CN101627132A - 用于大肠杆菌检测的dna芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对大肠杆菌专一的核酸探针，其在检测并鉴定生物样品中的大肠杆菌有用。更具体地说，本发明涉及用于检测并鉴定大肠杆菌的DNA芯片，来自大肠杆菌的23S rRNA基因被固定于所述芯片上。与常规细菌培养方法相比，根据本发明的DNA芯片的应用能够节约时间并精确地诊断细菌感染。另外，在临床实践中其不受抗生素加入的影响，因此导致更精确地诊断。

Description

用于大肠杆菌检测的DNA芯片
技术领域
本发明涉及一种对大肠杆菌专一的核酸探针，其用于检测并鉴定生物样品中的大肠杆菌。更具体地说，本发明涉及一种用于检测并鉴定大肠杆菌的DNA芯片，来自大肠杆菌的23S rRNA基因被固定于所述芯片上。
背景技术
如果病原生物体不能被正确鉴定并控制，由于病原体在人类血液、液体和组织中存在并活动导致的传染病可发展成致命疾病。近年来，存在通过移植和通过抗肿瘤治疗的超剂量药物的抗生素物质的滥用、免疫抑制剂的过度使用。结果，病原体经历了基因中的连续或替代变化并且所述病原体的培养速度减少。病原体的适应使得难以使用传统诊断方法诊断传染病。由于一些厌氧生物显示了使人类引起严重疾病的足够致病性，生物样品中病原微生物的快速检测和精确鉴定在传染病的治疗中是相当重要的。
大肠杆菌，是这些感染性病原微生物的一种，其产生引起肠出血性大肠杆菌感染的vero毒素，迄今为止，已知超过70个大肠杆菌血清型产生毒性。肠出血性大肠杆菌感染是主要在发达国家包括美国和日本发现的食物传染性疾病，其引起可称为溶血尿毒症综合征的并发症，如果严重的话，其可导致死亡。在美国，估计每年发生超过20,000例肠出血性大肠杆菌感染，导致250例死亡(James等人，1998)。在日本，到1996年大约发生100个病例，但现在，自从1996年急剧增加到3,022例之后，每年报道2000例。在韩国，肠出血性大肠杆菌感染于2000年被传染病防治法规定为传染病(I类)，自从1998年一位患者受到该病的困扰以来，每年出现不到10个病例。直到2002，肠出血性大肠杆菌感染的全国性流行已经不再出现，但预计由于西化食物的原因其可能全国流行。
因此，用于引起传染病的大肠杆菌的检测和鉴定的各种方法已经进行了长时间的研究和开发。尽管用于微生物检测的技术已经取得了显著的进步，但仍很费力并且只能提供较低的灵敏度和专一性。
除病毒之外，所有原核生物体都含有编码原核5S、16S和23S rRNA同族分子的rRNA基因。在原核生物中，这些rRNA分子为5S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA，它们大体上与原核分子类似。用于检测在生物样品中的专一性目标rRNA子序列的核酸探针特别是非病毒生物体或者非病毒生物体组中先前已经描述。在常规诊断方法中许多问题可通过使用所述核酸探针与公知的聚合酶链式反应(PCR)技术结合来解决。待扩增目标基因的选择在诊断核酸探针技术中非常重要，并且rRNA基因，尤其是23S rRNA基因常常被作为目标序列。已经报道来自rRNA基因的核酸探针序列有利地允许在适当的严格条件下以很低的可能性与来自不同于目标物种的微生物的核酸发生交叉反应(P.Wattiau等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，56：816-819，2001；D.A.Stahlm等人，J.Bacteriol.，172：116-124，1990；Boddinghaus等人，J.Clin.，Microbiol.，28：1751-1759，1990；T.Rogall等人，J.Gen.Microbiol.，136：1915-1920，1990；T.Rogall等人，Int.J.System.Bacteriol.，40：323-330，1990；K.Rantakokko-Jalava等人，J.Clin.，Mirobiol.，38(1)：32-39，2000；Park等人，J.Clin.，Mirobiol.，38(11)：4080-4085，2000；A.Schmalenberger等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，67(8)：3557-3563，2001；WO 98/55646；US 6,025,132；以及US6,277,577).
本发明的发明人已经提交了涉及使用对所述感染性微生物专一的核酸序列作为探针以便检测并鉴定非病毒感染性有机物的DNA芯片的专利(WO 03/095677A1)，并且进行了研究来提高DNA芯片的灵敏度。
因此，本发明的发明人付出了极大的努力来快速精确地检测来自依其叙述感染了大肠杆菌的患者的样品中的大肠杆菌。结果，本发明的发明人从大肠杆菌基因组的23S rRNA基因中分离了对大肠杆菌专一的独特序列，使用该序列作为探针构建了用于大肠杆菌检测的DNA芯片，并确定可使用该DNA芯片以快速精确的方式检测大肠杆菌，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供用于检测并鉴定大肠杆菌的DNA芯片，包括对大肠杆菌专一的从大肠杆菌基因组的23S rRNA基因中分离的序列的寡核苷酸被固定于其上。
本发明的另一目的在于提供包括寡核苷酸的用于检测并鉴定大肠杆菌的探针。
为了实现上述目的，本发明提供了包括一个或多个寡核苷酸的用于检测并鉴定大肠杆菌的探针，所述寡核苷酸选自由具有序列号1-7的寡核苷酸序列组成的组。
本发明还提供了检测并鉴定大肠杆菌的DNA芯片，其中所述探针被固定于基质上。
在本发明中，DNA芯片优选具有固定于其上的序列号1-7寡核苷酸序列的所有寡核苷酸。
通过下列实施方式和所附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加完全明显。
附图说明
图1A显示了设计用于包括大肠杆菌的样品的盲试验的DNA芯片的示意性图示，图1B显示了在包括E.coli.的样品的盲试验中由ArrayWorks微阵列扫描仪检测的DNA芯片上的杂交结果。
图2A显示了设计用于包括大肠杆菌的样品的盲试验的DNA芯片的示意性图示，图2B显示了在包括大肠杆菌的样品的盲试验中由ArrayWorks微阵列扫描仪检测的DNA芯片上的杂交结果。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及用于检测并鉴定大肠杆菌的探针，其由包括对大肠杆菌专一的序列的寡核苷酸组成，而所述序列为来自大肠杆菌基因组的23S rRNA基因。
在本发明中，将大肠杆菌的23S rRNA核苷酸序列与其序列已经通过进行多序列比对鉴定的其他探针的那些序列进行比较，以确定对大肠杆菌专一的序列，并使用对大肠杆菌专一的序列选择候选探针，从而合成对大肠杆菌专一的探针。
在另一方面，本发明涉及用于检测并鉴定大肠杆菌的DNA芯片，包括来自大肠杆菌基因组的23S rRNA基因的对E.coli专一的序列的寡核苷酸被固定在所述芯片上。
在本发明中，用于检测大肠杆菌的DNA芯片通过将用于检测并鉴定大肠杆菌的所述合成探针固定在乙醛-胺相互作用的载玻片上而构建的。
另外，为了验证用于检测大肠杆菌的所述探针和DNA芯片的专一性，分离标准菌株的基因组以用作用于PCR的模板，然后将得到PCR产物在DNA芯片上杂交，从而确定DNA芯片在大肠杆菌检测中是有效的。此外，与常规培养方法的大肠杆菌检测率受到抗生素加入的影响的事实相反的是，通过实验结果可以确定本发明的DNA芯片在加入抗生素的情况下也显示了高检测效率。
