KR100577451B1

KR100577451B1 - 코리네박테리움 디프테리애 균의 검출용 ｄｎａ 칩

Info

Publication number: KR100577451B1
Application number: KR1020057014597A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 장경희; 유승민; 유소영; 금기창; 유내춘; 유원민; 이진; 김준명
Original assignee: 메디제네스(주); 유원민; 금기창; 유내춘
Priority date: 2005-08-08
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2006-05-08
Also published as: KR20050084544A

Abstract

본 발명은 생물학적 시료중에서 비바이러스 감염 유기체를 검출 및 동정하는데 유용하고 그러한 비바이러스 감염 유기체에 의해 발생되는 질환을 진단하는데 사용하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 핵산 탐침이 고정된 감염질환을 진단하는데 유용한 DNA 칩에 관한 것이다.

비바이러스, 감염 유기체, 병원체 검출, 질환, 진단, 핵산, 탐침, DNA 칩

Description

코리네박테리움 디프테리애 균의 검출용 ＤＮＡ 칩{DNA chips for Detection of Corynebacterium diphtheriae bacilli}

도 1은 스타필로코코스 아우레우스, 슈도모나스 애루지노사, 프로테우스 미라빌리스, 크레브시엘라 뉴모니에, 아시네토박터 바우마니, 이. 콜라이 또는 엔테로코코스 페슘 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험을 위한 DNA 칩의 디자인을 도시한 것이다.

도 2는 스타필로코코스 아우레우스 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이(Scanarray) 5000을 이용하여 검색된 도 1의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 3은 슈도모나스 애루지노사 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이(Scanarray) 5000을 이용하여 검색된 도 1의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 4는 프로테우스 미라빌리스 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이(Scanarray) 5000을 이용하여 검색된 도 1의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 5는 크레브시엘라 뉴모니에 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이(Scanarray) 5000을 이용하여 검색된 도 1의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 6은 아시네토박터 바우마니 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이(Scanarray) 5000을 이용하여 검색된 도 1의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 7은 이. 콜라이 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이(Scanarray) 5000을 이용하여 검색된 도 1의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 8은 엔테로코코스 페슘 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이(Scanarray) 5000을 이용하여 검색된 도 1의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 9는 스타필로코코스 에피더미디스 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험을 위한 DNA 칩의 디자인을 도시한 것이다.

도 10은 스타필로코코스 에피더미디스 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 9의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 11은 살모넬라 그룹 E 균 또는 살모넬라 그룹 B 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험을 위한 DNA 칩의 디자인을 도시한 것이다.

도 12는 살모넬라 그룹 E 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 11의 DNA 칩에서의 혼성화 반응결과를 보여준다.

도 13은 살모넬라 그룹 B 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 11의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 14는 크레브시엘라 옥시토카 균 또는 벌코데리아 세파시아 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험을 위한 DNA 칩의 디자인을 도시한 것이다.

도 15는 크레브시엘라 옥시토카 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 14의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 16은 벌코데리아 세파시아 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 14의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 보여준다.

도 17은 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용되는 프라이머의 위치를 보여준다. (16S: 16S rRNA; ITS: 내부전사 스페이서 영역 (Internal Transcribed Spacer Region, 이하 "ITS"라 한다); 23S: 23S rRNA).

본 발명은 생물학적 시료중에서 비바이러스 감염 유기체를 검출 및 동정하는데 유용하고 그러한 비바이러스 감염 유기체에 의해 발생되는 질환을 진단하는데 사용하는 핵산 탐침에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 비바이러스 감염 유기 체의 rRNA 유전자로부터 유도되어 그들 유기체를 검출 및 동정하는데 유용한 핵산 탐침 및 이 핵산 탐침을 포함하여 감염질환을 진단하는데 유용한 조성물 및 키트에 관한 것이다.

(배경기술)

감염질환은 병원체가 혈액, 체액 및 조직 내에 출현하여 서식하기 시작하면서 발병하는 질환으로서, 원인균의 정확한 동정 및 적절한 치료가 이루어지지 않을 경우, 생명을 잃을 수 있는 질병이다. 더욱이 최근에는 항생제투여의 오남용으로 인해 병원체의 배양률이 감소하게 되었고, 이식에 따른 면역억제제 사용의 증가, 항암 치료로 인한 약물투여의 증가 등으로 인한 원인병원체가 다양해지게 되면서 배양 검사와 같은 기존의 감염질환을 진단하는 진단방법들이 점차 어려움에 부딪히고 있는 실정이다. 특히 혐기성 균을 포함한 특정 병원체의 경우 인체에 매우 치명적이고 중한 질환을 야기시키기 때문에 이를 조속히 진단함과 동시에 원인 병원체의 종류를 확인하는 것이 치료에 있어서 상당히 중요한 위치를 차지한다. 이와 같은 필요성으로 인해 오랫동안 감염질환 원인 미생물을 동정하고자 하는 진단 방법들이 연구 및 개발되어 왔다. 지난 10년 동안에 많은 미생물을 검출하는데 상당한 진보가 있어 왔지만 현재 이용되고 있는 진단 방법들은 여전히 많은 노동을 필요로 하고 있고 민감도 및 특이성이 낮은 형편이다.

바이러스를 제외하고, 모든 원핵 유기체는 원핵성 5S, 16S 및 23S rRNA 분자들의 상동체를 코딩하는 rRNA 유전자를 함유한다. 진핵 세포의 경우는 이들 rRNA 분자들이 원핵 세포의 분자와 실질적으로 유사한 5S rRNA, 5.8S rRNA, 18S rRNA 및 28S rRNA이다. 생물학적 시료에서 특정한 유기체 또는 유기체 군의 rRNA 아서열을 특정한 표적으로 하여 검출하기 위한 탐침들이 많이 공개되어 있다. 이러한 핵산 탐침을 잘 알려진 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 함께 병용함으로써 종래의 진단 방법에서의 상기 문제점가운데 많은 것들이 해결될 수 있었다. 진단을 위한 핵산 탐침 기술에서는 증폭시키는 표적 유전자의 선택이 매우 중요한데 대체로 rRNA, 특히 23S rRNA 유전자 및 내부전사지역 (Internal Transcribed Spacer Region, ITS)이 이용되고 있으며 이들에 대한 핵산 탐침서열은 유리하게는 적당한 긴축 조건하에서 다른 유기체로부터 유래된 핵산과 교차 반응하는 확률이 낮은 것으로 알려져 있다 (P. Wattiau et. al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56, 816-819, 2001; D, A. Stahlm et. al., J. Bacteriol., 172, 116-124, 1990; Boddinghaus. et. al., J. Clin., Microbiol., 28, 1751-1759, 1990; T. Rogall et al., J. Gen. Microbiol., 136, 1915-1920, 1990; T. Rogall, et. al., Int. J. System. Bacteriol., 40, 323-330, 1990; K. Rantakokko-Jalava et. al., J. Clin., Mirobiol., 38(1), 32-39, 2000 ; Park et. al., J. Clin., Mirobiol., 38(11), 4080-4085, 2000; A. Schmalenberger et. al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 67(8), 3557-3563, 2001; 국제특허공개 WO98/55646; Jannes 등의 미국특허 제6025132호; 및 Rossau 등의 미국특허 제6,277,577호).

그러나, 많은 병원체에 대하여 rRNA 유전자의 염기 서열이 동정되지 않은 상태에 있으며 그럼으로써 그러한 병원체의 rRNA 유전자의 염기 서열을 동정하고 그 로부터 유도되는 고도의 특이성을 갖는 탐침을 개발할 필요가 여전히 남아있다. 또한, 비록 일부 병원체의 경우 rRNA 유전자의 염기 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 밝혀져 있을지라도, 그러한 병원체를 보다 특이적으로 검출할 수 있는 새로운 핵산 탐침은 계속 개발될 필요가 있다.

이에, 본 발명의 목적은 하기의 비바이러스 병원체를 검출 및 동정하는데 유용한 핵산 탐침을 개발하는데 있다:

(1) 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumanii);

(2) 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스

(Anaerobiospirillum succiniciproducens);

(3) 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis);

(4) 카디오박테리움 호미니스 (Cardiobacterium hominis);

(5) 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 (Chryseobacterium meningosepticum);

(6) 클로스트리디움 람모섬 (Clostridium ramosum);

(7) 코마모나스 아시도보란스 (Comamonas acidovorans);

(8) 코리네박테리움 디프테리애 (Corynebacterium diphtheriae);

(9) 크레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca);

(10) 오크로박트룸 안트로피 (Ochrobactrum anthropi);

(11) 펩토스트렙토코코스 프레보티 (Peptostreptococcus prevotii);

(12) 포피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis);

(13) 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 (Peptostreptococcus anarobius);

(14) 펩토스트렙토코커스 마그누스 (Peptostreptococcus magnus);

(15) 푸소박테리움 네크로포룸 (Fusobacterium necrophorum);

(16) 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris);

(17) 엔테로박터 에어로게네스 (Enterobacter aerogenes);

(18) 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans);

(19) 킨젤라 킨갭 (Kingella kingaep);

(20) 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus);

(21) 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron);

(22) 클로스트리디움 디프실 (Clostridium diffcile);

(23) 해모필러스 아프로필라스 (Haemophilus aprophilas);

(24) 나이세리아 고노헤아 (Neisseria gonorrhea);

(25) 아이케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens);

(26) 박테로이데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus);

(27) 브란하멜라 카타르할리스 (Branhamella catarrhalis);

(28) 수테렐라 와즈워텐시스 (Sutterella wadsworthensis);

(29) 액티노마이세스 이스라엘이 (Actinomyces israelii);

(30) 스타필로코코스 에피더미디스 (Staphylococcus epidrmidis);

(31) 벌코데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia);

(32) 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella spp.(enteritidis));

(33) 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli);

(34) 크레브시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pneumoniae);

(35) 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis);

(36) 스트렙토코코스 뉴모니에 (Streptococcus pneumoniae);

(37) 비브리오 벌른피커스 (Vibrio vulnificus);

(38) 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa);

(39) 에로모나스 하이드로필라 (Aeromonas hydrophila);

(40) 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes);

(41) 엔테로코코스 페슘 (Enterococcus faecium);

(42) 스타필로코코스 아우레우스 (Staphylococcus aureus);

(43) 나이세리아 메닌자이티디스 (Neisseria meningitidis);

(44) 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila);

(45) 캔디다 알비칸스 (Candida albicans); 및

(46) 캔디다 글라브라타 (Candida glabrata).

본 발명자들은 상기 각 병원체의 rRNA 유전자와 특정적으로 혼성화하고 다른 유기체의 핵산과는 교차 반응하지 않는 염기 서열을 갖는 탐침을 개발하였고 또한 이들 탐침을 집적한 DNA 칩을 제작하여 임상 실험을 통해 그들 탐침의 각 특이성을 확인함으로써 상기 본 발명의 목적을 달성하였다. 상기 (1) 내지 (28)의 각 세균의 검출 및 동정을 위한 핵산 탐침은 본 발명자들에 의해 직접 동정된 각 세균의 23S rRNA 유전자 및 ITS의 전체 염기 서열(서열번호 1 내지 28)로부터 유도되어 이의 기원이 되는 세균의 23S rRNA 또는 ITS와 특정적으로 혼성화하고 그 외의 다른 유기체의 핵산과는 교차 반응하지 않는 특정 염기 서열을 갖는다. 상기 (29) 내지 (44)의 세균의 경우는 공지된 23S rRNA 유전자로부터 유도되어 이의 기원이 되는 세균의 23S rRNA 유전자와 특정적으로 혼성화하고 그 외 다른 유기체의 핵산과는 교차 반응하지 않는 특정 염기 서열을 갖는다. 상기 (45) 및 (46)의 진균의 경우는 공지된 18S rRNA 유전자로부터 유도되어 이의 기원이 되는 진균의 18S rRNA 유전자와 특정적으로 혼성화하고 그 외 다른 유기체의 핵산과는 교차 반응하지 않는 염기 서열을 갖는다.

한 관점으로, 본 발명은 상기 (1) 내지 (28)의 세균의 23S rRNA 유전자와 ITS의 전체 염기 서열로서 각각 서열번호 1 내지 28로 기술된 염기 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다.

다른 관점(1-i-a)으로, 본 발명은 아시네토박터 바우마니 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TGATGGAACTTGCTT (Acti004, 서열번호 29);

AGGGCACACATAATG (Acti23S01, 서열번호 30); 또는

ACGCTGTTGTTGGTG (Acti23S02, 서열번호 31).

다른 관점(1-i-b)으로, 본 발명은 아시네토박터 바우마니 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

ATACACAGTACTTCG (Acti3, 서열번호 32);

ATAGTGTTGCAAGGC (Acti002, 서열번호 33); 또는

TGAAAAGCCAGGGGA (Acti003, 서열번호 34).

다른 관점(1-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 29 내지 34중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 아시네토박터 바우마니 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(1-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 29 내지 34중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 아시네토박터 바우마니 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(1-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 29 내지 34중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 아시네토박터 바우마니 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 아시네토박터 바우마니 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(1-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 29 내지 34중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 아시네토박터 바우마니 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(1-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 29 내지 34중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 아시네토박터 바우마니 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 아시네토박터 바우마니 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(2-i-a)으로, 본 발명은 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TGACTCGTGCCCATG (Anas001, 서열번호 45);

TACCGGGGTTAAAAG (Anas002, 서열번호 46);

ATCAGTGATCTGAGA (Anas003, 서열번호 47);

GAGACGAAGCACCAT (Anas004, 서열번호 48);

AGTTGATACAGGTAG (Anas011, 서열번호 49);

GGCCCCATCCGGGGT(Anas013, 서열번호 50); 또는

CAGTTGGAAGCAGAG (Anas23S03, 서열번호 51).

다른 관점(2-ii-b)으로, 본 발명은 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GTTCTTGATTCATTGC (Anas005, 서열번호 52);

CAGCCCAAAAGTTGA (Anas008, 서열번호 53);

AAACTGCAGGGCACA (Anas009, 서열번호 54); 또는

ATACTACCTGACGAC (Anas010, 서열번호 55).

다른 관점(2-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 45 내지 55중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(2-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 45 내지 55중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(2-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 45 내지 55중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분: 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

관점(2-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 45 내지 55중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(2-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 45 내지 55중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(3-i)으로, 본 발명은 박테로이데스 프라질리스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GTCGAACCTGACAGT (Bf011, 서열번호 78).

다른 관점(3-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 78의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 프라질리스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(3-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 78의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 프라질리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(3-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 78의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 프라질리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 박테로이데스 프라질리스균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(3-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 78의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 프라질리스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(3-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 78의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 프라질리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 박테로이데스 프라질리스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(4-i-a)으로, 본 발명은 카디오박테리움 호미니스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

AACCCTGGTGAAGGG (Car 006, 서열번호 93);

ATATGAAGATATGTG (Car 007, 서열번호 94);

TAGATTGACTTACGG (Car 008, 서열번호 95);

GTAAAGTTTTACTAC (Car 009, 서열번호 96); 또는

CCAGCACACTGTTGG (Car2, 서열번호 97).

다른 관점(4-i-b)으로, 본 발명은 카디오박테리움 호미니스 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

AAAGAGAGAACAGCA (Car3(CarI), 서열번호 98);

TTGGCGACAACAGGC (Car001, 서열번호 99);

GCCCCGGGAAGCTGA (Car002, 서열번호 100);

TAGACTGCGGAAGCG (Car003, 서열번호 101); 또는

AATTAAGTTGCGTAT (Car004, 서열번호 102).

다른 관점(4-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 93 내지 102중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 카디오박테리움 호미니스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(4-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 93 내지 102중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 카디오박테리움 호미니스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(4-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 93 내지 102중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 카디오박테리움 호미니스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 카디오박테리움 호미니스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 93 내지 102중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 카디오박테리움 호미니스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 93 내지 102중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 카디오박테리움 호미니스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 카디오박테리움 호미니스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(5-i-a)으로, 본 발명은 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GGCATATTTAGATGA (Chr23S04, 서열번호 105).

다른 관점(5-i-b)으로, 본 발명은 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 분리된 핵산 분자를 제공한다:

CTTAGGTGATCACTT (Chr001, 서열번호 106);

TAACCCCTTAGATTA (Chr003, 서열번호 107);

TCAAACCTCAAACTA (Chr004, 서열번호 108); 또는

AAGAAATCGAAGAGA (Chr005, 서열번호 109).

다른 관점(5-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 105 내지 109중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(5-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 105 내지 109중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(5-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 105 내지 109중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(5-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 105 내지 109중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(5-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 105 내지 109중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(6-i)으로, 본 발명은 클로스트리디움 람모섬 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

CCAGTGTGTGAGGAG (C.ramosa04, 서열번호 115); 또는

CCCGGGAAGGGGAGT (C.ramo 004, 서열번호 116).

