PL240694B1 - Sposób i zestaw do identyfikacji szczepu E.coli patogennego dla ptaków - Google Patents

Sposób i zestaw do identyfikacji szczepu E.coli patogennego dla ptaków Download PDF

Info

Publication number
PL240694B1
PL240694B1 PL431942A PL43194219A PL240694B1 PL 240694 B1 PL240694 B1 PL 240694B1 PL 431942 A PL431942 A PL 431942A PL 43194219 A PL43194219 A PL 43194219A PL 240694 B1 PL240694 B1 PL 240694B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
coli
strains
gene
pathogenic
strain
Prior art date
Application number
PL431942A
Other languages
English (en)
Other versions
PL431942A1 (pl
Inventor
Jarosław DASTYCH
Jarosław Dastych
Joanna KAZIMIERCZAK
Joanna Kazimierczak
Karolina POSPIECH
Karolina Pospiech
Patrycja SOWIŃSKA
Patrycja Sowińska
Ewelina A. WÓJCIK
Ewelina A. Wójcik
Małgorzata STAŃCZYK
Małgorzata Stańczyk
Justyna ANDRYSIAK
Justyna Andrysiak
Dominik Strapagiel
Błażej Marciniak
Paulina BORÓWKA
Paulina Borówka
Marcin Wojciech LIS
Marcin Wojciech Lis
Original Assignee
Proteon Pharmaceuticals Spolka Akcyjna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Proteon Pharmaceuticals Spolka Akcyjna filed Critical Proteon Pharmaceuticals Spolka Akcyjna
Priority to PL431942A priority Critical patent/PL240694B1/pl
Priority to BR112022010224A priority patent/BR112022010224A2/pt
Priority to US17/779,351 priority patent/US20230287518A1/en
Priority to EP20845245.8A priority patent/EP4065733B1/en
Priority to CA3163082A priority patent/CA3163082A1/en
Priority to PCT/PL2020/050089 priority patent/WO2021107795A1/en
Priority to MX2022006380A priority patent/MX2022006380A/es
Publication of PL431942A1 publication Critical patent/PL431942A1/pl
Publication of PL240694B1 publication Critical patent/PL240694B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest szybka metoda pozwalająca na jednoznaczną identyfikację pozajelitowych szczepów E. coli patogennych dla drobiu (APEC - Avian Pathogenic Escherichia coli), zwłaszcza za pomocą nowej kombinacji genów amplifikowanych w metodzie diagnostycznej PCR typu multipleks.
Patogenne E. coli wywołują kolibakteriozę, powszechną chorobę ptactwa domowego, która stanowi istotne zagadnienie w bezpieczeństwie hodowli zwierząt, jest jedną z głównych przyczyn dużej śmiertelności drobiu oraz związanych z tym znaczących strat ekonomicznych w przemyśle drobiarskim (Barnes, HJ. et al., 2008, Ewers, C. et al., 2008, Lutful Kabir, SM., 2010). Dotychczas stwierdzono, że szczepy APEC posiadają wiele podobieństw z innymi, pozajelitowymi szczepami E. coli (ang. ExPEC Extraintestinal pathogenic Escherichia coli) chorobotwórczymi dla ludzi, m.in. ze szczepami UPEC (uropathogenic E. coli), NMEC (neonatal meningitis-associated E. coli), czy SEPEC (sepsis-causing E. coli) i stanowią potencjalne ryzyko dla zdrowia człowieka (Mellata, M., 2013).
Patogenne szczepy E. coli wykazują oporność na wiele środków przeciwdrobnoustrojowych, dlatego powszechnie stosowane terapie antybiotykowe są na ogół nieefektywne. Dotychczas nie udało się również opracować skutecznej szczepionki przeciwko tym bakteriom (Huja, S. et al., 2015). Coraz więcej dowodów wskazuje również na fakt, że niektóre APEC są patogenami powodującymi zoonozy (Hussein A.H., 2013), a liczba infekcji wywoływanych przez te bakterie ciągle wzrasta (Dziva, F. et al., 2008).
Powszechnym problemem dotyczącym szczepów APEC jest brak jednolitego systemu ich identyfikacji. Wynika to z paru czynników:
- powszechności występowania pałeczki okrężnicy w środowisku zwierząt: E. coli stanowi florę komensalną, która może być rezerwuarem czynników patogenności, nie wywołując efektu chorobotwórczego; dodatkowo trudno jest wyizolować z narządów chorych ptaków jedynie szczepy patogenne (Lindstedt, BA. et al., 2018, Stromberg, ZR. et al., 2017, Sarowska, J. et al., 2019);
- mnogości serotypów wśród szczepów E. coli - istnieją serotypy, które można powiązać z patogennością (np. O1, O2, O78), jednakże wiele szczepów nie daje się typować tradycyjnymi metodami serologicznymi lub istnieją serotypy rzadkie, których nie można powiązać z chorobotwórczością szczepów (Dziva, F. et al., 2012, Jorgensen, S.L. et al., 2017, Iguchi, A. et al., 2015); ‘
- ogromnej genetycznej różnorodności - pozajelitowe szczepy E. coli posiadają mechanizmy warunkujące ich patogenność i przystosowujące je do życia w środowisku pozajelitowym; czynniki zjadliwości dotyczą głównie zdolności do przylegania/adhezji, wytwarzania toksyn, czy mechanizmów pozyskiwania żelaza, jednak nie ma powszechnej metody określającej, które czynniki mają bezpośredni wpływ na patogenność, jak również nie określono minimalnej ilości takich czynników, które mogłyby być dobrym predyktorem patogenności; istnieje wiele prac, które wskazują na obecność pewnych wybranych czynników wirulencji w szczepach patogennych, jednak nie określono istotności statystycznej występowania analizowanych genów w szczepach patogennych w stosunku do szczepów niepatogennych (Dissanayake, DR. et al., 2013, Subedi, M. et al., 2018, Silveira, F. et al., 2016, Johnson, TJ. et al., 2008, Huja, S. et al., 2015, Guabiraba R. & Schouler, C., 2015, Paixao, A.C. et al., 2016).
Obecnie najczęściej stosowaną metodą diagnostyczną typowania szczepów APEC jest identyfikacja serologiczna. Metoda ta pozwala jednak na identyfikację jedynie ograniczonej liczby szczepów i nie odzwierciedla obecności czynników wirulencji (Schouler, C. et al., 2012).
W związku z powyższym, bez dokładnej identyfikacji szczepów chorobotwórczych i odróżnienia ich od szczepów komensalnych, nie ma możliwości odpowiedniego doboru terapii - np. zastosowania antybiotyku, wobec którego wrażliwe są szczepy patogenne. Jako że szczepy APEC charakteryzuje duża antybiotykooporność, informacja dotycząca patogenności szczepu jest niezwykle istotna (Subedi, M. et al., 2018).
Istotnym markerem umożliwiającym wykrywanie i charakterystykę szczepów APEC może być identyfikacja czynników wirulencji. Najbardziej obiecującą metodą ich wykrywania jest genotypowanie
PL 240 694 B1 za pomocą PCR typu multipleks. Przydatność tej metody w identyfikacji APEC potwierdzają liczne doniesienia.
Iguchi i wsp. opracowali multipleks PCR składający się z 20 mieszanin reakcyjnych zawierających od 6 do 9 par starterów w celu identyfikacji i klasyfikacji większości znanych szczepów E. coli należących do serotypów O. Walidacja metody z wykorzystaniem serotypów referencyjnych i dzikich wykazała dokładność metody na poziomie odpowiednio 100 i 90,8% (Iguchi, A. et al., 2015).
Metoda PCR typu multipleks została również zastosowana w badaniach Barbieri i wsp., którzy przeprowadzili charakterystykę 144 izolatów E. coli pochodzących z zapalenia tkanki łącznej kurczaków z obszaru południowej Brazylii. Genotypowanie przeprowadzone w oparciu o 34 geny wirulencji potwierdziło obecność we wszystkich izolatach genów odpowiedzialnych za adhezję, pozyskiwanie żelaza i odporność na surowicę, których występowanie wiązane jest z patogennością dla drobiu (Barbieri, N.L. et al., 2013). Ewers i wsp. w metodzie multipleks PCR wykorzystali kombinację genów papC, iucD, irp2, tsh, vat, astA, iss i cva/cvi do identyfikacji szczepów E. coli wyizolowanych z przypadków kolibakteriozy. W celu weryfikacji metody sprawdzano częstość występowania badanych genów w szczepach izolowanych od zdrowych kurcząt oraz w szczepach uropatogennych, enteropatogennych i enterotoksycznych. Uzyskane wyniki potwierdziły obecność od 4 do 8 badanych genów w szczepach E. coli wyizolowanych od zwierząt z objawami kolibakteriozy. Natomiast u szczepów niepatogennych potwierdzono obecność maksymalnie 3 badanych genów (Ewers, C. et al., 2005). Podobnych obserwacji potwierdzających większą częstość genów wirulencji (od 5 do 8) w szczepach APEC dostarczyły badania Roussan i wsp. W tym samym badaniu wykazano obecność mniej niż 4 genów wirulencji w szczepach niepatogennych (Roussan, D.A. et al., 2014).
Większą częstość występowania 2 genów wirulencji: iss (gen odporności na surowicę) oraz tsh (gen kodujący termowrażliwą hemaglutyninę) w izolatach E. coli pochodzących od chorych ptaków potwierdziły również badania, w których oceniano częstość występowania genów iss, tsh, iucC i cvi (Skyberg, JA. et al., 2003).
W pracy Westhuizen i wsp. została opisana metoda multipleks PCR, w której w celu przeprowadzenia molekularnej charakterystyki szczepów E. coli w izolatach pochodzących z obszarów Afryki Południowej i Zimbabwe, wykorzystano kombinację 18 genów wirulencji. Selekcja genów została pr zeprowadzona w oparciu o dostępne dane literaturowe, które potwierdzały wysoką częstość występowania badanych genów wśród APEC w innych krajach oraz badania dotyczące roli tych genów w mechanizmie wirulencji (van der Westhuizen, WA. & Bragg, RR, 2012).
W badaniach przeprowadzonych na 219 szczepach E. coli (153 szczepach APEC, 30 ptasich kałowych E. coli (AFEC) i 36 szczepach środowiskowych) wykazano występowanie znacznej przewagi genów wirulencji iroN, ompT, hlyF, iss, iutA wśród APEC (89,5-94,7%, P<0,001) w porównaniu do AFEC (46,6-53,3%) i szczepów środowiskowych (10-25%) (Hussei,. A.H. et al., 2013).
Również w literaturze patentowej wiele opracowań nawiązuje do E. coli patogennego dla drobiu. W patencie (EP2298798B1) została opisana metoda izolacji kwasu nukleinowego zawierającego sekwencję genu yqi, wykorzystywana w diagnostyce chorób powodowanych przez APEC.
W zgłoszeniu patentowym US 2014/0193824 A1 opisano metodę typowania genetycznego E. coli opartą na zmodyfikowanej metodzie MLST (Multilocus Sequence Typing), polegającą na określeniu sekwencji nukleotydowej genu adhezyny fimbrialnej typu 1 w badanej próbce i dalszej selekcji genu z grupy składającej się z genów: fumC, adk, gyrB, icd, mdh, purA i recA w celu zidentyfikowania klonotypu E. coli.
Lee i wsp. opracowali metodę polegającą na wykorzystaniu chipów DNA do wykrywania i identyfikacji E. coli, zawierających sekwencje specyficzne dla tych bakterii (WO2008/084888 A).
Weigl i wsp. (US 2008/0199877 A1) opracowali metodę specyficznej gatunkowo identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Providencia stuartii i Serratia marcescens), a także wykrywania i diagnostyki infekcji powodowanych przez te bakterie oraz ich oporności na chinolony (US 2008/0199877 A1).
W zgłoszeniu patentowym Lee i wsp. zastosowano technikę hybrydyzacji wykorzystującą sondy kwasów nukleinowych komplementarne do specyficznych regionów w genach kodujących rRNA. Metoda ta może być stosowana do wykrywania i identyfikacji infekcji, które nie są powodowane przez wirusy (US 2007/0065817 A1).
PL 240 694 B1
Szczegółowa identyfikacja APEC jest kluczowa dla zrozumienia roli czynników wirulencji w patogenezie chorób powodowanych przez te drobnoustroje. Nadal jednak wiedza dotycząca tych zagadnień jest niewystarczająca, aby w pełni zrozumieć związek pomiędzy występowaniem czynników wirulencji a zdolnością do wywoływania określonych zmian chorobowych (Janβen, T. et al., 2003). Identyfikacja szczepów E. coli patogennych dla ptaków jest również istotna ze względu na możliwość zastosowania terapii alternatywnych m.in. bakteriofagów (van der Westhuizen et al., 2012).
Dotychczas opracowane testy diagnostyczne nie pozwalają na przeprowadzenie szybkiej i jednoznacznej diagnostyki APEC z uwzględnieniem zarówno czynników wirulencji, jak i najczęściej występujących serotypów, co może utrudniać m.in. wdrożenie nowych sposobów leczenia. Duża różnorodność szczepów E. coli oraz fakt, że niektóre z nich nie są wirulentne, to dodatkowe czynniki utrudniające identyfikację tych bakterii z uwzględnieniem podziału na szczepy patogenne i niepatogenne (Guabiraba, R. & Schouler, C., 2015). Dlatego problemem, który w dalszym ciągu wymaga rozwiązania jest jednoznaczna klasyfikacja bakterii E. coli jako APEC, dzięki której możliwe będzie zwiększenie nie tylko bezpieczeństwa żywności, ale również zdrowia ludzi i zwierząt.
Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie skutecznego sposobu identyfikowania APEC pozwalającego na wykrywanie co najmniej 90%, korzystnie ponad 95%, szczepów E. coli patogennych dla drobiu. W kontekście niniejszego opisu za szczep patogenny dla drobiu uznaje się szczep bakteryjny E. coli powodujący w 19 dobie od zakażenia śmiertelność zarodków kurzych wynoszącą co najmniej 85%, przy czym w teście śmiertelności wykorzystuje 9 dniowe zarodki kurze, które zakaża się jedną dawką zakażającą zawierającą 5x104 CFU bakterii/zarodek.