下列定义用于解释在下面阐明的在本发明的不同实施方式中使用的术语和解释。
“分离”的核酸分子是从在天然核酸源中存在的其他核酸分子中分离的一种核酸分子。例如，关于基因组DNA，术语“分离”包括从基因组DNA与其天然相关的染色体分离的核酸分子。
术语“探针”或者“核酸探针”指的是具有与待测目标碱基序列充分互补以便杂交的碱基序列的单链序列专一性寡核苷酸。
“合成”指的是与细菌或者真菌rRNA互补的探针可处于纯的状态或者与其他探针结合。另外，探针可与盐或者缓冲液结合，并可以在干燥状态作为沉淀物处于酒精溶液中，或者处于水溶液中。
术语“目标”指的是来自生物样品的具有与本发明的核酸探针互补的碱基序列的核酸分子。目标核酸可以是单链或者双链DNA(如果合适的话，通过后面的扩增得到)或者RNA，并包含具有至少部分与至少一种寡核苷酸探针互补的序列。
短语“生物样品”指的是可从其中寻找感兴趣的目标核酸的样本诸如临床样品(脓液，唾液，血液，尿液等)、环境样品、细菌菌落、污染或纯净培养物、纯化核酸等。
“寡核苷酸”指的是核苷酸聚合物，一般包括大约10个到大约100个核苷酸长度，但其可大于100个核苷酸长度或者小于10个核苷酸长度。
“核苷酸”指的是包括磷酸基团、5-碳糖和含氮碱基的核酸亚单位。在RNA中，5-碳糖为核糖。在DNA中，其为2-脱氧核糖。对于5-核苷酸而言，糖包含碳-5上的羟基(-OH)。该术语还包括所述亚单位的类似物。
术语“同源性”是相同的同义词，指的是多聚核苷酸，例如被称为90％同源性的多核苷酸当序列对比时显示在相同位置90％相同的碱基对。
“杂交”涉及互补序列与目标核酸(待测序列)的退火。两种含有互补序列的核酸发现彼此并通过碱基配对相互作用退火的能力是公认的现象。
术语“引物”指的是能够作为用于与待复制核酸链互补的引物、延伸产物合成的起始点的单链DNA寡核苷酸序列。引物的长度和序列必须被设计成使它们允许引发延伸产物的合成。优选地，引物长大约5-50核苷酸。特定长度和序列可取决于所需DNA或RNA目标的复杂性，以及引物使用条件诸如温度和离子强度。
在这里使用的术语“标记”指的是任何可被用于提供可与核酸连接的可检测(优选可定量)信号的原子或分子。标记提供可通过荧光、放射、比色、比重、X-射线衍射或者吸收、磁以及类似物检测的信号。
“杂交”指的是在两个单链核酸序列之间通过沃森-克里克碱基配对或者非标准碱基配对形成的复合物。
短语“探针专一性”指的是探针的特征，描述了其区分目标和非目标序列的能力。从这个角度来说，术语“专一性”指的是核苷酸序列可与限定的目标序列杂交，并且基本上不与非目标序列杂交，或者与非目标序列的杂交可被忽略。探针专一性取决于序列和测定条件。
术语“标准菌株”包括在该领域可从市场上购买或者很容易得到的那些序列。
探针的鉴定
每个探针需要对感兴趣的微生物专一。根据本发明的专一性探针设计如下。首先，仅仅存在于感兴趣的微生物中的专一性核苷酸序列通过将来自所有可能微生物种类的核苷酸序列多序列比对来鉴定。多序列比对使用来自细菌的23S rRNA基因和来自真菌的18S rRNA基因进行。许多来自23S rRNA基因和18S rRNA的片段被选择作为候选探针。第二，候选探针的专一性通过使用本领域公知的BLAST分析与含有核苷酸序列的公共数据库比较来确定以将菌株应用于杂交，从而选择与感兴趣的微生物反应的探针作为用于鉴定的探针。第三，候选探针的灵敏性通过将其用于各种生物样品的临床试验来测定。
本发明的探针包括至少15-mer寡核苷酸并优选与待测目标探针精确互补的70％、80％、90％或者超过95％的同源性。那些探针长大约50个核苷酸的长度。当然，包括超过50核苷酸的探针也可被使用。在本发明中使用的探针可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和修饰的核苷酸诸如次黄嘌呤核苷或者基本上不改变杂交特性的含有修饰基团的核苷酸。
探针的使用
本发明的探针可被用于诊断目的，按照所有已知杂交技术，尤其是按照称为“DOT-BLOT”的过滤器上进行的点沉积技术(Maniatis等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，1982)，被称为“SOUTHERNBLOT”的DNA转移技术(Southern，E.M.，J.Mol.Biol.98：503，1975)或者被称为“NORTHERN BLOT”的RNA转移技术，研究生物样品中目标核酸存在或不存在。
本发明的探针还可在增强以核酸探针为基础的测定的专一性的夹心杂交系统中使用。以核酸探针为基础的测定中夹心杂交的原理和用途已经被描述(例如：Dunn和Hassel，Cell，12：23-36；1977；Ranki等人，Gene，21：77-85；1983)。夹心杂交技术使用捕获探针和/或检测探针，所述探针能够与目标核酸的两个不同区域杂交，并且至少一个所述探针(一般为检测探针)能够与对被研究的物种或者物种组专一的目标杂交。应当理解，捕获探针和检测探针必须具有至少部分不同的核苷酸序列。虽然直接杂交测定具有良好的动力学，但夹心杂交在更高的信噪比方面是有利的。此外，夹心杂交可增加以核酸探针为基础的测定的专一性。构成夹心杂交过程的关键阶段的培育和随后的清洗阶段每个阶段都在大约20℃与65℃之间的恒定温度下进行。已知核酸杂交具有取决于杂交碱基对数目(温度随着杂交的长度而增加)并且还取决于杂交碱基对的性质以及取决于用于每个杂交碱基的相邻碱基的性质的解链温度。在夹心杂交技术中使用的温度应当显然地通过常规试验被选择为低于在给定探针与互补序列目标之间形成的杂交的半解链温度。
本发明的探针还可在竞争性杂交方案中被使用。在竞争性杂交中，目标分子与在专一性探针和其互补分子之间的杂交形成物间进行竞争。目标分子存在的越多，在探针及其互补分子之间形成的杂交量越低。表示专一性目标存在的阳性信号通过与没有加入目标的系统相比杂交反应的降低来观察。在特定实施方式中，适当标记的专一性寡核苷酸探针与目标分子杂交。接着，将混合物转移到与专一性探针互补的寡核苷酸被固定在其中的容器中(例如微滴定板孔中)并继续杂交。在洗涤之后，根据使用的标记物测定、优选定量测定、互补寡核苷酸与探针之间的杂交。
另外，本发明的探针可在反向杂交中使用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：6230-6234，1989)。在这种情况下，目标序列首先通过PCR与5’生物素化引物进行酶扩增。在第二步骤中，当与固定在固相载体上的专一性寡核苷酸杂交时扩增产物被检测。反向杂交还可在没有扩增步骤时进行。在该特定情况下，在样品中存在的核酸必须在杂交之前被专一性或者非专一性标记或者修饰，例如采用化学方法或者通过加入特定染料标记或修饰。
本发明的核酸探针可包含在可用于快速确定感兴趣的病原体存在或不存在的试剂盒中。试剂盒包括对于测定这些病原体所需的所有成分。在通用概念中，试剂盒包括标记探针的稳定制剂，用于目标和探针多聚核苷酸杂交的干燥或者液体形式的杂交溶液，以及用于洗涤和除去不需要和非双螺旋的多聚核苷酸的溶液，用于检测标记双螺旋的底物，并任选地包括用于标记物检测的仪器。