다른 관점(6-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 115 또는 116의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 클로스트리디움 람모섬 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(6-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 115 또는 116의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 클로스트리디움 람모섬 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(6-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 115 또는 116의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 클로스트리디움 람모섬 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 클로스트리디움 람모섬 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(6-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 115 또는 116의 염기 서열을 포함한 핵산 핵산 분자를 포함하는 클로스트리디움 람모섬 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(6-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 115 또는 116의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 클로스트리디움 람모섬 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함 을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 클로스트리디움 람모섬 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(7-i)으로, 본 발명은 코마모나스 아시도보란스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TAGGGCGTCCAGTCG (Com 004, 서열번호 124);

CGCAGAGTACAGCTT (Com 005, 서열번호 125);

GTACCGATGTGTAGT (Com 006, 서열번호 126);

GAACTTGAACAAAGG (Com 007, 서열번호 127);

TGTGCTAGAGAAAAG (Coma2, 서열번호 128); 또는

ATCCGCCGGGCTTAG (Coma3, 서열번호 129).

다른 관점(7-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 124 내지 129중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 코마모나스 아시도보란스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(7-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 124 내지 129중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 코마모나스 아시도보란스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(7-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 124 내지 129중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 코마모나스 아시도보란스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증 폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 코마모나스 아시도보란스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(7-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 124 내지 129중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 코마모나스 아시도보란스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(7-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 124 내지 129중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 코마모나스 아시도보란스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 코마모나스 아시도보란스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(8-i)으로, 본 발명은 코리네박테리움 디프테리애 균으로부터 유도된 하기 23S rRNA의 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

ACCATCTTCCCAAGG (C.diph003, 서열번호 135).

다른 관점(8-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 135의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 코리네박테리움 디프테리애 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(8-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 135의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 코리네박테리움 디프테리애 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(8-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 135의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 코리네박테리움 디프테리애 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 코리네박테리움 디프테리애 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(8-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 135의 염기 서열을 포함한 핵 산 분자를 포함하는 코리네박테리움 디프테리애 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(8-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 135의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 코리네박테리움 디프테리애 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 코리네박테리움 디프테리애 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(9-i)으로, 본 발명은 크레브시엘라 옥시토카 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GAACGTTACTAACGC (Ko001, 서열번호 142).

다른 관점(9-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 142의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크레브시엘라 옥시토카 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(9-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 142의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크레브시엘라 옥시토카 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(9-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 142의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크레브시엘라 옥시토카 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 크레브시엘라 옥시토카 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(9-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 142의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크레브시엘라 옥시토카 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(9-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 142의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크레브시엘라 옥시토카 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 크레브시엘라 옥시토카 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(10-i-a)으로, 본 발명은 오크로박트룸 안트로피 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GGACCAGGCCAGTGG (Ochr04, 서열번호 151); 또는

GACCAGGCCAGTGGC (Ochr05, 서열번호 152).

다른 관점(10-i-b)으로, 본 발명은 오크로박트룸 안트로피 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GTTGATTGACACTTG (Ochr004, 서열번호 153);

TACCGCTCACGAGCC (Ochr005, 서열번호 154); 또는

GGGTCCGGAGGTTCA (Ochr007, 서열번호 155).

다른 관점(10-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 151 내지 155중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 오크로박트룸 안트로피 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(10-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 151 내지 155중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 오크르박트룸 안트로피 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(10-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 151 내지 155중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 오크로박트룸 안트로피 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 오크로박트룸 안트로피 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(10-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 151 내지 155중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 오크로박트룸 안트로피 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(10-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 151 내지 155중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 오크로박트룸 안트로피 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 오크로박트룸 안트 로피 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(11-i)으로, 본 발명은 펩토스트렙토코코스 프레보티 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

ACTAGGGAGAGCTCA (Pep002, 서열번호 166);

GCTTAGTAAAGCAAG (Pep003, 서열번호 167);

TACTAACATGTGACC (pep004, 서열번호 168);

AAGCAGAGAGAGCTC (Pep005, 서열번호 169);

CGAACGGTGAGGCCG (Pep006, 서열번호 170);

GTAGATGTTGATTAT (Pep007, 서열번호 171);

GTCGAATCATCTGGG (Pep23S02, 서열번호 172); 또는

TAAAACGTATCGGAT (Pep23S03, 서열번호 173).

다른 관점(11-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 166 내지 173중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코코스 프레보티 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(11-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 166 내지 173중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코코스 프레보티 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(11-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 166 내지 173중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코코스 프레보티 균 의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 펩토스트렙토코코스 프레보티 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(11-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 166 내지 173중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코코스 프레보티 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(11-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 166 내지 173중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코코스 프레보티 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 펩토스트렙토코코스 프레보티 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(12-i-a)으로, 본 발명은 포피로모나스 진지발리스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

AGTTGGTGAGCGAGC (Por 003, 서열번호 178); 또는

CTGAGCTGTCGTGCA (Por23S08, 서열번호 179).

다른 관점(12-i-b)으로, 본 발명은 포피로모나스 진지발리스 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GTTTTTGTGAGTGGA (Por 001, 서열번호 180); 또는

TGATGGGTGGGGTTG (Por 002, 서열번호 181).

다른 관점(12-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 178 내지 181중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 포피로모나스 진지발리스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(12-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 178 내지 181중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 포피로모나스 진지발리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(12-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 178 내지 181 중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 포피로모나스 진지발리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐 침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 포피로모나스 진지발리스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(12-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 178 내지 181중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 포피로모나스 진지발리스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(12-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 178 내지 181중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 포피로모나스 진지발리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 포피로모나스 진지발리스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(13-i)으로, 본 발명은 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

AGGAGGAAGAGAAAG (P.anae003, 서열번호 186); 또는

GCGAAAGGAAAAGAG (P.anae004, 서열번호 187).

다른 관점(13-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 186 또는 187의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(13-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 186 또는 187의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(13-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 186 내지 187중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(13-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 186 또는 187의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(13-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 186 또는 187의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 균은 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(14-i)으로, 본 발명은 펩토스트렙토코커스 마그누스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

CATGCAACGATCCGT (P.magn002, 서열번호 190).

다른 관점(14-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 190의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코커스 마그누스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(14-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 190의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코커스 마그누스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함 한 조성물을 제공한다.

다른 관점(14-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 190의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코커스 마그누스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 펩토스트렙토코커스 마그누스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(14-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 190의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코커스 마그누스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(14-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 190의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 펩토스트렙토코커스 마그누스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 펩토스트렙토코커스 마그누스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(15-i)으로, 본 발명은 푸소박테리움 네크로포룸 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TTTCGCAGACGTAAG (fnecro01, 서열번호 193);

GTTTTCTTGCGCTGT (fnecro02, 서열번호 194);

CCGTATTCATGTCAA (fnecro03, 서열번호 195);

CTGCAAGCTATTTCG (fnecro05, 서열번호 196);

CAGACGTAAGCAAAG (fnecro06, 서열번호 197); 또는

CCTGTATTGGTAGTT (fnecro07, 서열번호 198).

다른 관점(15-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 193 내지 198중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 푸소박테리움 네크로포룸 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(15-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 193 내지 198중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 푸소박테리움 네크로포룸 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(15-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 193 내지 198중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 푸소박테리움 네크로포룸 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 푸소박테리움 네크로포룸 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(15-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 193 내지 198중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 푸소박테리움 네크로포룸 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(15-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 193 내지 198중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 푸소박테리움 네크로포룸 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 푸소박테리움 네크로포룸 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(16-i-a)으로, 본 발명은 프로테우스 불가리스 균으로부터 유도된 하기 23S rRNA의 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

AGAGGAGGCTTAGTG (Pvulga04, 서열번호 199).

다른 관점(16-i-b)으로, 본 발명은 프로테우스 불가리스 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

ATACGTGTTATGTGC (Pvulga01, 서열번호 200).

다른 관점(16-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 199 또는 200의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 프로테우스 불가리스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(16-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 199 또는 200의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 프로테우스 불가리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(16-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 199 또는 200의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 프로테우스 불가리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형 성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 프로테우스 불가리스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(16-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 199 또는 200의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 프로테우스 불가리스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(16-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 199 또는 200의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 프로테우스 불가리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 프로테우스 불가리스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(17-i)으로, 본 발명은 엔테로박터 에어로게네스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TTCCGACGGTACAGG (e.aero01, 서열번호 207);

GTATCAGTAAGTGCG (e.aero03, 서열번호 208); 및

TTATCCAGGCAAATC (e.aero04, 서열번호 209).

다른 관점(17-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 207 내지 209중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엔테로박터 에어로게네스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(17-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 207 내지 209중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엔테로박터 에어로게네스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(17-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 207 내지 209중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엔테로박터 에어로게네스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 엔테로박터 에어로게네스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(17-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 207 내지 209중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엔테로박터 에어로게네스 균의 검출 용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(17-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 207 내지 209중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엔테로박터 에어로게네스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 엔테로박터 에어로게네스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(18-i)으로, 본 발명은 스트렙토코커스 뮤탄스 균으로부터 유도된 하기 23S rRNA의 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TAGGTATTCTCTCCT (S.mutan001, 서열번호 212).

다른 관점(18-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 212의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(18-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 212의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(18-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 212의 염기 서열을 포 함한 핵산 분자를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 스트렙토코커스 뮤탄스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(18-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 212의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(18-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 212의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스트렙토코커스 뮤탄스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 스트렙토코커스 뮤탄스 균을 검출 및 동정하 는 방법을 제공한다.

다른 관점(19-i)으로, 본 발명은 킨젤라 킨갭 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GGTTAGCAAACTGTT (k.king02, 서열번호 218);

CCAGTAGGTGGAAAG (k.king03, 서열번호 219);

AACACCGAGACGTGA (k.king04, 서열번호 220); 또는

TATTCAATGCGATGG (k.king09, 서열번호 221).

다른 관점(19-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 218 내지 221중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 킨젤라 킨갭 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(19-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 218 내지 221중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 킨젤라 킨갭 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(19-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 218 내지 221중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 킨젤라 킨갭 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에 서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 킨젤라 킨갭 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(19-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 218 내지 221중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 킨젤라 킨갭 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(19-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 218 내지 221중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 킨젤라 킨갭 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 킨젤라 킨갭 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(20-i)으로, 본 발명은 박테로이데스 오바투스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TAGAAGGAAGCATTC (b.ovatus01, 서열번호 227);

CCAATGTTGTTACGG (b.ovatus02, 서열번호 228); 또는

TGTAGGACCACGATG (b.ovatus05, 서열번호 229).

다른 관점(20-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 227 내지 229중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 오바투스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(20-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 227 내지 229중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 오바투스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(20-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 227 내지 229중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 오바투스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 박테로이데스 오바투스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(20-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 227 내지 229중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 오바투스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(20-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 227 내지 229중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 오바투스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 박테로이데스 오바투스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(21-i)으로, 본 발명은 박테로이데스 테타이오타오미크론 균으로부터 유도된 하기 23S rRNA의 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GCTAACGCAGGGAAC (b.thetaio006, 서열번호 234).

다른 관점(21-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 234의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 테타이오타오미크론 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(21-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 234의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 테타이오타오미크론 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(21-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 234의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 테타이오타오미크론 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 박테로이데스 테타이오타오미크론 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(21-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 234의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함한 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(21-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 234의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 테타이오타오미크론 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 박테로이데스 테타이오타오미크론 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(22-i)으로, 본 발명은 클로스트리디움 디프실 균으로부터 유도된 하기 23S rRNA의 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GTTCGTCCGCCCCTG (C.diffc005, 서열번호 240).

다른 관점(22-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 240의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 클로스트리디움 디프실 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(22-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 240의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 클로스트리디움 디프실 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(22-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 240의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 클로스트리디움 디프실 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 클로스트리디움 디프실 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(22-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 240의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 클로스트리디움 디프실 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(22-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 240의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 클로스트리디움 디프실 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 클로스트리디움 디프실 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(23-i)으로, 본 발명은 해모필러스 아프로필라스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GGTGAAGAACCCACT (H.aphro003, 서열번호 245).

다른 관점으로, 본 발명은 해모필러스 아프로필라스 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TGGGAGTGGGTTGTC (H.aphro001, 서열번호 246); 또는

TAACAAACCGGAAAC (H.aphro002, 서열번호 247).

다른 관점(23-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 245 내지 247중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 해모필러스 아프로필라스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(23-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 245 내지 247중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 해모필러스 아프로필라스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(23-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 245 내지 247중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 해모필러스 아프로필라스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 해모필러스 아프로필라스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(23-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 245 내지 247중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 해모필러스 아프로필라스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(23-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 245 내지 247중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 해모필러스 아프로필라스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 해모필러스 아프로필라스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(24-i-a)으로, 본 발명은 나이세리아 고노헤아 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TATCAAAGTAGGGAT (N.gono005, 서열번호 254); 또는

AGTCAACGGGTAGGT (N.gono006, 서열번호 255).

다른 관점(24-i-b)으로, 본 발명은 나이세리아 고노헤아 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

AACCTCTCGCAAGAG (N.gono002, 서열번호 256)

다른 관점(24-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 254 내지 256중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 나이세리아 고노헤아 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(24-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 254 내지 256중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 나이세리아 고노헤아 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(24-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 254 내지 256중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 나이세리아 고노헤아 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 나이세리아 고노헤아 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(24-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 254 내지 256중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 나이세리아 고노헤아 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(24-Vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상 기 서열번호 254 내지 256중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 나이세리아 고노헤아 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 나이세리아 고노헤아 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(25-i-a)으로, 본 발명은 아이케넬라 코로덴스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GGATAGGAGAAGGAA (E.corro005, 서열번호 262); 또는

ACTCATCATCGATCC (E.corro006, 서열번호 263).

다른 관점(25-i-b)으로, 본 발명은 아이케넬라 코로덴스 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

AGTCGTAGAGCGGAG (E.corro001, 서열번호 264).

다른 관점(25-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 262 내지 264중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 아이케넬라 코로덴스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(25-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 262 내지 264중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 아이케넬라 코로덴스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(25-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 262 내지 264중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 아이케넬라 코로덴스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 아이케넬라 코로덴스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(25-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 262 내지 264중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 아이케넬라 코로덴스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(25-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 262 내지 264중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 아이케넬라 코로덴스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 아이케넬라 코로덴스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(26-i)으로, 본 발명은 박테로이데스 불가투스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

AGTCAGCGTCGAAGG (b.vulga03, 서열번호 268); 또는

CGAATGCGCATCAGT (b.vulga07, 서열번호 269).

다른 관점(26-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 268 또는 269의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 불가투스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(26-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 268 또는 269의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 불가투스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(26-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 268 또는 269의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 불가투스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 박테로이데스 불가투스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(26-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 268 또는 269의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 불가투스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(26-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 268 또는 269중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 박테로이데스 불가투스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 박테로이데스 불가투스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(27-i)으로, 본 발명은 브란하멜라 카타르할리스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

ATATCTTCGCGCTGT (B.catar005, 서열번호 280).

다른 관점(27-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 280의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 브란하멜라 카타르할리스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(27-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 280의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 브란하멜라 카타르할리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(27-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 280의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 브란하멜라 카타르할리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 브란하멜라 카타르할리스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(27-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 280의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 브란하멜라 카타르할리스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(27-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존 재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 280의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 브란하멜라 카타르할리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 브란하멜라 카타르할리스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(28-i)으로, 본 발명은 수테렐라 와즈워텐시스 균의 ITS로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다;

TTCGGGTCCGTAATT (Swad02, 서열번호 292);

AATCAAGGCCGAGGC (Swad03, 서열번호 293); 또는

GCCGAGGCGTGATGA (Swad04, 서열번호 294).

다른 관점(28-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 292 내지 294중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 수테렐라 와즈워텐시스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(28-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 292 내지 294중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 수테렐라 와즈워텐시스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(28-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 292 내지 294중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 수테렐라 와즈워텐시스균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 수테렐라 와즈워텐시스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(28-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 292 내지 294중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 수테렐라 와즈워텐시스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(28-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 292 내지 294중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 수테렐라 와즈워텐시스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하 는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 수테렐라 와즈워텐시스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(29-i)으로, 본 발명은 엑티노마이세스 이스라엘이 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

AACCTGGCTGGTGGC (Aciil, 서열번호 296).

다른 관점(29-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 296의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엑티노마이세스 이스라엘이 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(29-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 296의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엑티노마이세스 이스라엘이 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(29-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 296의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엑티노마이세스 이스라엘이 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하 여, 생물학적 시료에서 엑티노마이세스 이스라엘이 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(29-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 296의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엑티노마이세스 이스라엘이 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(29-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 296의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엑티노마이세스 이스라엘이 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 엑티노마이세스 이스라엘이 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(30-i)으로, 본 발명은 스타필로코코스 에피더미디스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GATAGATAACAGGTG (SeM01, 서열번호 299); 또는

AGGGTTCACGCCCAG (SeM02, 서열번호 300).

다른 관점(30-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 299 또는 300의 염기 서열 을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스타필로코코스 에피더미디스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(30-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 299 또는 300의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스타필로코코스 에피더미디스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(30-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 299 또는 300의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스타필로코코스 에피더미디스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 스타필로코코스 에피더미디스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(30-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 299 또는 300의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스타필로코코스 에피더미디스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(30-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향 과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 299 또는 300의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스타필로코코스 에피더미디스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 스타필로코코스 에피더미디스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(31-i)으로, 본 발명은 벌코데리아 세파시아 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TTGTTAGCCGAACGC (Bur23, 서열번호 304); 또는

GGGTGTGGCGCGAGC (Bur01, 서열번호 305).