Nieoczekiwanie rozwiązaniem przedstawionych problemów jest zastosowanie niniejszego wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji szczepu E. coli patogennego dla ptaków (APEC), charakteryzujący się tym, że:
a) z badanej próbki materiału biologicznego izoluje się DNA,
b) w próbce wyizolowanego DNA bada się obecność: genów wirulencji iroC i hlyF oraz genu odpowiedzialnego za serotyp O78, przy czym stwierdzenie obecności co najmniej jednego genu spośród wspomnianych genów wirulencji lub genu odpowiedzialnego za serotyp O78 świadczy o zidentyfikowaniu w badanej próbce szczepu E. coli patogennego dla ptaków (APEC) z dokładnością wynoszącą do 97,7%.
Korzystnie, w etapie a) badaną próbką jest próbka tkanki chorego ptaka lub próbka środowiskowa. Korzystnie, w etapie b) próbka wyizolowanego DNA zawiera genomowy DNA bakteryjny, zwłaszcza DNA E. coli. Korzystnie, w etapie b) obecność wspomnianych genów bada techniką PCR.
Korzystnie, w etapie b) stosuje metodę PCR typu multiplex oraz zestaw primerów przedstawionych jako Sekw. Nr Id. 1-6, przy czym:
- obecności genu wirulencji iroC świadczy obecność produktu o długości 732 pz,
- obecności genu wirulencji hlyF świadczy obecność produktu o długości 458 pz, natomiast
- obecności genu antygenu odpowiedzialnego za serotyp O78 świadczy obecność produktu o długości 994 pz.
Korzystnie, zidentyfikowanie szczepu APEC oznacza stwierdzenie kolibakteriozy u chorego ptaka, zwłaszcza drobiu hodowlanego, korzystnie kury.
Korzystnie, niewykrycie żadnego spośród wspomnianych genów świadczy o zakażeniu szczepem niepatogennym.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw do identyfikacji szczepu E. coli patogennego dla ptaków (APEC) charakteryzujący się tym, że zawiera:
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu wirulencji iroC przedstawionego na Sekw. Nr Id. 7,
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu wirulencji hlyF przedstawionego na Sekw. Nr Id. 8,
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu antygenu odpowiedzialnego za serotyp O78 przedstawionego na Sekw. Nr Id. 9,
PL 240 694 B1 przy czym stwierdzenie obecności co najmniej jednego genu spośród wspomnianych genów wirulencji lub genu odpowiedzialnego za serotyp O78 świadczy o zidentyfikowaniu w badanej próbce szczepu E. coli patogennego dla ptaków (APEC) z dokładnością wynoszącą do 97,7%.
Korzystnie, zestaw według wynalazku zawiera oligonukleotydy o sekwencjach przedstawionych jako Sekw. Nr Id. 1-6.
Korzystnie, zestaw według wynalazku jest przeznaczony do diagnozowania kolibakteriozy u ptaków, zwłaszcza drobiu hodowlanego, korzystnie kur.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zestawu zawierającego:
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu wirulencji iroC przedstawionego na Sekw. Nr Id. 7,
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu wirulencji hlyF przedstawionego na Sekw. Nr Id. 8,
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu antygenu odpowiedzialnego za serotyp O78 przedstawionego na Sekw. Nr Id. 9, do określania stopnia patogenności szczepu E. coli dla ptaków.
Korzystnie, stosowany zestaw zawiera oligonukleotydy o sekwencjach przedstawionych jako Sekw. Nr Id. 1-6.
Szczegółowy opis wynalazku
Ujawniona została szybka metoda diagnostyczna identyfikująca szczepy E. coli patogenne dla drobiu (APEC - Avian Pathogenic Escherichia coli) oparta na wykrywaniu unikalnej kombinacji dwóch genów wirulencji oraz jednego genu odpowiedzialnego za serotyp O78, wybranych w oparciu o analizę, w trakcie której szczepy klasyfikowano jako patogenne, stosując jako kryterium śmiertelność zarodków wynoszącą co najmniej 85%, korzystnie > 96%, w 19 dobie i powtarzalność wyników. W korzystnej realizacji metoda charakteryzuje się tym, że:
a) z narządów chorego ptaka izoluje się szczep bakteryjny E. coli,
b) przeprowadza się izolację genomowego DNA (dowolnie wybraną metodą),
c) wykonuje się test diagnostyczny: PCR typu multipleks na obecność dwóch genów wirulencji (iroC, hlyF) oraz jednego genu wybranego z klastru genów odpowiedzialnych za syntezę antygenu O dla serotypu O78,
d) weryfikuje się obecność genów w próbkach w trakcie rozdziału elektroforetycznego, a następnie klasyfikuje się szczep do grupy określającej patogenność: P - patogenny (obecność co najmniej jednego z genów), NP - niepatogenny (komensalny: brak obecności któregokolwiek z genów).
Jako gen odpowiedzialny za serotyp O78 uznaje się dowolny gen należący do klastru genów odpowiedzialnych za syntezę antygenu O dla serotypu O78.
Nieoczekiwanie ujawniony sposób nadaje się do łatwej, szybkiej i jednoznacznej identyfikacji szczepów jako APEC z dokładnością wynosząca do 97,7%, co ma istotne znaczenie w diagnostyce kolibakteriozy, która jest jedną z najważniejszych przyczyn strat w drobiarstwie. Pozwala to również na wybór odpowiednich szczepów np. do produkcji efektywnej autoszczepionki lub dobór odpowiedniej terapii.
Ponadto, równie nieoczekiwanie, ujawniona metoda nadaje się do łatwej i szybkiej identyfikacji szczepów E. coli jako niepatogenne z dokładnością do 94,1%.
W celu lepszego wyjaśnienia wynalazku został on zilustrowany na przykładach.
P r z y k ł a d 1. Charakterystyka szczepów E. coli w oparciu o ich zsekwencjonowane genomy oraz czynniki wirulencji.
Izolacja i badanie podobieństwa szczepów.
Na wstępie pozyskano kolekcję 102 szczepów E. coli wyizolowanych od chorych ptaków oraz 32 szczepów E. coli wyizolowanych od zdrowych ptaków. Następnie z każdego z tych szczepów izolowano genomowy DNA i badano podobieństwo szczepów na podstawie profili uzyskanych metodą MP-PCR (Krawczyk, B. et al., 2006). Szczepy sklasyfikowane jako różniące się od siebie stanowią kolekcję, która zawiera 85 szczepów pozyskanych od chorych ptaków oraz 27 szczepów pozyskanych od zdrowych ptaków (Tabela 1).
PL 240 694 Β1
Tabela 1. Szczepy E. coli z kolekcji Proteon Pharmaceuticals
Nr szczepu. » zwierzę data izolacji
szczepy izolowane od chorych ptaków Escherichio co//_OOlPP2O15 stado kur reprodukcyjnych 19.05.2015
Escherichio co//_002PP2015 stado kur reprodukcyjnych 19.05.2015
Escherichio co//_004PP2015 indyki 05.06.2015
Escherichio co//_005PP2015 stado kur reprodukcyjnych 04.11.201Ξ
Escherichio co//_007PP2015 indyki 17.11.2015
Escherichio co//_009PP2015 indyki 17.11.2015
Escherichio co//_011PP2015 indyki 17.11.2015
Escherichio co/L012PP2015 stado kur reprodukcyjnych 17.11.2015
Escherichio co//_014PP2015 stado kur reprodukcyjnych 24.11.2015
Escherichio co//_015PP2015 stado kur reprodukcyjnych 01.12.2015
Escherichio co//_016PP2015 stado rodzicielskie brojlerów kurzych 10.12.2015
Escherichio co/L017PP2015 stado kur reprodukcyjnych 10.12.2015
Escherichio co//_018PP2015 kury nioski towarowe 14.12.2015
Escherichio co//_019PP2015 stado kur reprodukcyjnych 22.12.2015
Escherichio co//_020PP2016 stado rodzicielskie brojlerów kurzych 04.01.2016
Escherichio co//_021PP2016 kury nioski 04.01.2016
Escherichio co//_022PP2016 kury nioski 04.01.2016
Escherichio co//_023PP2016 indyki 11.01.2016
Escherichio co//_024PP2016 kury nioski konsumpcyjne 02.02.2016
Escherichio co//_027PP2016 indyki 10.02.2016
Escherichio co//_028PP2016 kury nioski 17.02.2016
Escherichio co//_029PP2016 indyki 25.03.2016
Escherichio co//_030PP2016 indyki 18.02.2016
Escherichio co//_031PP2016 stado kur reprodukcyjnych 25.02.2016
Escherichio co//_032PP2016 kury 02.03.2016
Escherichio coli_033PP201& stado kur reprodukcyjnych 02.03.2016
Escherichio co//_034PP2016 stado kur reprodukcyjnych 02.03.2016
Escherichio co//_035PP2016 broilery 15.03.2016
Escherichio co//_036PP2016 indyki 15.03.2016
Escherichio coli_037PP2016 broilery 15.03.2016
Escherichio co//_038PP2016 broilery 15.03.2016
Escherichio co//_039PP2016 kury nioski 15.03.2016
Escherichio co//_040PP2016 kury nioski 15.03.2016
Escherichio co//_041PP2016 indyki 25.03.2016
Escherichio co//_043PP2016 kury nioski towarowe 16.03.2016
Escherichio co/L044PP2016 indyki 16.03.2016
Escherichio co//_045PP2016 indyki 16.03.2016
PL 240 694 Β1
# Nr szczepu ..........· zwierzę ................ data izolacji
Escherichia co/y_046PP2016 stada kur reprodukcyjnych 16.03.2016
Escherichia co//_D47PP2016 kury 24.03.2016
Escherichio coli_048PP2016 kury 24.03.2016
Escherichio coli_049PP2016 kury 30.03.2016
Escherichio coli 050PP2016 kury 30.03.2016
Escherichia co//_ 051PP2016 kury 05.04.2016
Escherichia coli_QS2PP2Q16 kury 08.04.2016
Escherichia co/)_ 053 PP2016 stado kur reprodukcyjnych 08.04.2016
Escherichia coi7_054PP2016 indyki 21.04.2016
Escherichia coli_0E>7PP20l6 kury nioski 21.04.2016
Escherichia coli_059PP2016 kury nioski 21.04.2016
Escherichio coii_062PP2016 kury nioski 21.04.2016
Escherichio coi7_ 063PP2016 kury nioski 21.04.2016
Escherichia coli_065PP2016 kury nioski 21.04.2016
Escherichio coli_066PP2016 kury nioski 21.04.2016
Escherichia coli_Q67PP2Q16 kury nioski 21.04.2016
Escherichia coli_069PP2016 kury nioski 21.04.2016
Escherichio co//_070PP2016 kury nioski 21.04.2016
Escherichio coli_073PP2O16 indyki 09.05.2016
Escherichio coli_07ĄPP2Q16 indyki 24.05.2016
Escherichia coli_075PP2016 kury 24.05.2016
Escherichio coli_076PP2016 indyki 24.05.2016
Escherichia coii_Q77PP2Q16 indyki 24.05.2016
Escherichia co//_078PP2016 kury 30.05.2016
Escherichia coi7_079PP2016 kury 30.05.2016
Escherichio coi7_080PP2016 indyki 13.06.2016
Escherichia co/j_081PP2016 indyki 09.07.2016
Escherichia coli_082PP2016 indyki 16.06.2016
Escherichio coli_083PP2016 gĘSi 22.06.2016
Escherichia coli 084PP2016 indyki 02.08.2016
Escherichio coli_085PP2016 kury 04.08.2016
Escherichia coli_085PP2016 kury 04.08.2016
Escherichia coli_087PP2016 kury nioski 28.09.2016
Escherichia coii_ 088PP2016 kury nioski 28.09.2016
Escherichia coli_089PP2016 indyki 29.09.2016
Escherichia coli 8 _001PP2016 kury 17.02.2016
Escherichia coli 8 _002PP2016 stado kur reprodukcyjnych 28.09.2016
Escherichio coi7_105PP2016 kury zielononóżki 02.11.2016
PL 240 694 Β1
Nr szczepu data izolacji
Escherichia co//_113PP2016 stado kur reprodukcyjnych 17.11.2016
Escherichia co//_114PP2016 stado kur reprodukcyjnych 24.11.2016
Escherichia co/f_130PP2017 kury 02.01.2017
Escherichia coli_131PP2017 kury 17.01.2017
Escherichia co//_154PP2017 indyki 03.03.2017
Escherichia co//_155PP2017 kury 03.03.2017
Escherichia co//_156PP2017 indyki 03.03.2017
Escherichia coli_157PP2017 stado rodzicielskie brojlerów kurzych 09.03.2017
Escherichia co/f_158PP2017 kury nioski konsumpcyjne 15.03.2017
Escherichia co/,_159PP2017 kury nioski reprodukcyjne 15.03.2017
szczepy izolowane od zdrowych ptaków Escherichia co//_106PP2016 indyki 17.11.2016
Escherichia coli_ 107 PP2016 indyki 17.11.2016
Escherichia co//_108PP2016 indyki 17.11.2016
Escherichia co/(_110PP2016 indyki 17.11.2016
Escherichia co/7_120PP2016 kury 12.12.2016
Escherichia coli_121PP2016 kury 12.12.2016
Escherichia co//_123PP2016 kury 12.12.2016
Escherichia colf_124PP2016 kury 12.12.2016
Escherichia CO/L126PP2016 kury 12.12.2016
Escherichia coli_ 127 PP2016 kury 12.12.2016
Escherichia co/i_134PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co/i_135PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_137PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_138PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_139PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_140PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia coli 141PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia coli 142PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_143PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_144PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_145PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_146PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_147PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co/i_ 149 PP2017 kury 06.02.2017
PL 240 694 Β1
Nr szczepu data izolacji
Escherichia co//_151PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_152PP2017 kury 06.02.2017
Escherichia co//_153PP2017 kury 06.02.2017
Sekwencjonowanie szczepów i obróbka post-sekwencyjna.
