WO2011092792A1 - 特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法 - Google Patents

特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法 Download PDF

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WO2011092792A1
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WO
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seq
base sequence
mold
nucleic acid
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PCT/JP2010/007473
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加瀬谷泰介
青木俊介
平山幸一
田辺卓
竹治仁詩
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東洋製罐株式会社
東洋鋼鈑株式会社
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
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    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/38—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from Aspergillus

Definitions

  • the present invention relates to mold detection technology for detecting fungi in the environment by molecular biological techniques, and in particular, for detection of specific molds for detecting specific molds that frequently occur in dry conditions in libraries and cultural property storage areas.
  • the present invention relates to a microarray and a method for using the same.
  • Patent Document 1 describes a method of detecting the presence or absence of a target mold by amplifying mold DNA using a predetermined primer and performing electrophoresis of the obtained amplification product.
  • Patent Documents 2 and 3 a predetermined primer is used to amplify mold and mite DNA, and a predetermined probe for detecting mold and mite is used to hybridize the amplified DNA fragment to the probe. The method of detecting by doing is described. According to these detection methods, since it is not necessary to culture mold, the time required for mold detection can be greatly reduced.
  • the 18S rDNA region of mold is amplified, but since these are gene regions that are common in fungi, the same region of a wide variety of fungi is amplified. . Therefore, even if the presence or absence of the obtained DNA fragment is detected by electrophoresis, only the presence or absence of fungi can be detected, and the genus and family as well as the species cannot be specified.
  • Patent Documents 2 and 3 describe molds of the genus Aspergillus as molds to be detected, but do not describe molds of the Aspergillus penicillides type, and identify and detect molds of that type I can't.
  • Eurotium herbariorum is described as a fungus of the genus Eurotium, but detection of the level of Eurotium is not described. That is, according to the inventions described in Patent Documents 2 and 3, it was not possible to accurately identify the presence or absence of Aspergillus penicilliosides mold and Eurotium mold.
  • the present inventors have intensively researched and succeeded in developing a novel probe capable of suitably identifying molds of the genus Eurotium and Aspergillus penicillioides, and completed the present invention.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a microarray for detecting a specific mold, in which a novel probe for detecting fungi of the genus Eurotium and Aspergillus penicillioides, which are dry molds, is immobilized. And Furthermore, these specific molds can be contaminated by hybridizing amplification products obtained using a PCR reaction solution containing a novel primer pair and / or dimethyl sulfoxide that can improve the detection accuracy of these molds to a new probe. It is an object of the present invention to provide a specific mold detection microarray that can be detected even in the presence of an object, and a method of using the specific mold detection system.
  • the microarray for detecting a specific mold of the present invention has a probe having the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 9 and a base sequence complementary to the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 9 In this configuration, at least one probe selected from the group consisting of probes is immobilized.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 It is also preferable to adopt a configuration in which a nucleic acid obtained by immobilizing and amplifying Eurotium spp. Genomic DNA is hybridized to an immobilized probe to detect Eurotium fungi.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and / or a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • the nucleic acid obtained by immobilizing and amplifying mold genomic DNA of Aspergillus penicilloides strains in Aspergillus penicillioides is hybridized to the immobilized probe to detect Aspergillus penicilloids molds. It is also preferable.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and / or a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9
  • the nucleic acid obtained by immobilizing and amplifying mold genomic DNA of Aspergillus vitricola strain in Aspergillus penicillioides is hybridized to the immobilized probe to detect mold of Aspergillus vitricola strain It is also preferable.
  • a primer pair comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, a sample genomic DNA, and a nucleic acid synthase
  • the nucleic acid is amplified by PCR using a PCR reaction solution containing a nucleic acid synthesis substrate, and the genomic DNA of the sample contains europium mold and / or mold of Aspergillus penicillides
  • the nucleic acid obtained by amplifying these mold genomic DNAs is identified by hybridizing to an immobilized probe.
  • the PCR reaction solution preferably contains 0.5 to 7% by volume of dimethyl sulfoxide in a final concentration.
  • the method for using the microarray for detecting a specific mold of the present invention is a microarray for detecting a specific mold for detecting a mold of Eurotium spp. Or a mold of Aspergillus penicillioides (Aspergillus penicillioides) in the genus Aspergillus.
