JP2011155912A - 特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の塩基配列を有するプローブ、及び、特定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも1のプローブを固定化した特定カビ検出用マイクロアレイ。
【選択図】なし
Description
しかしながら、カビには、60〜70%RHやそれ以下の低湿度下で多く発生する好乾性カビも存在する。このようなカビとしては、例えばユーロチウム属(Eurotium spp.)における各種カビ、及びアスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種(Aspergillus penicillioides)のカビ(以下、これらを特定カビ、対象カビ又は検出対象カビと称する場合がある)を挙げることができる。
したがって、その繁殖を防止するために、これらのカビを定期的に測定検出することは、図書及び文化財保護のために重要である。
すなわち、従来、一般的には、カビを培養してコロニーを形成させ、肉眼及び顕微鏡による観察を行うことで同定を行っていたため、カビの採取を開始してからその同定を完了するまでには、およそ3〜4週間という長期間を要するという問題があった。また、担当者の技量によって、カビの検出精度が異なってしまうという問題もあった。
例えば、特許文献1には、所定のプライマーを用いてカビのDNAを増幅し、得られた増幅産物の電気泳動を行うことで、対象となるカビの存否を検出する方法が記載されている。
また、特許文献2及び3には、所定のプライマーを用いてカビやダニのDNAを増幅するとともに、カビやダニを検出するための所定のプローブを用い、増幅したDNA断片を、プローブにハイブリダイズさせることにより検出する方法が記載されている。
これらの検出方法によれば、カビの培養を行う必要がないため、カビの検出に要する時間を大きく低減することが可能である。
その主たる原因は、これらのカビのDNAがGCリッチな配列を有する(二本鎖DNAにおいて、3つの水素結合により対合するGとCの対の割合が相対的に多く存在する)点にあると考えられる。すなわち、このGCリッチな配列により、PCR(polymerase chain reaction ポリメラーゼ連鎖反応)においてDNAが乖離しにくく、また乖離しても二次構造を形成しやすく、十分に増幅できないためであると推定される。
その結果、これらのカビのDNAの増幅産物は得られにくく、検出精度が低かったと考えられる。さらに、夾雑物が存在する場合には、このような低い検出精度が一層低下するため、現実の環境下でこれらのカビを特定して検出することはできず、実用的なレベルでの検出を行うことは非常に困難であった。
すなわち、特許文献2及び3に記載の発明によれば、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ、及びユーロチウム属のカビを特定して、その存否を的確に検出することはできなかった。
[マイクロアレイ]
本実施形態のマイクロアレイは、本実施形態の検出対象である特定カビを検出するための所定のプローブの少なくともいずれか1つを、基板上に固定化したものであれば特に限定されるものではなく、例えばスポット型DNAマイクロアレイ、合成型DNAチップなどを用いることができる。
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、上記プローブにより、これらの特定カビをそれぞれ選択的に高感度で検出することができる。
例えば、配列番号3のプローブが何らかの理由によりマイクロアレイに適切に固定化されなかった場合など、当該プローブでは検出できない場合に、配列番号1又は2のプローブによる検出が行われていれば、新たなマイクロアレイを使用して再確認を行うことができ、検出の確実性を向上させることが可能となる。
また、同様に、アスペルギルス ペニシリオイデス種におけるアスペルギルス ビトリコラ系統のカビについては、配列番号5のプローブの蛍光強度が最も大きくなっている。このため、配列番号5のプローブを主たるプローブとして用いると共に、配列番号4のプローブ、及び/又は、配列番号9のプローブを補助的なプローブとして使用することも好ましい。これにより、アスペルギルス ビトリコラ系統のカビの検出の確実性を向上させることが可能となる。
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化される上記プローブは、いずれも20mer(塩基)程度の長さであり、DNA合成装置により合成できる。
後述する実施例で用いた本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化した配列番号1〜9の配列からなる各プローブは、いずれもDNA合成装置により合成したものを使用している。
なお、後述する実施例で用いた配列番号10及び11の配列からなるプライマー対も同様に20mer(塩基)程度の長さであり、DNA合成装置により合成したものを使用している。
Harbor Laboratory Press(1989)、特に11.45節「Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes」に記載されている条件等を使用することができる。
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、配列番号1〜9の配列をそれぞれ備えたプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、本実施形態のマイクロアレイとして、貼り付け型のDNAマイクロアレイを作成する場合は、DNAスポッターによりプローブをスライドガラス上に固定化することによって、作成することができる。また、合成型DNAチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴDNAを合成することによってプローブを生成し、本実施形態のマイクロアレイを作成することができる。
本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、図書館や文化財保管場等の室内空気から採取された試料に、ユーロチウム属のカビ、及び/又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが存在するか否かを検出するために使用する。
