JP2014230497A - Ｄｎａチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ＤＮＡチップを用いた生物の検出における誤判定を抑制する。
【解決手段】 検出対象の生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させ、増幅産物の有無をハイブリダイゼーションによって確認する、ＤＮＡチップを用いた生物の検出方法であって、核酸断片の増幅にホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を使用する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、環境中における微生物などの存否を確認するための検査方法等に関する。

近年、食品製造現場や臨床現場、文化財保護環境等において、カビや細菌などの微生物が存在するか否かを検査して、環境の安全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
このようなカビの検査では、一般的に、環境中から試料を採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定する形態観察法（培養法）が行われている。

また、最近は、カビの検査においてＤＮＡを用いた同定法も行われている。例えば、環境中から採取した試料を培養した後、培養細胞からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりＤＮＡにおける増幅対象領域（標的領域）を増幅し、その増幅産物を解析することで、試料中のカビを同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、例えば電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブが固定化されたＤＮＡチップを用いて、試料中に存在するカビを検出することが行われている。

このようなＤＮＡチップを用いた生物の検出において、本来は検出されるはずの生物が検出できない偽陰性反応が問題となっていた。すなわち、ＰＣＲ法などによって検出対象の生物のＤＮＡにおける標的領域を増幅することができており、かつその増幅産物に相補的に結合するプローブが固定化されたＤＮＡチップを用いて反応を行っても、増幅産物がプローブに十分に結合されず、検出対象の生物が検出できないことがあった。

偽陰性反応が生じたケースでは、ＰＣＲにおいて、一般的なＤＮＡ合成酵素が用いられていた。このようなスタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素は、活性化のための特別な制御がされておらず、ＰＣＲ増幅産物として、目的産物以外の副産物が生じていた。このような副産物の発生は、高温下で活性化を開始するように制御された、いわゆるホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いることで、抑制できることが知られている（特許文献１−３参照）。

すなわち、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合、ＰＣＲの開始にあたって低温の反応液をＤＮＡが変性する高温にまで昇温する途中において、ＤＮＡがアニーリングする温度付近でプライマーが標的領域以外にミスマッチ結合をすると、次にＤＮＡ合成酵素が活性化する温度になったときにこのミスマッチ結合したプライマーからＤＮＡが合成される。このため、以後のＰＣＲのサイクルにおいて、増幅産物として目的産物以外の副産物が発生する。
一方、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合、ＤＮＡがアニーリングする温度付近でプライマーが標的領域以外にミスマッチ結合をしても、ＤＮＡが変性する高温を経てからでないとＤＮＡ合成酵素が活性化されない。このため、高温時にミスマッチ結合したプライマーは解離し、このようなミスマッチ結合にもとづく副産物は発生しない。したがって、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いれば、ＰＣＲにおける副産物の発生を抑制することが可能となっている。

特許第４０５３３６３号公報 特許第５０２００７４号公報 特許第５０２２３８３号公報

ここで、目的産物と相補的に結合するプローブが固定化されたＤＮＡチップを用いた生物の検出において、目的産物とプローブとの結合が、副産物によって阻害される可能性がある。また、副産物の発生を抑制すれば、偽陰性反応が低減し、誤判定が抑制される可能性がある。
しかしながら、これまで、ＰＣＲにおけるホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素の使用が、目的産物とプローブとの結合に影響を与えることは知られておらず、また、ＤＮＡチップによる誤判定が抑制されるか否かは明らかではなかった。

そこで、本発明者らは鋭意研究して、ＰＣＲにおけるホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素の使用により、ＤＮＡチップによる誤判定が抑制されることを見いだして、本発明を完成させた。
本発明は、誤判定を抑制することが可能なＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法の提供を目的とする。

上記目的を達成するため、本発明のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法は、検出対象の生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させ、増幅産物の有無をハイブリダイゼーションによって確認する、ＤＮＡチップを用いた生物の検出方法であって、核酸断片の増幅にホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いる方法としてある。