本发明的更特异的的实施方式包括利用夹心测定的构思的试剂盒。该试剂盒可包括用于收集来自患者的样品的第一成分，诸如刮擦装置或者纸尖、用作容器的小瓶以及用于分散并溶解样品的缓冲液。第二成分可包括用于目标和探针多核苷酸杂交以及通过除去不需要和非双螺旋形式的干燥或液体形式的介质。第三成分包括与一部分目标多聚核苷酸互补的未标记核酸探针固定于其上或者与其结合的固相载体。在多个目标分析的情况下，每个对其自身的核糖体RNA专一的两个以上的捕获探针可被应用于试纸条(dipstick)的不同分散区域。第四种成分可含有与相同rRNA链的第二和不同区域互补的标记探针，第三种成分的固定的未标记核酸探针与其杂交。这里描述的探针成分包括干燥形式诸如冻干的核酸或者沉淀形式诸如酒精沉淀的核酸或者处于缓冲溶液中的探针的组合。标记物可以是上面描述的标记物的任何一种。例如，探针可使用常规方法生物素化，并且生物素化探针的存在可通过加入与酶结合的抗生物素蛋白诸如辣根过氧化物酶以接触底物来检测，当与过氧化物反应时，所述底物可视觉监测或者通过使用比色计或者分光光度计的仪器来监测。与放射性标记方法相比，这种标记方法和其他酶类型的标记物相比具有成本低、灵敏度高并且相对安全的优点。用于标记探针检测的各种试剂和用于试剂盒的其他混杂材料诸如说明、阳性和阴性对照以及用于进行混合的容器等可使所述测定试剂盒完善。
DNA芯片
本发明的探针还在DNA芯片中使用。在优选实施方式中，本发明提供了DNA芯片，其中核酸探针被固定在固相载体上。通过将各种碱基序列的DNA片段高密度布置在狭窄基板上形成的DNA芯片通过固化的DNA和与其互补的未知DNA样品之间杂交在发现未知样品的DNA上的信息中被使用。探针寡核苷酸固定于其上的固相载体的例子包括无机材料，诸如玻璃和硅以及聚合材料诸如丙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯。固相载体的表面可以是平坦的或者具有多个孔。探针通过3’端或5’端的共价键被固定在基板上。固定可通过常规技术来实现，例如，使用静电力，包被载玻片的乙醛和与合成低聚物相连接的氨基之间的结合或者点样在氨基包被的载玻片、L-赖氨酸包被的载玻片或者硝酸纤维素包被的载玻片上。本发明的一种实施方式包括当合成探针时将碱基与探针3’位置上的氨基残基结合，接着将其共价结合到乙醛包被的载玻片上。
各种探针在固体基板上的固定和布置通过针微阵列、喷墨、光刻、电阵列等进行。在本发明的实施方式中，探针分别被溶解在缓冲液中并且得到的溶液使用通过已知方法(Yoon等人，J.Microbiol.Biotechnol.，10(1)：21-26，2000)制备的微阵列仪点样到基板上。微阵列仪的基本原理是精密构造的针从平板上选取探针DNA并将其输送到由计算机指定的位置。对于由微阵列仪输送的探针的固定来说，固定反应被允许在45％到65％、优选50％到55％的湿度下至少进行一个小时，并且其保持至少6小时以利于探针3’位置的氨基与包被在载玻片上的醛基之间的反应。
为了检测来自活的有机体的细胞或者活的有机体本身，如果需要的话，这些细胞的RNA和/或DNA可通过使用化学和/或物理方法部分或全部溶解细胞而得到，并与可被检测的本发明的一种或多种探针接触。这种接触可在处于液体介质或者溶液中的合适载体诸如硝酸纤维素、纤维素或者尼龙滤膜上进行。
这种接触可在最佳、非最佳条件下或者在限制条件下进行。所述条件包括温度、反应物浓度、降低核酸配对的最佳温度的物质的存在(例如甲酰胺，二甲亚砜和尿素)以及明显减少反应体积和/或加速杂交形成的物质的存在(例如硫酸葡聚糖，聚乙二醇或苯酚)。
探针制备
为了得到大量核酸探针，人们可使用常规克隆方法克隆所需序列诸如Maniatis，T.等人在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，New York，1982中描述的方法，或者人们可通过使用从市场购买的DNA合成仪化学合成探针。
本发明的探针可通过常规方法制备。两种方法典型地被引入。第一种方法是制备单链探针。制备单链探针的代表性的例子包括通过自动DNA合成仪的二甲氧基三苯甲基(DMT)断裂法，所述方法包括除去DMT基团以释放5’羟基用于偶联反应，偶联并加帽。由此得到的探针使用荧光染料(荧光异氰酸酯，FITC)标记以确定感兴趣的核酸存在与否。作为替代，与单链DNA模板互补的DNA探针通过将引物/模板DNA退火并使用Klenow片段和标记有荧光染料的dNTP由引物/模板复合物进行延伸反应来制备。由此制备的探针由于其荧光染料而显示了高灵敏度和专一性。
第二种方法是双链探针的制备。通过使用专一性限制酶消化基因组DNA或者质粒DNA能够制备具有所需基因区域或碱基片段的探针。随机引发方法是通过将各种随机六聚体与模板DNA杂交进行具有各种长度的荧光标记探针的合成。作为替代，荧光标记探针可通由T4多核苷酸激酶将32P转移到DNA的5′端来合成。另外，探针的合成可使用DNase I通过分解双链DNA分子并使用DNA聚合酶I和荧光标记的dNTP进行DNA复制来实现。由此得到的双链探针被变性以形成随后在杂交反应中使用的单链。
本发明的探针有利地被标记。任何常规标记都可使用。探针可通过放射性示踪物诸如32P，35S，125I，3H和14C来标记。放射性标记可按照任何常规方法来进行，诸如使用放射性标记核苷酸、多核苷酸激酶(具有或不具有通过磷酸化酶的去磷酸化)、末端转移酶或者连接酶在3′或5′位置进行标记。用于放射性标记的另一种方法是本发明的探针的化学碘化，其导致几个125I原子在探针上的结合。
如果本发明的探针中一种具有放射性以用于与非放射性RNA或DNA杂交，则检测杂交的方法将取决于使用的放射性示踪物。一般说来，放射自显影法、液晶闪烁、伽马计数或者使人们能够检测由放射性示踪物发出的电离射线的任何其他常规方法都可被使用。非放射性标记也可被使用，只要通过将本发明的探针与具有下列性质的残基偶联，具有的性质为：免疫学性质(例如抗原或半抗原)、对于一些试剂的亲和力(例如配体)，提供可检测酶反应的性质(例如酶，辅酶或者参加酶反应的底物)，或者物理性质诸如荧光、任何波长的光的发射和吸收。专一性检测由探针和目标形成的杂交的抗体也可被使用。
当化学合成的本发明的探针和腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷以及它们的的尿嘧啶残基易与其他能够检测探针或者在探针与互补DNA或RNA片段之间形成的杂交的化学残基结合时，非放射性标记可被提供。
目标
为了使用结构探针提供可在临床样品中微生物的检测和鉴定中使用的底物，从样品中提取核酸。可使用各种标准技术或者市售试剂盒从样品中提取核酸。例如，允许RNA或者DNA从组织样品中分离的试剂盒可购自Qiagen，Inc.(Chatsworth，CA)和Stratagene(La Jolla，CA)。例如，QIAamp Blood试剂盒允许DNA从血液(新鲜、冰冻或者干燥)以及骨膜、体液或者细胞悬液中分离。QIAamp组织试剂盒允许DNA从组织诸如肌肉、器官和肿瘤中分离。
在确定生物样品是否含有可指示所需病原体存在的rRNA或rDNA的优选方法中，核酸可通过声波断裂从细胞中释放，例如按照由Murphy等人在美国专利号5,374,522中公开的方法。用于裂解细胞的其他已知方法包括酶、  渗透振荡、化学处理和使用玻璃珠涡流。适于从微生物中释放可进行本文中公开的杂交的核酸的其他方法已经由Clark等人在美国专利5,837,452中和Kacian等人在美国专利5,364,763中描述。
在rRNA释放之后或者同时，标记探针可在加速剂的存在下加入并在最佳杂交温度下培养达到明显杂交反应所需的一段时间。在双链核酸目标的情况下，建议在进行检测步骤之间先变性。双链核酸的变性可通过已知的化学方法、物理方法或者酶变性来进行，特别是在高于80℃的合适温度下加热进行。