このため、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、以下の工程により、例えば室内空気から採取された試料のDNAをPCR法により増幅し、得られた増幅産物を当該マイクロアレイに固定化したプローブにハイブリダイズさせることで使用する。
そして、得られた増幅産物を本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ上のプローブにハイブリダイズさせ、標識検出装置により増幅産物の標識を検出することで、試料に特定カビのDNAが含まれているか否かを検出する。
(1)カビの採取
まず、エアーサンプラーを用いて、図書館や文化財保管場の室内空気を採取する。採取した空気を専用培地に吹き付けて培養する。培地としては、好乾性カビの生育に適したM40Y培地やジクロラン-グリセロール(DG−18)寒天培地などをエアーサンプラー用にストリップ形状にしたものを使用することが好ましい。培養条件としては、25℃で暗所に65時間以上静置することが好ましい。
試料からのゲノムDNAの抽出は、CTAB法(Cetyl trimethyl ammonium bromide)による方法やDNA抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
本実施形態における特定カビのDNA増幅用プライマー対(配列番号10及び11のプライマー対)と、DMSO(ジメチルスルホキシド,終濃度で0.5〜7容量%(以下、単に%と称する場合がある))、試料のゲノムDNA(DNA抽出液)、及び上述したその他の所定の試薬を混合して、本実施形態のPCR反応液を作成する。
なお、DMSOは、融点が18℃付近の単体の有機化合物であり、室温では通常液体状態となっている。
なお、本実施形態で使用するPCR反応液にはDMSOが含まれるが、酵素は高濃度のDMSOによって容易に破壊され得る。このため、DNA合成酵素はPCR反応液に最後に混合し、混合後は、核酸増幅装置により直ちに増幅反応を開始させることが好ましい。
(a)DNA鎖の乖離(DNA変性)工程 93〜97℃ 20〜40秒
(b)プライマーの対合(アニーリング)工程 50〜60℃ 10〜50秒
(c)DNA合成工程 70〜74℃ 50〜70秒
(i)95℃ 10分、(ii)95℃ 30秒、(iii)56℃ 30秒、(iv)72℃ 60秒((ii)〜(iv)を40サイクル)、(v)72℃ 10分、(vi)4℃ ∞(保持)
次に、PCR増幅産物をマイクロアレイ上に滴下して、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化されたプローブにハイブリダイスしたPCR増幅産物の標識を検出する。
まず、PCR増幅産物に所定の緩衝液を混合し、94℃で5分間加温することで、二本鎖DNAを一本鎖に乖離させる。これを氷上にて急冷し、マイクロアレイに滴下する。
次に、マイクロアレイを45℃で1時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイスしなかったPCR産物をマイクロアレイから洗い流す。
そして、マイクロアレイを標識検出装置にかけて標識の検出を行い、試料中に特定カビが存在するか否かを検出する。
本実施形態で使用するPCR反応液は、例えば以下のような組成とすることが好ましい。すなわち、核酸合成基質(dNTPmixture(dCTP;400μM、dATP、dTTP、dGTP;500μM each) 5容量%)、フォワードプライマー(Forward primer(10pmol/μl) 5容量%)、リバースプライマー(Reverse primer(10pmol/μl) 5容量%)、核酸合成酵素(NovaTaq 1容量%)、標識成分(1mM Cy5−dCTP 1容量%)、ジメチルスルホキシド(DMSO 2容量%)、試料のゲノム(所定量、例えば0.1ng〜300ng)、緩衝液(60容量%)、及び残りの容量%の成分として水を含むものとすることが好ましい。なお、緩衝液は、例えばAmpdirect(R)(株式会社 島津製作所)のPCR処方における緩衝液として、Amp addition−1、Amp addition−2、及びAmpdirectをそれぞれ20容量%ずつ含有させることができる。
図1に示すように、フォワードプライマーは、真菌類のrDNA(リボソームDNA)における18Sから選択された配列からなる新規プライマーである。また、リバースプライマーは、同5.8Sから選択された配列からなる新規プライマーである。
なお、塩基配列には方向性があり、配列番号に示される塩基配列は、5’末端から3’末端方向の配列を示している。
これらの新規プライマー対を用いて、例えばユーロチウム属のカビ(JCM1575 Eurotium herbariorum(F.H.Wiggers)Link)のDNAを増幅した場合、258bpの増幅産物が得られる。また、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ(JCM22961 Aspergillus penicillioides Spegazzini)のDNAを増幅した場合、309bpの増幅産物が得られる。
このように、本実施形態における特定カビのDNA増幅用のプライマー対(配列番号10及び11のプライマー対)を用いることにより、従来のおよそ1/2あるいはそれ以下の長さのDNA断片を得ることができる。本発明の発明者らは、このような短いDNA断片を使用することで、マイクロアレイに固定されたプローブとのハイブリダイズ効率を向上させることに成功している。
その結果、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用することで、従来の手法では実用的なレベルでの検出が困難であった、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの検出精度を、大きく向上させることが可能となっている。
核酸増幅装置は、本実施形態における専用のPCR反応液を使用して、試料における特定カビのrDNAのITS1領域を増幅するPCR装置である。一般的なサーマルサイクラー(Thermal Cycler 温度制御装置)に、上記専用のPCR反応液を入れて構成することができる。