また、本発明のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法は、検出対象の生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させて目的産物を取得する核酸増幅工程と、目的産物の一部と相補的に結合するプローブが固定化されたＤＮＡチップを用いて、目的産物とプローブとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした目的産物を検出することにより検出対象の生物の存否を判定する生物検出工程とを有し、核酸増幅工程において、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いて核酸断片を増幅させ、目的産物以外の増幅産物である副産物の発生を抑制することにより、生物検出工程において、副産物による目的産物とプローブとのハイブリダイゼーション阻害効果を抑制し、偽陰性反応の発生を抑制する方法とすることも好ましい。

さらに、本発明の誤判定抑制方法は、検出対象の生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させて目的産物を取得する核酸増幅工程と、目的産物の一部と相補的に結合するプローブが固定化されたＤＮＡチップを用いて、目的産物とプローブとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした目的産物を検出することにより検出対象の生物の存否を判定する生物検出工程とを有する、ＤＮＡチップを用いた生物の検出における誤判定抑制方法であって、核酸増幅工程において、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いて核酸断片を増幅させ、目的産物以外の増幅産物である副産物の発生を抑制することにより、生物検出工程において、副産物による目的産物とプローブとのハイブリダイゼーション阻害効果を抑制し、偽陰性反応の発生を抑制する方法としてある。

本発明によれば、ＤＮＡチップを用いた生物の検出における偽陰性反応の発生を抑制し、誤判定を抑制することが可能となる。

本発明の実施形態に係るＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法の効果を確認するための試験１で用いたプライマーセットの塩基配列を示す図である。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法の効果を確認するための試験１で用いたプローブの塩基配列を示す図である。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法の効果を確認するための試験１の結果を示す図である。 核酸増幅工程における副産物が目的産物とプローブとのハイブリダイゼーションを阻害することを示唆する試験２の結果を示す図である。 電気泳動を行ったゲルから目的産物を分離抽出精製してＤＮＡチップによる判定を行った試験３の結果を示す図である。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法の効果を確認するための試験４で用いたプローブの塩基配列を示す図である。 本発明の実施形態に係るＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法の効果を確認するための試験４の結果を示す図である。

以下、本発明のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、この実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
本実施形態のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法は、いずれも検出対象の生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させ、増幅産物の有無をハイブリダイゼーションによって確認する方法であり、核酸断片の増幅にホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いることを特徴とする。
また、これらの方法は、核酸増幅工程と、生物検出工程とを有することが好ましく、核酸増幅工程においてホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いることにより、生物検出工程における偽陰性反応を抑制する構成とすることが好ましい。

核酸増幅工程では、検出対象の生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させて目的産物を取得する。
具体的には、まず検出対象の生物からゲノムＤＮＡを抽出する。その方法は特に限定されないが、例えば、生物の細胞を、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して凍結した後、振盪装置を用いて細胞を破砕する。そして、得られた細胞の破砕物から、ＣＴＡＢ法（Cetyl trimethyl ammonium bromide）やＤＮＡ抽出装置により、ＤＮＡを抽出する。

検出対象の生物の種類は、特に限定されない。すなわち、本実施形態のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法は、カビなどの真菌や、食中毒菌などの細菌等の微生物の検査に好適に用いることができ、またヒトを含むあらゆる動物及び植物の同定に用いることも可能である。

次に、抽出したＤＮＡを用いて、標的領域を含む核酸断片を増幅させる。この標的領域とは、ＰＣＲ法などによって増幅させる対象となるターゲットの領域を意味する。また、核酸断片とは、ＰＣＲ法などにより、プライマーセットを用いて増幅されるゲノムＤＮＡの一部分を意味する。

核酸断片を増幅する方法としては、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ法では、標的領域を含む核酸断片を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、核酸断片の増幅処理が行われる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。

本実施形態のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、標的領域を含む核酸断片を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃ １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程） ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程） ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分

ＰＣＲ用の反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、蛍光標識試薬（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。