另外，与探针杂交的目标DNA常常通过两种方法来制备。第一种方法是在使用Southern印迹或者Northern印迹中使用的方法。使用合适的限制酶消化基因组DNA或者质粒DNA并通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA片段并使用。第二种方法是通过PCR扩增所需DNA。PCR的例子包括使用相同量的正向和反向引物的最典型的PCR，其中双链和单链带可通过不对称地加入引物得到的非对称PCR，其中可通过一次同时加入各种引物扩增多个目标DNA的多重PCR，其中目标DNA使用特定的4种引物和连接酶扩增并且通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测定荧光量的连接酶链反应(LCR)，以及其他PCR，诸如热启动PCR、套式PCR，DOP-PCR(变性寡核苷酸引物PCR)，RT-PCR(逆转录PCR)、半定量RT-PCR、实时PCR、RACE(cDNA末端的快速扩增)、竞争性PCR、STR(短串联重复序列)、SSCP(单链构造多态性)、DDRT-PCR(差异显示反转录酶)等等。
已经发现来自相对同质的样本(诸如血液、细菌菌落、病毒斑或者脑脊液)的粗提物比来自更多复合的样本(诸如尿液、唾液或者粪便)更好地适于用作独特PCR产物扩增的模板(Mullis等人，Shibata in PCR：The Polymerase Chain Reaction，eds.，Birkhauser，Boston，pp.47-54，1994)。含有相对较少待扩增材料(即目标核酸)拷贝的样品诸如脑脊液，可直接被加入到PCR中。血样在PCR中由于红细胞的抑制性质而造成特定问题。在PCR中使用血液之前，红细胞必须被除去；有两种经典并可从市场上得到的方法用于此目的(例如QIAamp Blood试剂盒，经过Chelex 100柱[BioRad]等)。提取唾液中的核酸，选择用于直接检测的结核分枝杆菌样本，要求事先净化以杀死或者抑制其他细菌种类的生长。这种净化典型地通过使用N-乙酰L半胱氨酸和NaOH处理样品(Shinnick和Jones，supra)来实现。该净化过程仅仅在唾液样本在分析之前进行培养时才是需要的。
本发明的优选实施方式包括使用分离样品的DNA作为模板通过不对称PCR制备基因片段。基因片段通过加入1∶5比例的正向和反向引物立即进行PCR得到。
使用的引物与普遍存在于细菌中的16S rRNA或23S rRNA对应(Pirkko K.等人，Clin.Microbiol.，36(8)，2205-2209，1999)，这些引物如下：
引物1-S(有义)：P-TTGTACACACCGCCCGTC(序列号：8，1585Fw)，
引物1-A(反义)：Cy3-TTTCGCCTTTCCCTCACGGTACT(序列号：9，23Br)，
引物2-S(有义)：P-AGTACCGTGAGGGAAAGGGGAA(序列号：10，23BFw)，
引物2-A(反义)：Cy3-TGCTTCTAAGCCAACATCCT(序列号：11，MS37R)，
引物3-S(有义)：P-AGGATGTTGGCTTAGAAGCA(序列号：12，MS37F)，
引物3-A(反义)：Cy3-CCCGACAAGGAATTTCGCTACCTT(序列号：13，MS38R)。
在上述引物中，位置如图1中所示，并且与5’端结合的字母“F”表示荧光异氰酸酯(FITC)。目标DNA使用5-FITC结合的引物扩增，然后扩增的目标DNA与核酸探针之间的杂交通过荧光来确定以确信感染试剂的同一性。为了得到其中不能由上述引物扩增的区域，通过多序列比对和BLAST设计另外的引物。
在PCR的优选实施方式中，将5μL的10X PCR缓冲液(100mMTris-HCl，pH 8.3，500mM KCl，15mM MgCl2)，4μL的dNTP混合物(dATP，dGTP，dCTP，dTTP，每种2.5mM)，0.5μL的10pmol正向引物，2.5μL的10pmol反向引物，1μL的1/10稀释的模板DNA(100ng)和0.5μL的Taq聚合酶(5单位/μL，Takara Shuzo Co.，Shiga，Japan)混合，并将水加入到得到的混合物中至混合物总体积为50μL。不对称PCR进行10个循环，每个循环包括在94℃下第一次变性7分钟、94℃下第二次变性1分钟、52℃下退火1分钟并72℃延伸1分钟，和30个循环，每个循环包括在94℃下第三次变性1分钟、52℃下退火1分钟并72℃延伸1分钟、接着72℃延伸5分钟的一个最终延伸。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳确认。
杂交和洗涤
特别的杂交技术对于本发明来说不是必须的。杂交技术一般在现有技术中有描述(Gall和Pardue，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A，63：378-383，1969；以及John等人，Nature，223：582-587，1969)。
杂交条件由“严格性”来确定，也就是说操作条件的严格。当以更严格的条件进行时杂交变得更专一。严格性是一种功能，尤其是探针/目标双螺旋的碱基组成以及两种核酸之间的错配程度的功能。严格同样具有杂交反应参数的功能，诸如在杂交液中存在的离子样本的浓度和类型，变性剂的性质和浓度和/或杂交温度。进行杂交反应必须的严格条件尤其取决于所使用的探针。所述这些数据都是已知的并且合适条件在每种情况下能够通过常规实验确定。一般说来，取决于使用的探针长度，用于杂交反应的温度在大约20℃与65℃之间，尤其是在35℃与65℃之间，在浓度大约为0.8M到1M的盐溶液中进行。
标记寡核苷酸探针与核酸目标之间的核酸杂交可通过使用Hogan等人在美国专利号5,030,557中公开的“未标记辅助探针”来增强。辅助探针是与由测定探针标定的目标核酸不同的目标核酸结合的寡核苷酸，其将单链核酸的新的二级及三级结构的影响施加于单链核酸的目标区域上，从而使测定探针的结合速度增加。
本领域技术人员可以理解，影响热稳定性的因素也可影响探针专一性，因此其必须受到控制。因此，解链方案，包括寡核苷酸/目标杂交体的解链温度(Tm)应当被确定。优选方法在美国专利号5,283,174中描述。为了使用杂交保护测定测定Tm，使用下列技术。探针：目标杂交体在含有十二烷基硫酸锂的琥珀酸锂缓冲液中在过量目标中形成。等分的这些“进行的”杂交在杂交缓冲液中稀释并在从低于预期Tm(通常为55℃)开始并以2-5℃的增量增加的各种温度下孵育5分钟。
该溶液然后使用适量碱性硼酸盐缓冲液稀释并在更低的温度(例如50℃)下孵育10分钟。在这些条件下，在那些与杂交探针连接的吖啶相对“被保护”的同时，与单链探针连接的吖啶被水解。这被称作为杂交保护测定(“HPA”)。剩余的化学发光量与杂交成正比，并通过加入过氧化氢然后加入碱在照度计中测定。将该数据作为最大信号(通常来自最低温度)的百分比对温度作图。Tm被定义为最大信号保持50％的点处的温度。
除上述方法外，寡核苷酸/目标杂交体解链温度还可通过本领域技术人员公知的同位素法来测定。应当注意，对于给定杂交的Tm可基于使用的溶液而变化，因为其热稳定性取决于不同盐、去污剂和在热变性过程中影响相对杂交稳定性的其他溶液的浓度。(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab Publ.编著，9.51(第二版)，1989)。
