于基因芯片点样。
五、基因芯片制备
1基因芯片的设计：选定表3的检测探针和质控探针。
表3：检测探针和质控探针选定表
2基因芯片的制备：将选定的检测探针和质控探针以表4所示的点阵形式分布在醛基基片上，每个芯片上有四个点阵，芯片的点样是由博奥生物有限公司生产的晶芯 SmartArrayerTM48微阵列芯片点样系统完成的；制备完成后的芯片经晶芯 LuxScanTM10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Power＝90/900的扫描参数下扫描，在同一张芯片内，同一根针点样，点直径偏差小于20％。点阵整齐，无明显连点现象，即证明芯片是合格的。
表4：基因芯片点样表
六、基因芯片检测应用验证
1样品选取：收集从表5中9种细菌的标准菌株和水产品致病菌样品，从中提取基因组DNA(样品名中-1为各细菌的标准菌株)。
表5：标准菌株采样菌株列表
2引物的设计和合成：根据细菌16S rRNA、细菌解旋酶基因gyrB设计扩增引物。首先从NCBI数据库中下载基因及蛋白序列，利用序列分析软件MUSCLE对蛋白序列进行全局比对，寻找序列的保守区域，在保守区域设计简并引物(表6)。上游引物 5’-TAMRA标记；探针在英俊生物技术有限公司合成。
表6：PCR扩增引物表
其中N表示A/T/G/C，Y表示C/T，R表示A/G，H表示A/C/T，S表示G/C。gyrB-F/R来自于(Seo et al.，2003)，引物设计之后，利用BLASTP，将引物设计的靶氨基酸序列与各细菌的蛋白序列进行比对，以确定PCR的效果及产物大小。
3样品扩增：将28份样品分别用表6所示的16S和gyrB通用引物以及表7、8所示的扩增体系和扩增参数进行PCR扩增反应，得到靶序列PCR产物。
表7：PCR扩增体系
表8：PCR扩增参数表
4用上述PCR产物进行杂交反应：按表9所示配制杂交液，将杂交液用移液器混匀后，3000rpm离心30s，95℃热变性3min(可在PCR仪中进行)，骤冷冰浴1min；用移 液器将杂交液注入盖片上的小孔，确认杂交液覆盖芯片上的点阵后，盖紧杂交盒盖，放入42℃恒温水浴锅中，杂交2h；杂交结束后，快速将芯片从杂交盒中拿出(盖片可以重复利用)，将芯片转移到盛放洗液I(2×SSC，0.2％SDS)的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗4min，以洗去没有与探针特异结合的样品。洗液I清洗结束后，迅速用镊子将芯片转移到盛放洗液II(0.2×SSC)的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗4min。清洗后，放在50ml锥形离心管中1500rpm离心1min。使样品与探针充分反应根据碱基互补配对的原则，在适当的反应条件下，带有荧光素标记的PCR产物与基因芯片上的互补探针杂交结合形成稳定的双链，也间接对待测序列进行了定性分析。
表9：杂交液配制表
其中7ul PCR产物为以16S引物的扩增产物和以gyrB引物的扩增产物各3.5ul。
5检测结果和分析：杂交结果用博奥生物公司开发的海水养殖致病微生物基因芯片检测系统软件软件或电泳进行了判读，判读结果为：
vpa-1、vpa-2、vpa-3、vpa-4和vpa-5均杂交弧菌属特异性探针Vib-1、Vib-2，判读它们均属弧菌属细菌，其中vpa-1、vpa-2、vpa-3、vpa-4与种特异性探针Vib-par-2杂交，非特异性杂交溶藻弧菌种特异性探针Vib-alg-2，非特异性杂交诺卡氏菌属探针Nac-1，判读Vib-1、Vib-2，vpa-1、vpa-2、vpa-3、vpa-4为副溶血弧菌种；vpa-5非特异性杂交溶藻弧菌种特异性探针Vib-alg-1、Vib-alg-2，且信号较强，判读vpa-5为溶藻弧菌种。
Ahy-1、Ahy-2、Ahy-3、Ahy-4和Ahy-5均杂交气单胞菌属特异性探针Aer-1、Aer-2，判读它们均属气单胞菌属细菌，Ahy-1、Ahy-2、Ahy-3与嗜水气单胞菌种特异性探针Aer hydrophila杂交，判读Ahy-1、Ahy-2、Ahy-3为嗜水气单胞菌种。
Sin-1、Sin-2和Sin-3均杂交链球菌属特异性探针Str-1、Str-2和海豚链球菌种特异性探针Str iniae-1、Str iniae-2，判读Sin-1、Sin-2和Sin-3为链球菌海豚链球菌种细菌。
Val-1、Val-2和Val-3均杂交弧菌属特异性探针Vib-1、Vib-2及溶藻弧菌种特异性探针Vib alg-1、Vib alg-2，判读Val-1、Val-2和Val-3弧菌属溶藻弧菌种细菌。
Aso-1、和Aso-3均杂交气单胞菌属特异性探针Aer-1、Aer-2，Aso-2与弧菌属探 针Vib-2、诺卡氏菌属探针Nac-1、Nac-2、鰤鱼诺卡氏菌中探针Nac ser-1、Nac ser-2有非特异杂交，判读Aso-1和Aso-3为气单胞菌属细菌，Aso-2可能有污染。
Nse-1、Nse-2和Nse-3均杂交诺卡氏菌属特异性探针Nac-1、Nac-2和鰤鱼诺卡氏菌种特异性探针Nac ser-1、Nac ser-2，判读Nse-1、Nse-2和Nse-3为诺卡氏菌属鰤鱼诺卡氏菌种细菌。
Van-1、Van-2和Van-3均杂交弧菌属特异性探针Vib-1、Vib-2和鳗弧菌种特异性探针Vib ang-1、Vib ang-2、Vib ang-3、Vib ang-4，判读Van-1、Van-2和Van-3为弧菌属鳗弧菌种细菌。