本実施形態のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法では、核酸合成酵素として、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いる。
ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素は、反応液の温度が、最初にＤＮＡ変性工程の温度（上記の例では９５℃）に昇温された後に、ＤＮＡ合成工程の温度（上記の例では７２℃）になると活性化されるＤＮＡポリメラーゼである。このようなホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素の活性化の制御には、ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いて行うもの、化学修飾によるもの、核酸添加剤を用いて行うものなど種々の方法があり、いずれの方法を用いるものであっても良い。例えば、Ｎｏｖａ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（メルク株式会社製）、Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、ＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アジレントテクノロジー株式会社製）などを用いることが可能である。

このようなホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いて核酸断片を増幅させることで、標的領域以外の核酸断片（標的領域であって増幅対象領域を全て含まないものを含む）が増幅されることを抑制し、目的産物以外の増幅産物である副産物の発生を抑制することができる。
すなわち、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いると、反応液を最初にＤＮＡ変性工程の温度にまで昇温する途中において、反応液の温度がアニーリング工程の温度付近に達したときに、プライマーが標的領域における結合予定位置以外の場所にミスマッチ結合する。そして、反応液の温度がＤＮＡ合成工程の温度に達したときに、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素はプライマーのミスマッチ結合部分からＤＮＡを合成して伸長させる。さらに、以降は、この伸長されたＤＮＡを鋳型として、標的領域以外の核酸断片が増幅され、副産物が発生することになる。

これに対し、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いると、反応液の温度がアニーリング工程の温度付近に達したときに、プライマーが標的領域における結合予定位置以外の場所にミスマッチ結合しても、ＤＮＡの合成は起こらない。そして、反応液の温度がＤＮＡ変性工程の温度に達した時点で、ミスマッチ結合したプライマーは解離する。したがって、このようなミスマッチ結合にもとづく核酸断片の増幅は行われず、副産物の発生を抑制することが可能になっている。

また、核酸増幅工程において、二以上の標的領域を同時に増幅させる場合がある。例えば、複数の種類の生物から抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させたり、ゲノムＤＮＡにおける複数の標的領域を対象として、これらを同時に増幅させたりする場合がある。このような場合にはより一層ミスマッチ結合が生じやすくなるため、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いて副産物の発生を抑制することは、非常に有効である。

次に、生物検出工程では、目的産物の一部と相補的に結合するプローブが固定化されたＤＮＡチップを用いて、目的産物とプローブとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした目的産物を検出することにより検出対象の生物の存否を判定する。
このＤＮＡチップとしては、既存の一般的な方法で製造されたものを使用ことができ、プローブが固定化された担体であれば良く、その他の点では特に限定されない。例えば、貼り付け型のＤＮＡチップは、ＤＮＡスポッターによりプローブを基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成される。また、合成型ＤＮＡチップは、光リソグラフィ技術により、基板上で一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成される。基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。

このようなＤＮＡチップに目的産物を滴下し、目的産物とＤＮＡチップに固定化されたプローブとをハイブリダイズさせて、ハイブリダイズした目的産物の標識を検出する。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置などの一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴを用いて、目的産物における蛍光標識の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal to Noise ratio，（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）として得ることが好ましい。なお、標識は蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。

ここで、ＰＣＲによって得られた増幅産物の中に、標的領域を含む核酸断片が適切に増幅された目的産物以外に、プライマーのミスマッチ結合にもとづく増幅産物である副産物が含まれている場合、次のようなハイブリダイゼーション阻害効果があると推測される。
まず、副産物の二本鎖のうちの一方が、ＤＮＡチップに固定されたプローブにハイブリダイズして、副産物に含まれる標識が検出される。このとき、副産物のサイズは通常は目的産物よりも小さく、標識量も少ない。また、副産物の二本鎖のうちのもう一方は、目的産物とハイブリダイズして、目的産物がプローブにハイブリダイズする結合領域をブロックすると考えられる。このため、目的産物とプローブとのハイブリダイゼーションが阻害され、副産物によって、偽陰性反応が生じると推測される。

そこで、本実施形態のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法では、副産物による目的産物とプローブとのハイブリダイゼーション阻害効果を抑制するために、核酸増幅工程においてＤＮＡ合成酵素としてホットスタート仕様のものを用い、これによって生物検出工程における偽陰性反応の発生を抑制することを可能にしている。