다른 관점(31-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 304 또는 305의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 벌코데리아 세파시아 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(31-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 304 또는 305의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 벌코데리아 세파시아 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(31-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 304 또는 305의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 벌코데리아 세파시아균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 벌코데리아 세파시아 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(31-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 304 또는 305의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 벌코데리아 세파시아 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(31-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 304 또는 305의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 벌코데리아 세파시아 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 벌코데리아 세파시아 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(32-i)으로, 본 발명은 살모넬라 엔테리티디스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GCCTGAATCAGCATG (Styp23, 서열번호 307).

다른 관점(32-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 307의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(32-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 307의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(32-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 307의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 살모넬라 엔테리티디스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(32-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 307의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(32-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 307의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 살모넬라 엔테리티디스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(33-i)으로, 본 발명은 에스케리치아 콜라이 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다.

CTGAAGCGACAAATG (E coli 003, 서열번호 312).

다른 관점(33-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 312의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 에스케리치아 콜라이 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(33-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 312의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 에스케리치아 콜라이 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(33-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 312의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 에스케리치아 콜라이 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 에스케리치아 콜라이 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(33-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 312의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 에스케리치아 콜라이 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(33-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 312의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 에스케리치아 콜라이 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 에스케리치아 콜라이 균을 검출 및 동정하는 방법 을 제공한다.

다른 관점(34-i)으로, 본 발명은 크레브시엘라 뉴모니에 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GTACACCAAAATGCA (Kpneu 23, 서열번호 317); 또는

GCTGAGACCAGTCGA (K.pneu002, 서열번호 318).

다른 관점(34-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 317 또는 318의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크레브시엘라 뉴모니에 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(34-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 317 또는 318의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크레브시엘라 뉴모니에 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(34-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 317 또는 318의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크레브시엘라 뉴모니에 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으 로 하여, 생물학적 시료에서 크레브시엘라 뉴모니에 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(34-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 317 내지 318중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크레브시엘라 뉴모니에 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(34-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 317 또는 318의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 크레브시엘라 뉴모니에 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 크레브시엘라 뉴모니에 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(35-i)으로, 본 발명은 프로테우스 미라빌리스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GTTACCAACAATCGT (Pm, 서열번호 321);

GGCGACGGTCGTCCC (Pm002, 서열번호 322);

GATGACGAACCACCA (Pm003, 서열번호 323); 또는

TGAAGCAATTGATGC (Pm004, 서열번호 324).

다른 관점(35-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 321 내지 324중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 프로테우스 미라빌리스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(35-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 321 내지 324중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 프로테우스 미라빌리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(35-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 321 내지 324중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 프로테우스 미라빌리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 프로테우스 미라빌리스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(35-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 321 내지 324중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 프로테우스 미라빌리스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(35-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 321 내지 324중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 프로테우스 미라빌리스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 프로테우스 미라빌리스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(36-i)으로, 본 발명은 스트렙토코코스 뉴모니에 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TAGGACTGCAATGTG (StreppM, 서열번호 328).

다른 관점(36-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 328의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스트렙토코코스 뉴모니에 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(36-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 328의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스트렙토코코스 뉴모니에 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(36-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 328의 염기 서열을 포 함한 핵산 분자를 포함하는 스트렙토코코스 뉴모니에 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 스트렙토코코스 뉴모니에 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(36-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 328의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스트렙토코코스 뉴모니에 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(36-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 328의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스트렙토코코스 뉴모니에 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 스트렙토코코스 뉴모니에 균을 검출 및 동정 하는 방법을 제공한다.

다른 관점(37-i)으로, 본 발명은 비브리오 벌른피커스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GTTGACGATGCATGT (Vvul02, 서열번호 333).

다른 관점(37-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 333의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 비브리오 벌른피커스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(37-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 333의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 비브리오 벌른피커스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(37-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 333의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 비브리오 벌른피커스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 비브리오 벌른피커스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(37-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 333의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 비브리오 벌른피커스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(37-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 333의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 비브리오 벌른피커스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 비브리오 벌른피커스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(38-i)으로, 본 발명은 슈도모나스 애루지노사 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GAAGTGCCGAGCATG (P.aeru001, 서열번호 339); 또는

GGATCTTTGAAGTGA (Pa03, 서열번호 340).

다른 관점(38-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 339 또는 340의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 슈도모나스 애루지노사 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(38-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 339 또는 340의 염기 서열 을 포함한 핵산 분자를 포함하는 슈도모나스 애루지노사 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(38-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 339 또는 340의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 슈도모나스 애루지노사 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 슈도모나스 애루지노사 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(38-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 339 또는 340의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 슈도모나스 애루지노사 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(38-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 339 또는 340의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 슈도모나스 애루지노사 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건 하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 슈도모나스 애루지노사 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(39-i)으로, 본 발명은 에로모나스 하이드로필라 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GGCGCCTCGGTAGGG (Ah, 서열번호 347).

다른 관점(39-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 347의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 에로모나스 하이드로필라 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(39-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 347의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 에로모나스 하이드로필라 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(39-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 347의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 에로모나스 하이드로필라 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 에로모나스 하이드로필라 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(39-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 347의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 에로모나스 하이드로필라 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(39-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이며 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 347의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 에로모나스 하이드로필라 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 에로모나스 하이드로필라 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(40-i)으로, 본 발명은 리스테리아 모노사이토제네스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GGGTGCAAGCCCGAG (LM, 서열번호 354).

다른 관점(40-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 354의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(40-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 354의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(40-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 354의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 리스테리아 모노사이토제네스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(40-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 354의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(40-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존 재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 354의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 리스테리아 모노사이토제네스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 리스테리아 모노사이토제네스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(41-i)으로, 본 발명은 엔테로코코스 페슘 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TTACGATTGTGTGAA (E.faecium002, 서열번호 359); 또는

ATAGCACATTCGAGG (E.faecium003, 서열번호 360).

다른 관점(41-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 359 또는 360의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엔테로코코스 페슘 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(41-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 359 또는 360의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엔테로코코스 폐습 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(41-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 359 또는 360의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엔테로코코스 페슘 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 엔테로코코스 페슘 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(41-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 359 또는 360의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엔테로코코스 페슘 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(41-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 359 또는 360중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 엔테로코코스 페슘 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 엔테로코코스 페슘 균 을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(42-i)으로, 본 발명은 스타필로코코스 아우레우스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

GATTGCACGTCTAAG (S.aureus004, 서열번호 365);

AATCCGGTACTCGTT (S.aureus005, 서열번호 366); 또는

TCTTCGAGTCGTTGA (Saure03(Saureus03), 서열번호 367).

다른 관점(42-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 365 내지 367중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스타필로코코스 아우레우스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(42-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 365 내지 367중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스타필로코코스 아우레우스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(42-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 365 내지 367중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스타필로코코스 아우레우스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생 성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 스타필로코코스 아우레우스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(42-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 365 내지 367중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스타필로코코스 아우레우스 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(42-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 365 내지 367중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 스타필로코코스 아우레우스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 스타필로코코스 아우레우스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(43-i)으로, 본 발명은 나이세리아 메닌자이티디스 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

AGATGTGAGAGCATC (Nm002, 서열번호 377).

다른 관점(43-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 377의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 나이세리아 메닌자이티디스 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(43-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 377의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 나이세리아 메닌자이티디스균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(43-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 377의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 나이세리아 메닌자이티디스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 나이세리아 메닌자이티디스 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(43-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 377의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 나이세리아 메닌자이티디스균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(43-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향 과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 377의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 나이세리아 메닌자이티디스 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 나이세리아 메닌자이티디스 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(44-i)으로, 본 발명은 레지오넬라 뉴모필라 균의 23S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TGGAGAGCATTTTAT (L.pneu011, 서열번호 383);

GTGATTTTGAGGTGA (L.pneu012, 서열번호 384); 또는

AGATGGTAAAGAAGA (L.pneu013, 서열번호 385).

다른 관점(44-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 383 내지 385중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 레지오넬라 뉴모필라 균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(44-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 383 내지 385중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 레지오넬라 뉴모필라 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(44-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 383 내지 385중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 레지오넬라 뉴모필라 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 레지오넬라 뉴모필라 균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(44-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 383 내지 385중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산분자를 포함하는 레지오넬라 뉴모필라 균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(44-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 383 내지 385중의 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 레지오넬라 뉴모필라 균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 레지오넬라 뉴모필 라 균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(45-i)으로, 본 발명은 캔디다 알비칸스 진균의 18S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

TGGTAGCCATTTATG (C.alic 001, 서열번호 396);

CTGGACCAGCCGAGC (C.alic 003, 서열번호 397);

TCAAGAACGAAAGTT (C.alic 006, 서열번호 398);

AAGGATTGACAGATT (C.alic 007, 서열번호 399); 또는

CATTAATCAAGAACG (C.alic 008, 서열번호 400).

다른 관점(45-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 396 내지 400중 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 캔디다 알비칸스 진균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(45-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 396 내지 400중 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 캔디다 알비칸스 진균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(45-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 396 내지 400중 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 캔디다 알비칸스 진균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도 하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 캔디다 알비칸스 진균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(45-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 396 내지 400중 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 캔디다 알비칸스 진균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(45-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 396 내지 400중 어느 하나의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 캔디다 알비칸스 진균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 캔디다 알비칸스 진균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

다른 관점(46-i)으로, 본 발명은 캔디다 글라브라타 진균의 18S rRNA로부터 유도된 하기 염기 서열을 포함한 핵산 분자로 이루어진 그룹중에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다:

CTGGAATGCACCCGG (C.glab 001, 서열번호 404); 또는

TGGCTTGGCGGCGAA (C.glab 003, 서열번호 405).

다른 관점(46-ii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 404 또는 405의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 캔디다 글라브라타 진균의 검출용 핵산 탐침을 제공한다.

다른 관점(46-iii)으로, 본 발명은 상기 서열번호 404 또는 405의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 캔디다 글라브라타 진균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 관점(46-iv)으로, 본 발명은 (a) 상기 서열번호 404 또는 405의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 캔디다 글라브라타 진균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 캔디다 글라브라타 진균을 검출 및 동정하기 위한 키트를 제공한다.

다른 관점(46-v)으로, 본 발명은 상기 서열번호 404 또는 405의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 캔디다 글라브라타 진균의 검출용 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 관점(46-vi)으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 서열번호 404 또는 405의 염기 서열을 포함한 핵산 분자를 포함하는 캔디다 알비칸스 진균의 검출용 핵산 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 캔디다 글라브라타 진균을 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

추가의 관점으로, 본 발명은 상기 탐침중에서 선택된 2종 이상의 탐침을 포함한 조성물을 제공한다.

다른 추가의 관점으로, 본 발명은 상기 탐침중에서 선택된 2종 이상의 탐침을 포함한 조성물; (b) 임의로 생물학적 시료중의 폴리핵산을 증폭하는데 사용하는 전방향과 역방향 프라이머 쌍; (c) 상기 조성물에 함유된 탐침과 생물학적 시료중에 존재하는 폴리핵산 또는 이의 증폭된 산물사이에 혼성화 반응을 유도하는 완충액 또는 이러한 완충액을 생성하는데 필요한 성분; (d) 적당한 세척 조건하에서 형성된 하이브리드를 세척하기 위한 용액 또는 이러한 용액을 생성하는데 필요한 성분; 및 (e) 임의로 앞서 형성된 하이브리드를 검출하는 수단을 포함함을 특징으로 하여, 생물학적 시료에서 상기 균중 2종 이상을 동시에 검출 및 동정하기 위한 키 트를 제공한다.

다른 추가의 관점으로, 본 발명은 상기 탐침중에서 선택된 2종 이상의 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다.

다른 추가의 관점으로, 본 발명은 (a) 임의로 생물학적 시료로부터 중에 존재하는 폴리핵산을 분리 및/또는 농축하고, (b) 임의로 폴리핵산을 적절한 전방향과 역방향 프라이머 쌍으로 증폭하고; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)의 폴리핵산을 상기 탐침중에서 선택된 2종 이상의 탐침을 포함한 조성물과 적절한 혼성화 및 세척 조건하에서 접촉시키고; (d) 상기 (c) 단계에서 형성된 하이브리드를 검출하고; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 상이한 혼성화 시그날로부터 시료에 존재하는 균주를 동정함을 특징으로 하여, 상기 생물학적 시료중에서 상기 균중 2종 이상을 동시에 검출 및 동정하는 방법을 제공한다.

용어 정의

다음의 정의는 아래 기술된 바와 같이 본 발명의 다른 양태에서 사용된 용어 및 표현을 설명해 준다.

"분리된" 핵산 분자는 핵산의 천연원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 예를 들면, 게놈 DNA와 관련하여, 용어 "분리된"은 게놈 DNA가 천연적으로 결합하고 있는 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다.

"탐침" 또는 "핵산 탐침"은 검출하고자 하는 표적 염기 서열과 충분히 상보적이어서 혼성화하는 염기 서열을 갖는 일본쇄-특이적 올리고뉴클레오타이드를 가리킨다.

"조성물"은 세균 또는 진균의 rRNA에 상보적인 탐침이 순수한 상태이거나 다른 탐침과 배합되어 있을 수 있음을 의미한다. 또한, 탐침은 염 또는 완충제와 배합되어 건조된 상태, 침전물로서 알코올 용액 또는 수용액의 상태로 있을 수 있다.

"표적"은 본 발명에 따른 탐침중 어느 것과도 상보적인 서열을 갖는 생물학적 시료 유래의 핵산 분자를 의미한다. 표적 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄의 DNA (임의로 증폭 후 수득함)이거나 RNA일 수 있으며 적어도 한 개의 탐침 올리고뉴클레오타이드와 적어도 부분적인 상보성을 갖는 서열을 함유한다.

"생물학적 시료"는 목적하는 표적 서열을 검출하고자 하는 임상 시료 (예, 농즙, 타액, 혈액, 뇨 등), 환경 시료, 세균 콜로니, 오염된 또는 순수한 배양물, 정제된 핵산 등의 검체 (specimen)를 가리킨다.

"폴리핵산"은 적어도 10, 20, 30, 40 또는 50개의 뉴클레오타이드가 연속하고 있는 일본쇄 또는 이본쇄 cDNA 또는 게놈 DNA 또는 RNA에 상응한다. 뉴클레오타이드의 길이가 100개 이하인 폴리핵산은 흔히 올리고뉴클레오타이드라고 한다. 일본쇄 폴리핵산 서열은 본 발명에서 항상 5' 말단으로부터 3' 말단으로 표시된다.

"올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 고분자를 의미한다. 그러나, 뉴클레오타이드의 길이는 100개 이상이거나 10개 이하일 수 있다.

"뉴클레오타이드"는 포스페이트 그룹, 5-탄당 및 질소 염기로 구성된 핵산의 기본 단위이다. RNA에서 5-탄당은 리보스이다. DNA에서 5-탄당은 2-데옥시리보스이다. 5-뉴클레오타이드의 경우, 당은 5-탄당-2에서 하이드록실그룹(-OH)을 함유한 다. 이 용어는 또한 리보스의 2 위치에 메톡시 그룹과 같이 상기 기본 단위의 유사체를 포함한다.

"상동성"은 동일성과 동의어로서, 예를 들면 90% 상동성이라고 하는 폴리핵산은 서열의 배열시 동일한 위치에서 90%의 동일한 염기쌍을 나타내는 것을 의미한다.

"혼성화"는 표적 핵산(검출하고자 하는 서열)에 상보 서열의 교잡(annealing)을 의미한다. 상보 서열을 포함한 두 핵산 고분자가 서로를 발견하고 염기 쌍 상호작용을 통해 교잡하는 능력은 잘 알려진 현상이다.

"프라이머"는 복제하고자 하는 핵산 본쇄에 상보적인 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있는 일본쇄 DNA 올리고뉴클레오타이드 서열을 가리킨다. 프라이머의 길이 및 서열은 이들이 연장 산물의 합성을 개시할 수 있을 정도이면 되는데 바람직하게는 약 5 내지 50개의 뉴클레오타이드로 구성된다. 특정한 길이 및 서열은 목적하는 DNA 또는 RNA 표적의 복잡성뿐만 아니라 온도 및 이온강도와 같은 프라이머 사용의 조건에 의해 결정될 것이다.

"긴축"은 혼성화 및 후속 과정동안의 온도 및 용매 조성을 기술하기 위해 사용된다. 고도의 긴축 조건하에서 단지 고도로 상보적인 핵산 하이브리드가 형성될 것이다. 반대로, 충분한 정도의 상보성이 결여되어서는 하이브리드는 형성되지 않는다. 따라서, 검정 조건의 긴축은 하이브리드를 형성하는 두 핵산 본쇄사이에 필요한 상보성의 양을 결정한다. 긴축은 표적 핵산 및 비표적 핵산과 형성과 형성된 하이브리드간에 안정성의 차이를 최대화하는데서 선택된다.