  • the PCR reaction solution contains dimethyl sulfoxide in a final concentration of 0.5 to 7% by volume.
  • the present invention in the detection of specific molds using a microarray, it is possible to greatly improve the detection sensitivity of molds of the genus Eurotium and Aspergillus penicillides, and the target mold concentration is low in the presence of contaminants. However, these can be selectively detected.
  • FIG. 6 is a diagram showing test results of Example 1-6 and Reference Example 1. It is a figure which shows the kind and strain of a genome which were used by the Example and the reference example. It is a figure which shows the test result of Example 7-13. It is a figure which shows the test result of Example 14-18 and the reference examples 2 and 3.
  • FIG. It is a figure shown about the influence of the primer in embodiment of this invention. It is a figure shown about the influence of DMSO density
  • the microarray of the present embodiment is not particularly limited as long as at least one of the predetermined probes for detecting the specific mold that is the detection target of the present embodiment is immobilized on the substrate.
  • a spot type DNA microarray, a synthetic type DNA chip or the like can be used.
  • the probe for detecting the target mold of the present embodiment is a DNA fragment having a base sequence specified by SEQ ID NOs: 1 to 9, respectively.
  • SEQ ID NOs: 1 to 9 those specified by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 are probes for detecting europium mold, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, What is specified by SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 is a probe for detecting mold of Aspergillus penicilliosides.
  • molds to be detected are dry-dry molds that frequently occur at a low humidity of 60 to 70% RH or less. Such dry-drying molds can grow in libraries and cultural property storages kept at low humidity, and can damage books and cultural properties.
  • the specific mold detecting microarray of the present embodiment can selectively detect each of these specific molds with high sensitivity using the probe.
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 9 are probes for detecting the strain of Aspergillus vitricola.
  • SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, Number 8 is a probe for detecting the strain of Aspergillus penicillioides. Taxonomy is in the process of development, and these are all treated as Aspergillus penicilliosides in the current theory.
  • the probes for detecting these target molds are all prepared based on the base sequence obtained by searching the ITS1 region of each mold rDNA.
  • the probe of SEQ ID NO: 3 As will be described later in the Examples, it is possible to detect DNA of six major strains that are frequent species that are commonly detected in the environment in the genus Eurotium. is there. For this reason, by using the probe of SEQ ID NO: 3, it is practically possible to specifically detect most molds present in the genus Eurotium. In the present embodiment, the reliability of detection is improved by using the probes of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in addition to the probe of SEQ ID NO: 3. Moreover, any one of the probes of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 may be used in an auxiliary manner together with the probe of SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 1 was selected from the ITS1 region of the fungal rDNA of Eurotium herbariorum
  • SEQ ID NO: 2 was selected from the ITS1 region of the fungal rDNA of Eurotium tonophilum. Is. For example, if detection by the probe of SEQ ID NO: 1 or 2 is performed when the probe of SEQ ID NO: 3 cannot be detected by the probe, such as when the probe of SEQ ID NO: 3 is not properly immobilized on the microarray for some reason, a new microarray It is possible to perform reconfirmation by using and to improve the certainty of detection.
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 are sequences specific to mold of Aspergillus penicilliosides, and probes comprising these sequences are as described above. It is possible to selectively detect molds of Aspergillus penicillioides.
  • the fluorescence intensity of the probe of SEQ ID NO: 7 is the highest for Aspergillus penicilliosides molds in Aspergillus penicilliosides. For this reason, while using the probe of sequence number 7 as a main probe, it is also preferable to use the probe of sequence number 6 and / or the probe of sequence number 8 as an auxiliary probe. As a result, it is possible to improve the certainty of detecting mold of the Aspergillus penicillioides strain. Similarly, the Aspergillus penicillioides species Aspergillus vitricola strain has the highest fluorescence intensity of the probe of SEQ ID NO: 5.
  • All of the probes immobilized on the specific mold detecting microarray of this embodiment have a length of about 20 mer (base) and can be synthesized by a DNA synthesizer.
  • Each probe consisting of the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9 immobilized on the specific mold detecting microarray of the present embodiment used in Examples described later is synthesized by a DNA synthesizer.
  • the primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NOs: 10 and 11 used in Examples described later has a length of about 20 mer (base) and is synthesized by a DNA synthesizer.