Vha-1、Vha-2和Vha-3均杂交弧菌属特异性探针Vib-1、Vib-2和哈维氏弧菌种特异性探针Vib har，判读Vha-1、Vha-2和Vha-3为弧菌属哈维氏弧菌种细菌。
上述实例的基因芯片中也可以增加检测河流弧菌、创伤弧菌、苏伯利气单胞菌、黄杆菌属、嗜冷黄杆菌和变形杆菌属的检测探针，具体设计、制备如上相同。
从以上实施例中可以看出本发明具有对水产品致病菌进行高通量、微型化和自动化检测的优点，且检测的特异性较好。
序列表
<110>宁波大学、宁波博奥生物工程有限公司、博奥生物有限公司
<120>水产品养殖致病菌的基因芯片
<160>42
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
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TAGCCAACCA GTTTCAGATG 20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>38
AGAAGCCACG GTTCAAGACC 20
<210>39
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>39
GCTGCCTCCC GTAGGAGT 18
<210>40
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<212>DNA
<213>人工合成
<400>40
GTCACATGCG ATGGATCGAG CTCCTTTATC ATCGTTCCCA 40
CCTTAATGCA 50
<210>41
<211>23
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<400>41
GTTGCTTCTG GAATGAGTTT GCT 23
<210>42
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>42
CTCATGCCCA TGCCGATGC 19
Claims (5)
1.检测水产品养殖致病菌的基因芯片，包括经化学修饰的固相载体，在所述固相载体上点阵分布有检测探针和质控探针，其特征在于所述检测探针包括待测弧菌属、霍乱弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血性弧菌、诺卡氏菌属、鰤鱼诺卡氏菌、气单胞菌属、嗜水性气单胞菌、链球菌属、海豚链球菌的特异性16S rDNA序列和/或gyrB基因序列，所述质控探针为PCR质控阳性寡聚核苷酸序列SEQ ID NO：39、芯片固定阳性对照寡聚核苷酸序列SEQ ID NO：40、芯片杂交阴性对照寡聚核苷酸序列SEQID NO：41、芯片杂交阳性对照寡聚核苷酸序列SEQ ID NO：42和芯片杂交空白对照，待测弧菌属的为SEQ ID NO：1序列和SEQ ID NO：2序列，待测霍乱弧菌的为SEQ IDNO：3序列和SEQ ID NO：4序列，待测哈维氏弧菌的为SEQ ID NO：5序列，待测溶藻弧菌的为SEQ ID NO：6序列和SEQ ID NO：7序列，待测鳗弧菌的为SEQ ID NO：8序列、SEQ ID NO：9序列、SEQ ID NO：10序列和SEQ ID NO：11序列，待测副溶血性弧菌的为SEQ ID NO：12序列，待测诺卡氏菌属的为SEQ ID NO：13序列和SEQID NO：14序列，待测鰤鱼诺卡氏菌属的为SEQ ID NO：15序列和SEQ ID NO：16序列，待测气单胞菌属的为SEQ ID NO：17序列和SEQ ID NO：18序列，待测嗜水性气单胞菌属的为SEQ ID NO：19序列，待测链球菌属的为SEQ ID NO：20序列和SEQ IDNO：21序列，待测海豚链球菌的为SEQ ID NO：22序列和SEQ ID NO：23序列。
2.如权利要求1所述的检测水产品养殖致病菌的基因芯片，其特征在于所述检测探针还包括待测河流弧菌、创伤弧菌、苏伯利气单胞菌、黄杆菌属、嗜冷黄杆菌和变形杆菌属的特异性16S rDNA序列和/或gyrB基因序列，待测河流弧菌的为SEQ ID NO：24序列、SEQ ID NO：25序列和SEQ ID NO：26序列，待测创伤弧菌的为SEQ ID NO：27序列、SEQ ID NO：28序列和SEQ ID NO：29序列，待测苏伯利气单胞菌的为SEQID NO：30序列，待测黄杆菌属的为SEQ ID NO：31序列和SEQ ID NO：32序列，待测嗜冷黄杆菌的为SEQ ID NO：33序列、SEQ ID NO：34序列、SEQ ID NO：35序列和SEQ ID NO：36序列，待测变形杆菌属的为SEQ ID NO：37序列和SEQ ID NO：38序列。
3.如权利要求1所述的检测水产品养殖致病菌的基因芯片，其特征在于所述化学修饰为醛基修饰。
4.权利要求1所述的基因芯片在检测水产品养殖致病菌中的应用。
5.如权利要求4所述的基因芯片的应用，其特征在于所述基因芯片的检测水产品养殖致病菌过程由检测系统软件自动检测。
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