以下、本発明の実施形態に係るＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法の効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。

（試験１）
まず、施設環境から野生カビを採取し、これを検出対象の生物として使用した。具体的には、エアーサンプラーを用いて施設環境内の空気を採取し、これをＰＤＡ培地に吹き付けて、２５℃の暗所で、７日間静置させて培養した。次に、培地に生じたカビの各コロニーの一部を採取して、それぞれ２５℃の暗所で７〜１０日間ＰＤＡ培地により分離培養を行った。そして、分離培養された各コロニーのカビをＤＮＡ配列解析に供して、その菌種を確認した。その結果、ユーロチウム属菌のカビ、具体的には、ユーロチウム ヘルバリオラム（Eurotium herbariorum）と、ユーロチウム ルブラム（Eurotium rubrum）の存在が確認された。

また、培地に生じたカビの各コロニーの一部を一括して採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。そして、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出した。

次に、ＰＣＲ法により、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域を標的領域として、この標的領域を含む核酸断片を増幅した。
このとき、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、図１に示す配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー（Ｆプライマー）及び配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー（Ｒプライマー）を使用した。また、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、同図に示す配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。これらのプライマーは、オペロンテクノロジー株式会社により合成された。

また、ＰＣＲ用反応液として、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のサンプルを２０μｌずつ作成した。
すなわち、ＤＮＡ合成酵素としてスタンダード仕様のもの（NovaTaq DNA polymerase）を用いたサンプル１，２、及びＤＮＡ合成酵素としてホットスタート仕様のもの（NovaTaq HotStart DNA polymerase）を用いたサンプル１，２の４種類のＰＣＲ用反応液を作成した。スタンダード仕様のサンプル１とホットスタート仕様のサンプル１の組成は、ＤＮＡ合成酵素以外は同一であり、試料のＤＮＡも同じものを用いている。スタンダード仕様のサンプル２とホットスタート仕様のサンプル２の組成についても同様である。

１．Ampdirect(G/Crich) 4.0μl
２．Ampdirect(addition-4) 4.0μl
３．dNTPmix 1.0μl
４．Cy-5dCTP 0.2μl
５．ITS1-Fw primer(2.5μM)（配列番号１） 1.0μl
６．ITS1-Rv primer(2.5μM)（配列番号２） 1.0μl
７．BtF primer(10μM)（配列番号３） 1.0μl
８．BtR primer(10μM)（配列番号４） 1.0μl
９．Template DNA 1.0μl
１０．NovaTaq HotStart DNA polymerase 又は NovaTaq DNA polymerase 0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）

上記各ＰＣＲ用反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １０分
（b）９５℃ ３０秒
（c）５６℃ ３０秒
（d）７２℃ ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃ １０分

ＤＮＡチップには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図２に示されるユーロチウム属菌検出用プローブ（配列番号５，ＩＴＳ領域から選択、配列番号６,β−チューブリン遺伝子から選択）を固定化したものを使用した。これらのプローブは、ＤＮＡ配列解析により同定されたユーロチウム ヘルバリオラム（Eurotium herbariorum）及びユーロチウム ルブラム（Eurotium rubrum）のゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域、又はβ−チューブリン遺伝子の標的領域を含む核酸断片の増幅産物とそれぞれハイブリダイズするものである。

次に、サンプル毎に、ＰＣＲ産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記ＤＮＡチップに滴下した。
このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、ハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物を上記緩衝液を用いてＤＮＡチップから洗い流した。

次いで、ＤＮＡチップを標識検出装置（GenePix4100A Molecular Devices社製）にかけて、各プローブにおける蛍光強度を測定し、Ｓ／Ｎ比値を算出した。そして、このＳ／Ｎ比値が３以上を示した場合に陽性と判定した。

また、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素と、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素により増幅された増幅産物の相違の有無を確認するために、電気泳動を行って、バンドの位置及び濃さを確認した。
具体的には、ＭｕｌｔｉＮＡ（Ｒ）(株式会社島津製作所製）を用いて、マイクロキャピラリー電気泳動により、サンプル１〜４を使用して得られたＰＣＲの増幅産物を泳動させた。