本実施形態のPCR反応液に含まれる特定カビのDNAを増幅可能な新規プライマー対は、試料中にユーロチウム属のカビ、及び/又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが存在する場合には、そのrDNAのITS1領域を増幅することができる。
すなわち、従来のPCR反応液を用いた場合、試料中にユーロチウム属のカビ及び/又はアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが存在していても、そのゲノムDNAの特性上、これを検出しうるまで効率的に増幅することは困難であった。また、試料中に、従来のプライマー対により増幅される夾雑菌が含まれている場合には、その夾雑菌のDNAが競合して増幅され、対象カビを十分に増幅して検出することが困難であった。
これに対して、本実施形態における上記専用のPCR反応液を用いれば、核酸増幅装置により、本実施形態の検出対象の特定カビのDNAをより効率的に増幅することができ、試料中にその他の夾雑菌が含まれている場合でも、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを用いて、特定カビを検出することが可能となっている。
これに対し、本実施形態のPCR反応液では、以下の実施例で示されるように、夾雑物が6ng存在する場合でも、検出対象カビが0.1ng(100pg)存在すれば検出することが可能である。
標識検出装置は、マイクロアレイ上でプローブにハイブリダイスした増幅産物(DNA断片)に結合している標識を検出する。この標識検出装置としては、蛍光スキャニング装置など一般的なものを用いることができる。
本実施形態では、PCR反応液に含まれるCy5−dCTPによって標識された増幅産物の蛍光強度を、標識検出装置により検出している。
なお、本実施形態の特定カビ検出システムにおいて使用する標識成分は、Cy5−dCTPに限定されるものではなく、放射性同位元素やジゴキシゲニンなどその他の標識成分を用いて標識することも可能である。
すなわち、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化されたプローブのうち、配列番号1〜3からなるプローブは、ユーロチウム属のカビの検出に適した配列からなるものであり、配列番号4〜9からなるプローブは、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビの検出に適した配列からなるものである。これらのプローブを用いることにより、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを実用レベルで特異的に検出することが可能となっている。
さらに、本実施形態で用いられるPCR反応液にはDMSOが所定の濃度で含有されており、これによって、ユーロチウム属とアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのDNAの変性が促進されるとともに、二次構造の形成が抑制されてPCR反応の誤作動を低減させることができ、検出対象カビのDNAの増幅反応を促進させることが可能となっている。
試験番号(1):対象ゲノム(ユーロチウム属のカビのみ)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
上記実施形態における特定カビのDNA増幅用の新規プライマー対(配列番号10及び11により特定される塩基配列からなるプライマー対)を含有し、DMSOを2容量%含有するPCR反応液を用いて、検出対象カビであるユーロチウム属の主要種1のカビ(A1,JCM1575 Eurotium herbariorum(F.H.Wiggers)Link)のゲノムDNAを増幅した。PCR反応液に夾雑物は含まれていない。そして、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用して、増幅産物をハイブリダイズさせ、蛍光検出を行った。
1.5×Amp addition−1 2.0μl
2.5×Amp addition−2 2.0μl
3.5×Ampdirect 2.0μl
4.核酸合成基質 dNTPmixture 0.5μl
(dCTP;400μM、dATP、dTTP、dGTP;500μM each)
5.フォワードプライマー(配列番号10:オペロンテクノロジー株式会社により合成) 0.5μl(10pmol/μl)
6.リバースプライマー(配列番号11:同上) 0.5μl(10pmol/μl)
7.核酸合成酵素 NovaTaq 0.1μl
8.標識成分 1mM Cy5−dCTP 0.1μl
9.対象カビ及び夾雑物のゲノム ユーロチウム属の主要種1のカビ(A1,JCM1575 Eurotium herbariorum(F.H.Wiggers)Link,(独)理化学研究所バイオリソースセンターより入手) 0.1ng(100pg)
10.水(全体が10.0μlになるまで加水)
1.95℃ 10分
2.95℃ 30秒
3.56℃ 30秒
4.72℃ 60秒(2〜4を40サイクル)
5.72℃ 10分
6.4℃保持 ∞
試験番号(2):対象ゲノム(アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのみ)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムとして、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ(B1,アスペルギルス ペニシリオイデス,JCM22961 Aspergillus penicillioides Spegazzini)のゲノムDNAのみを0.1ng用いた点以外は、実施例1と同様にして試験を行った。その結果を図2に示す。
試験番号(3):対象ゲノム(アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのみ)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムとして、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ(B2,アスペルギルス ビトリコラ,NBRC8155 Aspergillus penicillioides(Synonym Aspergillus vitricola Otsuki))のゲノムDNAのみを0.1ng用いた点以外は、実施例1と同様にして試験を行った。その結果を図2に示す。