DNA szczepów poddano reakcji sekwencjonowania metodą NGS (Next Generation Sequencing). Uzyskane wyniki składano de novo (SPAdes 3.7.1 i 3.8.0) oraz poddano manualnej obróbce (FA_TOOL), a otrzymane sekwencje adnotowano (RAST). Każdą z sekwencji zapisywano w postaci plików fasta (sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe).
Badanie występowania 175 genów wirulencji w zsekwencjonowanych genomach.
Na podstawie doniesień literaturowych przygotowano listę 175 czynników wirulencji występujących w szczepach APEC (Tabela 2). Aminokwasową sekwencję odpowiadającą każdemu z genów zapisywano w formacie fasta, na podstawie sekwencji dostępnych w bazie danych UniProt.
Tabela 2. Czynniki wirulencji szczepów APEC
adhezyny aufA, aufB, aufC, aufD, aufE, aufF, aufG, crl, csgA, csgB, csgC, csgD, csgE, csgF, csgG, eaeH, ecpA, ecpB, ecpC, ecpD, ecpE, ecpR, fimA, fimB, fimC, fimD, fimE, fimF, fimG, fimH, fiml, fmlA, fmID, focA, focB, focC, focD, focl, hcpA, hcpB, hra, htrA, htrB, htrC, htrE, mat, papA, papB, papC, papD, papE, papF, papGII, papHpapl, papK, papX, sfaB, sfaC, sfaG, sfaH, stgA, stgB, stgD, tsh, yehA, yehB, yehC, yehD, yehE, yqi
inwazyny ibeA, IbeB, ibeC, IbeR, tia
związane z Fe chuA, chuS, chuT, chuU, chuW, chuX, chuY, eitA, eitB, eitC, eitD, feoA, feoB, feoC, fepA, fepB, fepC, fepD, fepE, fyuA, ireA, iroB, iroC, iroD, IroE, iroN, irpl, irp2, iucA, iucB, iucC, iucD, iutA, sitA, sitB, sitC, sitD, ybtA, ybtE, ybtP, ybtS, ybtT, ybtU, ybtX
inne etsA, etsB, etsC, fliC, maIX
protektyny bor, kpsE, kpsM, kpsT, neuC, neuS, ompT, traT
białka sekrecyjne aecl4, aecl5, aecl6, aecl7, aecl8, aecl9, aec22, aec23, aec24, aec25, aec26, aec27, aec28, aec29, aec30, aec31, aec32, aec7, aec8
toksyny astA, astB, astC, astD, astE, cba, cbi, cdtA, cdtB, cdtC, cma, cmi, cvaA, cvaB, cvaC, hlyD, hlyE, hlyF, pic, pilO, sat, usp, vat
Następnie badano obecność poszczególnych czynników wirulencji (w postaci sekwencji aminokwasowych) w adnotowanych sekwencjach genomów wszystkich szczepów. Przeprowadzone badanie pozwoliło na jednoczesną analizę wszystkich wybranych czynników wirulencji we wszystkich analizowanych genomach. Obecność czynników wirulencji określano w sposób zero-jedynkowy, gdzie 0 - brak obecności danego czynnika wg przyjętych założeń, zaś 1 - obecność danego czynnika wg przyjętych założeń.
Serotypowanie in silico na podstawie zsekwencjonowanych genomów.
W celu oceny przynależności badanych szczepów do poszczególnych serotypów oraz sprawdzenia, czy pewne serotypy są powiązane z patogennością szczepów przeprowadzono analizę serotypowania in silico.
Przykład 2. Podział szczepów E. coli na patogenne i niepatogenne na podstawie danych uzyskanych z testu żywotności zarodków kurzych w modelu in ovo.
Celem weryfikacji pierwotnej informacji dotyczącej klasyfikacji szczepów na patogenne i komensalne (izolaty pozyskane od chorych i zdrowych ptaków) przeprowadzono test na żywotność zarodków kurzych w modelu in ovo. Doświadczenie 1. polegało na optymalizacji dawki zakażającej, natomiast kolejne doświadczenia na ocenie patogenności szczepów.
PL 240 694 Β1
Przebieg doświadczenia 1 (UR, Kraków) - optymalizacja dawki zakażającej
Przeprowadzono doświadczenie polegające na zakażeniu 9-dniowych zarodków kurzych czterema szczepami E. coli (2 szczepy zaklasyfikowane pierwotnie jako niepatogenne: wzorcowy szczep K12 i 139PP2017 oraz 2 szczepy zaklasyfikowane pierwotnie jako patogenne: 002PP2015 i 053PP2016w4dawkach zakażających: 1x107 CFU/zarodek, 1x106 CFU/zarodek, 1x105 CFU/zarodek i 1x104 CFU/zarodek (po 60 zarodków w przypadku każdej badanej dawki każdego szczepu).
Zawiesiny bakterii (po 100 μΙ/jajko) zostały użyte do zakażenia zarodków 24 h po zawieszeniu w soli fizjologicznej.
1080 zalężonych jaj podzielono na 18 grup po 60 jaj. 16 grup zakażano badanymi szczepami, dodatkowe 2 grupy stanowiły grupy kontrolne: grupę negatywną zerową (niczym nie traktowaną) oraz negatywną kontrolną (traktowaną 0,85% NaCI, w którym rozcieńczano szczepy do zakażania). Następnie (w kolejnych dniach) oceniano śmiertelność zarodków. Eksperyment zakończono w 10 dniu od zakażenia.
Dane dotyczące śmiertelności na koniec eksperymentu przedstawiono w Tabeli 3. Uzyskane wyniki potwierdziły patogenność 2 szczepów E. coli oznaczonych numerami: 002PP2015 i 053PP2016 (wysoka śmiertelność zarodków) oraz znacząco niższy efekt 2 pozostałych szczepów. Ponadto, w oparciu o uzyskane wyniki do kolejnych badań patogenności szczepów E. coli w modelu in ovo wytypowano dawkę zakażającą: 5x104 CFU/zarodek.
Tabela 3. Śmiertelność zarodków kurzych podczas doświadczenia 1
Szczep E coli Zakładana dawka [CFU/zarodek] Śmiertelność po 5 dniach : od zakażenia (E14) [%] Śmiertelność na zakończenie eksperymentu [E19] < Odchylenie standardowe w
K-12 1Χ107 43,3 79,6 12,7
139PP2017 80,7 82,6 17,7
002PP2015 91,7 98,3 4,1
053PP2016 98,3 100,0 0,0
K-12 1Χ106 68,7 78,9 12,2
139PP2017 48,5 64,6 28,6
002PP2015 89,6 100,0 o,o
053PP2016 79,1 100,0 0,0
K-12 lxl05 77,5 86,0 10,2
139PP2017 51,3 79,6 15,2
002PP2015 91,7 100,0 0,0
053PP2016 96,7 98,3 4,1
K-12 1Χ104 63,1 72,0 4,63
139PP2O17 36,7 65,0 20,7
002PP2015 84,6 100,0 0,0
O53PP2O16 96,7 100,00 0,0
PL 240 694 Β1
Przebieg doświadczenia 2 (UR, Kraków)
Przeprowadzono doświadczenie polegające na zakażeniu 9-dniowych zarodków kurzych szesnastoma szczepami E. coli (004PP2015, 009PP2015, 011PP2015, 015PP2015, 039PP2016, 047PP2016, 053PP2016, 075PP2016, 077PP2016, 082PP2016, 087PP2016, 105PP2016, 108PP2016, 138PP2017, 139PP2017 i 144PP2017) w jednej dawce zakażającej 5x104 CFU/zarodek (po 60 zarodków w przypadku każdego badanego szczepu, miano bakterii 5x105 CFU/ml).
Zawiesiny bakterii (po 100 μΙ/jajko) zostały użyte do zakażenia zarodków 24 h po zawieszeniu w soli fizjologicznej.
1080 zalężonych jaj podzielono na 18 grup po 60 jaj. 16 grup zakażano badanymi szczepami, dodatkowe 2 grupy stanowiły grupy kontrolne: grupę negatywną zerową (niczym nie traktowaną) oraz negatywną kontrolną (traktowaną 0,85% NaCI, w którym przygotowywano szczepy do zakażania). Podczas trwania całego eksperymentu oceniano śmiertelność zarodków. Eksperyment zakończono w 10 dniu od zakażenia.
Dane dotyczące śmiertelności na koniec eksperymentu przedstawiono w Tabeli 4. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że śmiertelność zarodków jest uzależniona od przynależności szczepu do odpowiedniej grupy patogenności. Szczepy uporządkowano w tabeli wraz z malejącą śmiertelnością. Część szczepów wywołuje śmierć 88,3-100% zarodków w przyjętej dawce, natomiast inne szczepy powodują w tej samej dawce śmierć 63,4-85% zarodków , co stanowi zauważalną różnicę.
Tabela 4. Podsumowanie wyników doświadczenia 2.
Szczep E. coli Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia (E14) {%] Śmiertelność na zakończenie eksperymentu (E19) [%} Odchylenie standardowe [%]
0 - kontrola negatywna 3,5 3,5 5,5
K-0,85% NaCI 23,3 29,2 16,0
OO9PP2O15 100,0 100,0 0,0
O15PP2O15 100,0 100,0 0,0
039PP2016 100,0 100,0 0,0
053PP2016 100,0 100,0 0,0
087PP2016 100,0 100,0 0,0
OO4PP2O15 98,3 100,0 0,0
O75PP2O16 98,3 100,0 0,0
105PP2016 95,0 100,0 0,0
144PP2O17 91,7 100,0 0,0
077PP2016 88,3 95,0 8,4
1O8PP2O16 71,7 89,8 6,3
047PP2016 60,0 88,3 11,7
138PP2O17 60,0 85,0 8,4
O11PP2O15 55,0 78,3 19,4
139PP2O17 35,0 73,3 5,2
O82PP2O16 21,7 63,4 13,1
Przebieg doświadczenia 3 (UR, Kraków)
Przeprowadzono doświadczenie polegające na zakażeniu 9-dniowych zarodków kurzych dwudziestoma dwoma szczepami E. coli (002PP2015, 017PP2015, 018PP2015, 022PP2016, 029PP2016, 030PP2016, 032PP2016, 036PP2016, 040PP2016, 044PP2016, 045PP2016, 048PP2016,
PL 240 694 Β1
049PP2016, 051PP2016, 054PP2016, 063PP2016, 070PP2016, 074PP2016, 076PP2016, 084PP2016, 110PP2016 i 120PP2016) w jednej dawce zakażającej 5x104 CFU/zarodek (po 30 zarodków w przypadku każdego badanego szczepu, miano bakterii 5x105 CFU/ml).
Zawiesiny bakterii (po 100 μΙ/jajko) zostały użyte do zakażenia zarodków 24 h po zawieszeniu w soli fizjologicznej.
720 zalężonych jaj podzielono na 24 grupy po 30 jaj. 22 grupy zakażano badanymi szczepami, dodatkowe 2 grupy stanowiły grupy kontrolne: grupę negatywną zerową (niczym nie traktowaną) oraz negatywną kontrolną (traktowaną 0,85% NaCI, w którym przygotowywano szczepy do zakażania). Podczas trwania całego eksperymentu oceniano śmiertelność zarodków. Eksperyment zakończono w 10 dniu od zakażenia.
Dane dotyczące śmiertelności na koniec eksperymentu przedstawiono w Tabeli 5. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że śmiertelność zarodków jest uzależniona od przynależności szczepu do odpowiedniej grupy patogenności. Szczepy uporządkowano w tabeli wraz z malejącą śmiertelnością. W przyjętej dawce część szczepów wywołuje śmierć 93,3-100% zarodków, natomiast inne szczepy powodują śmierć 52,2-83,3%, co stanowi zauważalną różnicę.
Tabela 5. Podsumowanie wyników doświadczenia 3.
Szczep E. coli Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia (E14J W Śmiertelność na zakończenie eksperymentu (E19) t%l Odchylenie standardowe [%]
0 - kontrola negatywna 0,0 0,0 0,0
K-0,85% NaCI 13,3 13,3 15,3
002PP2015 100,0 100,0 0,0
017PP2015 100,0 100,0 0,0
022PP2016 100,0 100,0 0,0
040PP2016 100,0 100,0 0,0
044PP2016 100,0 100,0 0,0
076PP2016 100,0 100,0 0,0
029PP2016 96,7 100,0 0,0
045PP2016 96,7 100,0 0,0
070PP2016 95,8 100,0 0,0
063PP2016 92,6 100,0 0,0
018PP2015 91,1 100,0 0,0
110PP2016 83,3 100,0 0,0
030PP2016 82,6 100,0 0,0
084PP2016 80,0 100,0 0,0
054PP2016 86,7 96,7 5,8
036PP2016 86,3 96,7 5,8
032PP2016 61,1 93,3 11,6
074PP2016 72,6 83,3 20,8
051PP2016 62,6 75,9 5,3
049PP2016 47,8 74,8 28,1
048PP2016 36,3 57,4 17,9
120PP2016 27,4 52,2 13,5
PL 240 694 Β1
Przebieg doświadczenia 4 (UR, Kraków)
Przeprowadzono doświadczenie polegające na zakażeniu 9-dniowych zarodków kurzych dwudziestoma dwoma szczepami E. coli (014PP2015, 024PP2016, 035PP2016, 043PP2016, 050PP2016, 057PP2016, 078PP2016, 079PP2016, 080PP2016, 081PP2016, 086PP2016, 114PP2016,
135PP2017, 137PP2017, 141PP2017, 142PP2017, 143PP2017, 151PP2017, 152PP2017,
155PP2017, 159PP2017 i B001PP2016) w jednej dawce zakażającej 5x104 CFU/zarodek (po 30 zarodków w przypadku każdego badanego szczepu, miano bakterii 5x105 CFU/ml).
Zawiesiny bakterii (po 100 μΙ/jajko) zostały użyte do zakażenia zarodków 24 h po zawieszeniu w soli fizjologicznej.
720 zalężonych jaj podzielono na 24 grupy po 30 jaj. 22 grupy zakażano badanymi szczepami, dodatkowe 2 grupy stanowiły grupy kontrolne: grupę negatywną zerową (niczym nie traktowaną) oraz negatywną kontrolną (traktowaną 0,85% NaCI, w którym przygotowywano szczepy do zakażania). Podczas trwania całego eksperymentu oceniano śmiertelność zarodków. Eksperyment zakończono w 10 dniu od zakażenia.