  • each probe comprising the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9 in the present embodiment is not limited to the sequences themselves, and one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 9
  • Probes that can be hybridized under stringent conditions to nucleic acid fragments consisting of base sequences complementary to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 9 can also be used.
  • these probes and probes having a base sequence complementary to the probes consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 9 can also be used.
  • Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • a DNA having high homology (homology of 90% or more, preferably 95% or more) to the DNA comprising the sequence represented by SEQ ID NO: 1 is complementary to the DNA comprising the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the conditions for hybridizing with DNA having a typical nucleotide sequence usually, it means a case where hybridization occurs at a temperature about 5 ° C. to about 30 ° C., preferably about 10 ° C. to about 25 ° C. lower than the melting temperature (Tm) of the complete hybrid.
  • Tm melting temperature
  • the primer pair consisting of the sequences of SEQ ID NOs: 10 and 11 is not limited to the sequence itself, but a primer in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, In addition, a primer pair provided with a primer in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 can be used.
  • a primer comprising a nucleic acid fragment capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid fragment comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 A primer pair provided with a primer comprising a nucleic acid fragment that can hybridize under stringent conditions to a nucleic acid fragment comprising a complementary base sequence can also be used.
  • the specific mold detecting microarray of the present embodiment can be manufactured by an existing general method using probes each having the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9.
  • an affixed DNA microarray is prepared as the microarray of the present embodiment, it can be prepared by immobilizing a probe on a slide glass with a DNA spotter.
  • a probe is generated by synthesizing a single-stranded oligo DNA having the above sequence on a glass substrate by a photolithographic technique, and the microarray of this embodiment is produced. Can do.
  • the microarray for detecting specific molds of this embodiment detects whether or not molds of the genus Eurotium and / or molds of Aspergillus penicilliosides exist in samples collected from indoor air such as libraries and cultural property storages. Used to do. For this reason, the microarray for detecting a specific mold according to the present embodiment is a probe obtained by amplifying DNA of a sample collected from room air, for example, by the PCR method and immobilizing the obtained amplification product on the microarray by the following steps. Use by hybridizing.
  • a specific DNA region contained in a sample is amplified by a nucleic acid amplification apparatus using a dedicated PCR reaction solution described later. Then, the obtained amplification product is hybridized to the probe on the specific mold detection microarray of this embodiment, and the label of the amplification product is detected by the label detection device, so that the sample contains the DNA of the specific mold Detect whether or not.
  • air sampler is used to collect indoor air from libraries and cultural property storage. The collected air is blown onto a special medium and cultured.
  • the medium it is preferable to use a strip of M40Y medium or dichlorane-glycerol (DG-18) agar medium, which is suitable for the growth of psychrophilic molds, for an air sampler.
  • DG-18 dichlorane-glycerol
  • ITS1 region in rDNA of specific mold by PCR method
  • Primer pair for specific mold DNA amplification in this embodiment primer pair of SEQ ID NOS: 10 and 11
  • DMSO dimethyl sulfoxide, 0.5 in final concentration
  • the PCR reaction solution of the present embodiment is prepared by mixing ⁇ 7% by volume (hereinafter sometimes referred to simply as “%”)), genomic DNA (DNA extract) of the sample, and other predetermined reagents described above.
  • % ⁇ 7% by volume
  • genomic DNA DNA extract
  • DMSO is a simple organic compound having a melting point of around 18 ° C. and is usually in a liquid state at room temperature.
  • the PCR reaction solution used in the present embodiment can be prepared, for example, according to a prescription prescribed in Ampdirect (R) (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • Ampdirect manufactured by Shimadzu Corporation
  • the PCR reaction solution used in this embodiment contains DMSO, the enzyme can be easily destroyed by a high concentration of DMSO. For this reason, it is preferable that the DNA synthase is finally mixed in the PCR reaction solution, and after mixing, the amplification reaction is immediately started by the nucleic acid amplifier.
  • the PCR reaction conditions of the nucleic acid amplification apparatus are as follows in order to obtain a high amplification effect: It is preferable to do.