試験番号(4):対象ゲノムなし、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液に、対象ゲノム及び夾雑物を混入させることなく、その他の条件は、実施例1と同様にして試験を行った。その結果を図2に示す。
試験番号(5):対象ゲノム(ユーロチウム属のカビと夾雑物のみ)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビ(A1)のゲノムDNAのみを0.1ng用いるとともに、夾雑物(C,NBRC4026 Alternaria alternata(Fries)Keissler,NBRC6348 Cladosporium cladosporioides(Fresenius)de Vries,(独)製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門より入手,各3ng、合計6ng)をPCR反応液に添加した点以外は、実施例1と同様にして試験を行った。その結果を図2に示す。
試験番号(6):対象ゲノムではないアスペルギルス ペニシリオイデスの近縁種のDNA(AV,AR)を含む、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノムと共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種の近縁種のカビとして、アスペルギルス レストリクタス(AR,JCM1727 Aspergillus restrictus G.Smith,(独)理化学研究所バイオリソースセンターより入手)、及びアスペルギルス ヴェルシカラー(AV,JCM10258 Aspergillus versicolor(Vuillemin)Tiraboschi,(独)理化学研究所バイオリソースセンターより入手)のゲノムDNAをそれぞれ0.1ng用いた点以外は、実施例4と同様にして試験を行った。その結果を図2に示す。
試験番号(7):対象ゲノム(アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビと夾雑物のみ)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノムを含有させることなく、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ(B1)のゲノムDNAを0.1ng用いた点以外は、実施例4と同様にして試験を行った。その結果を図2に示す。
試験番号(8):対象ゲノム(ユーロチウム属の主要種A2)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種2のカビ(A2,NBRC8157 Eurotium tonophilum Otsuki)のゲノムDNAを0.1ng用いると共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ(B1)のゲノムDNAを0.1ng用いた点以外は、実施例4と同様にして試験を行った。その結果を図4に示す。
試験番号(9):対象ゲノム(ユーロチウム属の主要種A3)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種3のカビ(A3,JCM1568 Eurotium chevalieri L.Mangin)のゲノムDNAを0.1ng用いた点以外は、実施例7と同様にして試験を行った。その結果を図4に示す。
試験番号(10):対象ゲノム(ユーロチウム属の主要種A4)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種4のカビ(A4,JCM1565 Eurotium amstelodami Mangin)のゲノムDNAを0.1ng用いた点以外は、実施例7と同様にして試験を行った。その結果を図4に示す。
試験番号(11):対象ゲノム(ユーロチウム属の主要種A5)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種5のカビ(A5,JCM1580 Eurotium repens de Bary)のゲノムDNAを0.1ng用いた点以外は、実施例7と同様にして試験を行った。その結果を図4に示す。
試験番号(12):対象ゲノム(ユーロチウム属の主要種A6)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種6のカビ(A6,JCM22942 Eurotium rubrum Konig et al.)のゲノムDNAを0.1ng用いた点以外は、実施例7と同様にして試験を行った。その結果を図4に示す。
試験番号(13):対象ゲノム(アスペルギルス ビトリコラ B2)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム(A1 0.1ng)と共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのうち、B1と同種かつ別個の系統のアスペルギルス ビトリコラ(B2,NBRC8155 Aspergillus penicillioides(Synonym Aspergillus vitricola Otsuki))のゲノムDNAを0.1ng用いた点以外は、実施例4と同様にして試験を行った。その結果を図4に示す。
試験番号(14):対象ゲノム(アスペルギルス ペニシリオイデス2種 B1,B2)あり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
PCR反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム(A1 0.1ng)と共に、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのうち、B1とB2の両方のDNAをそれぞれ0.1ng用いた点以外は、実施例4と同様にして試験を行った。その結果を図4に示す。
試験番号(15):対象ゲノムあり、新規プライマー対、DMSO濃度0%