Dane dotyczące śmiertelności na koniec eksperymentu przedstawiono w Tabeli 6. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że śmiertelność zarodków jest uzależniona od przynależności szczepu do odpowiedniej grupy patogenności. Szczepy uporządkowano w tabeli wraz z malejącą śmiertelnością. W przyjętej dawce część szczepów wywołuje śmierć 93,3-100%, natomiast inne szczepy powodują śmierć 70-83,3%, co stanowi zauważalną różnicę.
Tabela 6. Podsumowanie wyników doświadczenia 4.
Szczep E. coli Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia (E14) [%] Śmiertelność na zakończenie eksperymentu (E19) l%] Odchylenie standardowe [%]
0 - kontrola negatywna 0,0 0,0 0,0
K-0,85% NaCI 3,4 3,7 6,4
014PP2015 100,0 100,0 0,0
O24PP2O16 100,0 100,0 0,0
035PP2016 100,0 100,0 0,0
050PP2016 100,0 100,0 0,0
086PP2016 100,0 100,0 0,0
159PP2017 100,0 100,0 0,0
B001PP2016 100,0 100,0 0,0
043PP2016 90,0 100,0 0,0
078PP2016 96,7 100,0 0,0
079PP2016 96,7 100,0 0,0
080PP2016 96,7 100,0 0,0
155PP2016 93,4 100,0 0,0
081PP2016 86,7 100,0 0,0
152PP2017 80,0 100,0 0,0
057PP2016 96,3 96,3 6,4
137PP2017 93,4 96,3 6,4
1S1PP2017 93,4 96,3 6,4
143PP2017 80,0 96,3 6,4
114PP2016 90,0 93,3 11,5
PL 240 694 Β1
Szczep E. coli śmiertelność po 5 dniach od zakażenia (E14) . (%] . Śmiertelność na zakończenie eksperymentu (E19) Odchylenie standardowe
142PP2017 76,7 93,3 11,5
135PP2O17 56,7 83,3 5,8
141PP2017 69,0 70,0 26,5
Przebieg doświadczenia 5 (UR, Kraków)
Przeprowadzono doświadczenie polegające na zakażeniu 9-dniowych zarodków kurzych dwudziestoma ośmioma szczepami E. coli (001PP2015, 005PP2015, 007PP2015, 027PP2016, 052PP2016, 059PP2016, 069PP2016, 083PP2016, 085PP2016, 106PP2016, 107PP2016,
113PP2016, 123PP2016, 124PP2016, 126PP2016, 127PP2016, 130PP2017, 131PP2017,
134PP2017, 140PP2017, 145PP2017, 146PP2017, 147PP2017, 149PP2017, 153PP2017,
154PP2017, 156PP2017 i B002PP2016) w jednej dawce zakażającej 5x104 CFU/zarodek (po 30 zarodków w przypadku każdego badanego szczepu, miano bakterii 5x105 CFU/ml zarodków).
Zawiesiny bakterii (po 100 μΙ/jajko) zostały użyte do zakażenia zarodków 24 h po zawieszeniu w soli fizjologicznej.
900 zalężonych jaj podzielono na 30 grup po 30 jaj. 28 grup zakażano badanymi szczepami, dodatkowe 2 grupy stanowiły grupy kontrolne: grupę negatywną zerową (niczym nie traktowaną) oraz negatywną kontrolną (traktowaną 0,85% NaCI, w którym przygotowywano szczepy do zakażania). Podczas trwania całego eksperymentu oceniano śmiertelność zarodków. Eksperyment zakończono w 10 dniu od zakażenia.
Dane dotyczące śmiertelności na koniec eksperymentu przedstawiono w Tabeli 7. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że śmiertelność zarodków jest uzależniona od przynależności szczepu do odpowiedniej grupy patogenności. Szczepy uporządkowano w tabeli wraz z malejącą śmiertelnością. W przyjętej dawce część szczepów wywołuje śmierć 93,3-100% zarodków, natomiast inne szczepy powodują około śmierć 34,4-83,3% zarodków, co stanowi zauważalną różnicę.
Tabela 7. Podsumowanie wyników doświadczenia 5.
Szczep E. coli Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia (E14) [%J Śmiertelność na zakończenie eksperymentu (E19) Odchylenie standardowe (%]
0 - kontrola negatywna 0,0 0,0 0,0
K - 0,85% NaCI 16,7 16,7 15,3
154PP2017 100,0 100,0 0,0
156PP2017 100,0 100,0 0,0
005PP2015 95,8 100,0 0,0
123PP2016 93,3 100,0 0,0
124PP2016 93,3 100,0 0,0
146PP2017 93,3 100,0 0,0
PL 240 694 Β1
7 Szczep E. coli ? Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia (E14) Śmiertelność na zakończenie eksperymentu (E19) (%1 Odchylenie standardowe S|Oiii
145PP2017 92,6 100,0 0,0
126PP2O16 86,7 100,0 0,0
106PP2016 83,3 100,0 0,0
131PP2O17 82,2 100,0 0,0
127PP2O16 80,0 100,0 0,0
134PP2017 78,5 100,0 0,0
113PP2O16 76,7 100,0 0,0
O59PP2O16 66,7 100,0 0,0
069PP2016 66,3 100,0 0,0
153PP2O17 65,0 100,0 0,0
083PP2016 93,3 96,7 5,8
O85PP2O16 89,6 96,7 5,8
149PP2017 90,0 93,3 5,8
130PP2017 73,3 93,3 5,8
107PP2016 63,0 93,3 11,5
B002PP2016 53,3 93,3 5,8
001PP2015 76,7 83,3 11,5
052PP2016 52,6 80,0 17,3
OO7PP2O15 54,2 70,8 8,8
027PP2016 60,0 70,0 10,0
147PP2017 50,0 66,7 15,3
140PP2017 16,7 34,4 15,0
Przebieg doświadczenia 6 (UR, Kraków)
Przeprowadzono doświadczenie polegające na zakażeniu 9-dniowych zarodków kurzych trzydziestoma trzema szczepami E. coli (001PP2015, 012PP2015, 014PP2015, 016PP2015, 019PP2015, 020PP2015, 021PP2016, 023PP2016, 028PP2016, 031PP2016, 032PP2016, 033PP2016,
034PP2016, 038PP2016, 041PP2016, 046PP2016, 047PP2016, 051PP2016, 052PP2016,
062PP2016, 065PP2016, 066PP2016, 067PP2016, 073PP2016, 088PP2016, 089PP2016,
121PP2016, 135PP2017, 137PP2017, 138PP2017, 141PP2017, 157PP2017 i 158PP2017) w jednej dawce zakażającej 5x104 CFU/zarodek (po 30 zarodków w przypadku każdego badanego szczepu, miano bakterii 5x105 CFU/ml).
Zawiesiny bakterii (po 100 μΙ/jajko) zostały użyte do zakażenia zarodków 24 h po zawieszeniu w soli fizjologicznej.
PL 240 694 Β1
1050 zalężonych jaj podzielono na 35 grup po 30 jaj. 33 grupy zakażano badanymi szczepami, dodatkowe 2 grupy stanowiły grupy kontrolne: grupę negatywną zerową (niczym nie traktowaną) oraz negatywną kontrolną (traktowaną 0,85% NaCI, w którym przygotowywano szczepy do zakażania). Podczas trwania całego eksperymentu oceniano śmiertelność zarodków. Eksperyment zakończono w 10 dniu od zakażenia.
Dane dotyczące śmiertelności na koniec eksperymentu przedstawiono w Tabeli 8. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że śmiertelność zarodków jest uzależniona od przynależności szczepu do odpowiedniej grupy patogenności. Szczepy uporządkowano w tabeli wraz z malejącą śmiertelnością. W przyjętej dawce część szczepów wywołuje śmierć 86,7-100% zarodków, natomiast inne szczepy powodują śmierć 26,7-71,9% zarodków, co stanowi zauważalną różnicę.
Tabela 8. Podsumowanie wyników doświadczenia 6.
Szczep E. coli Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia (E14). . l%] Śmiertelność na zakończenie eksperymentu (E19) Odchylenie standardowe [%]
0 - kontrola negatywna 0,0 10,7 0,64
K-0,85% NaCI 10,0 24,1 15,1
016PP2015 100,0 100,0 0,0
O28PP2O16 100,0 100,0 0,0
O31PP2O16 100,0 100,0 0,0
O33PP2O16 100,0 100,0 0,0
041PP2016 100,0 100,0 0,0
O66PP2O16 100,0 100,0 0,0
O67PP2O16 100,0 100,0 0,0
121PP2O16 100,0 100,0 0,0
157PP2O17 100,0 100,0 0,0
046PP2016 96,7 100,0 0,0
O62PP2O16 96,7 100,0 0,0
O88PP2O16 96,7 100,0 0,0
158PP2O17 96,7 100,0 0,0
052PP2016 86,7 100,0 0,0
073PP2016 96,7 96,7 5,8
135PP2O17 90,0 96,3 6,4
021PP2016 86,7 96,3 6,4
PL 240 694 Β1
. Szczep E. coli Śmiertelność po 5 dniach i: od zakażenia (E14) Śmiertelność na zakończenie γ ,ΐί ekspery mentu (E19) (%1 - Odchylenie standardowe ? i%i
051PP2016 66,7 90,0 10,0
O12PP2O15 60,0 86,7 5,8
O23PP2O16 60,0 71,9 17,3
014PP2015 71,3 71,3 19,7
089PP2016 50,0 63,3 5,8
034PP2016 40,0 56,7 15,3
019PP2015 40,0 43,3 20,8
038PP2016 23,3 43,3 20,8
O2OPP2O15 43,3 43,3 23,4
032PP2016 16,7 46,3 11,6
138PP2O17 44,8 44,8 29,3
047PP2016 13,3 42,2 29,1
O65PP2O16 20,0 37,5 22,2
137PP2O17 26,7 34,8 13,0
001PP2015 20,0 31,1 20,1
141PP2017 23,3 26,7 5,8
Przebieg doświadczenia 7 (UR, Kraków)
Przeprowadzono doświadczenie polegające na zakażeniu 9-dniowych zarodków kurzych trzy dziestoma trzema szczepami E. coli (011PP2015, 012PP2015, 014PP2015, 019PP2015, 020PP2016,
023PP2016, 027PP2016, 034PP2016, 038PP2016, 049PP2016, 050PP2016, 052PP2016,
059PP2016, 073PP2016, 074PP2016, 075PP2016, 077PP2016, 081PP2016, 084PP2016,
089PP2016, 106PP2016, 108PP2016, 114PP2016, 121PP2016, 123PP2016, 124PP2016,
126PP2016, 127PP2016, 137PP2017, 141PP2017, 146PP2017, 149PP2017 i 154PP2017) w jednej dawce zakażającej 5x104 CFU/zarodek (po 30 zarodków w przypadku każdego badanego szczepu, miano bakterii 5x105 CFU/ml).
Zawiesiny bakterii (po 100 μΙ/jajko) zostały użyte do zakażenia zarodków 24 h po zawieszeniu w soli fizjologicznej.
1050 zalężonych jaj podzielono na 35 grup po 30 jaj. 33 grupy zakażano badanymi szczepami, dodatkowe 2 grupy stanowiły grupy kontrolne: grupę negatywną zerową (niczym nie traktowaną) oraz negatywną kontrolną (traktowaną 0,85% NaCI, w którym przygotowywano szczepy do zakażania). Podczas trwania całego eksperymentu oceniano śmiertelność zarodków. Eksperyment zakończono w 10 dniu od zakażenia.
Dane dotyczące śmiertelności na koniec eksperymentu przedstawiono w Tabeli 9. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że śmiertelność zarodków jest uzależniona od przynależności szczepu do odpowiedniej grupy patogenności. Szczepy uporządkowano w tabeli wraz z malejącą śmiertelnością. W przyjętej dawce część szczepów wywołuje śmierć 85,5-100% zarodków, natomiast inne szczepy powodują śmierć 3,3-82,5% zarodków, co stanowi zauważalną różnicę.
PL 240 694 Β1
Tabela 9. Podsumowanie wyników doświadczenia 7.
Szczep E. coli Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia (E14) Śmiertelność na zakończenie e ks pery m ent u {E19) . Odchylenie standardowe [%]
0-kontrola negatywna 0,0 0,0 0,0
K-0,85 NaCI 0,0 3,3 5,8
089PP2016 80,0 100,0 0,0
074PP2016 74,4 100,0 0,0
126PP2016 71,7 100,0 0,0
127PP2016 66,7 100,0 0,0
124PP2016 65,6 100,0 0,0
081PP2016 42,2 100,0 0,0
154PP2017 90,0 96,7 5,8
038PP2016 86,3 96,7 5,8
084PP2016 85,9 96,7 5,77
020PP2016 73,3 93,3 11,5
023PP2016 63,3 93,3 11,5
123PP2016 60,7 93,0 6,1
034PP2016 48,1 93,0 6,1
059PP2016 37,8 93,0 6,1
077PP2016 75,2 92,6 12,8
014PP2015 73,1 92,6 12,8
012PP2015 57,4 89,3 11,1
075PP2016 60,0 88,4 11,1
146PP2017 57,8 86,3 15,2
027PP2016 52,7 85,5 4,8
121PP2016 51,1 82,5 10,9
149PP2017 40,0 76,7 15,3
019PP2015 37,8 75,9 25,1
052PP2016 63,8 73,3 37,9
PL 240 694 Β1
Szczep E. coli . Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia (E14) Śmiertelność na zakończenie eksperymentu (E19) Odchylenie standardowe
050PP2016 63,3 73,3 11,5
011PP2015 48,5 65,6 15,0
073PP2016 38,1 58,5 20,2
141PP2O17 14,9 49,0 11,9
137PP2017 20,0 30,0 20,0
049PP2016 13,7 20,4 9,4
1O6PP2O16 3,3 19,9 8,7
108PP2016 0,0 3,3 5,8
114PP2016 3,3 3,3 5,8
Przebieg doświadczenia 8 (UR, Kraków)
Przeprowadzono doświadczenie polegające na zakażeniu 9-dniowych zarodków kurzych dwudziestoma dwoma szczepami E. coli (001PP2015, 019PP2015, 020PP2016, 023PP2016, 027PP2016, 032PP2016, 034PP2016, 037PP2016 - powt. A, 037PP2016 - powt. B, 038PP2016, 047PP2016, 049PP2016, 050PP2016, 051PP2016, 073PP2016, 089PP2016, 106PP2016, 108PP2016, 114PP2016, 138PP2017, 142PP2017 i 149PP2017) w jednej dawce zakażającej 5x104 CFU/zarodek (po 30 zarodków w przypadku każdego badanego szczepu, miano bakterii 5x105 CFU/ml).