"상보성"은 개개 본쇄의 왓슨-크릭 염기 쌍사이에 수소 결합을 통해 하이브리드 또는 이본쇄 DNA:DNA, RNA:RNA 또는 DNA:RNA를 형성할 수 있는 DNA 또는 RNA의 일본쇄의 염기 서열에 의해 제공되는 성질을 가리킨다. 아데닌(A)은 통상 티민(T) 또는 우라실(U)과 상보적이고 구아닌(G)은 통상 시토신(C)과 상보적이다.

"부정합"은 하이브리드에서 정상적인 왓슨-크릭 수소 결합을 형성하지 않는 두 뉴클레오타이드의 모든 쌍을 가리킨다.

"표지"는 검출가능한 (바람직하게는 정량가능한) 시그날을 제공하고 핵산에 결합될 수 있는 모든 원자 또는 분자를 가리킨다. 표지는 형광, 방사성, 색도, X-선 회절 또는 흡수, 마그네티즘 등에 의해 검출가능한 시그날을 제공할 수 있다.

"하이브리드"는 상보적인 염기사이의 왓슨-크릭 염기 쌍 또는 비표준 염기 쌍에 의해 두개의 일본쇄 핵산 서열사이에 형성된 복합체이다.

"탐침 특이성"은 표적과 비표적 서열을 구분하는 능력을 기술하기 위한 탐침의 특징을 가리킨다. 이와 관련하여, 탐침이 특이적이다 라고 하는 것은 뉴클레오타이드 서열이 정해진 표적 서열과 혼성화하고 비표적 서열과는 실질적으로 하이브리드하지 않거나 비표적 서열과의 혼성화가 최소로 이루어진다는 것을 의미한다. 탐침 특이성은 서열 및 검정 조건에 의해 좌우된다.

"Tm"은 탐침의 50%가 혼성화 형태로부터 비혼성화 형태로 전환되는 시점의 온도를 가리킨다.

"표준균주"는 시판중에 있거나 용이하게 입수가능한 균주를 가리킨다.

탐침의 동정

균의 검출용 핵산 탐침을 제작하기 위해서는 각 균에만 특이성을 가져야 하는데 이를 위하여 먼저 각 균에 대한 특이 탐침 후보군을 선정한다. 특이 탐침 후보군은 가능한 모든 균들의 염기서열들을 다중 정렬(multiple alignment)을 통해서 일렬로 정렬 비교하여 각 균에만 존재하는 특이적인 염기서열을 별도로 구분하여 그 내부에 존재하는 탐침 후보군을 제작하여 선별한다. 탐침 후보군은 세균의 경우 각 균내의 23S rRNA 유전자 및/또는 ITS 부위 내에서 결정하고, 진균의 경우는 18S rRNA 유전자 부위 내에서 결정한다. 탐침 후보군의 특이성 여부는 먼저 BLAST 검색을 통해 균별간 유사성을 비교하여 확인하고 실제로 혼성화 반응에 균주들을 적용하여 각 균에서만 반응하는 탐침을 후보군 내에서 동정용으로 선별한다. 추가로, 상기와 같이 선별된 동정용 핵산 탐침은 여러 생물학적 시료를 대상으로 하는 임상 시험에 적응하여 민감성을 확인한다.

본 발명에 따라 선별된 핵산 탐침은 적어도 15량체의 올리고뉴클레오타이드이며, 바람직하게는 검출하고자 하는 표적의 완전한 상보서열과 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는다. 본 발명에 따른 각 균의 검출 및 동정용 핵산 탐침의 올리고뉴클레오타이드의 길이는 50개 또는 그 이상도 가능하다. 본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 및 이노신 또는 변형 그룹을 함유한 뉴클레오타이드와 같은 변형된 뉴클레오타이드도 가능하나, 이들은 혼성화 특징에 반드시 영향을 미치지 않아야 한다.

탐침 이용

본 발명의 핵산 탐침은 진단 목적상 생물학적 시료중에서 표적 핵산의 유무 를 시험하는데 있어서 공지된 모든 혼성화 기술, 예를 들면 도트-블롯이라고 하는 필터상에의 포인트 침착 기술(MANIATIS et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), 써던 블롯이라고 하는 DNA 전달 기술 (SOUTHERN, E.M., J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)), 노썬 블롯이라고 하는 RNA 전달 기술에 따라 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산 탐침은 핵산 탐침-기본 검정의 특이성을 높여주는 샌드위치 혼성화 시스템에 사용할 수 있다. 핵산 탐침-기본 검정에서 샌드위치 혼성화의 원리 및 사용은 공지되어 있다(DUNN and HASSEL, Cell, 12: 23-36, 1977; 및 RNAKI et al., Gene, 21: 77-85, 1983). 샌드위치 혼성화 기술은 포획 탐침 및/또는 검출 탐침이 사용되며 이들 탐침은 표적 핵산의 상이한 두 영역과 혼성화할 수 있고 그들 중 적어도 하나 (일반적으로 검출 탐침)가 목적하는 균에 대해 특이적인 표적의 영역과 혼성화할 수 있다. 포획 탐침과 검출 탐침은 적어도 부분적으로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가져야 한다. 직접적인 혼성화 검정이 유리한 역학을 제시하지만, 샌드위치 혼성화는 시그날-대-노이즈 비율이 높다는 점에서 유리하다. 또한, 샌드위치 혼성화는 핵산 탐침-기본 검정의 특이성을 높일 수 있다. 샌드위치 혼성화 과정의 주요 단계를 구성하는 배양 및 후속 세척 단계는 각각 항온, 약 20 내지 65℃에서 실시한다. 핵산 하이브리드는 혼성화된 염기의 수에 의해 좌우되고 (온도는 하이브리드의 크기에 비례하여 증가한다) 또한 혼성화된 염기의 성질 및 각각의 혼성화된 염기의 경우 인접한 염기의 성질에 의해 좌우되는 해리 온도를 갖는 것으로 알려져 있다. 샌드위치 혼성화 기술에서 사용되는 혼성화 온도는 주어진 탐침과 상보적인 서열의 표적사이에 형성된 하이브리드의 반-해리 온도 이하에서 선택되어야 한다. 이러한 반-해리 온도는 간단한 통상의 실험에 의해 결정할 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산 탐침은 경쟁 혼성화 프로토콜에 사용할 수 있다. 경쟁 혼성화에서, 표적 분자는 특정 탐침과 이의 상보체사이에서의 하이브리드 형성과 경쟁한다. 표적이 더 많이 존재할수록 탐침과 이의 상보체사이에 형성된 하이브리드의 양은 줄어든다. 특정 표적이 존재함을 지시하는 양성 시그날은 표적이 첨가되지 않은 시스템과 비교하여 혼성화 반응이 감소하는 것으로 나타난다. 특정 양태로서, 편리하게는 표지되는 특이적 올리고뉴클레오타이드 탐침을 표적 분자와 혼성화한다. 이어서, 혼합물을 특이적 탐침과 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 고정된 미세역가 디쉬 웰에 넣고 계속 혼성화 반응이 일어나도록 한다. 세척 후 상보적인 올리고뉴클레오타이드와 탐침사이의 하이브리드를 바람직하게는 사용된 표지에 따라 정량한다.

또한, 본 발명의 핵산 탐침은 역혼성화 (reversed hybridization) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6230-6234, 1989)에 사용할 수 있다. 이 경우는 우선 표적 서열을 5 바이오티닐화 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 효소적으로 증폭할 수 있다. 두 번째 단계로 증폭된 산물은 고체 지지체상에 고정된 특정 올리고뉴클레오타이드와의 혼성시켜 검출한다. 역혼성화는 증폭하지 않고서 실시할 수 있다. 이러한 경우는 생물학적 시료에 존재하는 핵산은 혼성화이전에 화학적으로나 특정 염료을 첨가하여 특이적으로 또는 비특이적으로 표지 또는 변형시켜야 한다.

본 발명의 핵산 탐침은 상기 본 발명에서 목적하는 병원균의 존재 여부를 신속히 결정하는데 사용할 수 있는 키트에 포함될 수 있다. 키트는 병원균의 존재를 검정하는데 필요한 모든 구성요소를 포함한다. 통상의 개념으로, 키트는 표지된 탐침의 안정한 제제, 표적과 탐침 핵산의 혼성화를 유도하기 위한 무수 또는 액체 형태의 혼성화액, 원치않거나 혼성화되지 않은 핵산을 세척하여 제거하기 위한 용액, 표지된 하이브리드를 검출하기 위한 기질 및 임의로 표지를 검출하기 위한 기기를 포함한다.

본 발명의 한 가지 특정 양태는 샌드위치 검정의 개념을 이용하는 키트를 포함한다. 이 키트는 환자의 특정 부위에서 검체를 수집하기 위한 제1 요소, 예를들면 검체의 스크랩핑 도구 또는 페이터 포인트, 수용 바이알, 분산 및 용해 완충액이 포함된다. 제2 요소는 표적과 탐침 핵산사이의 혼성화를 위한 무수 또는 액체 상태의 매질 및 혼성화되지 않고 원하지 않는 형태를 세척하여 제거하기 위한 매질을 포함한다. 제3 요소는 표적 핵산의 일부에 상보적인 비표지된 핵산 탐침이 고정되어 있거나 결합되어 있는 고체 지지체를 포함한다. 다수의 표적을 분석하는 경우는 개개 자신의 rRNA에 대해 특이적인 한종 이상의 포획 탐침이 딥스틱의 다른 개별 영역에 적용된다. 제4 요소는 제3 요소의 고정되고 비표지된 핵산 탐침이 혼성화되는 동일한 rRNA 본쇄의 제2의 다른 영역에 상보적인 표지된 탐침을 함유한다. 여기서, 핵산 탐침은 동결건조된 핵산과 같은 무수 형태 또는 알코올 침전된 핵산과 같은 침전형태 또는 완충액으로서 탐침의 배합물을 포함한다. 표지된 알려진 어떠한 표지도 가능할 수 있다. 예를 들면, 탐침은 통상적인 수단에 의해 바이오티닐 화할 수 있으며 바이오티닐화된 탐침의 존재는 고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소에 결합된 아비딘을 첨가한 다음, 퍼옥시다제와 반응했을 때 시각적으로 모니터링하거나 색도계 또는 분광계를 이용한 장비로 모니터링할 수 있는 기질과 접촉시켜 검출할 수 있다. 이러한 표지 방법 및 기타 효소 형태의 표지는 방사능 표지방법과 비교하여 경제적이고, 고도로 민감하며, 비교적 안전하다는 이점을 갖는다. 검정 키트의 완성품에는 표지된 탐침의 검출을 위한 여러 시약 및 기타 키트에 포함되는 것들, 예를 들면 지침서, 양성 및 음성 대조군 및 여러 성분을 혼합 반응시키기 위한 용기 등이 포함된다.

DNA 칩

또한, 본 발명의 핵산 탐침은 유전자 칩으로 사용된다. 본 발명의 바람직한 양태는 본 발명의 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다. DNA 칩은 작은 기판상에 여러 염기 서열의 단편이 고밀도로 집적된 것으로 기판에 고정된 DNA와 이에 상보적인 미지의 DNA 시료사이의 혼성화에 의해 미지 시료의 DNA를 검출하는데 사용한다. 탐침을 고정시킬 기판은 유리, 실리콘 등과 같은 무기질이나 또는 아크릴계, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (polyethylene terephtalate, PET), 폴리스틸렌 (polystylene), 폴리카보네이트 (polycarbonate), 폴리프로필렌 (polypropylene) 등과 같은 고분자 물질로 이루어지고, 기판의 표면은 편평하거나 다수개의 구멍(hole)이 있는 것을 사용할 수 있다. 탐침의 고정은 5' 또는 3' 중 어느 한 위치가 기판에 공유결합으로 고정된다. 고정화 방법은 통상의 기술로서 예를 들면 정전기적 힘을 이용하거나, 합성된 올리고상에 아민기를 붙여 알데하이드 코팅된 슬라이드에 붙여 이 둘간의 결합을 유도하거나, 아민기 코팅된 슬라이드상에 혹은 L-라이신이 코팅된 슬라이드상에 혹은 니트로셀룰로즈 막이 코팅된 슬라이드 상에 집적함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명의 한 양태로서, 탐침을 합성할 때 3' 위치에 아민기 (amino residue)를 가진 염기를 삽입하여 알데하이드 잔기로 코팅된 유리판에 공유결합 되도록 한다.

기판 표면에 각기 다른 탐침들을 고정, 배열하는 것은 핀 마이크로어레이, 잉크젯, 포토리소그래피, 전기적 어레이 등의 방법을 사용한다. 본 발명의 한 양태로는 탐침을 완충용액에 용해시킨 상태로 공지방법에 따라 제작된 마이크로어레이어(microarrayer)를 이용하여(Yoon et al, J. Microbiol. Biotechnol., 10(1), 21-26, 2000) 집적한다. 마이크로어레이어의 원리는 미세하게 제작된 핀이 DNA를 플레이트로부터 담아서 기판으로 컴퓨터가 지정한 똑같은 장소에 옮기는 것이다. 마이크로어레이어에 의해 옮겨진 탐침의 고정을 위해 45% 내지 65% 정도, 바람직하게는 50% 내지 55% 정도의 습도가 유지되는 조건에서 탐침의 3' 위치의 아민기와 유리판에 코팅되어 있는 알데히드기 사이의 반응이 원활이 이루어지도록 하기 위해 1시간 이상 반응을 유도하고, 6시간 이상 방치하여 DNA 탐침을 고정시킨다.

생존 유기체로부터 유래된 세포 또는 유기체 자체를 검출하기 위해 필요한 경우 이들 세포를 화학적 및/또는 물리적 방법으로 부분적으로 또는 완전히 용해시켜 그들 세포의 RNA 및/또는 DNA에 접근이 용이하게 만들고 본 발명의 탐침과 접촉시킨다. 접촉은 액체 매질 또는 용액중에서 니트로셀룰로즈, 셀룰로즈 또는 나일론 필터와 같은 적절한 지지체상에서 수행할 수 있다. 이러한 접촉은 최적 조건, 하위 최적 조건 또는 제한 조건하에서 일으킬 수 있다, 이러한 조건은 온도, 반응물 농도, 핵산의 염기쌍 최적 온도를 낮추는 물질 (예, 포름아미드, 디메틸설폭사이드 및 우레아)의 존재 및 반응 부피를 저감시키고/시키거나 하이브리드 형성을 가속하는 물질 (예, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌글리콜 또는 페놀)의 존재를 포함한다.

탐침 제작

핵산 탐침은 통상의 클로닝 방법(Maniatis, T., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982)을 이용하여 목적하는 서열을 클로닝하거나 시판되는 DNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성하여 다량으로 얻을 수 있다.

본 발명의 탐침은 통상적인 방법에 따라 일본쇄 또는 이본쇄로 제작할 수 있다. 일본쇄의 탐침을 얻는 방법으로서 가장 대표적인 예는 자동화학합성기에서 DMT (dimethoxytrityl) 오프 (off) 방식에 의해 합성하여 탈보호 반응을 시행한 후, 원하는 수의 염기로 이루어진 탐침을 합성하는 것이다. 이렇게 제작된 탐침은 합성시 한 쪽 가닥 말단에 FITC (fluorescein isothiocyanate)와 같은 형광물질을 부착하여 특정 핵산의 존재유무를 확인할 수 있다. 다른 방식으로는 일본쇄의 DNA를 주형으로 하여 그와 상보적인 염기서열을 가지는 탐침을 만드는 방법으로, 주형의 DNA에 프라이머를 교잡시키고, 그 프라이머로부터 클레노우(Klenow) 효소와 형광물질이 부착된 염기(dNTP)를 사용하여 탐침을 합성하게 된다. 이는 DNA 내부에 형광물질이 부착하게 되므로, 높은 민감도 및 특이성을 갖는 탐침을 합성할 수 있다. 이 중가닥의 탐침을 얻는 방법으로서, 게놈 DNA 혹은 플라스미드 DNA를 특정 제한효소로 절단하여 원하는 부분의 유전자 혹은 염기부분을 포함한 탐침을 얻을 수 있다. 랜덤 프라이밍(random priming) 방법은 6개의 랜덤 핵사머(random hexamer)와 주형 DNA를 혼성화시킨 후, 형광물질이 부착되어 있는 다양한 길이의 탐침을 합성하는 방법이고, 또 다른 방식으로는 DNA의 5'말단에 ³²P를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(polynucleotide kinase)를 이용하여 옮겨서 형광물질이 부착된 탐침을 합성할 수도 있으며, DNA 분해효소(DNase) I을 이용하여 이본쇄의 DNA에 절단부분을 만든 후, 이 DNA를 주형으로 하여 DNA 중합효소 I과 형광물질이 부착된 염기(dNTP)를 사용하여 탐침을 합성할 수 있다. 이렇게 이중가닥으로 합성된 탐침은 변성(denaturation)과정을 거쳐 일본쇄로 만든 후 혼성화 반응에 사용된다.