PCR反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム(A1 0.1ng)と、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビ(B1 0.1ng)を用い、PCR反応液にDMSOを添加することなく、その他の点は実施例4と同様にして試験を行った。その結果を図5に示す。
試験番号(16):対象ゲノムあり、新規プライマー対、DMSO濃度0.5%
DMSOを0.5容量%含有するPCR反応液を用いた点以外は、実施例14と同様にして試験を行った。その結果を図5に示す。
試験番号(17):対象ゲノムあり、新規プライマー対、DMSO濃度2%
DMSOを2容量%含有するPCR反応液を用いた点以外は、実施例14と同様にして試験を行った。その結果を図5に示す。
試験番号(18):対象ゲノムあり、新規プライマー対、DMSO濃度5%
DMSOを5容量%含有するPCR反応液を用いた点以外は、実施例14と同様にして試験を行った。その結果を図5に示す。
試験番号(19):対象ゲノムあり、新規プライマー対、DMSO濃度7%
DMSOを7容量%含有するPCR反応液を用いた点以外は、実施例14と同様にして試験を行った。その結果を図5に示す。
試験番号(20):対象ゲノムあり、従来のリバースプライマーを含むプライマー対、DMSO濃度0%
配列番号10及び12により特定される塩基配列からなるプライマー対を使用した点以外は、実施例14と同様にして試験を行った。その結果を図5に示す。
試験番号(21):対象ゲノムあり、従来のリバースプライマーを含むプライマー対、DMSO濃度2%
配列番号10及び12により特定される塩基配列からなるプライマー対を使用した点以外は、実施例16と同様にして試験を行った。その結果を図5に示す。
上記各実施例及び参考例において、試験結果における蛍光強度(光量)が、50以上の場合は、標識検出装置(GenePix4100A)から出力される画像データにおいて、肉眼で識別可能なレベルの強度であり、対象ゲノムを検出している可能性が高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、30〜50未満の場合は、肉眼ではほとんど識別できないが、明らかに反応が見られ、対象ゲノムを検出している可能性が比較的高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、10〜30未満の場合は、明らかに反応が見られるが、対象ゲノム以外の類似するゲノムを検出している可能性も高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、10未満の場合は、試験番号8に示されるように、ノイズの検出と考えられる。以上のことから、以下の説明では、蛍光強度30以上を有効な検出として説明している。
まず、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法による対象カビの特定的検出について、図2及び図4を参照して説明する。
参考例1に示されるように、PCR反応液に検出対象カビが含まれていない場合、有効な光量は検出されていない。
これに対し、実施例1〜3に示されるように、PCR反応液に検出対象カビが含まれている場合は、それぞれのカビに対応するプローブの多くに有効な光量が検出されている。また、実施例4〜6に示されるように、夾雑物存在下においても、検出することができている。
また、これらA1〜A6のカビは、ユーロチウム属のカビのうちの多くを占める頻出種であり、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビをほぼ属レベルで特定的に検出することができる。
また、実施例5のPCR反応液には、アスペルギルス属でペニシリオイデス種ではない近縁の種のカビである、アスペルギルス レストリクタス(AR)、及びアスペルギルス ヴェルシカラー(AV)のゲノムDNAが含まれているが、これらについては、有効な検出は得られず、偽陽性反応は見られなかった。
したがって、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを選択的に特定できることがわかる。
このように、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビを、それぞれ選択的に検出することが可能である。
次に、上記実施形態における特定カビのDNA増幅用の新規プライマー対(配列番号10及び11に示す塩基配列からなるプライマー対)が、対象カビの検出精度に与える影響について、図6を参照して説明する。なお、図6において、注目すべき部分を太枠で示している。図7及び図8においても同様である。
同図に示す実施例16と参考例3とは、PCR反応液に含まれるプライマー対のみが相違し、その他については同一条件で試験を行ったものである。すなわち、実施例16では上記実施形態における新規プライマー対を使用し、参考例3では従来のリバースプライマーを含むプライマー対を使用している。
これらの試験による蛍光強度のうち、良く反応しているプローブについて比較すると、実施例16の蛍光強度は、参考例3の蛍光強度のおよそ約2.5〜17倍となっている。
その結果、上記実施形態における新規プライマー対を使用して短鎖の増幅産物を生成し、これを上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを用いてプローブにハイブリダイズさせることで、検出対象カビをより高い精度で検出することが可能になっていると考えられる。
次に、PCR反応液のDMSO濃度が、対象カビの検出精度に与える影響について、図7を参照して説明する。
実施例14〜18に示されるように、ユーロチウム用プローブの配列番号3に示す塩基配列からなるプローブでは、DMSO濃度が0%の時に比較して、DMSO濃度が0.5%,2%で約6倍、DMSO濃度が5%で約10倍、DMSO濃度が7%で約3倍に蛍光強度が増加している。
したがって、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイによれば、夾雑物が多く存在し、検出対象カビであるユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビが比較的少ない環境下であっても、DMSOを添加することで、蛍光強度を増大させ、より高い精度で検出できることがわかる。