Zawiesiny bakterii (po 100 μΙ/jajko) zostały użyte do zakażenia zarodków 24 h po zawieszeniu w soli fizjologicznej.
720 zalężonych jaj podzielono na 24 grupy po 30 jaj. 22 grupy zakażano badanymi szczepami, dodatkowe 2 grupy stanowiły grupy kontrolne: grupę negatywną zerową (niczym nie traktowaną) oraz negatywną kontrolną (traktowaną 0,85% NaCI, w którym przygotowywano szczepy do zakażania). Podczas trwania całego eksperymentu oceniano śmiertelność zarodków. Eksperyment zakończono w 10 dniu od zakażenia.
Dane dotyczące śmiertelności na koniec eksperymentu przedstawiono w Tabeli 10. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że śmiertelność zarodków jest uzależniona od przynależności szczepu do odpowiedniej grupy patogenności. Szczepy uporządkowano w tabeli wraz z malejącą śmiertelnością. W przyjętej dawce część szczepów wywołuje śmierć 85,6%-100% zarodków, natomiast inne szczepy powodują śmierć 65,7%-83% zarodków, co stanowi zauważalną różnicę.
PL 240 694 Β1
Tabela 10. Podsumowanie wyników doświadczenia 8.
Szczep f. coli Śmiertelność po 5 dniach □d zakażenia (E14) Śmiertelność na zakończenie eksperymentu (E19) [%] Odchylenie standardowe
0 - kontrola negatywna bd 0,0 0,0
K-0,85% NaCI bd 7,0 6,12
019PP2015 bd 100,0 0,0
023PP2016 bd 100,0 0,0
037PP2016-A bd 100,0 0,0
O73PP2O16 bd 100,0 0,0
114PP2016 bd 100,0 0,0
149PP2017 bd 100,0 0,0
138PP2017 bd 100,0 0,0
O2OPP2O16 bd 96,7 5,8
D37PP2016-B bd 96,7 5,8
038PP2016 bd 96,7 5,8
089PP2016 bd 96,7 5,8
034PP2016 bd 96,3 6,4
106PP2016 bd 93,3 5,8
050PP2016 bd 93,0 6,1
OO1PP2O15 bd 90,0 17,3
108PP2016 bd 90,0 17,3
142PP2O17 bd 90,0 10,0
O51PP2O16 bd 85,6 17,1
027PP2016 bd 83,0 11,2
047PP2016 bd 83,0 5,1
049PP2016 bd 76,9 11,2
032PP2016 bd 65,7 28,9
Po przeprowadzonych doświadczeniach zweryfikowano pierwotną klasyfikację szczepów na patogenne i niepatogenne opartą o stan zdrowia ptaków, od których szczep został wyizolowany (ptak zdrowy/chory). Zgromadzoną kolekcję szczepów reklasyfikowano w oparciu o wyniki testu żywotności zarodków kurzych w modelu in ovo.
Po reklasyfikacji wytypowano ostateczną grupę do analizy, którą stanowiło 105 szczepów.
PL 240 694 Β1
Tabela 11. Patogenność szczepów po reklasyfikacji.
Szczep E. coli Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia Śmiertelność na Zakończenie eksperymentu [%1 Odchylenie standardowe WSWSiil eksperymentu Klasyfikacja pozyskania Klasyfikacja wyników In ovo Ostateczna , klasyfikacja
OSTATECZNA GRUPA SZCZEPÓW
001PP2015 76,7 83,3 11,5 5 P NP NP
20,0 31,1 20,1 6 NP
bd 90,0 17,3 8 P
002PP2015 91,7 98,3 4,1 1 P P P
89,6 100,0 0,0 1 P
91,7 100,0 0,0 1 P
84,6 100,0 0,0 1 P
100,0 100,0 0,0 3 P
004PP2015 98,3 100,0 0,0 2 P P P
005PP2015 95,8 100,0 0,0 5 P P P
007PP2015 54,2 70,8 8,8 5 P NP NP
009PP2015 100,0 100,0 0,0 2 P P P
O11PP2O15 55,0 78,3 19,4 2 P NP NP
48,5 65,6 15,0 7 NP
012PP2015 60,0 86,7 5,8 6 P P P
57,4 89,3 11,1 7 P
014PP2015 100,0 100,0 0,0 4 P P P
bd 71,3 19,7 6 NP
73,1 92,6 12,8 7 P
015PP2015 100,0 100,0 0,0 2 P P P
016PP2015 100,0 100,0 0,0 6 P P P
017PP2015 100,0 100,0 0,0 3 P P P
018PP2015 91,1 100,0 0,0 3 P P P
020PP2015 bd 42,2 23,4 6 P NP P
73,3 93,3 11,5 7 P
bd 96,7 5,8 8 P
021PP2016 86,7 96,3 6,4 6 P P P
022PP2016 100,0 100,0 0,0 3 P P P
023PP2016 60,0 71,9 17,3 6 P NP P
63,3 93,3 11,5 7 P
bd 100,0 0,0 8 P
024PP2016 100,0 100,0 0,0 4 P P P
028PP2016 100,0 100,0 0,0 6 P P P
029PP2016 96,7 100,0 0,0 3 P P P
030PP2016 82,6 100,0 0,0 3 P P P
031PP2016 100,0 100,0 0,0 6 P P P
032PP2016 61,1 93,3 11,6 3 P P NP
PL 240 694 Β1
Szczep E. tali Śmiertelność po s dniach od zakażenia ' I«J Śmiertelność na zakończenie eksperymentu wf·; ' odchylenie · standardowe [%l Nr eksperymentu Klasyfikacja Wg 5 pozyskania szczepu Klasyfikacja wg wyników in ovo Ostateczna klasyfikacja
16,7 46,3 11,6 6 NP
bd 65,7 28,9 8 NP
033PP2016 100,0 100,0 0,0 6 P P P
034PP2016 40,0 56,7 15,3 6 P NP P
48,1 93,0 6,1 7 P
bd 96,3 6,4 8 P
035PP2016 100,0 100,0 0,0 4 P P P
036PP2016 86,3 96,7 5,8 3 P P P
037PP2016 bd 100,0 0,0 8 P P P
bd 96,7 5,8 8 P
038PP2016 23,3 43,3 20,8 6 P NP P
86,3 96,7 5,8 7 P
bd 96,7 5,8 8 P
039PP2016 100,0 100,0 0,0 2 P P P
040PP2016 100,0 100,0 0,0 3 P P P
O41PP2O16 100,0 100,0 0,0 6 P P P
043PP2016 90,0 100,0 0,0 4 P P P
044PP2016 100,0 100,0 0,0 3 P P P
045PP2016 96,7 100,0 0,0 3 P P P
046PP2016 96,7 100,0 0,0 6 P P P
047PP2016 60,0 88,3 11,7 2 P P NP
13,3 42,2 29,1 6 NP
bd 83,0 5,1 8 NP
048PP2016 36,3 57,4 17,9 3 P NP NP
049PP2016 47,8 74,8 28,1 3 P NP NP
13,7 20,4 9,4 7 NP
bd 76,9 11,2 8 NP
050PP2016 100,0 100,0 0,0 4 P P P
63,3 73,3 11,5 7 NP
bd 93,0 6,1 8 P
052PP2016 52,6 80,0 17,3 5 P NP NP
86,7 100,0 0,0 6 P
63,8 73,3 37,9 7 NP
053PP2016 98,3 100,0 0,0 1 P P P
79,1 100,0 0,0 1 P
96,7 98,3 4,1 1 P
96,7 100,00 0,0 1 P
100,0 100,0 0,0 2 P
054PP2016 86,7 96,7 5,8 3 P P P
057PP2016 96,3 96,3 6,4 4 P P P
059PP2016 66,7 100,0 0,0 5 P P P
PL 240 694 Β1
Szczep E. coli Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia Śmiertelność < na zakończenie eksperymentu [%] Odchylenie ; standardowe Nr j eksperymentu Klasyfikacja Wg;: pozyskania -szczepu Klasyfikacja wyników in Ostateczna klasyfikacja
37,8 93,0 6,1 7 P
062PP2016 96,7 100,0 0,0 6 P P P
O63PP2O16 92,6 100,0 0,0 3 P P P
065PP2016 20,0 37,5 22,2 6 P NP NP
066PP2016 100,0 100,0 0,0 6 P P P
O67PP2O16 100,0 100,0 0,0 6 P P P
069PP2016 66,3 100,0 0,0 5 P P P
070PP2016 95,8 100,0 0,0 3 P P P
O73PP2O16 96,7 96,7 5,8 6 P P P
38,1 58,5 20,2 7 NP
bd 100,0 0,0 8 P
075PP2016 98,3 100,0 0,0 2 P P P
60,0 88,4 11,1 7 P
076PP2016 100,0 100,0 0,0 3 P P P
077PP2016 88,3 95,0 8,4 2 P P P
75,2 92,6 12,8 7 P
078PP2016 96,7 100,0 0,0 4 P P P
079PP2016 96,7 100,0 0,0 4 P P P
080PP2016 96,7 100,0 0,0 4 P P P
O81PP2O16 86,7 100,0 0,0 4 P P P
42,2 100,0 0,0 7 P P
082PP2016 21,7 63,4 13,1 2 P NP NP
083PP2016 93,3 96,7 5,8 5 P P P
084PP2016 80,0 100,0 0,0 3 P P P
85,9 96,7 5,77 7 P
085PP2016 89,6 96,7 5,8 5 P P P
086PP2016 100,0 100,0 0,0 4 P P P
087PP2016 100,0 100,0 0,0 2 P P P
088PP2016 96,7 100,0 0,0 6 P P P
089PP2016 50,0 63,3 5,8 6 P NP P
80,0 100,0 0,0 7 P
bd 96,7 5,8 8 P
105PP2016 95,0 100,0 0,0 2 P P P
106PP2016 83,3 100,0 0,0 5 NP P P
3,3 19,9 8,7 7 NP
bd 93,3 5,8 8 P
107PP2016 63,0 93,3 11,5 5 NP P P
108PP2016 71,7 89,8 6,3 2 NP P P
0,0 3,3 5,8 7 NP
bd 90,0 17,3 8 P
110PP2016 83,3 100,0 0,0 3 NP P P
PL 240 694 Β1
- , Śmiertelność ? ----?·“ ,· po 5 dniach . Szczep E coli .... od Zakażenia • .· J ' [%1 Śmiertelność na zakończenie eksperymentu r%i ’ Odchylenie, standardowe [%1 .1 Nr eksperymentu Klasyfikacja wg pozyskania szczepu Klasyfikacja wg Ł wyników in wo > Ostateczna klasyfikacja
113PP2016 76,7 100,0 0,0 5 P P P
114PP2016 90,0 93,3 11,5 4 P P P
3,3 3,3 5,8 7 NP
bd 100,0 0,0 8 P
120PP2016 27,4 52,2 13,5 3 NP NP NP
123PP2016 93,3 100,0 0,0 5 NP P P
60,7 93,0 6,1 7 P
124PP2016 93,3 100,0 0,0 5 NP P P
65,6 100,0 0,0 7 P
126PP2016 86,7 100,0 0,0 5 NP P P
71,7 100,0 0,0 7 P
127PP2016 80,0 100,0 0,0 5 NP P P
66,7 100,0 0,0 7 P
13OPP2O17 73,3 93,3 5,8 5 P P P
131PP2017 82,2 100,0 0,0 5 P P P
134PP2017 78,5 100,0 0,0 5 NP P P
137PP2017 93,4 96,3 6,4 4 NP P NP
26,7 34,8 13,0 6 NP
20,0 30,0 20,0 7 NP
138PP2017 60,0 85,0 8,4 2 NP NP NP
bd 45,9 29,3 6 NP
bd 100,0 0,0 8 P
139PP2017 80,7 82,6 17,7 1 NP NP NP
48,5 64,6 28,6 1 NP
51,3 79,6 15,2 1 NP
36,7 65,0 20,7 1 NP
35,0 73,3 5,2 2 NP
140PP2017 16,7 34,4 15,0 5 NP NP NP
141PP2017 69,0 70,0 26,5 4 NP NP NP
23,3 26,7 5,8 6 NP
14,9 49,0 11,9 7 NP
142PP2017 76,7 93,3 11,5 4 NP P P
bd 90,0 10,0 8 P
143PP2017 80,0 96,3 6,4 4 NP P P
144PP2017 91,7 100,0 0,0 2 NP P P
147PP2017 50,0 66,7 15,3 5 NP NP NP
149PP2017 90,0 93,3 5,8 5 NP P P
40,0 76,7 15,3 7 NP
bd 100,0 0,0 8 P
151PP2017 93,4 96,3 6,4 4 NP P P
152PP2017 80,0 100,0 0,0 4 NP P P
PL 240 694 Β1
Szczep E. coli Śmiertelność po 5 dniach od zakażenia [%] Śmiertelność zakończenie eksperymentu Odchylenie standardowe ; . Nr eksperymentu Klasyfikacja wg ' pozyskania szczepu Klasyfikacja Wg wyników in ; OVO Ostateczna klasyfikacja
153PP2O17 65,0 100,0 0,0 5 NP P P
154PP2017 100,0 100,0 0,0 5 P P P
90,0 96,7 5,8 7 P
155PP2O16 93,4 100,0 0,0 4 P P P
156PP2O17 100,0 100,0 0,0 5 P P P
157PP2O17 100,0 100,0 0,0 6 P P P
158PP2O17 96,7 100,0 0,0 6 P P P
159PP2O17 100,0 100,0 0,0 4 P P P
B001PP2016 100,0 100,0 0,0 4 P P P
B002PP2016 53,3 93,3 5,8 5 P P P
_ SZCZEPY USUNIĘTE Z ANALIZY
O19PP2O15 40,0 43,3 20,8 6 P NP ? (wysokie SD>20% poszczególnych powtórzeń; SD całościowe =28%)
37,8 75,9 25,1 7 NP
bd 100,0 0,0 8 P
O27PP2O16 52,7 85,5 4,8 7 P P? ? (NP/P)
60,0 70,0 10,0 5 NP
bd 83,0 11,2 8 NP
051PP2016 62,6 75,9 5,3 3 P NP ? (NP/P)
66,7 90,0 10,0 6 P
bd 85,6 17,1 8 P?