杂交条件可依赖于多种参数来监测，例如杂交温度，介质的成分的性质和浓度。以及形成的杂交被洗涤的温度。杂交和洗涤温度被限制为根据探针(其核酸组成、种类和长度)的上限值，本文中描述的最大杂交或洗涤温度大约为30℃到60℃。在更高的温度下，双螺旋与在探针和目标之间形成的杂交体的解离(或者变性)竞争。优选的杂交介质包括大约3X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)，大约25mM pH 7.1的磷酸缓冲液，和20％去离子甲酰胺，0.02％聚蔗糖，0.02％牛血清蛋白，0.02％聚乙烯吡咯烷酮和大约0.1mg/mL剪切的变性鲑鱼精子DNA。优选的洗涤介质包括大约3X SSC、25mM pH 7.1的磷酸缓冲液和20％去离子甲酰胺。但是，当将修饰引入探针和介质中时，探针可被使用以得到所需专一性的温度应当根据已知关系进行变化。从这个角度讲，还应当注意的是，一般说来，DNA:DNA杂交体比RNA:DNA杂交体或RNA:RNA杂交体的稳定性低。基于待检测杂交的性质，杂交条件应当相应地被修改以实现专一性检测。
在本发明的优选实施例中，将杂交缓冲液(6XSSPE(0.15M NaCl，5mM C6H5Na3O7，pH 7.0)，20％(v/v)甲酰胺)与PCR扩增目标基因混合，将得到的混合物施加到探针被固定于其上的载玻片上，然后将反应保持在30℃下6小时，使所述探针可与所述目标互补杂交。然后顺序使用3XSPE，2XSSPE和1XSSPE洗涤载玻片，每次5分钟。
形成的杂交体可通过使用荧光或者放射性同位素按照常规方法标记目标来定量。标记可通过标记引物的使用或者在扩增的聚合酶步骤过程中结合的标记核苷酸的使用来进行。
大肠杆菌在肠中通常不致病，但是在肠以外的器官中，这种微生物会引起膀胱炎、肾盂炎、腹膜炎和脓血症。此外，包括O-26，O-55和O-111的大肠杆菌的抗原类型(血清型)偶尔在婴儿和成人中引起感染性腹泻，因此其被称为致病性大肠杆菌。
本发明的用于检测和鉴定大肠杆菌的探针被应用于DNA芯片上以极好的专一性检测大肠杆菌，因此可精确地诊断由大肠杆菌引起的传染病。另外，本发明的探针可将两种或多种样本结合到DNA芯片上使用以便同时检测在特定类型的生物样品中可能存在的多种病原体。
实施例
此后，将通过下列实施例对本发明进行详细描述。但是，对本领域技术人员来说容易想到的是，这些实施例被给出以提供对本发明的更好地理解，而不解释为对本发明的范围的限制。
实施例1：用于鉴定大肠杆菌的候选DNA探针的选择
为了检测并鉴定大肠杆菌，对大肠杆菌专一的探针被构建。为了构建专一性探针，对大肠杆菌专一的候选探针被选择。将在基因文库中列举的大肠杆菌的23S rRNA序列通过多序列比对与已知微生物的那些序列进行比较以确定仅仅在大肠杆菌中存在的专一性序列，从而构建候选探针。候选探针在大肠杆菌的23S rRNA基因中选择。候选探针的专一性通过使用BLAST分析比较微生物之间的序列相似性来确定。结果，由此筛选的候选探针在下表1中显示。
表1：对大肠杆菌专一的候选探针
  探针号   序列   命名   序列号
  1   GTTAGCGGTAACGCG   Eco001   1
  2   GTTAGTGGAAGCGTC   Eco001m   2
  3   GTGTTAGTGGAAGCGTCTGG   Eco001-20   3
  4   ATGGGGTTAGCGGTAACGCGAAGCT   Eco001-25   4
  5   ATGCACATATTGTGA   Eco002   5
  6   GTGCTGAAGCAACAAATGCC   Eco003-20   6
  7   CGGTGCTGAAGCGACAAATGCCCTG   Eco003-25   7
实施例2：核酸探针的合成
为了构造DNA芯片，化学合成上面的实施例1中筛选出的候选探针。将单核苷酸(Proligo Biochemie GmbH Hamburg Co.)引入到Expedite8900核酸合成系统(PE Biosystems Co.)中并输入所需核酸序列和以比例提供的0.05μmole纯核酸探针。得到的探针通过电泳来确认。
实施例3：DNA芯片的构建
为了将DNA探针固定在固相载体上，使用氨基-醛基共价键。合成的寡核苷酸探针的3′端使用氨基连接柱(Cruachem，Glasgow，Scotland)以氨基残基修饰以便固定在载玻片上。对于载玻片来说，使用醛基包被的载玻片(CEL Associates，Huston，TX)。将探针溶解在3X SSC(0.45M NaCl，15mM C6H5Na3O7，pH 7.0)点样液中。使用微阵列仪(MicroGrid Spotter，Biorobotics Inc，England)将得到的溶液点样在载玻片上。将载玻片保持在大约55％的湿度下1小时然后空气干燥6小时，使DNA探针可被固定在载玻片上。所有探针以100pmol的浓度以250-275μm的间隔点样。为了评估固定效率，将载玻片使用SYBRO绿II(Molecular Probe，Inc.，Leiden，Netherlands)染色。
实施例4：目标DNA的分离和扩增
从在下表2中阐明的59种标准菌株中提取DNA。
[表2]59种标准菌株源
  菌种   革兰氏染色   来源  菌种   革兰氏染色   来源
  淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae) - ATCC10150  鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii) - KCTC2771
  脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides) - ATCC13100  啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corodens)   - ATCC51724
  嗜肺性军团病菌(Legionellapneumophilia) - 临床分离  伊氏放线菌(Actinomyces israeli)   - ATCC12102
  单核细胞增生利   +   ATCC700603  产琥珀酸厌氧螺菌   -   ATCC29305
  斯特菌(Listeriamonocytogenes)   (Anaerobiospirilumsucciniciproducens)
  摩氏摩根菌(Morganellamorganii) - ATCC25830   嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)   -   KCCM32586
  普通拟杆菌(Bacteroidvulgatus) -   KCCM11423KCCM8482   大肠杆菌(Escherichia coli) -   ATCC25922
卵形拟杆菌(Bacteroid ovatus) - ATCC8483   产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes) -   KCCM11783ATCC29751
  多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron) - ACTC5015   阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae) -   KCCM40044
  脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragils) - ATCC25282   粪肠球菌(Enterococcusfaecalis) + ATCC19433
  洋葱伯克氏菌(Burkholderiacepacia) - ATCC25416   屎肠球菌(Enterococcusfaecium) + ATCC19434