その結果、図３に示すように、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合、及びホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合のいずれにおいても、目的産物が増幅されていることが確認された。すなわち、図１に示すプライマーセットを用いて増幅されるユーロチウム属菌のＩＴＳ領域の増幅産物のサイズはおよそ２６０ｂｐであるところ、いずれのサンプルにおいても２６０ｂｐ付近に濃いバンドが見られた。また、図１に示すプライマーセットを用いて増幅されるユーロチウム属菌のβ−チューブリン遺伝子の増幅産物のサイズはおよそ４６０ｂｐであるところ、いずれのサンプルにおいても４６０ｂｐ付近にバンドが見られた。
また、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合では、電気泳動画像に目的産物のバンド以外に、副産物のバンドが多数見られた。
一方、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合では、副産物のバンドは無いか、又はほとんど見られなかった。

また、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号５）において検出されたＳ／Ｎ比値は、サンプル１では１．９５、サンプル２では０．０５、β−チューブリン遺伝子プローブ（配列番号６）において検出されたＳ／Ｎ比値は、サンプル１では８４．１、サンプル２では７３．８となっており、ＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値が３未満であるため、全体として陰性反応を示している。一方、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号５）において検出されたＳ／Ｎ比値は、サンプル１では５２．０、サンプル２では５１．１、β−チューブリン遺伝子プローブ（配列番号６）において検出されたＳ／Ｎ比値は、サンプル１では３９．２、サンプル２では４１．１となっており、陽性反応を示している。
すなわち、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合には、偽陰性反応が発生しているが、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合には、偽陰性反応の発生を抑制できていることがわかる。

（試験２）
次に、副産物が目的産物とプローブとのハイブリダイゼーションを阻害している可能性があることを確認するための試験を行った。この試験では、サンプルとして、試験１で使用したスタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素によるサンプル１，２と同じものをそれぞれ使用した。
すなわち、サンプル１，２によりそれぞれ得られたＰＣＲ産物１０μlを、アドバンス社製の電気泳動装置Mupidを使用して、１．５％アガロースゲルにて電気泳動させた。その結果、ゲル上に、目的産物のバンドと、副産物のバンドが生じた。

次に、ＵＶ装置上で目的産物のサイズ（およそ２６０ｂｐ）を確認しながら、カッターを用いて、サンプル毎に、ゲルにおける目的産物のバンド部分を切り出した。さらに、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて、切り出したゲルから目的産物を抽出精製し、得られた目的産物を３０μlの滅菌水に懸濁した。

そして、試験１と同様に、この目的産物の懸濁液に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合し、９４℃で５分間加温して、ＤＮＡチップに滴下した。次いで、このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流し、標識検出装置により、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号５）における蛍光強度を測定して、Ｓ／Ｎ比値を算出した。そして、試験１の分離抽出精製前のＩＴＳ領域プローブ（配列番号５）におけるＳ／Ｎ比値と、試験２の分離抽出精製後のＩＴＳ領域プローブ（配列番号５）におけるＳ／Ｎ比値とを比較した。この分離抽出のイメージ画と、分離抽出精製前後のＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値の変化を図４に示す。

同図に示すように、分離抽出精製前のＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値には、副産物の影響が有ったと推測され、サンプル１のＳ／Ｎ比値は１．９５、サンプル２のＳ／Ｎ比値は０．０５であり、いずれも陰性を示していた。
一方、これらのサンプルのゲルから、目的産物のバンド部分を切り出して測定した分離抽出精製後のＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値には、副産物の影響が無いと考えられ、サンプル１のＳ／Ｎ比値は４．１、サンプル２のＳ／Ｎ比値は０．８であった。

すなわち、ＰＣＲ産物から副産物を除去し、目的産物のみを用いてＤＮＡチップによるハイブリダイゼーションを行うと、Ｓ／Ｎ比値が上昇することがわかる。
したがって、この結果から、ＰＣＲ産物に目的産物以外の副産物が含まれることにより、目的産物とプローブとのハイブリダイゼーションが阻害される可能性があることが明らかとなった。