また、このような検出精度の向上効果は、次に説明するように、上記実施形態における新規プライマーを組み合わせることで、より一層増大させることが可能となっている。
次に、PCR反応液のDMSO濃度、及び新規プライマー対が、対象カビの検出精度に与える影響について、図8を参照して説明する。
同図には、ユーロチウム用の主たるプローブである配列番号3のプローブ、及びアスペルギルス ペニシリオイデス用の主たるプローブである配列番号7のプローブについて、短鎖の増幅産物が得られる新規プライマー対を用いたとき、及び長鎖の増幅産物が得られる従来のリバースプライマーを含むプライマー対を用いたときのそれぞれにおける、DMSO濃度が0%,2%の場合の蛍光強度の比較結果が示されている。
すなわち、配列番号3のプローブでは、参考例2及び3のプライマー対を用いた場合、PCR反応液にDMSOを2容量%含有させることで、蛍光強度は1.9倍に増加している。これに対し、実施例14及び実施例16の新規プライマー対を用いた場合、PCR反応液にDMSOを2容量%含有させることで、蛍光強度は5.7倍に増加している。
これは、長鎖の増幅産物が得られる場合よりも、短鎖の増幅産物が得られる場合の方が、DMSOを添加した場合のPCR増幅効率が高くなることによるものと推定される。
このように、PCR反応液に上記実施形態における新規プライマー対を含有させるとともに、DMSOを含有させることで、対象カビの検出精度をより一層向上できることが明らかとなった。
例えば、PCR反応液として本発明における新規プライマーとDMSOが含有され、本発明と同様の効果を奏することができるものであれば、その他の成分は適宜変更することが可能である。
また、本実施形態における検出対象カビは、図書館や文化財保管場におけるものに限定されず、例えば香辛料や穀物などの乾燥食品、皮革や綿などの乾燥した工業製品の保管庫におけるものなど、ユーロチウム属又はアスペルギルス ペニシリオイデス種のカビであれば、その検出場所はどこであってもかまわない。
Claims (12)
- 配列番号1〜9のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号1〜9のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも1のプローブを固定化したことを特徴とする特定カビ検出用マイクロアレイ。
- 配列番号3に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号1に示す塩基配列を有するプローブ及び/又は配列番号2に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、ユーロチウム属(Eurotium spp.)のカビのゲノムDNAを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、ユーロチウム属のカビを検出する
ことを特徴とする請求項1記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。 - 配列番号7に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号6に示す塩基配列を有するプローブ及び/又は配列番号8に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス ペニシリオイデス種(Aspergillus penicillioides)におけるアスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビのゲノムDNAを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス ペニシリオイデス系統のカビを検出する
ことを特徴とする請求項1又は2記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。 - 配列番号5に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号4に示す塩基配列を有するプローブ及び/又は配列番号9に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス ペニシリオイデス種(Aspergillus penicillioides)におけるアスペルギルス ビトリコラ系統のカビのゲノムDNAを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス ビトリコラ系統のカビを検出する
ことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。 - ユーロチウム属(Eurotium spp.)のカビを検出するための、以下の(1)〜(3)のいずれかのプローブを固定化した、及び/又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種(Aspergillus penicillioides)のカビを検出するための、以下の(4)〜(6)のいずれかのプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
(1)配列番号1〜3に示す塩基配列において1又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
(2)配列番号1〜3に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
(3)(1)又は(2)のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
(4)配列番号4〜9に示す塩基配列において1又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
(5)配列番号4〜9に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