  粘膜炎布兰汉球菌(Branhamellacatarrhalis) -   KCCM4006ATCC43617   人苍白杆菌(OcrobactrumAnthropi) - ATCC49188
创伤弧菌(Vibriovulnifucus) - KCTC2962   人心杆菌(Cardiobacteriumhominis) - ATCC14900
霍乱弧菌(Vibriocholerae) - KCTC2715   白喉棒状杆菌(Corinaebacteriumdiphteriae) + ATCC51696
  肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis) - KCCM12021   嗜酸丛毛单胞菌(Comamonasacidovorans) - ATCC9355
  鼠伤寒沙门杆菌(Salmonellatyphimurium) - KCCM40253   肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae) -   AATCC700603
  粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens) - KCTC1299   产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) - ATCC43863
  Sutterellawadsworthensis -   ATCC51579   脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium -   ATCC13253
 meningosepticum)
索氏志贺菌(Shigella sonnei) - KCCM11903  难辨梭状芽胞杆菌(Clostridiumdifficile) + ATCC9689
弗氏志贺菌(Shigella flexneri)   - ATCC11836  多枝梭状芽胞杆菌(Clostridiumramosum) + ATCC25582
  铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) - KCTC1636 金氏金菌(Kingellakingae)   - ATCC23330
  金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) + KCTC1621  大消化链球菌(Peptostreptococcusmagnus) + ATCC29328
  表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis) + KCTC1917  厌氧消化链球菌(Peptostreptococcusanaerobius) + ATCC27337
  粘滑口腔球菌(Stomatococcusmucilaginosus) + ATCC17931  普氏消化链球菌(Peptostreptococcusprevotii) + KCTC3319
Sterntrophomonasmaltophila - ATCC13637  牙龈卟啉单胞菌(Phorphyromonasgingivalis) + ATCC33277
  变异链球菌(Streptococcusmutans) +   KCCM11823ATCC25175  坏死梭形杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)   - ATCC25286
  绿色链球菌(Streptococcusviridans) + ATCC35037  奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)   -   KCCM11381
  无乳链球菌(Streptococcusagalactiae) + KCCM11957  普通变形杆菌(Proteus vulgaris)   -   KCCM11539
  化脓链球菌(Streptococcuspyogenes) + KCCM11817  嗜沫嗜血杆菌(Haemophilusaprophilus)   - ATCC13252
  肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae) + KCCM40410  流感嗜血杆菌(Haemophylusinfluenzae)   - ATCC51907
  枸橼酸杆菌(Citrobacterfreundii) - ATCC51579
微生物样本在合适的培养基上生长并悬浮在200μL无菌蒸馏水中。将悬浮液以14000rpm离心10分钟。弃去上清液，得到小球。
对于革兰氏阴性菌，将小球加入到180μL ATL溶液(组织裂解溶液，DNeasy Tissue Kit，QIAGEN)中。将20μL蛋白酶K加入到溶液中以裂解细胞。得到的裂解产物在55℃下培养1小时。将培养物涡流15秒并与200μL AL溶液(裂解溶液，DNeasy Tissue Kit，QIAGEN)混合。得到的混合物在70℃下培养10分钟。将培养物与200μL乙醇(100％)混合。将得到的溶液加载到安放在2mL管中的DNeasy迷你柱中并8000rpm或更高的速度下离心1分钟。弃去在管中收集的溶液。将500μL AW1溶液(洗液1，DNeasy Tissue Kit，Qiagen)吸入柱中然后8000rpm离心1分钟。弃去洗脱液并将500μL AW2溶液(洗液2，DNeasy Tissue Kit，Qiagen)再次吸入柱中，然后1500rpm离心3分钟。将DNeasy膜干燥然后弃去洗脱液。将干燥的DNeasy迷你柱设置在管中并在室温下放置15分钟，然后8000rpm离心1分钟以洗去基因组DNA。
对于革兰氏阳性菌，将小球悬浮在180μL裂解酶溶液(20mMTris-Cl，pH 8.0，2mM EDTA，1.2％ Triton X-100，20mg/mL裂解酶)中并在37℃下培养30分钟。将由此得到的培养物与25μL蛋白酶K和200μLAL溶液(裂解溶液，DNeasy Tissue Kit，QIAGEN)混合。将得到的混合物在70℃下培养30分钟。并且以上面描述的同样的方式进行分离基因组DNA的后续步骤。
使用上述从标准菌株中分离的DNA作为模板并使用如下引物进行PCR。在进行PCR时与探针结合的DNA通过使用在其5’端具有连接的Cy3的反向引物扩增来检查，所述引物使用荧光物质标记以便检测。下面的三对引物同时被用于PCR反应：
引物1-S(有义)：P-TTGTACACACCGCCCGTC(序列号：8，1585Fw)
引物1-A(反义)：Cy3-TTTCGCCTTTCCCTCACGGTACT(序列号：9，23BR)；
引物2-S(有义)：P-AGTACCGTGAGGGAAAGGCGAA(序列号：10，23BFw)
引物2-A(反义)：Cy3-TGCTTCTAAGCCAACATCCT(序列号：11，MS37R)；
引物3-S(有义)：P-AGGATGTTGGCTTAGAAGCA(序列号：12，MS37F)和引物3-A(反义)：Cy3-CCCGACAAGGAATTTCGCTACCTT(序列号：13，MS38R)
上面的序列的5’末端的“P”表示磷酸基团并且“Cy3”表示荧光物质Cy3。