（試験３）
次に、試験２に示したような分離抽出精製を行うと、目的産物のＤＮＡ量にロスが生じるため、通常はＳ／Ｎ比値が下がることを確認するための試験を行った。この試験では、サンプルとして、試験１で使用したホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素によるサンプル１，２と同じものをそれぞれ使用した。
すなわち、サンプル１，２によりそれぞれ得られたＰＣＲ産物１０μlを、アドバンス社製の電気泳動装置Mupidを使用して、１．５％アガロースゲルにて電気泳動させた。その結果、ゲル上に、目的産物のバンドが生じたが、副産物のバンドは生じなかった。

次に、ＵＶ装置上で目的産物のサイズ（およそ２６０ｂｐ）を確認しながら、カッターを用いて、サンプル毎に、ゲルにおける目的産物のバンド部分を切り出した。さらに、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて、切り出したゲルから目的産物を抽出精製し、得られた目的産物を３０μlの滅菌水に懸濁した。

そして、試験１と同様に、この目的産物の懸濁液に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合し、９４℃で５分間加温して、ＤＮＡチップに滴下した。次いで、このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流し、標識検出装置により、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号５）における蛍光強度を測定して、Ｓ／Ｎ比値を算出した。そして、試験１の分離抽出精製前のＩＴＳ領域プローブ（配列番号５）におけるＳ／Ｎ比値と、試験３の分離抽出精製後のＩＴＳ領域プローブ（配列番号５）におけるＳ／Ｎ比値とを比較した。この分離抽出のイメージ画と、分離抽出精製前後のＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値の変化を図５に示す。

同図に示すように、分離抽出精製前のＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値には、副産物の影響が無く、サンプル１のＳ／Ｎ比値は５２．０、サンプル２のＳ／Ｎ比値は５１．１であり、いずれも陽性を示していた。
一方、これらのサンプルのゲルから、目的産物のバンド部分を切り出して測定した分離抽出精製後のＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値にも、副産物の影響が無く、サンプル１のＳ／Ｎ比値は１２．４、サンプル２のＳ／Ｎ比値は４．６であった。

すなわち、ＰＣＲ産物に副産物が含まれない場合に、目的産物を分離抽出精製してＤＮＡチップによるハイブリダイゼーションを行うと、Ｓ／Ｎ比値が大きく低減することがわかる。これは、分離抽出精製によって、目的産物のＤＮＡ量にロスが生じるためであると考えられる。
したがって、この結果から、試験２に示したような分離抽出精製を行うと、通常はＳ／Ｎ比値が下がるにも拘わらず、副産物を除去することで、Ｓ／Ｎ比値が上昇したことがわかる。

よって、試験１−３の結果を考慮すると、核酸増幅工程において副産物の発生を抑制すれば、生物検出工程において副産物によるハイブリダイゼーション阻害効果を抑制でき、偽陰性反応の発生を抑制できると考えられる。

（試験４）
次に、ユーロチウム ヘルバリオラム（Eurotium herbariorum）と、ユーロチウム ルブラム（Eurotium rubrum）以外のカビに対しても、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素が誤判定の抑制に有効であることを確認するための試験を行った。

検出対象の生物としては、アスペルギルス ペニシリオイデス（Aspergillus penicillioides，JCM22971）、アスペルギルス フミガタス（Aspergillus fumigatus，JCM10253）、アスペルギルス バージカラー（Aspergillus versicolor，JCM12756）、スタキボトリス チャタラム（Stachybotrys chartarum，NBRC5369）を使用した。菌株番号がJCMからはじまるものは、独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms）から分譲された菌株であり、NBRCからはじまるものは、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center）から分譲された菌株である。

試験４では、ＰＣＲ法により、各カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子を標的領域として、これらの標的領域をそれぞれ含む核酸断片を同時に増幅した。これらの標的領域の両方の増幅産物にもとづいて、ＤＮＡチップにより共に陽性反応が得られた場合にのみ検出対象の生物が存在すると判定することで、偽陽性反応による誤判定を抑制することが可能となっている。