본 발명의 탐침은 유리하게는 표지될 수 있다. 어떠한 통상의 표지도 사용할 수 있다. 탐침은 ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I, ³H 및 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소를 사용하여 표지할 수 있다. 방사성 표지는 3 또는 5 위치를 방사성 표지된 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 키나제, 말단 트랜스퍼라제 또는 리가제를 사용하여 말단 표지하는 것과 같은 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 방사성 표지의 다른 방법은 본 발명의 탐침을 화학적으로 요도드화하는 것이며 이러한 요오드화에 의해 탐침상에 수개의 ¹²⁵I 원자가 결합하게 된다. 이와 같이 본 발명의 탐침중 하나가 방사성으로 표지되면 일반적으로 자가방사기록, 액체 신틸레이션, 감마 계수 또는 다른 통상의 방법을 사용하여 방사선을 검출한다. 또한, 본 발명의 탐침은 면역 특성을 갖는 잔 기(예, 항원 또는 합텐), 일부 시약에 대해 특이적 친화성을 갖는 잔기(예, 리간드), 검출가능한 효소 반응을 제공한 잔기(예, 효소, 보조효소, 효소 기질 또는 효소 반응에 참여하는 기질) 또는 어떤 파장에서 형광, 발광 또는 흡광의 물리적 특성을 제공하는 잔기과 결합하여 비방사성 표지될 수 있다. 또한, 탐침과 표적에 의해 형성된 하이브리드를 특이적으로 검출하는 항체를 사용할 수 있다. 비방사성 표지는 본 발명의 탐침을 화학적으로 합성할 때 제공할 수 있다. 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘 및 우라실 잔기는 다른 화학 잔기와 쉽게 결합하며 이에 탐침 또는 탐침과 상보적인 DNA 또는 RNA 단편사이에 형성된 하이브리드의 검출을 가능케 한다.

표적

생물학적 시료에서 세균을 검출하고 동정하는데 사용하기 위한 핵산 기질을 제공하기 위해 시료로부터 핵산을 추출한다. 핵산은 표준 기술 또는 시판되고 있는 키트를 사용하여 다양한 시료로부터 추출할 수 있다. 예를 들면, 조직 시료로부터 RNA 또는 DNA를 분리하는데 사용하는 키트는 Qiagen, Inc. (미국 캘리포니아) 및 Stratagene (미국 캘리포니아)에서 구입할 수 있다. QIAAMP 블러드 키트는 혈액뿐만 아니라 골수, 체액 또는 세포 현탁액으로부터 DNA의 분리를 가능케 한다. QIAAMP 조직 키트는 근육 및 기관으로부터 DNA의 분리를 가능케 한다. 생물학적 시료가 목적하는 균주의 존재를 지시하는 rRNA 또는 rDNA를 함유하는 지의 여부를 결정하는 바람직한 방법으로 핵산을 균주세포로부터 음파 분쇄, 예를 들면 Murphy 등의 미국특허 제5,374,522호에 기술된 방법에 따라 방출시킬 수 있다. 세포를 분쇄 하는 다른 공지 방법으로는 효소 사용, 삼투압 쇼크, 화학 처리 및 유리 비드와의 와동이 포함된다. 균주로부터 핵산을 방출시킬 수 있는 다른 적합한 방법이 Clark 등의 미국특허 제5,837,452호 및 Kacian 등의 미국특허 제5,364,763호에 기술되어 있다. rRNA의 방출 후 또는 방출과 동시에 표지된 탐침을 혼성화 촉진제의 존재하에 첨가하고 최적의 혼성화 온도에서 유의적인 혼성화 반응에 도달하는데 필요한 시간 동안 배양할 수 있다.

표적 핵산이 이본쇄인 경우에는 검출 과정을 이행하기 이전에 변성을 실시하는 것이 바람직하다. 이본쇄 핵산의 변성은 화학적, 물리적 또는 효소적 변성의 공지 방법, 특히 적절한 온도, 80℃ 이상의 온도로 가열함으로써 수행할 수 있다.

또한, 탐침과 혼성화 반응을 하는 표적 DNA는 보통 두 종류의 방법으로 준비될 수 있다. 첫째는, 서던 블럿 또는 노던 블럿시 사용되는 방법으로, 게놈 DNA 혹은 플라스미드 DNA를 적당한 제한효소로 자른 후 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동을 하여 크기별로 DNA 조각을 분리하여 사용한다. 둘째는, PCR 방법을 이용하여 원하는 부분의 DNA를 증폭시켜 사용하는 방법이다. 이때, 사용하는 PCR 방법을 살펴보면, 전방향과 역방향의 프라이머 쌍을 동일한 양을 사용해서 증폭시키는 가장 보편화되어 있는 PCR과 전방향과 역방향의 프라이머 쌍을 비대칭적으로 첨가시켜서 2중 가닥과 단일 가닥의 밴드를 동시에 얻을 수 있는 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR), 여러 가지의 프라이머 쌍을 넣어서 한꺼번에 증폭시킬 수 있는 다중 증폭 방법(Multiplex PCR), 특이적인 4개의 프라이머와 리가아제(Ligase)를 이용해 증폭한 후 효소면역법으로 형광량을 판정하는 리가아제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction; LCR)방법, 이 밖에도 핫스타트 PCR, 네스트 PCR, 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머 PCR, 역전사 효소 PCR, 반-정량적(Semi-quantitative) 역전사 효소 PCR, 실시간 PCR(Real time PCR), SACE(Rapid Amplification of cDNA Ends), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 연쇄반복(short tandem repeats; STR), 단일가닥입체다형화(Single Strand Conformation Polymorphism; SSCP), 동소 PCR, DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcriptase PCR) 등의 방법 등이 있다.

특정 PCR 산물의 증폭을 위한 주형으로서 비교적 균질한 시료(예, 혈액, 세균 콜로니 또는 뇌척수액)가 보다 복합적인 시료(예, 뇨, 타액 또는 배설물)보다 더 적합한 것으로 알려져 있다(Shibata in PCR:The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., Birkhauser, Boston (1994), pp, 47-54). 뇌척수액과 같이 증폭하고자 하는 표적 핵산의 복제물이 비교적 적게 함유된 시료는 PCR에 직접 첨가할 수 있다. 혈액 시료는 적혈구의 억제 특성으로 인해 PCR시 특별히 다루어야 하는데 PCR에 혈액을 사용하기 전에 적혈구 세포를 제거해야 한다. 이 목적을 위해 많은 방법이 이용되고 있으며, 예를 들면 CHELEX 100 컬럼(BioRad) 등을 통과시키는 것과 QIAAMP 블러드 키트를 사용하는 것들이 포함된다. 타액으로부터 핵산을 추출하는 것은 목적하는 균외의 다른 세균 종을 사멸시키거나 성장을 억제하는 사전 정화 과정이 필요하다. 이러한 정화 과정은 시료를 N-아세틸-L-시스테인 및 NaOH로 처리함으로써 달성된다. 이러한 정화과정은 타액 시료를 분석하기 전에 배양할 때만이 필요하다.

본 발명의 바람직한 양태는 분리된 검체의 DNA를 주형으로 하고 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)을 수행하여 단편 유전자를 제작한다. 단편 유전자는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 첨가비율을 1:5로 차별화 함으로써 한번의 중합효소연쇄반응으로 획득한다. 이때 사용한 프라이머는 세균의 경우 공통적으로 16S rRNA내지 23S rRNA에 존재하는 염기 서열 부분으로(Pirkko K. et al., Clin. Micorbiol., 36(8), 2205-2209, 1999) 다음과 같다:

프라이머 1 (센스): TTGTACACACCGCCCGTC (서열번호 406, 1585Fw)

프라이머 2 (안티센스): F-TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT (서열번호 407, 23BR);

프라이머 3 (센스): AGTACCGTGAGGGAAAGGGGAA (서열번호 408, 23BFw)

프라이머 4 (안티센스): F-TGCTTCTAAGCCAACATCCT (서열번호 409, 37R); 및

프라이머 5 (센스): AGGATGTTGGCTTAGAAGCA (서열번호 410, MS37F)

프라이머 6 (안티센스): F-CCCGACAAGGAATTTCGCTACCTT (서열번호 411, MS38R).

이들 프라이머에 대한 대략 위치도는 도 1과 같고 F는 5' 말단에 부착된 FITC 형광물질을 가리킨다. PCR 수행시 탐침과 결합한 DNA를 확인하기 위해 5-FITC가 부착된 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 형광을 통해 결합을 확인함으로써 감염 여부와 감염균의 종류를 알 수 있도록 한다. 또한, 이들 프라이머로 증폭할 수 없는 부분을 얻기 위해 바이오인포메틱스 (Bioinformatics) 방법으로 다중정렬, BLAST를 실시하여 프라이머를 디자인한다.

진균의 경우 사용한 프라이머는 진균류의 18S rRNA에 존재하는 염기 서열 부분으로 본 발명자가 직접 디자인하였고 염기서열은 다음과 같다:

프라이머 1(센스): GTAATTGGAATGAGTACAAT(서열번호 412, fun463F)와

프라이머 2(안티센스): F-CTACGACGGTATCTGATCAT(서열번호 413, fun986R).

본 발명의 바람직한 양태로서 PCR 반응은 10X PCR 완충액(100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl₂) 5ul, dNTP 혼합물(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 각각 2.5mM) 4ul, 10pmole 전방향 프라이머 0.5ul, 10pmole 역방항 프라이머 2.5ul, 1/10로 희석한 주형DNA(100ng) 1ul, Taq 폴리머라제(5unit/ul, Takara Shuzo Co., Shiga, Japan) 0.5ul를 첨가후 총 부피가 50ul가 되도록 물을 첨가한다. 첫 번째 변성은 94℃에서 7분간, 두 번째 변성은 94℃에서 1분간 수행한다. 교잡(annealing)은 52℃에서 1분, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하며, 이를 10회 반복한다. 그 후, 다시 세 번째 변성은 94℃에서 1분, 교잡은 54℃에서 1분, 연장은 72℃ 에서 1분간 수행하며, 이를 30회 반복한다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행한다. PCR 반응결과로 생성된 산물은 아가로스 겔 전기영동법(agarose gel electrophoresis)으로 확인한다.

혼성화 및 세척

혼성화 기술은 본 발명에서 특정적인 것이 아니다. 이 기술은 일반적으로 문헌(Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Ed. Hames, B. D. and Higgins, S. J., IRL Press, 1987; Gall and Pardue (1969), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 63:378-383, and John, Burnsteil and Jones (1969) Nature, 223:582-587)에 기술되어 있다.

혼성화 조건은 긴축(stringency), 즉 작용 조건의 엄격함에 의해 결정된다. 혼성화가 이루어지는 긴축이 고도하면 할수록 혼성화는 더욱 특이적이 된다. 긴축은 특히 탐침/표적 결합체의 염기 조성뿐만 아니라 두 핵산사이의 부정합 정도의 함수이다. 긴축은 또한 혼성화 용액에 존재하는 이온의 농도 및 종류, 변성제의 성질 및 농도 및/또는 혼성화 온도와 같은 혼성화 반응 변수의 함수일 수 있다. 혼성화 반응이 수행되어야 하는 조건의 기축은 특히 사용된 탐침에 의존한다. 모든 이들 데이터는 잘 알려져 있으며 적절한 조건은 개개의 경우에 통상의 실험에 의해 결정할 수 있다. 일반적으로, 사용된 탐침의 길이에 따라 혼성화 반응의 온도는 약 0.8 내지 1 M 농도의 염수 용액중에서 약 20℃ 내지 65℃, 특히 35℃ 내지 65℃이다.

표지된 올리고뉴클레오타이드 탐침과 표적 핵산사이의 혼성화는 Hogan 등의 미국특허 제5,030,557호에 기술된 절차에 따라 비표지된 헬퍼올리고뉴클레오타이드를 사용하여 증가시킬 수 있다. 헬퍼올리고뉴클레오타이드는 탐침에 의해 결합되는 영역외의 다른 표적 핵산의 영역과 결합한다. 이 결합은 일본쇄 핵산의 표적 영역에 새로운 이차 및 삼차 구조를 취해서 탐침의 결합 속도를 가속화한다.

당업자는 탐침과 표적사이에 형성된 하이브리드의 열 안정성에 영향을 미치는 인자들 또한 탐침 특이성에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 탐침과 표적의 하이브리드의 융점 온도를 포함하여 융점 프로필이 각각의 탐침과 표적의 하이브리드에 대해 경험적으로 결정되어야 한다. 이러한 결정은 Arnold 등의 미국특허 제5,283,174호에 기술된 방법에 따라 수행할 수 있다. 탐침과 표적의 하 이브리드의 융점 온도를 결정하는 한 가지 방법은 혼성화 보호 검정을 수행하는 것으로 포함한다. 이 검정 방법에 따르면 리튬 라우릴설페이트를 함유한 리튬 석시네이트 완충 용액중의 과량의 표적의 조건하에서 탐침과 표적의 하이브리드를 형성한다. 미리 형성된 하이브리드의 일부를 혼성화 완충액에 희석하고 예상되는 융점 온도 (전형적으로 55℃) 이하에서 시작하여 2 내지 5℃를 증가시킨 여러 온도에서 5분 동안 배양한다. 그런 후 이 용액을 약알카리성 보레이트 완충액으로 희석하고 보다 낮은 온도 (예, 50℃)에서 10분동안 배양한다. 일본쇄 탐침에 연결된 아크리디늄 에스테르는 이들 조건하에서 가수분해되는 한편 혼성화된 탐침에 연결된 아크리디늄 에스테르는 상대적으로 보호된다. 이 절차를 혼성화 보호 검정이라고 한다. 남아 있는 화학발광의 양은 하이브리드의 양과 비례하며 과산화수소에 이어 알카리를 차례로 첨가하여 발광계측기로 측정한다. 이 데이터를 온도에 대한 최대 시그날 (보통 최저 온도)의 퍼센트로 점적한다. 융점 온도는 최대 시그날의 50%가 남아 있는 포인트로서 정의된다. 다른 방도로서, 탐침과 표적의 하이브리드에 대한 융점 온도는 방사성 동위원소로 표지된 탐침을 이용하여 결정할 수 있다. 모든 경우에 있어서, 주어진 하이브리드에 대한 융점 온도는 혼성화 용액에 함유된 염, 세정제 및 기타 용질의 농도에 의해 다양할 수 있다. 이들 모든 인자는 열변성 동안에 상대적인 하이브리드 안정성에 영향을 미친다(Molecular Cloning: A Laboratory Manual Sambrook et al., eds. Cold Spring Harbor Lab Publ., 9.51 (1989)).

혼성화 조건은 몇 가지의 변수, 예를 들면 혼성화 온도, 매질 성분의 성질 및 농도, 형성된 하이브리드와 세척시 온도 등을 고려하여 모니터링할 수 있다. 혼 성화 및 세척 온도는 탐침의 염기 서열, 종류 및 길이에 따라 상위 값으로 한정하며 최대 혼성화 또는 세척 온도는 약 30℃ 내지 60℃ 이다. 보다 높은 온도에서 혼성화와 탐침과 표적사이에 형성된 하이브리드의 해리 또는 변성과 경쟁한다. 혼성화 매질은 예를 들면 약 3xSSC (1xSSC=0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0), 약 25 mM 인산염 완충액 PH 7.1 및 20% 탈이온 포름아미드, 0.02% 피콜, 0.02% 소혈청 알부민, 0.02% 폴리비닐피롤리돈 및 약 0.1 mg/ml 절삭되고 변성된 연어 정자 DNA를 함유한다. 세척 매질은 예를 들면 약 3xSSC, 25 mM 인산염 완충액 pH 7.1 및 20% 탈이온 포름아미드를 함유한다. 탐침 및 매질의 변형에 따라, 목적하는 특이성을 얻기 위해 혼성화 또는 세척 온도는 알려진 연관성에 따라 바꾸어 주어야 한다(B. D. HAMES and S. J. HIGGINS, (eds.). Nucleic acid hybridzation. A practical approach, IRL Press, Oxford, U.K., 1985). 이러한 관점에서, 일반적으로 DNA:DNA 하이브리드는 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드보다 덜 안정하기 때문에, 검출될 하이브리드의 성질에 따라 혼성화 조건은 특이적 검출을 달성하기 위해 적절히 조정되어야 한다.

본 발명의 바람직한 특정 양태로서, 혼성화 완충용액(6×SSPE (0.15M NaCl, 5mM C₆H₅Na₃O₇, pH 7.0), 20% (v/v) 포름아미드)을 PCR 증폭 유전자와 혼합하고 탐침이 고정된 유리판 위에 분주한 후 30℃에서 6시간 동안 반응시켜 상보적인 결합을 유도한다. 시간이 경과한 후 3×SPE, 2×SSPE, 1×SSPE 순으로 각각 5분씩 세척한다.

하이브리드의 정량은 통상적인 방법에 따라 표적을 상기된 탐침에서와 같이 형광 혹은 방사성 동위원소로 표지하여 이루어 질 수 있다. 표지는 프라이머 자체에 할 수도 있고 증폭 및 전사시에 형광 및 방사성 동위원소가 표지된 염기 잔기를 사용함으로써 이루어질 수 있다.