PCR反应进行如下：含有5μL 10X PCR缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.3)，500mM KCl，15mM MgCl2)，1μL dNTP混合物(每种dATP，dGTP，dCTP和dTTP 10mM)，1μL 10pmol正向引物，1μL 10pmol反向引物，1μL 1/10-稀释的DNA模板(100ng)和0.2μL Taq聚合酶(5单位/μL，Solgent Co.，Korea)的PCR混合物加入蒸馏水至终体积为50μL。在下列条件下进行PCR：在94℃下第一次变性5分钟，10个循环的94℃下第二次变性50秒，56℃下退火50秒并72℃延伸70秒，和20个循环的94℃下第三次变性50秒，58℃下退火50秒并72℃延伸70秒，接着72℃延伸5分钟的一个最终延伸。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析。分析显示合成了每种菌株的双链DNA。
使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Co.)纯化扩增的DNA产物以加入1μLLamda核酸外切酶(New England Biolabs，Inc.，Netherlands)，然后允许其37℃下反应1小时，从而得到单链DNA。Lamda核酸外切酶是一种通过选择性消化降解具有连接在其5’末端的磷酸基团的DNA链的酶。因此，使用具有连接在其5’端的磷酸基团的正向引物的PCR导致DNA链具有磷酸基团，其被Lamda核酸外切酶处理以降解具有与其连接的具有磷酸基团的双链，从而得到具有与其5’末端连接的荧光物质Cy3的剩余单链。
实施例5：杂交和洗涤
为了确定候选探针的专一性和灵敏性，通过将在上述实施例4中制备的PCR产物应用到在上述实施例3中制备的DNA芯片上进行杂交，候选探针被固定在所述芯片上。如果候选探针显示对于其物种的阳性杂交信号，则其被另外检测对于与来自上面58种菌株的基因组DNA的交叉反应(专一性)。
将DNA芯片以水蒸气水合然后浸入70％乙醇中以除去没有被固定在DNA芯片的载玻片上的任何探针。在杂交反应过程中，荧光可通过连接到载玻片表面上的醛基而导致杂交信号的增强，因而相应地降低了固定在芯片上的专一性探针的杂交信号。为了防止杂交信号的任何降低，将DNA芯片转移到封闭液(1.3g NaBH4，375ml PBS，125ml 100％乙醇)中然后摇动5分钟。将DNA芯片使用0.2％ SDS洗涤5分钟然后以无菌水洗涤5次，每次1分钟。将DNA芯片在1500rpm下离心3分钟以除去载玻片上的水分。
将在实施例4中扩增的50μL DNA片段与6X SSPE杂交缓冲液(20XSSPE：3M NaCl，0.2M NaH2PO4-H2O，0.02M EDTA，pH 7.4；20％(v/v)甲酰胺，Sigma Co.，St.Louis，MO)混合至终体积为200μL。将得到的混合物溶液应用到载玻片上，所述载玻片上固定探针并用probe-clip press-seal温育室(Sigma Co.，St.Louis，MO)覆盖。
在杂交室中加入湿组织以防止杂交过程中载玻片周围脱水，然后允许在静止培养箱中30℃反应8小时以上以诱导互补结合。杂交完成后，使用3X SSPE(0.45M NaCl，15mM C6HsNa3O7，pH 7.0)然后使用1X SSPE(0.15M NaCl，5mM C6HsNa3O7，pH 7.0)洗涤载玻片，分别洗涤5分钟。载玻片表面上的剩余湿气通过离心除去(15,000rpm 3分钟)。
实施例6：杂交的检测
使用Arrayworks微阵列扫描仪(ArrayWorks，Applied Precision，Inc.，USA)进行杂交检测。杂交结果在下表3中阐明。
表3
Figure A20078005205500271
实施例7：盲试验
对于大肠杆菌的盲实验使用在实施例3中构建的DNA芯片进行。被消化用于盲试验的DNA在图1A和2A中显示，其中标记指的是上表1中列举的探针。标记“M”指的是与下列序列对应的位置标记物：氨基3′-AAAAAAAAAAAAAAA-5′-FITC。空白指的是与探针被溶解于其中的缓冲液对应的对照(3X SSC)。
六十三位感染了病原体的患者参加盲试验。样品通过培养1天后得到。从患者收集的感染样品通过培养方法确认。
将基因组DNA从培养样品中分离如下。对于体液样品来说，在EDTA管或者光滑管中收集10mL体液。当样品量超过10mL时，将其在5000rpm下离心15分钟。当样品量少于10mL时，将其在14000rpm下离心15分钟并且由此形成的沉淀被收集在1.5mL管中。将体液样品悬浮在180μL裂解酶溶液(20mM Tris-Cl，pH 8.0，2mM EDTA，1.2％TritonX-100，20mg/mL裂解酶)中。将得到的悬浮液在37℃下培养30分钟。
将培养物与20μL蛋白酶K和200μL AL溶液(裂解液，QIAamp DNABlood Mini Kit，QIAGEN)温和地混合。将混合物在55℃下培养2小时然后在95℃下培养10分钟。将培养物与200μL 100％乙醇混合。
将得到的溶液加载到安放在2ml管中的QIAamp旋转柱上并8000rpm离心1分钟。弃去在管中收集的溶液。将500μL AW1溶液(洗液1，QIAamp DNA Blood Mini Kit，Qiagen)吸入到柱中，然后将柱8000rpm离心1分钟。弃去洗脱液并将500μL AW2溶液(Wash Solution 2，QIAampDNA Blood Mini Kit，Qiagen)再次吸入柱中，然后将柱14000rpm离心1分钟。弃去洗脱液并将QiAamp旋转柱转移到1.5mL管中。
将300μL AE溶液(洗脱液，DNA Blood Mini Kit，QIAGEN)置于管中并在室温下静置15分钟，然后8000rpm离心3分钟。将洗脱的基因组DNA与750μL 100％乙醇混合并在-20℃静置1小时。将混合物在14000rpm离心20分钟。弃去含乙醇的上清液并且将残渣干燥。由此得到的小球溶解在20μL无菌蒸馏水中并浓缩。
对于血液样品，将10mL血液置于EDTA管中并在4℃下1800rpm离心10分钟。将血浆层转移到1.5mL管中并14000rpm离心10分钟。将得到的沉淀转移到1.5mL管中，并且分离基因组DNA的后续步骤与上面描述的相同。
用于扩增、杂交、洗涤和杂交检测的步骤按照上面实施例4和5中描述的相同方式进行。结果在下表4中显示，其中分母为样品应用的数目，分子为出现杂交信号的数目。
表4
  血液   脑脊液   Pus   唾液   粪便   尿液
  大肠杆菌   9/9   3/3   3/3   19/19   1/1   28/28
图1B和图2B显示了在分别使用Scanarray 5000测定的含有大肠杆菌的盲样品中图1A和图2B上的DNA芯片上的杂交结果。
实施例8：加入抗生素对DNA芯片的灵敏性的影响
加入抗生素对在实施例3中构建的DNA芯片的灵敏性的影响使用抗生素处理的样品来检查。
对于菌株，使用大肠杆菌(ATCC 25922)，对于抗生素，使用大肠杆菌对其没有产生抗性的头孢曲松(CJ，Seoul，Korea)进行灵敏性检测。
首先，通过两次亚培养活化的每种菌株通过MIC(最小抑制浓度)测试被用于评估抗生素灵敏性。对于MIC检测，标准稀释方法(PerformanceStandards for Antimicrobial Susceptibility Testing；Fifteenth InformationalSupplement，Clinical and Laboratory Standard Institute，M100-S15，Vol.25，No.1，2005)按照CLIS(The Clinical and Laboratory Standards Institute)标准被使用。大肠杆菌的MIC为0.120μg/mL。