このとき、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、図１に示す配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー（Ｆプライマー）及び配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー（Ｒプライマー）を用いた。また、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、同図に示す配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。なお、いずれもオペロンテクノロジー株式会社により合成したものを使用した。

また、ＰＣＲ用反応液として、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のサンプルを２０μｌずつ作成した。
このとき、核酸合成酵素としてスタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素（NovaTaq DNA polymerase）を用いたサンプルと、核酸合成酵素としてホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素（NovaTaq HotStart DNA polymerase）を用いたサンプルを、カビ毎にそれぞれ１個ずつ作成した。

１．Ampdirect(G/Crich) 4.0μl
２．Ampdirect(addition-4) 4.0μl
３．dNTPmix 1.0μl
４．Cy-5dCTP 0.2μl
５．ITS1-Fw primer(2.5μM)（配列番号１） 1.0μl
６．ITS1-Rv primer(2.5μM)（配列番号２） 1.0μl
７．BtF primer(10μM)（配列番号３） 1.0μl
８．BtR primer(10μM)（配列番号４） 1.0μl
９．Template DNA 1.0μl
１０．NovaTaq HotStart DNA polymerase 又は NovaTaq DNA polymerase 0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）

上記各ＰＣＲ用反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １０分
（b）９５℃ ３０秒
（c）５６℃ ３０秒
（d）７２℃ ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃ １０分

ＤＮＡチップには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図６に示される、以下のプローブを固定化したものを使用した。以下において、（ＩＴＳ）はＩＴＳ領域から選択されたプローブを示し、（β）はβチューブリン遺伝子から選択されたプローブを示している。これらはいずれも各カビのゲノムＤＮＡにおけるそれぞれの標的領域から選択されたものであり、各標的領域を含む核酸断片の増幅産物とハイブリダイズするものである。
・アスペルギルス ペニシリオイデス用 配列番号７（ＩＴＳ），配列番号８（β）
・アスペルギルス フミガタス用 配列番号９（ＩＴＳ），配列番号１０（β）
・アスペルギルス バージカラー用 配列番号１１（ＩＴＳ），配列番号１２（β）
・スタキボトリス チャタラム用 配列番号１３（ＩＴＳ），配列番号１４（β）

次に、サンプル毎に、ＰＣＲ産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記ＤＮＡチップに滴下した。
このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。

次いで、ＤＮＡチップを標識検出装置（GenePix4100A Molecular Devices社製）にかけて、各プローブにおける蛍光強度を測定し、Ｓ／Ｎ比値を算出した。そして、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの両方のＳ／Ｎ比値が３以上を示した場合に陽性と判定した。その結果を図７に示す。

同図に示すように、アスペルギルス ペニシリオイデス（Aspergillus penicillioides）では、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号７）におけるＳ／Ｎ比値は６．２、βチューブリン遺伝子プローブ（配列番号８）におけるＳ／Ｎ比値は３９．０であり、陽性反応を示した。ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合は、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号７）におけるＳ／Ｎ比値は３８．４、βチューブリン遺伝子プローブ（配列番号８）におけるＳ／Ｎ比値は２９．５であり、同様に陽性反応を示したが、ＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値が大きく上昇している。このことから、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いることにより、偽陰性反応の発生する可能性を、低減できることがわかる。

また、アスペルギルス フミガタス（Aspergillus fumigatus）では、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号９）におけるＳ／Ｎ比値は１７．４、βチューブリン遺伝子プローブ（配列番号１０）におけるＳ／Ｎ比値は３９．１であり、陽性反応を示した。ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合は、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号９）におけるＳ／Ｎ比値は６７．１、βチューブリン遺伝子プローブ（配列番号１０）におけるＳ／Ｎ比値は５１．６であり、同様に陽性反応を示したが、ＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値が大きく上昇している。このことから、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いることにより、偽陰性反応の発生する可能性を、低減できることがわかる。