진단 용도

본 발명의 탐침은 키트, 특히 DNA 칩에 한종으로 적용하여 해당 균을 고도의 특이성으로 검출함으로서 각 균에 의해 유발되는 감염 질환을 단독으로 정확하게 진단할 수 있거나 2종 이상의 탐침을 적용함으로써 2종 이상의 감염 질환 원인균을 고도의 특이성으로 검출함으로서 그들 균에 의해 유발되는 감염 질환을 동시에 정확하게 진단할 수 있다. 본 발명에 따른 균에 의해 유발되는 감염 질환은 많은 문헌을 통해 잘 알려져 있으며 예를 들면 다음과 같다:

아시네토박터 바우마니 균은 인체의 모든 장기에 화농성 감염(Glew RH. et al., Medicine (Baltimore). 56, 79-97, (1977)), 요도관이나 요로 결석과 관련되어 신우신염과 방광염(Glew RH et al., Medicine (Baltimore), 56, 79-97, (1977)), 뇌막염(Berk SL et al., Arch. Neurol. 38, 95-98, (1981)), 봉와직염(Gervich DH et al, Am. J. Infect. Control, 13, 210-215, (1985)), 창상감염(Tong MJ. JAMA. 219, 1044-1047, (1972)), 괴사성 근막염(Amsel MB et al., Curr. Surg. 42, 370-372, (1985)), 내안구염 (Peyman GA et al., Am. J. Ophthalmol. 80, 764-765, (1975)), 심내막염 (Gradon JD, et al., Clin. Infect. Dis. 14, 1145-1148, (1992)), 골수염, 세균성 관절염, 간농양, 췌장 농양(Henricksen SD. Bacteriol. Rev. 37, 522-561, (1973)) 등을 일으키고;

언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 균은 임상적으로는 주로 균혈증(Tee W et al., J. Clin. Microbiol. 36(5), 1209-1213, (1998)), 패혈증(Marcus L et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15(9), 741-744, (1996)), 설사(Malnick H et al., J. Clin. Pathol., 36(10), 1097, (1983) 등을 일으키고;

박테로이데스 프라질리스 균은 중추신경계에서 뇌막염(Feder HM. Rev. Infect. Dis. 9, 783-786, (1987)), 뇌농양, 경막하축농 또는 경막외 농양(Swartz MN. In: Finegold SM, George WL, eds. Anaerobic infections in humans. New York: Academic; 155-212, 1989), 만성 부비동염 (Frederick J et al., N. Engl. J. Med. 290, 135-137, (1974)), 복강 내 감염(Gorbach SL. Clin. Infect. Dis. 17, 961-967, (1993)), 간농양(Rubin RH et al., Am. J. Med. 57, 601-610, (1974)), 균혈증(Lombardi DP et al., Am. J. Med, 92, 53-60, (1992); Chow AW. et al., Medicine (Baltimore) 53, 93-123, (1974); 및 Redondo MC et al., Clin. Infect. Dis., 20, 1492-1496, (1995)), 심내막염(Felner JM et al., N. Engl. J. Med. 282, 1188-1192, (1970); Nastro LJ et al., Am. J. Med., 54, 482-496, (1973); 및 (Nastro LJ et al., Am. J. Med., 54, 482-496, (1973)), 창상 감염, 개와 사람으로 물린 창상, 괴사성 근막염, 당뇨병성 괴양 또는 봉와직염(Gerding D. Clin. Infect. Dis. 20(Suppl 2), S283-S288, (1995)), 만성 골수염, 세균성 관절염(Rosenkranz P et al., Rev. Infect. Dis. 12, 20-30, (1990)을 일으키고;

카디오박테리움 호미니스 균은 심내막염(Traveras J.Md. et al., South. Med. J., 86, 1439-1440, (1993)), 합병증으로 전신에 색전증 및 뇌에 동맥류, 심부전을 일으키고;

크리서박테리움 메닌고셉티쿰 신생아에서 뇌막염(Plotkin S.A. et al., JAMA. 198, 194-196, (1966); Pokrywka M. et al., Am. J. Infect. Control, 21, 139-145, (1993)), 호흡기 감염(Brown R.B. et al., Am. J. Infect. Control, 17, 121-125, (1989)), 패혈증, 심내막염, 봉와직염, 창상 감염, 복강 농양, 복막염, 내안구염(Olsen H. et al., Lancet, 1, 1294-1296, (1965); Sheridan R.L. et al., Clin. Infect. Dis., 17, 185-187, (1993)) 등을 일으키고;

클로스트리디움 람모섬 균은 염증성 장 질환(Senda S, et al., Microbial Immunol 1985;29(11):1019-28), 뇌농양(An Med Interna. 1998 Jul;15(7):392-3), 신장이식을 받은 환자에게 폐혈성 동맥성 색전 (Transplant Proc. 1983 Jun;15(2):1715-9) 등을 일으키고;

코마모나스 아시도보란스 균은 약물 남용자에게 심내막염(Horowitz H. et al., J. Clin. Microbiol., 28, 143-145, (1990))을 일으키고;

코리네박테리움 디프테리애 균은 호흡기 디프테리아(Dobie RA, et al., JAMA. 1979;242:2197-2201), 심근염(Boyer NH, et al., N Engl J Med. 1948;239:913.), 안구운동과 섬모의 마비(Kallick CA, et al., III Med J. 1970;137:505-512; 및 Naiditch MJ, et al., Am J Med. 1954;17:229-245), 얼굴과 인두 그리고 후두의 기능 장애, 말초신경염, 피부 디프테리아 (Koopman JS, et. al., J Infect Dis. 1975;131:239-244), 심내막염(Tiley SM, et al., Clin Infect Dis. 1993;16:271-275), 진균 동맥류(Gruner E, et al., Clin Infect Dis. 1994;18:94-96), 골수염(Patey O, et al., J Clin Microbiol. 1997;35:441-445) 및 관절염(Patey O, et al., J Clin Microbiol. 1997;35:441-445.)을 일으키고;

크레브시엘라 옥시토카 균은 폐렴(Korvick JA et al., South. Med. J. 84(2), 200-204, (1991); 및 Al-Moamary MS et al., Clin. Infect. Dis. 26(3), 765-766, (1998)), 소아에서 급성 신우신염(Ghiro L et al., Nephron. 90(1), 8-15, (2002)), 신생아 중환자실에서 돌연사(outbreak)(Jeong SH et al., J. Hosp. Infect, 48(4), 281-288, (2001)), 장염(Soussi F et al., Gastroenterol. Clin. Biol. 25(8-9), 814-816, (2001)을 일으키고;

오크로박트룸 안트로피 균은 혈관내 도관과 관련된 균혈증(Kern W.V. et al., Infection, 21, 306-310, (1993)), 심내막염(Mahmood M.S. et al., J. Infect., 40, 287-290, (2000)), 내안구염(Berman A.J. et al., Am. J. Ophthalmol., 123, 560-562, (1997)), 췌장 농양, 괴사성 근막염(Brivet F. et al., Clin. Infect. Dis., 17, 516-518, (1993)), 연골염(Barson W.J. et al., J. Clin. Microbiol., 25, 2014-2016, (1987)) 등을 일으키고;

펩토스트렙토코코스 프레보티 균은 인체 내에서 여러 가지 농양(예, 뇌농양), 만성 중이염, 급성 유양돌기염, 만성 부비동염, 폐렴, 폐농양, 농흉, 여성 생식기 감염증(Murdoch DA et al., J. Med. Microbiol. 41, 36-44, (1987)), 균혈증(Brook I, J. Infect. Dis. 160, 1071-1075, (1989)), 골수염, 척추 골수염, 유방염, 봉와직염, 괴사성 근막염(Murdoch DA, Clin. Michrobiol. Rev., 11, 81-120, (1998)), 당뇨병성 족부 감염(Wren MWD, Br. J. Biomed. Sci., 53, 294-301, (1996)), 산후 패혈증과 인공관절과 관련된 세균성 관절염(Brook I et al., Am. J. Med. 94, 21-28, (1993)), 심내막염, 심장 판막 주위 농양, 세균성 심막염, 종격염(Murdoch DA, Clin. Microbiol. Rev., 11, 81-120, (1998), 구강내 감염(Finegold SM, New York: Academic; 1977)을 일으키고;

포피로모나스 진지발리스 균은 구강내 감염, 치주 농양, 치주염, 급성 괴사성 괴양성 치주염(Darby I et al., Periodontol. 2000, 26, 33-53, (2001)), 유방 농양(Edmiston CE et al., J. Infect. Dis., 162, 695-699, (1990)), 만성 골수염(Brook I. et al., Am. J. Med. 94(1), 21-28, (1993)), 인후염(Brook I., J. Fam. Pract., 38(2), 175-179, (1994)), 폐렴, 폐농양, 농흉, 중이염, 창상 감염, 복막염, 조갑주위염, 만성 부비동염(Brook I., J. Med. Microbiol. 42(5), 340-347, (1995)), 질염, 골반내 감염(Buerden BI, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 6(2-3), 223-227, (1993)), 균혈증(Lee SC et al., J. Microbiol. Immunol. Infect. 32(3), 213-216, (1999)), 심내막염(van Winkelhoff AJ et al., Periodontol. 2000, 20, 122-135, (1999)) 등을 일으키고;

*펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 균은 농양(Murdoch D. A. et al., J Med Microbiol 1994; 41: 36-44; Brook I., J Urol 1989; 141: 889-893; Brook I., Ann Otol Rhin Laryngol 1998; 107: 959-960; 및 Civen R. et al,, J Oral Pathol Med 2000; 29: 507-513), 치질 감염(Brook I. and Frazier E. H., Am J Gastroenterol 1996; 91: 333-335), 연부조직 감염(Brook I. and Frazier E. H., Arch Surg 1990; 125: 1445-1451), 심내막염(Montejo M. et al., Clin Infect Dis 1995; 20: 1431), 치은염과 치주염(Moore LVH, et al., J Dent Res 1987; 66: 989-995; 및 Wade WG, et al., J Clin Periodontol 1992; 19: 127-134), 등을 일으키고;

펩토스트렙토코커스 마그누스 균은 화농성 비인두염(Brook, I., et al., Arch. Otolaryngol. Head eck Surg. 122:4184, 1996), 농흉(Civen, R., H. et al., Clin. Infect. Dis. 20(Suppl. 2):S224S229, 1995; Marina, M., C. et al., Clin. Infect. Dis. 16(Suppl. 4):S256S262, 1993; 및 Murdoch, D. A., et al., J. Med. Microbiol. 41:3644, 1987), 괴사성 폐렴, 간농양(Brook, I. and E. H. Frazier. Pediatr. Infect. Dis. J. 12:743747, 1993), 몸통 표면 감염(Brook, I. and E. H. Frazier. Arch. Surg. 125:144514, 1990), 당뇨성 족부질환의 감염(Sanderson, P. J., Clin. Pathol. 30:266268, 1977), 급만성 비임신성 유방 농양, 봉와직염(Brook, I., and E. H. Frazier., Arch. Surg. 130:786792, 1995), 심내막염(Cofsky, R. D., and S. J. Seligman. 1985. Peptococcus magnus endocarditis. South. Med. J. 78:361362; 및 Pouedras, P., et al., Clin, Infect. Dis. 15:185), 뇌막염(Brown, M. A., et al., Am. J. Med. Sci. 308:18418, 1994), 골수염(Brook, I., and E. H. Frazier., Am. J. Med. 94:22128, 1993), 패혈증성의 관절염(Fitzgerald, R. H., et al., Clin. Orthoped. 164:14114, 1982), 화농성 심막염(Phelps, R., et al., JAMA 254:9479, 1985), 부비동염, 소아 중이염(Brook, I. 1994. Peptostreptococcal infection in children. Scand. J. Infect. Dis. 26:503510. and Clin. Microbiol. Rev. 8:4794) 등을 일으키고;

푸소박테리움 네크로포룸 균은 구강, 장관과 질내 감염(Mandell: Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th ed., Copyright 2000 Churchill Livingstone, Inc p.2564-2566), Lemierre's 증후군 (Bilateral Lemierre's syndrome: a case report and literature review.Ear Nose Throat J. 2002 Apr;81(4):234-6, 238-40, 242)을 일으키고;

프로테우스 불가리스 균은 요로 감염(Silverblatt FJ. J Exp Med. 1974;140:1696; 및 Wray SK, Hull SI, Cook RG, et al. Proteus mirabilis. Infect Immun. 1986;54:43-49; 및 Mobley HL, Chippendale GR. J Infect Dis. 1990;161:525-530), 수막염, 해면체 정맥 혈전증(Bodur H, Colpan A, Gozukuck R et al.Scand J Infect Dis. 2002;34(9):694-6)을 일으키고;

엔테로박터 에어로게네스 균은 심부 감염(De Gheldre Y, Maes N, Rost F, et al. J Clin Microbiol. 1997;35:152-160), 비정형 폐렴(Holden DA, Stoller JK. Department of Pulmonary Disease, Cleveland Clinic Foundation, Ohio, West J Med 1992 Jan;156(1):79-824) 등을 일으키고;

스트렙토코커스 뮤탄스 균은 심내막염(Infective Endocarditis in Adults Eleftherios Mylonakis, M.D., and Stephen B. Calderwood, M.D. In New England Journal of medicine Volume 345:1318-1330 November 1, 2001), 균혈증(Elting LS, Bodey GP, Keefe BH. Clin Infect Dis. 1992;14:1201-1207), 뇌막염(Hoyne AL, Herzon H. Ann Intern Med. 1950;33:879-902), 폐렴(Lorber B, Swenson RM. Ann Intern Med. 1974;81:329-331), 급성 화농성 침샘염(Raad II, Sabbagh MF, Caranasos GJ. Clin Infect Dis. 1990;12:591-601), 구강안면치원성 감염(Gill Y, Scully C. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1990;70;155-158), 내안구염(Principles and Practice of Infectious Diseases. 5th edition. Handell, Churchill Livingstone p.217), 중이염, 부비동염(Gaudreau C, Delage G. Rousseau D, et a. Can Med Assoc J. 1981;125:1246-1249) 등을 일으키고;

킨젤라 킨갭 균은 감염성 관절염, 골수염(Amir J, Schockelford PG, J Clin Microbiol. 1991;29:1083-1086; 및 Woolfrey BF, Lally RT, Faville RJ. Am J Clin Pathol. 1986;85:745-749), 심내막염(Wolff AH, Ullman RF, Strampfer MJ, Cunha BA. Heart Lung. 1987;16:579-583; Rabin RL, Wong P, Noonan JA, Plumley DD. Am J Dis Child. 1983;137:403-404; 및 Verbruggen A-M, Hauglustaine D, Schildermans F, et al. J Infect. 1986;13:133-142), 균혈증(Yagupsky P, Dagan R. Pediatr Infect Dis J. 1994;13:1148-1149; Birgisson H, Steingrimsson O, Gudnason T. Scand J Infect Dis. 1997;29:495-498; Roiz MP, Peralta FG, Arjona R. J Clin Microbiol, 1997;35:1916; Yagupsky P, Dagan R. Clin Infect Dis. 1997;24:860-866; 및 Redfield DC, Overturf GD, Ewing N, Powars D. Arch Dis Child. 1980;55:411-414), 폐렴, 후두덮개염, 뇌막염, 농양, 눈의 감염(Yagupsky P, Dagan R, Howard CW, et al. J Clin Microbiol. 1992;30:1278-1281; Kennedy CA, Rosen H. Am J Med. 1988;85:701-702; 및 Mollee T, Kelly P, Tilse M. J Clin Microbiol. 1992;30:2516-2517) 등을 일으키고;

박테로이데스 오바투스 균은 뇌막염, 뇌농양, 인두염, 이하선염, 복부내 감염, 설사, 여성 생식기 감염, 골수염, 패혈증성 관절염(Handell 5th , chapter 237 Bacteroides, Prevotella. Porphyromonas, and Fusobacterium Species and Other Medically Important Anaerobic Gram-Negative Bacilli, p, 2561- 2570)등을 일으키고;

박테로이데스 테타이오타오미크론 균은 항생제와 연관된 장염(George WL, Rolfe RD, Finegold SM. J Clin Microbiol. 1982;15:1049-1053; 및 Smith JA, Cooke DL, Hyde S, et al. J Med Microbiol. 1997;46:953-958)을 일으키고;

해모필러스 아프로필라스 균은 국소적으로 머리나 호흡기 감염, 부비동염, 중이염, 폐렴(Kiddy K, Webberley J. J Infect. 1987;15:161-163), 농흉, 균혈증, 심내막염(Geraci JE, Wilkowske CJ, Wilson WR, et al. Mayo Clin Proc. 1977;52:209-215), 감염성 관절염, 골수염(Petty BG, Burrow CR,Robinson RA, et al. Am J Med. 1985;78:159-162), 연조직 농양, 창상 감염, 괴사성 근막염, 뇌막염(Petty BG, Burrow CR, Robinson RA, et al, Am J Med. 1985;78:159-162), 뇌 농양(Kilian M., J Gen Microbiol. 1976;93:9-62; Page MI, King EO. Engl J Med. 1966;275:181-188; Sutter VL, Finegold SM. Ann NY Acad Sci. 1970;174:468-487; Kraut MS, Attebery HR, Finegold SM, et al. J Infect Dis. 1972;126:189-192; Elster SK, Mattes LM, Meyers BR, et al. Am J Cardiol. 1975;35:72-79; 및 Bieger RC, Brewer NS, Washington JA II, Medicine(Baltimore). 1978;57:345-355) 을 일으키고;