074PP2016 72,6 83,3 20,8 3 P NP ? (NP/P)
74,4 100,0 0,0 7 P
121PP2O16 100,0 100,0 0,0 6 NP P ? (NP/P)
51,1 82,5 10,9 7 NP
135PP2O17 56,7 83,3 5,8 4 NP NP ? (NP/P)
90,0 96,3 6,4 6 P
145PP2017 92,6 100,0 0,0 5 NP P USUNIĘTE Z ANALIZY ZE WZGLĘDU NA MOŻLIWOŚĆ ZAMIANY STOCKÓW
146PP2017 93,3 100,0 0,0 5 NP P
57,8 86,3 15,2 7 P
Przykład 3. Dobór genów pozwalających na jednoznaczne określenie patogenności szczepów E. coli.
W celu wytypowania maksymalnie 5 genów wirulencji, które same bądź w połączeniu z oznaczeniem serotypu badanego szczepu będą pozwalały na skuteczne i niezawodne określenie patogenności Escherichia coli u drobiu, przeprowadzono analizę dyskryminacyjną (Linear Discriminant Analysis; LDA).
Analiza pozwoliła stwierdzić iż najlepszymi dyskryminantami w modelu przewidywania patogenności szczepów E. coli są geny związane z metabolizmem żelaza: iroB, iroC, iroD, iroE, iroN, oraz hlyF (hemolysin), bor (prophage lipoprotein) i ompT (protease able to cleave colicin) (Tabela 12; Załącznik 01 - Analiza_LDA_wszystkie_geny). Aby uniknąć sytuacji, w której w modelu przewidywania mamy
PL 240 694 Β1 do czynienia z genami jednej rodziny, do modelu predykcyjnego wybrano geny: iroC, hlyF, ompT, bor oraz serotyp 078.
Ostatecznie w celu zapewnienia wysokiej skuteczności przewidywania przez algorytm patogenności szczepów w każdej populacji przy jednoczesnym utrzymaniu łatwości oznaczenia, w oparciu o wyniki wykonanych badań i analiz zdecydowano o wyborze do testu dwóch genów (iroC, hlyF) oraz serotypu 078.
Przykład 4. Opracowanie testu diagnostycznego.
Prcjektowanie
Bazując na przeprowadzonej analizie patogenności, zaprojektowano nowy test diagnostyczny opierający się na reakcji POR typu multipleks w celu analizy obecności wybranych genów odpowiedzialnych za wirulencję. W Tabeli 15 zaprezentowano sekwencje oryginalnych starterów służących do amplifikacji wybranych genów.
Ostateczny test na określenie patogenności szczepów E. coli izolowanych u drobiu wygląda następująco: próbki DNA pochodzące ze szczepów E. coli poddawane są reakcji POR typu multipleks w celu amplifikacji 2 genów wirulencji (iroC, hlyF) oraz genu odpowiedzialnego za serotyp 078. Następnie, weryfikowana jest obecność tych genów w próbkach poprzez rozdział elektroforetyczny, a szczep przyporządkowywany jest do odpowiedniej grupy określającej patogenność, tj. do szczepów patogennych (P) - w przypadku obecności dowolnego z trzech genów lub do szczepów niepatogennych (NP) - w przypadku braku obecności któregokolwiek z ww. genów.
Tabela 12. Startery wykorzystane w teście diagnostycznym
Etap testu Nazwa Sekwencja 5'-^ 3' Spodziewana wielkość produktu (bp)
I etap iroC-F (Sekw. Nr Id. 1) ACTATGTGCGCCGTGGTTAT 732
iroC-R(Sekw. Nr Id. 2) GTGAACGGGTGTCGATCAGT
hlyF-F (Sekw. Nr Id. 3) GAGCACCTACTCCACAAGCG 458
hlyF-A-R (Sekw. Nr Id. 4) TCGGG CAACCAACAAAG GTA
II etap 078-A-F (Sekw. Nr Id. 5) CACAACTCTCG GCAATATATCATCA 994
O78-A-R (Sekw. Nr Id. 6) TATGGGTTTGGTGGTACGTAGT
Weryfikacja
Zaprojektowany test diagnostyczny w postaci PCR multipleks wykonano na wszystkich szczepach z kolekcji, przyporządkowując szczepy do odpowiednich grup patogenności P lub NP. Otrzymane wyniki porównano z wynikami analiz bioinformatycznych. Podsumowanie uzyskanych wyników przedstawiono w Tabeli 13. Stwierdzono, że obie analizy są ze sobą zgodne, tj. przyporządkowują szczepy do odpowiednich grup patogenności w identyczny sposób.
PL 240 694 Β1
Tabela 13. Wyniki testu multipleks PCR
NR SZCZEPU E. coli Produkty i ich wielkości po reakcji multipleks PCR Patogenność szczepów Escherichia coli (N- szczep niepatogenny; P-szczep patogenny)
iroC (732 bp) hlyF (824 bp) 078 (992 bp) Grupa patogenności SEROTYP Uwagi
001PP2015 — NP
002PP2015 + + — P
004PP2015 + — P —
005PP2015 + 4- — P _
007PP2015 _ NP
009PP2015 + + 4- P 078
011PP2015 _ _ NP _
012PP2015 + + P _
014PP2015 + 4- 4- P 078
015PP2015 + + — P _
016PP2015 4- 4- 4- P 078
017PP2015 + 4- — P _
018PP2015 + 4- _ P _
019PP2015 + 4- 4- P 078
020PP2016 + + — P _
021PP2016 + 4- — P —
022PP2016 + + 4- P 078
023PP2016 + + — P _
024PP2016 4- + — P _
027PP2016 + 4- — P —
028PP2C16 + 4- — P _
029PP2016 4- + — P
030PP2016 4- 4- — P _
031PP2016 + 4- 4- P —
032PP2016 — NP _
033PP2016 + 4- — P _
034PP2C16 4- 4- — P —
035PP2C16 4- 4- 4- P 078
036PP2016 4- + — P —
PL 240 694 Β1
037PP2016 + 4- — P —
038PP2016 + 4- — P —
039ΡΡ2Π16 + 4- + P 078
040PP2016 + 4- + P 078
041PP2016 + 4- P 078
043PP2016 + 4- P 078
044PP2016 + 4- + P 078
045PP2016 + 4- — P —
046PP2016 + + — P —
047PP2016 — NP _
048PP2016 — — — NP —
049PP2016 — NP _
050PP2016 + 4- — P —
051PP2016 — — — NP —
052PP2016 — NP _
053PP2016 + 4- — P _
054PP2016 + 4- — P _
057PP2016 + 4- — P _
059PP2016 + + — P —
062PP2016 + 4- — P _
063PP2016 + 4- — P —
065PP2016 — NP _
066PP2016 + 4- — P —
067PP2016 + + — P _
069PP2016 + 4- — P _
070PP2016 + + — P _
073PP2016 + 4- — P _
074PP2016 + 4- - P —
075PP2016 + + — P —
076PP2016 + + 4- P 078
077PP2016 + 4- — P _
078PP2016 + 4- — P _
079PP2016 + 4- — P —
PL 240 694 Β1
080PP2016 + 4- — Ρ _
081PP2016 + + — Ρ —
082PP2016 — — — ΝΡ —
083PP2016 + 4- + Ρ 078
084PP2016 + 4- Ρ _
085PP2016 + 4- — Ρ —
086PP2016 + 4- — Ρ _
087PP2016 + 4- + Ρ 078
088PP2016 + 4- + Ρ 078
089PP2016 + 4- — Ρ —
β_001ΡΡ2016 + + — Ρ —
β_002ΡΡ2016 + + — Ρ _
105ΡΡ2016 + 4- — Ρ —
106ΡΡ2016 + + — Ρ —
107ΡΡ2016 + 4- — Ρ —
108ΡΡ2016 — — — ΝΡ —
110ΡΡ2016 + 4- — Ρ _
113ΡΡ2016 + 4- — Ρ _
114ΡΡ2016 + 4- — Ρ —
120ΡΡ2016 — 4- — Ρ —
121ΡΡ2016 + 4- — Ρ —
123ΡΡ2016 + + — Ρ —
124ΡΡ2016 + 4- — Ρ —
126ΡΡ2016 4- — Ρ _
127ΡΡ2016 — 4- — Ρ —
130ΡΡ2017 + 4- — Ρ —
131ΡΡ2017 + 4- — Ρ _
134ΡΡ2017 + 4- Ρ _
135ΡΡ2017 + 4- — Ρ —
137ΡΡ2017 — ΝΡ _
138ΡΡ2017 — ΝΡ —
139ΡΡ2017 — ΝΡ _
140ΡΡ2017 — — — ΝΡ —
PL 240 694 Β1
141PP2017 + + — P _
142PP2017 + + — P
143PP2017 + + — P
144PP2017 + P 078
147PP2017 — — — NP —
149PP2017 _ _ — NP
151PP2017 _ _ + P 078
152PP2017 - _ + P 078
153PP2017 + + — P _
154PP2017 4- + — P _
155PP2017 + + — P _
156PP2017 + + P 078
157PP2017 + + — P
158PP2017 + + + P 078
159PP2017 + + — P
K12 — — — NP —
Ocena skuteczności testu
Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń wykazano wysoką skuteczność metody diagnostycznej identyfikującej szczepy E. coli jako patogenne dla drobiu (APEC) - test pozwala ocenić szczep jako patogenny lub niepatogenny z dokładnością, odpowiednio do 97,7% oraz 94,1%.
Literatura
Antao, EM., Ganwu, L., Wieler, L., Preisinger, R., Ewers, C. Identification and characterization of a novel avian pathogenic E. coli (APEC) fimbrial adhesion. EP2298798B1.
Barbieri, N. L., de Oliveira, A. L., Tejkowski, T. M., Pavanelo, D. B., Rocha, D. A., Matter, L. B., ... Horn, F. (2013). Genotypes and pathogenicity of cellulitis isolates reveal traits that modulate APEC virulence. PloS one, 8(8), e72322. doi:10.1371/journal.pone.0072322.
Barnes, H.J., Nolan, L.K., Vaillancourt, JP. (2008). Colibacillosis in Diseases of Poultry, 12th Edition, Blackwell Publishing.
Dissanayake, DR., Octavia, S., Lan, R. (2014). Population structure and virulence contentof avian pathogenic Escherichia coli isolated from outbreaks in Sri Lanka. Veterinary Microbiology 168, 403412; doi: 10.1016/j.vetmic.2013.11.028.
Dziva, F., Stevens, MP. (2008). Colibacillosis in poultry: unravelling the molecular basis of virulence of avian pathogenic Escherichia coli in their natural hosts. Avian Pathol. 2008 Aug; 37(4):355-66. doi: 10.1080/03079450802216652.
Dziva, F., Hauser, H., Connor, T. R., van Diemen, P. M., Prescott, G., Langridge, G. C., ... Stevens, Μ. P. (2013). Sequencing and functional annotation of avian pathogenic Escherichia coli serogroup 078 strains reveal the evolution of E. coli lineages pathogenic for poultry via distinct mechanisms. Infection and immunity, 81(3), 838-849. doi: 10.1128/IAI.00585-12.
Ewers, C., Janssen, T., Kiessling, S., Philipp, H.C., Wieler, L.H. (2005). Rapid detection of virulence-associated genes in avian pathogenic Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction. Avian Dis. Jun; 49(2): 269-73. doi: 10.1637/7293-102604R.
PL 240 694 B1
Ewers, C., Antao, E. M., Diehl, I., Philipp, H. C., & Wieler, L. H. (2008). Intestine and environment of the chicken as reservoirs for extraintestinal pathogenic Escherichia coli strains with zoonotic potential. Applied and environmental microbiology, 75(1), 184-192. doi:10.1128/AEM.01324-08.
Guabiraba, R., Schouler, C. (2015). Avian colibacillosis: still many black holes. FEMS Microbiology Letters, 362, fnv118; doi:10.1093/femsle/fnv118.
Huja, S., Oren, Y., Trost, E., Brzuszkiewicz, E., Biran, D., Blom, J.,... Dobrindt, U. (2015). Genomic avenue to avian colisepticemia. mBio, 6(1), e01681-14. doi:10.1128/mBio.01681-14.
Hussein, AH., Ghanem, IA., Eid, AA., Ali, MA., Sherwood, JS., U, G., Nolan, LK., Logue, CM. (2013). Molecular and phenotypic characterization of Escherichia coli isolated from broiler chicken flocks in Egypt. Avian Dis. 57(3): 602-11. doi:10.1637/10503-012513-Reg.1.
Iguchi, A., lyoda, S., Seto, K., Morita-lshihara, T., Scheutz, F., Ohnishi, M., & Pathogenic E. coli Working Group in Japan (2015). Escherichia coli O-Genotyping PCR: a Comprehensive and Practical Platform for Molecular O Serogrouping. Journal of clinical microbiology, 53(8), 2427-2432.
doi:10.1128/JCM.00321-15.
Janβen, T., Dr Hans, C. P., Voss, M., Preisinger, R., Lotha,r H., Wieler, L. (2003). Multiplex PCR is the first technique to allow the specific and sensitive detection of avian pathogenic Escherichia coli (APEC). LOHMANN Information, 28/2003, 1-5.
Joensen, K. G., Tetzschner, A.M., Iguchi, A., Aarestrup, F.M. and Scheutz, F. (2015). Rapid and easy in silico serotyping of Escherichia coli using whole genome sequencing (WGS) data. J.Clin.Microbiol. 53(8):2410-2426. doi:JCM.00008-15 [pii];10.1128/JCM.00008-15 [doi].