将在BHI(Becton Dckinson，USA)中稀释的大肠杆菌以20-200CFU/mL接种在含有100mL BHI培养基的两个烧瓶中。将抗生素使用无内毒素的灭菌盐水(Choowae Pharma，Corp.，Korea)稀释并以与每种菌株浓度对应的0.5MIC，1MIC和2MIC加入到上面制备的培养基中。例如，2MIC大肠杆菌与0.240μg/mL抗生素加入对应，1MIC和0.5MIC分别等同于2倍稀释的2MIC和1MIC。
在抗生素处理以后，将每个含有大肠杆菌的烧瓶摇动并在37℃下温育，在培养过程中每种样品在0小时、2小时、4小时、6小时、12小时和24小时共被收集6次。样品收集通过从每个烧瓶中吸取15mL样品并将其置于15mLfalcon管中来进行。并且5mL每种吸取的样品被置于BACTEC/Alert培养基(Biomeriuex Inc.，USA)上并在Automated BloodCulture System(Biomerieux Inc.，USA)中保持35℃恒温下静止培养。将通过培养得到的菌落进行另外的生物化学检测以用于细菌鉴定。将剩余10mL样品中的5mL样品转移到45mLBHI培养基中，37℃下在250rpm摇动培养箱中培养。6小时以后，收集所有细菌并提取它们的基因组DNA。最后5mL样品直接用于提取基因组DNA。基因组DNA提取按照如下方式进行；将在各个时间点提取的培养液置于50mL管中12000rpm 4℃离心10分钟并在离心后弃去上清液以得到小球，从而使用Wizard GenomicDNA Purification Kit(Promega，Co)得到DNA。同时，为了评估每个时间点样品收集中的细菌数，收集100μL样品并且如果需要的话根据平板计数方法将其中的50μL直接涂布在一个平板上，剩余部分在10倍稀释或者100倍稀释后涂布在另一平板上，接着在培养箱中37℃下培养。
收集样品后，将直接从样品中提取的DNA和在培养6小时之后收集的DNA通过在实施例4中描述的PCR方法进行扩增，将得到的PCR产物应用到DNA芯片上。并且结果与通过使用Automated Blood CultureSystem和生物化学检查得到的细菌鉴定结果进行比较分析。
表5显示了三次进行的实验结果。在该表中，‘Y’表示被鉴定，‘N’表示未被鉴定并且‘NT’表示没有被检测。并且‘EC’表示大肠杆菌，例如，‘EC-0.5-02’表示将含有大肠杆菌的培养基使用0.5MIC抗生素处理然后培养2小时后收获。在表的上部书写的‘芯片’显示将样品应用到DNA芯片之后的结果，并且‘Cx芯片’柱显示在样品收集后将培养6小时的样品应用到DNA芯片上的结果。并且，‘CX’显示在使用Automated Blood Culture System培养之后使用生物化学检测的细菌鉴定结果。
表5：基于抗生素浓度和处理持续时间的测定方法的效力
Figure A20078005205500311
上述实验确定，与常规培养检测结果相比，包括在本发明中选择的探针的DNA芯片对抗生素处理的敏感性较低，并且可产生更精确地细菌鉴定结果。
虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，但对本领域技术人员来说显而易见的是，本说明书仅仅用于优选实施方式，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附权利要求书及其等同物来限定。本领域技术人员还会理解，对这些实施方式的改变和修改都不偏离本发明的精神和范围。
工业实用性
如上面详细描述的那样，本发明具有提供用于检测并鉴定大肠杆菌的DNA芯片的效果，来自大肠杆菌的23S rRNA基因的寡核苷酸被固定于所述芯片上，并且本发明提供了包括所述寡核苷酸的用于检测并鉴定大肠杆菌的核酸探针。
与常规细菌培养方法相比，根据本发明的DNA芯片的应用可以节约时间并精确地诊断细菌感染。另外，在临床实践中其不受抗生素加入的影响，因此导致更精确地诊断。
序列表
<110>株式会社美迪基尼斯
<120>用于大肠杆菌检测的DNA芯片
<130>PP-B0374
<160>13
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>1
gttagcggta acgcg              15
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>2
gttagtggaa gcgtc              15
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>3
gtgttagtgg aagcgtctgg         20
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>4
atggggttag cggtaacgcg aagct    25
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>5
atgcacatat tgtga               15
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>6
gtgctgaagc aacaaatgcc              20
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>7
cggtgctgaa gcgacaaatg ccctg        25
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>8
ttgtacacac cgcccgtc                18
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>9
tttcgccttt ccctcacggt act          23
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>10
agtaccgtga gggaaaggcg aa           22
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>11
tgcttctaag ccaacatcct              20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>12
aggatgttgg cttagaagca           20
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>13
cccgacaagg aatttcgcta cctt     24

Claims (3)

1.用于检测并鉴定大肠杆菌的探针，其特征在于，包括一个或多个选自由具有核苷酸序列序列号1-7的寡核苷酸组成的组中的的寡核苷酸。
2.用于检测并鉴定大肠杆菌的DNA芯片，其特征在于，权利要求1的探针被固定于基板上。
3.根据权利要求2所述的用于检测并鉴定大肠杆菌的DNA芯片，其特征在于，具有核苷酸序列序列号1-7的所有寡核苷酸都被固定在基板上。
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