나이세리아 고노헤아 균은 남성의 생식계에서 급성 요도염, 급성 부고환염, 생식기 주변 림프염, 요도주위 농양, 급성 전립선염, 타이슨샘과 카우퍼샘의 감염질환(Cohen MS, Cannon JG, Jerse AE, et al. J Infect Dis. 1994;169:532-537), 여성의 생식계에서 자궁경부염과 요도염, 수란관염(Platt R, Rice PA, McCormack WM. JAMA. 1983;250:3205-3209), 동성애자에서 항문직장 임질, 인두임질(Handsfield HH, Knapp JS, Diehr PK, et al. Sex Transm Dis. 1980;7:1-5), 안구감염, 급성 구개염, 구강 궤양, 피부 감염, 구강내 농양, 골반 염증성 질환(Quinn TC, Stamm WE, Goodell SE, et al. N Engl J Med. 1983;309:576-582) 등을 일으키고;

아이케넬라 코로덴스 균은 사람이 무는 것(Goldstein EJC. Clin Infect Dis. 1992;14:633-640), 두경부 감염(Tveteras K, Kristensten S, Bach V, et al. J Laryngol Otol. 1987;101:592-594), 호흡기 감염(Suwanagool S, Rothkopf MM, Smith SM, et al. Arch Intern Med. 1983;143:2265-2268), 부인과적 감염(Jeppson KG, Reimer LG. Obstet Gynecol. 1991;78:503-505; Drouet E, De Montclos H, Boude M, et al. Lancet. 1987;2:1089), 폐감염(Joshi N, O'BryanT, Appelbaum PC. Rev Infect Dis. 1991;13:1207-1212), 심내막염(Decker MD, Graham BS, Hunter EB, et al. Am J Med Sci. 1986;292:209-212) 등을 일으키고;

박테로이데스 불가투스 균은 뇌막염, 뇌농양, 인두염, 이하선염, 복부내 감염, 설사, 여성 생식기 감염, 골수염, 패혈증성 관절염(Mandell 5th, chapter 237 Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas, and Fusobacterium Species and Other Medically Important Anaerobic Gram-Negative Bacilli, p. 2561- 2570)을 일으키고;

브란하멜라 카타르할리스 균은 중이염(Stenfors L-E, Raisanen S. J Laryngol Otol. 1990;104:749-757), 하부기도 감염, 만성 폐쇄성 호흡기 질환자의 급성 악화(Verghese A, Roberson D, Kalbfleisch JH, Sarubbi F. Antimicrob Agents Chemother. 1990;34:1041-1044), 폐렴(Collazos J, de Miguel J, Ayarza R. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1992;11:237-240), 호흡기 감염(McKenzie H, Morgan MG, Jordens JZ, et al. J Med Microbiol, 1992;37:70-76), 부비동염(Pentilla M, Savolainen S, Kuikaanniemi H, et al. Acta Otolaryngol (Stockh). 1997;(Suppl) 529:S165-S168), 균혈증(Ioannidis JPA, Worthington M, Griffiths JK, Snydman DR. Clin Infect Dis. 1995;21:390-397)을 일으키고,

수테렐라 와즈워텐시스 균은 충수돌기염, 복막염, 복강내 농양(Clin Infect Dis. 1997;25(Suppl 2):S88-S93)을 일으키고;

캔디다 알비칸스 균은 아구창(Schultz, F.W 1925. Am.J.Dis.Child, 29;283-285), 설염(Bassiouny, A et al. 1984. J.Laryngol.Otol.,98; 609-611), 구내염(Olsen, et al. 1978. Scand.J.Dent.Res, 86;392-398), 질염(Ryley,J.F, J.Med.Vet.Mycol., 24;5-22, 1986), 기관지 폐렴(Plummers,N.S. 1966 Symposium on Candida Infection. London, Churchill Livingstone,pp214-220), 식도염, 위염, 장염(Trier,J.S 1984. Am.J.Med.,77;39-43), 만성적 점막캔디다증(Jorizzo,J.L.1982. Arch. Dermatol., 118; 963-965), 조갑 진균증(Ray, T.L et al.1978. Int.J.Dermatol.,17;603-690), 기저귀 관련 질환(Leyden,J.J 1978. Arch. Dermatol.,114;56-59), 캔디다 육아종(Imperator,P.J 1968. Arch. Dermatol., 97;139-146), 심내막염(Ben Joseph, 1985. Harefuah,108;72-73), 비뇨기계 감염(Goldberg,P.K 1979. J.Am.Med.Assoc.,241;582-584), 수막염(Roessman.1967. Arch.Pathol.,84;495-498), 패혈증(Ashcraft,K 1970. J.Am.Med.Assoc.,217;454-456), 습진(Drouet, M. 1985. Allergie Immunol., 17;13-18), 천식(Wengrower,D et al. 1985. Respiration, 47; 209-213) 등을 일으키고;

캔디다 글라브라타 균은 진균증(Block, C. S., Young, C. N. and Myers, R. A. M. 1977. S. Afr. Med. J 51, 632∼636), 궤사성 화농성 염증, 육아종성 반응(Francis W. Chandler, Williams Kaplan et al. A Colour Atlas and Textbook of the Histopathology of Mycotic Disease. Wolfe Medical Publications Ltd. pp45), 패혈증(Minkowitz, S., D. Koffler, et al. 1963. Am. J. Med., 34:252∼255), 신우신염(Newman, D. M., and J. M. Hogg, et al. 1969. J. Urol., 102:547∼548), 호흡기 감염(Oldfiekld, F. S. J., L. Kapica, et al. 1968. Can. Med. Assoc. J., 98:165∼168), 심내막염(Carmody, T. J., K. K. Kane. 1986. Heart Lung, 15:40∼42; Heffner, D.K., and W. A. Franklin. 1978. Am. J. Clin. Pathol., 70:420∼423; Lees, A. W., S. S. Rau, et al. 1971. Lancet, 1:943∼944), 뇌수막염(Wickerham, L. J. 1957. J. Am. Med. Assoc., 165:47∼48), 안구내염(Larson, P. A., R. L. Lindhstrum, et al. 1978. Arch. Ophthalmol., 96:1019∼1022)을 일으킨 다.

이하, 본 발명을 하기 실시예로 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되서는 안될 것이다.

(실시예)

실시예 1

균의 23S rDNA 및 ITS 염기 서열 결정

하기의 균주를 표 1에 기술된 바와 같이 직접 구입하여 각 표준균주의 23S rDNA 및 ITS의 전체 염기 서열을 결정하였다.

균주를 배양하고 GIAmp DNA mini kit (QIAGEN, USA)을 이용하여 염색체 DNA를 추출하였다. 염기서열을 결정하기 위하여 추출한 DNA를 주형으로 하여 알려져 있는 각 균의 16S, ITS, 23S rDNA 부위를 다중 정렬 (multiple alignment)과 BLAST를 실시하여 상기 예시된 것중 공지된 모든 균에 공통적으로 가지고 있는 공통 프라이머를 제작하였다. 제작된 공통 프라이머 중 ITS부위를 증폭할 수 있는 16S 부위의 공통 프라이머 (1585Fw; 5-TTGTACACACCGCCCGTC)(서열번호 406)와 23S 부위의 공통 프라이머 중 520R, 23S 750F(T), 23S 750F, 970F, 930R, 2960R(T) 및 2960RC는 본 발명자가 직접 제작하였고 나머지 프라이머는 알려져 있는 23S rDNA의 공통 프라이머 (Anthony. R. M., et al., J. Clin. Microbiol. 38(2), 781-788, 2000)를 제작하여 사용하였다. 염기서열 분석시 사용된 제작된 공통 프라이머의 서열 및 그들의 대략적인 위치는 아래 표 2와 같다.

염기서열을 결정하기 위하여 이들 공통 프라이머를 사용하여 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고 PCR을 수행하여 산물을 정제하였다. ITS부분과 23S앞부분의 염기서열을 결정하기 위해서, 알려져 있는 균의 16S rDNA를 가지고 다중 정렬(multiple alignment)과 BLAST를 실시하여 상기 예시된 것중 공지된 모든 균에 공통적으로 가지고 있는 16S rDNA 염기서열 부분을 선정하여 1585Fw 프라이머를 제작 하였고, 23BR의 프라이머와 함께 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 첫 번째 변성은 94℃에서 7분간, 두 번째 변성은 94℃에서 1분간 수행하였다. 교잡은 52℃에서 1분, 연장은 72℃에서 1분간 수행하였으며, 이를 10회 반복하였다. 그 후, 다시 세 번째 변성은 94℃에서 1분, 교잡은 54℃에서 1분, 연장은 72℃에서 1분간 수행하였으며, 이를 20회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. PCR 반응결과로 생성된 산물은 아가로스 겔 전기영동법으로 확인하였다. 증폭된 PCR 산물을 정제하고 DNA 자동 스퀀서(Perkin Elmer, ABI prism 3700 sequencer)로 분석하고자 하는 염기서열의 부위에 따라 적절한 프라이머를 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 염기서열의 분석시 사용된 프라이머는 일차적으로 제작된 공통 프라이머를 적용하였고 다음으로는 얻어진 염기서열을 기초로 520R, 23S 750F, 23S 750F(T) 프라이머를 제작하여 염기서열을 분석하였다. 상기의 23S rDNA 염기서열의 다음부분을 결정하기 위해서 23BFw와 MS38R을 가지고 PCR을 수행하였다.

PCR조건은 상기의 조건과 동일하게 수행하였고, 이것으로 얻어진 염기서열을 바탕으로 970F와 930R의 프라이머를 가지고, 염기서열을 분석하였다. 23S rDNA의 나머지 부분의 염기서열을 결정하기 위해서 기존의 알려져 있는 균들의 23S rDNA의 염기서열을 가지고 다중 정렬 (multiple alignment)과 BLAST를 실시하여 상기 예시된 것중 공지된 모든 균에 공통적으로 가지고 있는 2960R(T), 2960RC 프라이머를 제작하였다. 이 프라이머와 MS37F를 가지고 상기와 동일 조건의 PCR을 수행하였고, 이 프라이머를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 이에 따라 결정된 각 균의 23S rDNA 및 ITS의 전체 염기 서열은 서열번호 1 내지 28로 기재되어 있다.

실시예 2

균을 동정하기 위한 DNA 탐침 후보군의 선별

각 균의 존재 여부 및 동정을 확인하기 위해서 각 균에만 특이적인 탐침을 제작하였다. 특이 탐침의 제작을 위해서는 각 균에만 특이성을 가져야 하는데 이를 위하여 먼저 그 균에 대한 특이 탐침 후보군을 선정하였다. 특이 탐침 후보군은 상기 실시예 1에서 동정되었거나 GenBank에 공지된 각 균의 23S rRNA 및 ITS 염기 서열과 함께 지금까지 밝혀진 가능한 모든 세균들의 염기서열들을 다중 정렬을 통해서 일렬로 정렬 비교하여 각 균에만 존재하는 특이적인 염기서열을 별도로 구분하여 그 내부에 존재하는 탐침 후보군을 제작하였다. 탐침 후보군은 세균의 경우 23S rRNA 유전자 및/또는 ITS 부위, 진균의 경우 18S rRNA 유전자 부위 내에서 결정하였다. 탐침 후보군의 특이성 여부는 BLAST 검색을 통해 균별간 유사성을 비교하여 확인하였다. 결과로서, 선별된 탐침 후보군은 하기 표 4 내지 49에 수록되어 있다.

실시예 3

핵산 탐침의 합성

DNA 칩에 적용하기 위해 상기 실시예 2에서 선별된 각 탐침 후보군을 합성하였다. 모노뉴클레오타이드(Proligo Biochemie GmbH Hamburg Co.)를 자동화 합성기(Expedite^TM 8900, PE Biosystems Co.)에 투입하고 목적하는 탐침의 염기서열과 스케일을 입력하여 각각 0.05 umole의 순수한 핵산 탐침을 수득하였다. 수득된 탐침 은 전기영동을 하여 합성 여부를 확인하였다.

실시예 4

DNA 칩의 제작

DNA 탐침을 고정화하기 위해서는 알데히드기-아민기 사이의 결합을 이용하였다. DNA 탐침을 고정화하기 위해 모든 DNA 단편 탐침을 합성할 때, 3-첫번째 위치에 아미노링커컬럼(Aminolinker column, Cruachem, Glasgrow, Scotland)을 이용하여 아민기(amino residue)를 가진 염기를 삽입하였고, 유리판(slide glass)은 알데히드기(aldehyde residue)로 코팅화되어 있는 것을 구입(CEL Associates, Inc. Huston, Texas, USA)하였다.

탐침을 고정시킬때는 탐침을 3X SSC (0.45 M NaCl, 15 mM C₆H₅Na₃O₇, pH 7.0) 완충 용액에 용해시킨 상태로 공지 기술에 따라 제작한 마이크로어레이어(microarrayer)를 이용 (Yoon. S. H., et al, J. Microbiol. Biotechnol. 10(1), 21-26, 2000-이 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다)하여 스폿팅한 후, 55% 정도의 습도가 유지되는 조건에서 1시간 이상 화학 반응을 유도하고 6시간 이상 방치함으로써 DNA 탐침을 고정화하였다. 균 검색용 탐침은 100 pmole의 농도로 전체 탐침을 280 ㎛ 간격을 두고 순서대로 집적화시켜 탐침이 고정된 DNA 칩을 제작하였다.

탐침의 아민기와 유리판 위의 알데히드 사이의 반응이 원활히 이루어져 고정화가 잘 이루어졌는지 확인하기 위해 사이브로 그린 II (SYBRO green II, Molecular Probe, Inc., Leiden, Netherlands)로 염색하여 확인하였다.

실시예 5

표적 시료의 분리 및 증폭

실시예 1에 기술된 28종의 표준균주를 포함하여 하기 표 3에 수록된 31종의 표준균주로부터 게놈 DNA를 별도로 추출하였다:

적정 배지에 키운 균을 200㎕ 멸균된 증류수에 현탁하여 14,000rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 상층액을 버리고 펠렛만 남겼다.

그람 음성균인 경우, ATL용액(Tissue Lysis용액, DNeasy Tissue Kit, QIAGEN) 180㎕에 부유시키고, Proteinase K 20㎕를 넣어 용균한 후 55℃ 에서 1시간 배양하였다. 15초간 와동(vortexing)을 한 후 AL용액 (Lysis용액, DNeasy Tissue Kit, QIAGEN) 200㎕를 넣어 섞은 후 70℃에서 10분간 배양하였다. 에탄올(100%) 200㎕을 넣고 섞은 후 DNeasy 미니 컬럼이 들어 있는 2-ml 튜브에 전용액을 옮겨 8,000rpm이상에서 1분간 원심분리하여 튜브에 모이는 액을 버렸다. AW1용액(Wash용액1, DNeasy Tissue Kit, Qiagen) 500㎕를 넣고 8,000rpm 이상에서 1분간 원심분리하여 유출물을 버리고 다시 AW2용액(Wash용액2, DNeasy Tissue Kit, QIAGEN) 500㎕를 넣어 전속(full speed)에서 3분간 원심분리하여 DNeasy 막을 말리고, 유출물을 버렸다. DNeasy 미니 컬럼을 넣어 실온에서 15분간 정치한 후 8,000rpm이상에서 1분간 원심분리하여 게놈 DNA를 용출하였다.

그람 양성균(표준균주)의 경우, 리소자임 용균 용액(20mm Tris-Cl, pH8.0, 2mM EDTA, 1.2% TritonX-100, 20mg/ml lysozyme) 180㎕에 현탁한 후 37℃에서 30분 이상 배양하여 Proteinase K 25㎕와 AL용액(용균용액, DNeasy Tissue Kit, QIAGEN) 200㎕을 넣어 잘 섞은 뒤 70℃에서 30분간 배양하였다. 에탄올(100%) 200㎕을 넣고 섞은 후 DNeasy 미니 컬럼이 들어 있는 2-ml 튜브에 전용액을 옮겨 8,000rpm 이상에서 1분간 원심분리하여 튜브에 모이는 액을 버렸다. AW1용액(Wash용액1, DNeasy Tissue Kit, Qiagen) 500㎕를 넣고 8,000rpm 이상에서 1분간 원심분리하여 유출물을 버리고 다시 AW2용액(Wash용액2, DNeasy Tissue Kit, QIAGEN) 500㎕를 넣어 전속(full speed)에서 3분간 원심분리하여 DNeasy 막을 말리고, 유출물을 버렸다. DNeasy 미니 컬럼을 넣어 실온에서 15분간 정치한 후 8,000rpm 이상에서 1분간 원심분리하여 게놈 DNA를 용출하였다.