Johnson, T. J., Wannemuehler, Y., Doetkott, C., Johnson, S. J., Rosenberger, S. C., & Nolan, L. K. (2008). Identification of minimal predictors of avian pathogenic Escherichia coli virulence for use as a rapid diagnostic tool. Journal of clinical microbiology, 46(12), 3987-3996. doi:10.1128/JCM.00816-08.
J0rgensen, S. L., Kudirkiene, E., Li, L., Christensen, J. P., Olsen, J. E., Nolan, L., & Olsen, R. H. (2017). Chromosomal features of Escherichia coli serotype O2:K2, an avian pathogenic E. coli. Standards in genomic sciences, 12, 33. doi:10.1186/s40793-017-0245-3.
Krawczyk, B., Samet, A., Leibner, J., Sledzińska, A., & Kur, J. (2006). Evaluation of a PCR melting profile technique for bacterial strain differentiation. Journal of clinical microbiology, 44(7), 2327-2332. doi:10.1128/JCM.00052-06.
Lee, SY., Yoo, SM., Chang, KH., Yoo, SY., Yo, NCh., Yoo, WM., Keum, KCh., Kim, JM., Lee, G. Nucleic acid probes for detection of non-viral organisms. US 2007/0065817 A1.
Lee, SY., Yoo, SM., Shin, SY., Keum, KCh., Yoo, NCh., Yoo, WM., Kim, JM., Choi, JY. DNA chip for detection of Escherichia coli. WO2008/084888 A.
Lindstedt, B. A., Finton, M. D., Porcellato, D., & Brandal, L. T. (2018). High frequency of hybrid Escherichia coli strains with combined Intestinal Pathogenic Escherichia coli (IPEC) and Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli (ExPEC) virulence factors isolated from human faecal samples. BMC infectious diseases, 18(1), 544. doi:10.1186/s12879-018-3449-2.
Lutful Kabir S. M. (2010). Avian colibacillosis and salmonellosis: a closer look at epidemiology, pathogenesis, diagnosis, control and public health concerns. International journal of environmental research and public health, 7(1), 89-114. doi:10.3390/ijerph7010089.
Mellata M. (2013). Human and avian extraintestinal pathogenic Escherichia coli: infections, zoonotic risks, and antibiotic resistance trends. Foodborne pathogens and disease, 10(11), 916-932. doi:10.1089/fpd.2013.1533.
Paixao, AC., Ferreira, AC., Fontes, M., Themudo, P., Albuquerque, T., Soares, MC., Fevereiro, M., Martins, L, Correa de Sa, Ml. (2016). Detection of virulence-associated genes in pathogenic and commensal avian Escherichia coli isolates. Poultry Science 95:1646-1652. doi:10.3382/ps/pew087.
Roussan, D.A., Zakaria, H., Khawaldeh, G., Shaheen, I. (2014). Differentiation of avian pathogenic Escherichia coli strains from broiler chickens by multiplex polymerase chain reaction (PCR) and random amplified polymorphic DNA (RAPD) Open J. Vet. Med. 4: 211-219. doi:10.4236/ojvm.2014.410025.
Sarowska, J., Futoma-Koloch, B., Jama-Kmiecik, A., Frej-Madrzak, M., Ksiazczyk, M., Bugla-Ploskonska, G., & Choroszy-Krol, I. (2019). Virulence factors, prevalence and potential transmission of extraintestinal pathogenic Escherichia coli isolated from different sources: recent reports. Gut pathogens, 11, 10. doi:10.1186/s13099-019-0290-0.
PL 240 694 B1
Schouler, C., Schaeffer, B., Bree, A., Mora, A., Dahbi, G., Biet, F., ... Moulin-Schouleur, M. (2012). Diagnostic strategy for identifying avian pathogenic Escherichia coli based on four patterns of virulence genes. Journal of clinical microbiology, 50(5), 1673-1678. doi:10.1128/JCM.05057-11.
Silveira, F., Maluta, RP., Tiba, MR., de Paiva, JB., Guastalli, EA., da Silveira, WD. (2016). Comparison between avian pathogenic (APEC) and avian faecal (AFEC) Escherichia coli isolated from different regions in Brazil. The Veterinary Journal 217, 65-67; doi: 10.1016/j.tvjl.2016.06.007.
Skyberg, JA., Horne, SM., Giddings, CW., Wooley, RE., Gibbs, PS., Nolan, LK. (2003). Characterizing avian Escherichia coli isolates with multiplex polymerase chain reaction. Avian Dis. Oct-Dec; 47(4): 1441-7. doi:10.1637/7030.
Sokurenko, E., Johnson, J.R., Weissman, S., Tchesnokova, V. High-Resolution Clonal Typing of Escherichia coli. US 2014/0193824 A1.
Stromberg, Z. R., Johnson, J. R., Fairbrother, J. M., Kilbourne, J., Van Goor, A., Curtiss, R., Rd, & Mellata, M. (2017). Evaluation of Escherichia coli isolates from healthy chickens to determine their potential risk to poultry and human health. PloS one, 12(7), e0180599. doi:10.1371/journal.pone.0180599.
Subedi, M., Luitel, H., Devkota, B., Bhattarai, R. K., Phuyal, S., Panthi, P., ... Chaudhary, D. K. (2018). Antibiotic resistance pattern and virulence genes content in avian pathogenic Escherichia coli (APEC) from broiler chickens in Chitwan, Nepal. BMC veterinary research, 14(1), 113.
doi:10.1186/s12917-018-1442-z.
van der Westhuizen, WA., Bragg, RR. (2012). Multiplex polymerase chain reaction for screening avian pathogenic Escherichia coli for virulence genes. Avian Pathol. 41(1): 33-40.
doi:10.1080/03079457.2011.631982.
Weigel, LM., Tenover, FC. Oligonucleotide probes for detecting Enterobacteraceae and quinolone-resistant Enterobacteraceae. US 2008/0199877 A1.
PL 240 694 Β1
SEQUENCE LISTING < 11Θ> Proteon Pharmaceuticals S.A.
< 120> Sposób i zestaw do wykrywania pozajelitowych szczepów E. coli patogennych dla drobiu < 130> PK/7222/RW < 160> 9 < 170> Patentln version 3.5 < 210> 1 < 211> 20 < 212> DNA < 213> artificial <220>
< 223> primer < 400> 1 actatgtgcg ccgtggttat 20 < 210> 2 < 211> 20 < 212> DNA < 213> artificial <220>
< 223> primer < 400> 2 gtgaacgggt gtcgatcagt < 210> 3 < 211> 20 < 212> DNA < 213> artificial <220>
< 223> primer < 400> 3 gagcacctac tccacaagcg
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
PL 240 694 Β1 <220>
< 223> primer < 400> 4 tcgggcaacc aacaaaggta < 210> 5 < 211> 25 < 212> DNA < 213> artificial <220>
< 223> primer < 400> 5 cacaactctc ggcaatatat calca <210> 6 <211> 22 < 212> DNA < 213> artificial <220>
< 223> primer < 400> 6 tatgggtttg gtggtacgta gt <210> 7 <211> 3786 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7
atgataatca tatgccagca cccatccagg agtcatgcat ccataacaat gcgggaccgg 60
agcgtgctgg cttttttgcg gaacgatccg gccagtggat cgtatttta c agacggagga 120
ggcttaatgc ctgcgaatca cactcccaca ccggctcagt catggatagt tcgcctggcg 180
cgcgtgtgct gggaacgtaa gaaacttagt gtcatcgtgg tggtagcgtc agtatcgact 240
attttgctgg ctgcgctgac gccactgctg acaagacagg ctgtgaatga cgcactggcg 300
ggcaatccgg cccgcctgcc gtggctggcc tgcgggttac tgttgatcgc tttttttgat 360
ttcatcggta actatgtgcg ccgtggttat gccgggatgc tctcactctg ggtgcagcat 420
accctcagag gacgggtatt cgacagtatt cagaaacttg acggcgcagg ccaggatgcg 480
ctgcgcaccg ggcaggtgat ttcacggacc aacagcgatc tgcagcaggt gcataccctg 540
PL 240 694 Β1
ctgcagatgt gcccggtgcc gctggcagtg ttcacttatt acattgccgg cattgccgtg 600
atgctgtgga tgtcccctgc catgacgctt atcgtcgtgt gcgtactggt atgcctggcg 660
atcaccgcgc ttcgtgcgcg tcgtagggtc ttcgcgcaaa ccgggctggc ctcggaccaa 720
ctggcgaatc tcaccgaaca tatacgcgag gtgctggcac agatctcagt ggtaaaatcc 780
tgtgtggcag agatgcgtga aacgcactgg ctcgataggc agtcgcggca gattgtgcgt 840
gtacgcatcg gtgcggttat ctcgcaggcg atgcctgggg ccaccatgct ggcgctaccg 900
gtgctcgggc aaatcgtcct gctgtgctac ggcgggtggt cggtcatgca cgggcggatc 960
gatctcggta ccttcgttgc attcgccagc ttcctcgcga tgctgaccgg gccaacccgc 1020
gtactggcat cgtttctggt tatcgcacag cgcactcagg cgtccgtgga gcgggtgttt 1080
gcactgatcg acacccgttc acagatggag gacgggacgg agtcgattaa cagtcaggtt 1140
gtcggactgg aactggagaa tatgagcttt gactaccacc atggcgacag acatatcctc 1200
agcaatatct ccttttccct gcgcgccggt gaaaccgtgg cggtggtggg cgcatcgggt 1260
tcaggaaaat cgaccctgtt gatgctactg gcgcgttttt atgatccctg ctccggaaag 1320
atatggctca acaccagcga aggccgacaa aatcttcgcg atatcagact ggaggcgctt 1380
cgtcgccggg taggcatcgt atttgaagat gcttttctgt ttgccggtac ggtggcggaa 1440
aatatcgcct atggccaccc tcaggcaacg gcggacgaca ttcgccgtgc ggcagctgct 1500
gcaggagcca gcgattttat taacgccctg ccgaaaggct tcgatagcct gttaaccgaa 1560
cggggtacga atctttccgg cgggcagagg cagcgaatag cgctggcgcg ggcgctcatt 1620
actgcaccgg acgtgttaat cctggatgat actacctcag cggttgatgc tgttacggaa 1680
gcggagatta ataccgcgct gggtcgctat gctgacgaag ggcatatgct gctggtgatt 1740
gcccgacggc gttcaacact tcagctagcc agccgggttg tggtgctgga taagggccgt 1800
atggtggata ccggaacccc ggcagaactt gaagcgcgct gtccggcgtt ccgcgcactg 1860
atgaccggcg acagcgattt tctggccacg tcccacaata gccacaacga attgtggccg 1920
gctgaaccag cgacacaaga cgatgtaacg gatacggggg ataaaggttt tgtcgcccgt 1980
atgacccgcg taccggaaaa tgcagtacag caggcgctgg ccggtaaagg tcgcaaagtc 2040
acgtcactac tgaagcctgt ggcgtggatg ttcgtcatcg ccgctctgct gatcgcactc 2100
gattctgcgg caggcgtagg ggtactgata ctgttgcagc acggcattga ctccggtgtc 2160
PL 240 694 Β1
gccgcaggcg atatgtcgat catcggcctc tgtgccctgc tcgccctgtg cctggtcatt 2220
gtgggctggt gcagttattc tctgcagacg gtcttcgccg ccagagcggc ggaatcagtt 2280
cagcattcgg tgcgcttgcg cagcttcggc catatgctgc gtcttggact cccctggcat 2340
gaaaagcatg ccgattcgcg tcttacccgc atgaccgttg atgtggactc tctcgcccgc 2400
tttctgcaaa acggccttgc cggtgcggcc accagtctgg tgacgatgtt cgcaatcgcc 2460
gccaccatgt tctggctcga cccgttcctg gcgctgacgg cattaagcgc agtgccagtg 2520
gccgcactgg caaccatgat ttatcgccgc ctcagtaccc ctgcttatgc acaggcacgg 2580
ctggaaatag gcaaagtcaa cagcaccctg caggaaaaag tctctggcct gcgtgtcgtg 2640
caatcgcatg gtcagcagga actggagggc gcccggctgc gcgcgttatc ggagcgtttc 27Θ0
cgcgcaaccc gtgtgcgagc acaaaaatac cttgcagtct attttccgtt cctgacattc 2760
tgcaccgagg cctcctatgc cgctgttctg ttagtgggag cttcgcaggt cgccgctgga 2820
gaaatgactg ccggggtact ggcggctttc ttcctgttgc tggggcaatt ctatgggcca 2880
gtgcagcagt tatcagggat tgtcgacgcc tggcagcagg cgacagccag cggcaaacat 2940
attgatgaac tactggcgac agaaggcact gagaacctcg ggtcctcttc ggtcctccct 3000
gtcaccggtg cactgcatct tgatgaggtc acgttcagtt atcccgacag tcacgagcca 3060
gctctgaaca aacttaccct gacgatccct gagggaatgg ttgtcgcggt cgtcggtcgc 3120
agcggtgcgg gtaagtcgac gctgattaag ctgattgccg ggttgtattt ccccacgcac 3180
ggcaacatca gaatcggtgt gcaaatgctc gatgatgcct cgctcactga gtatcgtcgc 3240
cagattgggc ttgtcgatca ggatgtagca ctgtttagta gtgatattgc agaaaacatt 3300
cgttattcac ggccatccgc caccaatgaa gacgttgaaa ttgcctcaca gcgggcaggg 3360
ctgtatgaga tggtgtgcaa tctgccgcag ggattccgga caccggtgaa taacggcgga 3420
gccgatctgc ccgcaggtca gcgccagttg attgcgctgg cccgcgcgca actggcgaat 3480
gcccacatcc tgctgctcga cgaagccacg tcatgtctgg atcgcacatc cgaagaacga 3540
ctgatgtcat cgttaacaga tgtcgtgcat gccgggaagc actcggcgct gattgttgca 3600
catcgtctga ccaccgcgca acgctgcgat ctgattgccg ttattgataa ggggttactt 3660
gcggaatacg gaacccacga acagctgtta tctgcgggcg gcctctatac ccgcttatgg 3720
catgacagcg tcagcagtac tgctctccat cgccagcaca acatgaagga ggaaaccccg 3780
PL 240 694 Β1 ggatag
3786 <210> 8 <211> 1110 < 212> DNA < 213> Escherichia coli < 400> 8 atgaaattat tattacttac aggtgcaaca ggatttcttg gtggcgcggt cctggataag60 ctgctggata actgtaataa tataaatttg ctacttttag tacgagcacc tactccacaa120 gcgggactgg aaagaattaa agaaaatatg cgtaaattta atgtttgtga ggaaaggttg180 catgcattaa ctaatgataa catcttgcct ggggatctaa ataatccgga agcctttctc240 atggatcctc gtcttgatga agtcactcat gttataaact gtgcggctat agcttctttt300 ggtaataatc cttttatatg gaatgtgaat gttacaggta cacttgcttt tgcaagaaga360 atggcaaaag tggcaggact gaaacgcttc cttcatgttg gtactgctat gtcttgtaca420 cctcatacgg ggtcgctagt taaggaagag tctgcttcat cagaaacagg tgaacattta480 gtggagtata cgcattcaaa agcaacaata gaatatctga tgcgtaagca gtgtcctgat540 ttacctttgt tggttgcccg accatcaatt attgttggcc acagtcgttt agggtgctta600 ccttcaacca gtattttctg ggtattcaga atggggttaa tgttgcaaaa atttatgtgc660 tctctggatg ataaaataga tgttatccct gtagattatt gtgctgatgc attgctaatg720 ttgcttgaaa gctcgttaat taatggtgag attgttcata tatcagcagg taaagaaagt780 agtgtgacgt tctctgctat tgacgaagct gtagcccgtg ctttgaactg tgatcctgtt840 ggagacagat atactaaagt cagttatgac atactggcaa tgagccgtca tgattttaaa900 aatatttttg gtccctgtaa cgaacgcctt atgttaaaag ccattcgttt atatggagcg960 ttcagtatgc tcaatgtttg tttcagtaac gacaagctac tgagtatcgg aatgcctaaa1020 ccgccaaagt ttactgatta tattaaatac tgtatagaaa cgacaaaaca cctttcaatt1080 caacaacaaa tggaagttga ttttaaataa1110 < 210> 9 < 211> 1000 < 212> DNA < 213> Escherichia coli