また、アスペルギルス バージカラー（Aspergillus versicolor）では、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号１１）におけるＳ／Ｎ比値は０．０５、βチューブリン遺伝子プローブ（配列番号１２）におけるＳ／Ｎ比値は６８．３となっており、ＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値が３未満であるため、全体として陰性反応を示している。一方、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合は、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号１１）におけるＳ／Ｎ比値は５６．０、βチューブリン遺伝子プローブ（配列番号１２）におけるＳ／Ｎ比値は６１．３であり、陽性反応を示している。このように、本ケースでは、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合には陰性と誤判定されたが、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いることにより、このような偽陰性反応にもとづく誤判定を抑制できていることがわかる。

さらに、スタキボトリス チャタラム（Stachybotrys chartarum）では、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号１３）におけるＳ／Ｎ比値は０．１３、βチューブリン遺伝子プローブ（配列番号１４）におけるＳ／Ｎ比値は５０．５となっており、ＩＴＳ領域プローブにおけるＳ／Ｎ比値が３未満であるため、全体として陰性反応を示している。一方、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合は、ＩＴＳ領域プローブ（配列番号１３）におけるＳ／Ｎ比値は２６．０、βチューブリン遺伝子プローブ（配列番号１４）におけるＳ／Ｎ比値は４０．４であり、陽性反応を示している。このように、本ケースでは、スタンダード仕様のＤＮＡ合成酵素を用いた場合には陰性と誤判定されたが、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いることにより、このような偽陰性反応にもとづく誤判定を抑制できていることがわかる。

以上の通り、本実施形態のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法、及び誤判定抑制方法によれば、生物検出工程における偽陰性反応の発生を抑制することができ、誤判定を抑制することが可能になっている。

本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記試験のＰＣＲ用反応液における各種成分については、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を除き適宜変更することができる。また、上記のようなＤＮＡチップを用いて蛍光検出を行うのではなく、電流検出方式など他の検出方式のＤＮＡチップにより、プローブにハイブリダイズした増幅産物を検出することなども可能である。

本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生等において、環境中の微生物などの存否を確認する検査を行う場合に、好適に利用することが可能である。

Claims (5)

1. 検出対象の生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させ、増幅産物の有無をハイブリダイゼーションによって確認する、ＤＮＡチップを用いた生物の検出方法であって、
   前記核酸断片の増幅にホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いることを特徴とするＤＮＡチップを用いた生物の検出方法。
2. 検出対象の生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させて目的産物を取得する核酸増幅工程と、前記目的産物の一部と相補的に結合するプローブが固定化されたＤＮＡチップを用いて、前記目的産物と前記プローブとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした前記目的産物を検出することにより前記検出対象の生物の存否を判定する生物検出工程とを有し、
   前記核酸増幅工程において、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いて前記核酸断片を増幅させ、前記目的産物以外の増幅産物である副産物の発生を抑制することにより、前記生物検出工程において、前記副産物による前記目的産物と前記プローブとのハイブリダイゼーション阻害効果を抑制し、偽陰性反応の発生を抑制することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法。
3. 前記核酸断片を増幅させるときに、二組以上のプライマーセットを使用して、二組以上の核酸断片を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行うことを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法。
4. 前記生物が、カビ、酵母、又はバクテリアであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡチップを用いた生物の検出方法。
5. 検出対象の生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させて目的産物を取得する核酸増幅工程と、前記目的産物の一部と相補的に結合するプローブが固定化されたＤＮＡチップを用いて、前記目的産物と前記プローブとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした前記目的産物を検出することにより前記検出対象の生物の存否を判定する生物検出工程とを有する、ＤＮＡチップを用いた生物の検出における誤判定抑制方法であって、
   前記核酸増幅工程において、ホットスタート仕様のＤＮＡ合成酵素を用いて前記核酸断片を増幅させ、前記目的産物以外の増幅産物である副産物の発生を抑制することにより、前記生物検出工程において、前記副産物による前記目的産物と前記プローブとのハイブリダイゼーション阻害効果を抑制し、偽陰性反応の発生を抑制することを特徴とするＤＮＡチップを用いた生物の検出における誤判定抑制方法。