진균(표준균주)의 경우는, 200㎕의 멸균된 증류수에 현탁하여 14,000rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 상층액을 버리고 펠렛을 수거하였다. 이 펠렛을 200㎕의 SDS TE 완충액(10% SDS, 100mM Tris-Cl, 20mM EDTA, pH 8.0)와 20㎕의 프로테이나제(proteinase) K(DNeasy Tissue kit에 포함) 용액과 혼합하고 55℃에서 2시간 및 95℃에서 10분간 차례로 배양하였다. 배양물에 에탄올(100%) 200㎕을 넣고 섞은 후 이 혼합액을 DNesay 미니 컬럼이 들어 있는 2-㎖ 튜브에 옮겨 8,000rpm 이상에서 1분간 원심분리하여 튜브에 모이는 액을 버렸다. AW1용액(Wash용액1, DNesay Tissue Kit,Cat. No.69504 QIAGEN) 500㎕를 넣고 8,000rpm이상에서 1분간 원심분리하여 유출물을 버리고 다시 AW2용액(Wash용액2, DNesay Tissue Kit, QIAGEN) 500㎕를 넣어 전속(full speed)에서 3분간 원심분리하여 DNeasy 막을 말리고 유출물을 버렸다. DNesay 미니 컬럼을 1.5㎖ 튜브에 옮기고 AE용액(용출액, DNesay Tissue Kit, QIAGEN) 100㎕을 넣어 실온에서 15분간 정치한 후 8,000rpm 이상에서 1분간 원심분리하여 게놈 DNA를 용출시켰다. 다시 한번 더 DNesay 미니 컬럼에 AE용액(용출액, DNesay Tissue Kit, QIAGEN) 100㎕을 넣어 실온에서 15분간 정치한 후 8,000rpm이상에서 1분간 원심분리하여 게놈 DNA를 용출하였다.

상기에서와 같이 분리된 균주의 DNA를 주형으로 하고 비대칭 증폭방법(Asymmetric PCR)을 수행하여 단편 유전자를 제작하였다. 단편 유전자는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 첨가비율을 1:5로 차별화 함으로써 한번의 중합효소연쇄반응으로 획득하였다. PCR 수행시 탐침과 결합한 DNA를 확인하기 위해 5-FITC(fluorescein isothiocyanate)가 부착된 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 형광을 통해 결합을 확인하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머는 DNA가 세균으로부터 분리된 경우 다음과 같은 3개 쌍의 프라이머가 동시에 사용되었다:

프라이머 1 (센스): TTGTACACACCGCCCGTC (서열번호 406, 1585Fw)와

프라이머 2 (안티센스): F-TTTCGCCTTTCCCTCACGGTACT (서열번호 407, 23BR);

프라이머 3 (센스): AGTACCGTGAGGGAAAGGCGAA (서열번호 408, 23BFw)와

프라이머 5 (센스): AGGATGTTGGCTTAGAAGCA (서열번호 410, MS37F)와

상기 서열의 5' 말단에 부착된 F는 FITC 형광물질을 가리킨다.

DNA가 진균으로부터 분리된 경우 다음의 프라이머 쌍이 사용되었다:

프라이머 1 (센스): GTAATTGGAATGAGTACAAT(서열번호 412, fun463F)와

프라이머 2 (안티센스): F-CTACGACGGTATCTGATCAT(서열번호 413, fun986R).

PCR 반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 10X PCR 완충액(100mM Tris-HCl(pH 8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl₂) 5ul, dNTP 혼합물(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 각각 2.5mM) 4ul, 10pmole 전방향 프라이머 0.5ul, 10pmole 역방향 프라이머 2.5ul, 1/10로 희석한 주형 DNA(100ng) 1ul, Taq 폴리미라제(5unit/ul, Takara Shuzo Co., Shiga, Japan) 0.5ul를 첨가후 총 부피가 50ul가 되도록 물을 첨가하였다. 첫 번째 변성은 94℃에서 7분간, 두 번째 변성은 94℃에서 1분간 수행하였다. 교잡(annealing)은 52℃에서 1분, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하였으며, 이를 10회 반복하였다. 그 후, 다시 세 번째 변성은 94℃에서 1분, 교잡은 54℃에서 1분, 연장은 72℃에서 1분간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. PCR 반응결과로 생성된 산물은 아가로스 겔 전기영동법(agarose gel electrophoresis)으로 확인하였다. 이의 결과, 각 균주들에 대해 DNA 이중 가닥과 단편 가닥이 동시에 합성되었음을 확인하였다.

실시예 6

혼성화 및 세척

탐침 후보군의 특이성과 민감도를 확인하기 위하여 균체로부터 증폭된 상기 PCR 생성물(실시예 5)을 핵산 탐침이 고정된 DNA 칩(실시예 4)에 적용하여 혼성화 반응을 실시하였다. 핵산 탐침을 이의 표준균주로부터 분리한 게놈 유전자와 혼성화 반응 후 시그널이 나타나는 경우 나머지 종에 대해서 교차반응(특이성) 여부를 시험하였다.

유리판에 핵산 탐침이 고정된 DNA 칩에 수증기를 씌워 가수화를 시킨후, 70% 에탄올에 담금질함으로써 유리판에 고정되지 않은 탐침을 제거시켰다. 이후에, 혼성화 과정중에 형광물질이 유리판 표면에 남아있는 알데하이드 잔기에 부착되어 전체적인 시그널을 높여 특이적인 탐침의 시그널을 효과를 저해시키는 것을 방지하기 위해서 유리판을 차단용액(blocking solution)(1.3g NaBH₄, 375ml PBS, 125ml 100% 에탄올)에 담근후 진탕기(shaker)에서 5분간 반응시켰다. 0.2% SDS로 5분간 세척후, 멸균수로 1분간 2-3번 세척해준 후, 원심분리기를 이용하여 유리판에 있는 물기를 제거하였다(1,000rpm, 2분간).

혼성화시킬 용액은 혼성화완충용액(hybridization buffer: 6×SSPE; 20XSSPE; 3M NaCl, 0.2M NaH₂PO₄·H₂O, 0.02M EDTA, pH 7.4, 20% (v/v) 포름아미드; Sigma Co., St. Louis)에 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)으로 증폭시킨 유전자를 30㎕ 넣어서 총 부피가 200㎕가 되도록 제조하였다. 제조된 용액을 탐침이 고정화되어 있는 유리판 위에 분주한 후 프로브-클립 프레스-씰 배양실(probe-clip press-seal incubation chamber, Sigma Co., St. Louis, MO.)로 덮었다.

혼성화되는 동안 유리판 주변이 건조되는 것을 방지하기 위해서 혼성화 챔버에 물기가 있는 휴지를 넣은 후, 30℃ 항온진탕배양기(shaking incubator)에서 6시간 동안 반응시켜 상보적인 결합을 유도하였다. 시간이 경과한 후 3×SSPE (0.45M NaCl, 15mM C₆H₅Na₃O₇, pH 7.0), 2×SSPE (0.3M NaCl, 10mM C₆H₅Na₃O₇, pH 7.0), 1×SSPE (0.15M NaCl, 5mM C₆H₅Na₃O₇, pH 7.0) 순으로 각각 5분씩 세척한 후, 원심분리기를 이용하여 유리판에 있는 물기를 제거하였다(1,000rpm, 2분간).

실시예 7

하이브리드의 검출

혼성화 반응의 결과는 스캔어레이(Scanarray) 5000(GSI Lumonics Inc., Bedford, MA.)을 이용하여 검색하였고, 그 결과는 하기 표 4 내지 표 49에 나타나 있다. 하기 표 4 내지 49에 있어서, 21종 균주라 함은 수테렐라 와즈워텐시스 (Sutterella wadsworthii), 클로스트리디움 람모섬 (Clostridium ramosum), 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 (Peptostreptococcus anaerobius), 펩토스트렙토코커스 마그누스 (Peptostreptococcus magnus), 푸소박테리움 네크로포룸 (Fusobacterium necrophorum), 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris), 엔테로박터 에어로게네스 (Enterobacter aerogenes), 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 코리네박테리움 디프테리애 (Corynebacterium diphtheria), 킨젤라 킨갭 (Kingella kingae), 박테로이데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus), 해모필러스 액티노마이세템코미탄스 (Haemophilus actinomycetemcomitans), 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron), 클로스트리디움 디프실 (Clostridium diffcile), 엔테로박터 클로아체 (Enterobacter cloacae), 해모필러스 아프로필라스 (Haemohilus aphrophilas), 나이세리아 고노헤아 (Neisseria gonorrhea), 브란하멜라 카타르할리스 (Branhamella catarrhalis), 아이케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens) 및 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila)를 지칭하는 것이고, 20종 균주라 함은 상기 21종 균주 중에서 균주특이탐침에 해당하는 균주를 제외한 20종을 지칭하는 것이다.

표 4 내지 표 49

C.glab002	CTAACCCCAAGTCCT	406	18S	표준균주 KCCM 50701의 게놈 유전자 적용시 시그널 나타나지 않음
C.glab003	TGGCTTGGCGGCGAA	405	18S	표준균주 KCCM 50701의 게놈 유전자 적용시 시그널 나타나지 않음
C.glab005	TCAAGAACGAAAGTT	407	18S	교차반응 일으킴
C.glab006	CATTAATCAAGAACG	408	18S	교차반응 일으킴
C.glab007	AAACTTAAAGGAATT	409	18S	표준균주 KCCM 50701의 게놈 유전자 적용시 시그널 나타나지 않음

* 16종 균주 - 수테렐라 와즈워텐시스, 클로스트리디움 람모섬, 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스, 펩토스트렙토코커스 마그누스, 푸소박테리움 네크로포룸, 프로테우스 불가리스, 엔테로박터 에어로게네스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 코리네박테리움 디프테리애, 킨젤라 킨갭, 박테로이데스 불가투스, 박테로이데스 오바투스, 해모필러스 아프로필라스, 나이세리아 고노헤아, 브란하멜라 카타르할리스 및 아이케넬라 코로덴스.

실시예 8

블라인드 시험

실시예 4에서와 같이 DNA 칩을 제작하고 이를 이용하여 12종의 균, 즉 스타괼로코코스 아우레우스, 슈도모나스 애루지노사, 프로테우스 미라빌리스, 크레브시엘라 뉴모니에, 아시네토박터 바우마니, 에스케리치아 콜라이, 엔테로코코스 페슘, 스타필로코코스 에피더미디스, 살모넬라 그룹 E, 살모넬라 그룹 B, 크레브시엘라 옥시토카 및 벌코데리아 세파시아에 대한 블라인드 시험을 실시하였다. 도 1, 9, 11 및 14는 블라인드 시험을 위한 DNA 칩의 디자인을 도시한 것이다. 이들 도면에 기재된 명칭은 상기 표 4 내지 49에 수록된 탐침이 유리판에 고정되어 있는 것을 가리킨다. 포지션 마커로서 아민 3'-AAAAAAAAAAAAAAA-5'-FITC(서열번호, 428)가 사용되었고 C로 표기되어있으며, 네가티브 콘트롤로서 탐침이 녹아있는 버퍼(3X SSC)를 사용하였고 N으로 표기되어있다. 칩상의 포지티브 콘트롤로서 공통의 세균 탐침을 사용하였으며 이는 하기 표 50에 수록되어 있다.

이 시험에 사용된 검체는 약 300명의 병원성 감염 환자의 특정부위로부터 채취된 것으로서, 균의 감염여부는 배양방법에 의해 확인되었다.

배양된 검체로부터 게놈 DNA를 다음과 같이 추출하였다. 검체가 체액인 경우, 10ml의 체액을 EDTA 튜브 혹은 플레인 튜브(plain tube)에 수집하였다. 검체의 양이 10ml 이상이면 5,000 xg에서 15분간 원심분리하고 10ml 이하이면 14,000rpm에서 15분간 원심분리한 뒤 침전물을 1.5ml 튜브 1-2개에 모았다. 리소자임 완충액(20mM Tris-Cl, pH 8.0, 2mM EDTA, 1.2% Triton X-100, 20mg/㎖ lysozyme) 180㎕에 현탁하여 37℃에서 30분간 배양한 후 프로테이나제 K 20㎕와 AL용액 (Lysis용액, QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 200㎕를 넣어 부드럽게 섞은 후 55℃에서 2시간 배양하고 다시 95℃에서 10분간 배양하였다. 에탄올 (100%) 200㎕을 넣고 섞은 후 QIAamp 스핀 컬럼이 들어있는 2-㎖ 튜브에 전 용액을 옮겨 8,000rpm에서 1분간 원심분리하여 튜브에 모이는 액을 버렸다. AW1용액(Wash용액1, QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 500㎕를 넣고 8,000rpm에서 1분간 원심분리하여 유출물을 버리고 다시 AW2용액(Wash용액2, QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 500㎕를 넣어 14,000rpm에서 1분간 원심분리하여 유출물을 버렸다. QIAamp 스핀 컬럼을 1.5㎖ 튜브에 옮기고 AE용액(Elution용액, DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 300㎕을 넣어 실온에서 15분간 정치한 후 8,000rpm에서 3분간 원심분리하여 게놈 DNA를 용출하였다. 에탄올 (100%) 750㎕를 넣어 -20℃에서 1시간 정치한 후 14,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등물인 에탄올을 버리고 건조시킨 뒤 펠렛은 20㎕ 멸균된 증류수에 녹여 농축시켰다.

검체가 혈액인 경우, 10ml 혈액을 EDTA 튜브에 샘플링하였다. 4℃, 1,800rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장 층을 1.5㎖ 튜브에 나누어 담고, 14,000rpm에서 10분간 원심분리 한 뒤 침전물을 1.5㎖ 튜브에 나누었다. 라이소자임 완충액(20mM Tris-Cl, pH 8.0, 2mM EDTA, 1.2% Triton X-100, 20mg/㎖ lysozyme) 180㎕에 현탁하여 37℃에서 30분간 배양한 후 프로테이나제 K 20㎕와 AL용액(Lysis용액, QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 200㎕를 넣어 부드럽게 섞은 후 55℃ 에서 30분간 배양하고 다시 95℃에서 10분간 배양하였다. 에탄올(100%) 200㎕을 넣고 섞은 후 QIAamp 스핀 컬럼이 들어 있는 2-㎖ 튜브에 전 용액을 옮겨 8,000rpm에서 1분간 원 심분리하여 튜브에 모이는 액을 버렸다. AW1용액 (Wash용액1, QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 500㎕를 넣고 8,000rpm에서 1분간 원심분리하여 유출물을 버리고 다시 AW2용액 (Wash용액2, QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 500㎕를 넣어 14,000rpm에서 1분간 원심분리하여 유출물을 버렸다. QIAamp 스핀 컬럼을 1.5㎖ 튜브에 옮기고 AE용액(Elution용액, DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 300㎕을 넣어 실온에서 15분간 정치한 후 8,000rpm에서 3분간 원심분리하여 게놈 DNA를 용출하였다. 에탄올(100%) 750㎕를 넣어 -20℃ 에서 1시간 정치한 후 14,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등물인 에탄올을 버리고 건조시킨 뒤 펠렛은 20㎕ 멸균된 증류수에 녹여 농축시켰다.

증폭, 혼성화 반응, 세척 및 하이브리드의 검출은 상기 실시예 5 내지 7에서와 같이 동일하게 실시하였다. 그 결과는 하기 표 51에 기재되어 있다. 이 표에 수록된 데이터에서 분모는 검체의 적용 횟수이고 분자는 혼성화에 의한 시그널이 나타난 횟수를 가리킨다.

참고로, 도 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8은 스타필로코코스 아우레우스, 슈도모나스 애루지노사, 프로테우스 미라빌리스, 크레브시엘라 뉴모니에, 아시네토박터 바우마니, 이. 콜라이 및 엔테로코코스 페슘 균을 각각 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이(Scanarray) 5000을 이용하여 검색된 도 1의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 각각 보여준다. 도 10은 스타필로코코스 에피더미디스 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 9의 DNA 칩에서 의 혼성화 반응 결과를 보여준다. 도 12 및 13은 살모넬라 그룹 E 및 살모넬라 그룹 B 균을 각각 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 11의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 각각 보여준다. 도 15 및 16은 크레브시엘라 옥시토카 및 벌코데리아 세파시아 균을 각각 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 14의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 각각 보여준다.

상기 본 발명에 의하여, 상기 각 병원체의 rRNA 유전자와 특정적으로 혼성화하고 다른 유기체의 핵산과는 교차 반응하지 않는 염기 서열을 갖는 탐침을 개발하였고 또한 이들 탐침을 집적한 DNA 칩을 제작하여 임상 실험을 통해 그들 탐침의 각 특이성을 확인함으로써, 항암치료에 필요한 감염질환을 진단하는 새로운 진단방법을 산업적으로 이용할 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 135의 염기서열을 필수적으로 함유하는 15~50 bp의 올리고뉴클레오티드.
제1항의 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 고정되어 있는 코리네박테리움 디프테리애 균의 검출용 DNA 칩.