PL 240 694 Β1 <400> 9 agaatcacaa ctctcggcaa tatatcatca ttttgaaaat ataaccccat aaaaataaga60 gtcaacataa accaaaagtg caccattaat cttttaatat aattaacttt atctaatcca120 attttattta taacacgttt agggttataa ataaagcatg taaagaattg agatataatg180 atactataca tcaaaccctc agcattgtaa tgaggtatta aaaaacatga cagaattaaa240 accataactg ctgatataat actttgccta tgaaaatcgt aaataccaat ggcagtgcca300 attgaggtta gaataacctg acatgtttca atatagaata taataattat tgctactata360 taatagtagg atattacatc tattttcccc ttaagaatat actccgcaac aggaatacct420 aacaatgcca caaaagaagt agaaataaca gatataagca cactgatatc taatagttta480 agtgtgagag ggataacatc aacaccatca tggaaacgct ttgagagcgt aggcatcaaa540 taacttgcaa ccaaaataat tatcaaatta taaacattaa atatttgcaa aaagaaacca600 tatataatag tagaactaga actgctttct gaaccaaata ttttcaaata atatatagac660 aatgtataga tgaaaattgc aggaaaaaca gtaaaaaaaa gcttaaggtt atacttgaat720 ggtagatgga atgatttttc gctcctgttg acagacttct tatgcttaag gagtaaaaat780 gacaaagaat atattaagca gaatagtgag ctcaaaaacc atacaagagt taaatcatac840 aaatcaatgt ttttatcaga atgataaaac aagaaaagga aagcagttgg cataattatg900 gcgtacagaa atcgataaac tttatcgata ataatatttt gttttgcata tacacatgca960 ttaataatat tcgatatact acgtaccacc aaacccatac1000

Claims (12)

1. Sposób identyfikacji szczepu E. coli patogennego dla ptaków (APEC), znamienny tym, że:
a) z badanej próbki materiału biologicznego izoluje się DNA,
b) w próbce wyizolowanego DNA bada się obecność: genów wirulencji iroC i hlyF oraz genu odpowiedzialnego za serotyp 078, przy czym stwierdzenie obecności co najmniej jednego genu spośród wspomnianych genów wirulencji lub genu odpowiedzialnego za serotyp 078 świadczy o zidentyfikowaniu w badanej próbce szczepu E. coli patogennego dla ptaków (APEC) z dokładnością wynoszącą do 97,7%.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) badaną próbką jest próbka tkanki chorego ptaka lub próbka środowiskowa.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) próbka wyizolowanego DNA zawiera genomowy DNA bakteryjny, zwłaszcza DNA E. coli.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) obecność wspomnianych genów bada techniką PCR.
PL 240 694 B1
5. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że w etapie b) stosuje metodę PCR typu multiplex oraz zestaw primerów przedstawionych jako Sekw. Nr Id. 1-6, przy czym:
- o obecności genu wirulencji iroC świadczy obecność produktu o długości 732 pz,
- o obecności genu wirulencji hlyF świadczy obecność produktu o długości 458 pz, natomiast
- o obecności genu antygenu odpowiedzialnego za serotyp O78 świadczy obecność produktu o długości 994 pz.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że zidentyfikowanie szczepu APEC oznacza stwierdzenie kolibakteriozy u chorego ptaka, zwłaszcza drobiu hodowlanego, korzystnie kury.
7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że niewykrycie żadnego spośród wspomnianych genów świadczy o zakażeniu szczepem niepatogennym.
8. Zestaw do identyfikacji szczepu E. coli patogennego dla ptaków (APEC), znamienny tym, że zawiera:
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu wirulencji iroC przedstawionego na Sekw. Nr Id. 7,
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu wirulencji hlyF przedstawionego na Sekw. Nr Id. 8,
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu antygenu odpowiedzialnego za serotyp O78 przedstawionego na Sekw. Nr Id. 9, przy czym stwierdzenie obecności co najmniej jednego genu spośród wspomnianych genów wirulencji lub genu odpowiedzialnego za serotyp O78 świadczy o zidentyfikowaniu w badanej próbce szczepu E. coli patogennego dla ptaków (APEC) z dokładnością wynoszącą do 97,7%.
9. Zestaw według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera oligonukleotydy o sekwencjach przedstawionych jako Sekw. Nr Id. 1-6.
10. Zestaw według zastrz. 8, znamienny tym, że jest przeznaczony do diagnozowania kolibakteriozy u ptaków, zwłaszcza drobiu hodowlanego, korzystnie kur.
11. Zastosowanie zestawu zawierającego:
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu wirulencji iroC przedstawionego na Sekw. Nr Id. 7,
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu wirulencji hlyF przedstawionego na Sekw. Nr Id. 8,
- oligonukleotyd zawierający co najmniej 20 kolejnych nukleotydów należących do genu antygenu odpowiedzialnego za serotyp O78 przedstawionego na Sekw. Nr Id. 9, do określania stopnia patogenności szczepu E. coli dla ptaków.
12. Zastosowanie zestawu według zastrz. 11, znamienne tym, że zestaw zawiera oligonukleotydy o sekwencjach przedstawionych jako Sekw. Nr Id. 1-6.
PL431942A 2019-11-26 2019-11-26 Sposób i zestaw do identyfikacji szczepu E.coli patogennego dla ptaków PL240694B1 (pl)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL431942A PL240694B1 (pl) 2019-11-26 2019-11-26 Sposób i zestaw do identyfikacji szczepu E.coli patogennego dla ptaków
BR112022010224A BR112022010224A2 (pt) 2019-11-26 2020-11-26 Método e sistema para detecção de cepas extraintestinais de e. coli patogênicas para aves de capoeira
US17/779,351 US20230287518A1 (en) 2019-11-26 2020-11-26 Method and system for detection of extraintestinal e. coli strains pathogenic to poultry
EP20845245.8A EP4065733B1 (en) 2019-11-26 2020-11-26 Method and kit for detection of extraintestinal e. coli strains pathogenic to poultry
CA3163082A CA3163082A1 (en) 2019-11-26 2020-11-26 Method and system for detection of extraintestinal e. coli strains pathogenic to poultry
PCT/PL2020/050089 WO2021107795A1 (en) 2019-11-26 2020-11-26 Method and system for detection of extraintestinal e. coli strains pathogenic to poultry
MX2022006380A MX2022006380A (es) 2019-11-26 2020-11-26 Método y sistema para la detección de cepas extraintestinales de e. coli patógenas para aves de corral.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL431942A PL240694B1 (pl) 2019-11-26 2019-11-26 Sposób i zestaw do identyfikacji szczepu E.coli patogennego dla ptaków

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL431942A1 PL431942A1 (pl) 2021-05-31
PL240694B1 true PL240694B1 (pl) 2022-05-23

Family

ID=74195095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL431942A PL240694B1 (pl) 2019-11-26 2019-11-26 Sposób i zestaw do identyfikacji szczepu E.coli patogennego dla ptaków

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230287518A1 (pl)
EP (1) EP4065733B1 (pl)
BR (1) BR112022010224A2 (pl)
CA (1) CA3163082A1 (pl)
MX (1) MX2022006380A (pl)
PL (1) PL240694B1 (pl)
WO (1) WO2021107795A1 (pl)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020102546A1 (en) * 1998-02-12 2002-08-01 Nolan Lisa K. Nucleic acid encoding an avian E.coli iss polypeptide and methods of use
US6706475B1 (en) 1998-04-01 2004-03-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligonucleotide probes for detecting Enterobacteriaceae and quinolone-resistant Enterobacteriaceae
US20070065817A1 (en) 2002-05-09 2007-03-22 Sang-Yup Lee Nucleic acid probes for detection of non-viral organisms
JP2010515451A (ja) 2007-01-08 2010-05-13 メディジーンズ カンパニー リミテッド 大腸菌検出用ｄｎａチップ
EP2298798B1 (en) 2009-09-10 2012-05-09 Freie Universität Berlin Identification and characterization of a novel avian pathogenic E. coli (APEC) fimbrial adhesin
US20140193824A1 (en) 2013-01-04 2014-07-10 Evgeni V. SOKURENKO High-Resolution Clonal Typing of Escherichia coli

Also Published As

Publication number Publication date
EP4065733B1 (en) 2024-05-01
WO2021107795A1 (en) 2021-06-03
PL431942A1 (pl) 2021-05-31
US20230287518A1 (en) 2023-09-14
EP4065733A1 (en) 2022-10-05
MX2022006380A (es) 2022-08-10
CA3163082A1 (en) 2021-06-03
BR112022010224A2 (pt) 2022-10-25
EP4065733C0 (en) 2024-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Müller et al. Distribution of virulence factors in ESBL-producing Escherichia coli isolated from the environment, livestock, food and humans
Ewers et al. Molecular epidemiology of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) isolated from colisepticemia in poultry
Massacci et al. Characterization of Pasteurella multocida involved in rabbit infections
Moulin-Schouleur et al. Extraintestinal pathogenic Escherichia coli strains of avian and human origin: link between phylogenetic relationships and common virulence patterns
Ewers et al. Avian pathogenic, uropathogenic, and newborn meningitis-causing Escherichia coli: how closely related are they?
Gripp et al. Closely related Campylobacter jejuni strains from different sources reveal a generalist rather than a specialist lifestyle
Obeng et al. Antibiotic resistance, phylogenetic grouping and virulence potential of Escherichia coli isolated from the faeces of intensively farmed and free range poultry
Azam et al. Genomic landscape of multi-drug resistant avian pathogenic Escherichia coli recovered from broilers
Michelacci et al. A new pathogenicity island carrying an allelic variant of the Subtilase cytotoxin is common among Shiga toxin producing Escherichia coli of human and ovine origin
de Oliveira et al. Prevalence of ColV plasmid-linked genes and in vivo pathogenicity of avian strains of Escherichia coli
Newman et al. Characterizing avian pathogenic Escherichia coli (APEC) from colibacillosis cases, 2018
Radwan et al. Molecular characterization of antimicrobial-resistant Escherichia coli isolated from broiler chickens
Chen et al. Whole genome sequencing analysis of avian pathogenic Escherichia coli from China
Maurischat et al. Rapid real-time PCR methods to distinguish Salmonella Enteritidis wildtype field isolates from vaccine strains Salmovac SE/Gallivac SE and AviPro SALMONELLA VAC E
Rehman et al. Virulence genotype and phenotype of multiple antimicrobial-resistant Escherichia coli isolates from broilers assessed from a “One-Health” perspective
Roussan et al. Differentiation of avian pathogenic Escherichia coli strains from broiler chickens by multiplex polymerase chain reaction (PCR) and random amplified polymorphic (RAPD) DNA
Toboldt et al. Molecular epidemiology of Salmonella enterica serovar Kottbus isolated in Germany from humans, food and animals
PL240694B1 (pl) Sposób i zestaw do identyfikacji szczepu E.coli patogennego dla ptaków
Sedeek et al. Molecular epidemiology and sequencing of avian pathogenic Escherichia coli APEC in Egypt
Kariyawasam et al. Unique DNA sequences of avian pathogenic Escherichia coli isolates as determined by genomic suppression subtractive hybridization
Roseliza et al. Phylogenetic grouping and virulence gene profiles of Escherichia coli isolated from chicken.
Hasan et al. Isolation and molecular detection of some virulence associated genes in avian pathogenic E. coli.
Eid et al. An Overview of the Current Situation of Salmonellosis in Pigeons, Household Chickens, and Commercial Broilers with a Special Reference to a Customized Vaccine Developing Trial
Lefebvre et al. Detection of virulence-associated genes in Escherichia coli O157 and non-O157 isolates from beef cattle, humans, and chickens
Kwag et al. Characteristics of persistent Salmonella Enteritidis strains in two integrated broiler chicken operations of Korea