(6)(4)又は(5)のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。 - 配列番号10に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号11に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムDNAと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するPCR反応液を使用して、PCR法により核酸が増幅され、
前記試料のゲノムDNAに、ユーロチウム属のカビ、及び/又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのDNAが含まれている場合、これらのカビのゲノムDNAを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する
ことを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。 - 前記プライマー対が、以下の(A)又は(B)であることを特徴とする請求項6載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
(A)配列番号10に示す塩基配列において1又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号11に示す塩基配列において1又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対。
(B)配列番号10に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号11に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対。 - 前記PCR反応液が、ジメチルスルホキシドを終濃度で0.5〜7容量%含有することを特徴とする請求項6又は7記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
- ユーロチウム属(Eurotium spp.)のカビ、又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種(Aspergillus penicillioides)のカビを検出するための特定カビ検出用マイクロアレイに、
配列番号1〜9のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号1〜9のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも1のプローブを固定化し、
配列番号10に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号11に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムDNAと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するPCR反応液を使用して、PCR法により核酸を増幅し、
前記試料のゲノムDNAに、ユーロチウム属のカビ、及び/又は、アスペルギルス ペニシリオイデス種のカビのDNAが含まれている場合、これらのカビのゲノムDNAを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する
ことを特徴とする特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。 - 前記PCR反応液に、ジメチルスルホキシドを終濃度で0.5〜7容量%含有させることを特徴とする請求項9記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
- ユーロチウム属(Eurotium spp.)のカビを検出するための、以下の(1)〜(3)のいずれかのプローブを固定化した、及び/又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス ペニシリオイデス種(Aspergillus penicillioides)のカビを検出するための、以下の(4)〜(6)のいずれかのプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項9又は10記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
(1)配列番号1〜3に示す塩基配列において1又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
(2)配列番号1〜3に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
(3)(1)又は(2)のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
(4)配列番号4〜9に示す塩基配列において1又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
(5)配列番号4〜9に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
(6)(4)又は(5)のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。 - 前記プライマー対が、以下の(A)又は(B)であることを特徴とする請求項9〜11のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
(A)配列番号10に示す塩基配列において1又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号11に示す塩基配列において1又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対。
(B)配列番号10に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号11に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対。
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