  • the PCR reaction conditions are preferably as follows, for example. (I) 95 ° C. for 10 minutes, (ii) 95 ° C. for 30 seconds, (iii) 56 ° C. for 30 seconds, (iv) 72 ° C. for 60 seconds (40 cycles of (ii) to (iv)), (v) 72 ° C. 10 Min, (vi) 4 ° C ⁇ (hold)
  • a predetermined buffer is mixed with the PCR amplification product and heated at 94 ° C. for 5 minutes to dissociate the double-stranded DNA into a single strand. This is rapidly cooled on ice and dropped onto the microarray.
  • the microarray is allowed to stand at 45 ° C. for 1 hour, and then PCR products that have not been hybridized with a predetermined buffer solution are washed away from the microarray. Then, the label is detected by applying the microarray to the label detection device, and it is detected whether or not the specific mold is present in the sample.
  • the PCR reaction solution used in this embodiment preferably has the following composition, for example. That is, a nucleic acid synthesis substrate (dNTP mixture (dCTP; 400 ⁇ M, dATP, dTTP, dGTP; 500 ⁇ M each) 5% by volume), forward primer (Forward primer (10 pmol / ⁇ l) 5% by volume), reverse primer (Reverse primer (10 pmol / ⁇ l) ) 5 volume%), nucleic acid synthase (NovaTaq 1 volume%), labeling component (1 mM Cy5-dCTP 1 volume%), dimethyl sulfoxide (DMSO 2 volume%), sample genome (predetermined volume, eg, 0.1 ng to 300 ng) ), A buffer solution (60% by volume), and water as a remaining volume% component.
  • the buffer solution may contain 20% by volume of Amp addition-1, Amp addition-2, and Ampdirect, for example, as a buffer solution in PCR formulation of Ampdirect® (Shimadzu),
  • the forward primer (forward primer) of the primer pair for amplifying DNA of a specific mold is the one consisting of the sequence of SEQ ID NO: 10
  • the reverse primer (reverse primer) is of SEQ ID NO: 11.
  • the forward primer is a novel primer comprising a sequence selected from 18S in fungal rDNA (ribosomal DNA).
  • the reverse primer is a novel primer having a sequence selected from 5.8S.
  • the base sequence has directionality, and the base sequence shown in SEQ ID NO indicates a sequence from the 5 ′ end to the 3 ′ end.
  • amplification of the genomic DNA of the fungus belonging to the genus Eurotium or Aspergillus penicillioides which is the specific fungus to be detected, mainly consists of the base sequence of the ITS1 region, as shown in FIG.
  • a short amplification product of approximately 250 to 330 bp (base pair base pair) is obtained.
  • these new primer pairs are used to amplify DNA of, for example, Eurotium mold (JCM1575 Eurotium herbariorum (FHWiggers) Link)
  • an amplification product of 258 bp is obtained.
  • Aspergillus penicilloides mold JCM22961 Aspergillus penicillioides Spegazzini
  • an amplification product of 309 bp is obtained.
  • the base length of the amplification product is less than 250 bp, there is a high possibility that a sequence similar to the primer pair for obtaining the short amplification product exists in the genomic DNA of the genus Eurotium and Aspergillus penicillides. Many portions other than the ITS1 region are amplified. As a result, even if the target mold exists, the fluorescence intensity may decrease and the detection accuracy may decrease. In addition, if a sequence that hybridizes with the novel probe of the present embodiment is included in the region of such a portion, an erroneous reaction is caused and it is difficult to specifically detect the target mold. On the other hand, when the base length of the amplified product exceeds 330 bp, the efficiency of hybridization becomes lower than that below this, and the detection sensitivity may decrease.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Tm the temperature necessary for half of double-stranded DNA ⁇ dsDNA> to dissociate into single-stranded molecules
  • Tm the temperature necessary for half of double-stranded DNA ⁇ dsDNA> to dissociate into single-stranded molecules
  • Tm the temperature necessary for half of double-stranded DNA ⁇ dsDNA> to dissociate into single-stranded molecules
  • Tm the temperature necessary for half of double-stranded DNA ⁇ dsDNA> to dissociate into single-stranded molecules
  • Two dsDNA chain molecules are separated to become single-stranded ssDNA).
  • the secondary structure due to the GC repeating sequence is suppressed to make it linear. That is, the single-stranded DNA is prevented from taking a three-dimensional structure such as twisting or bending.
  • the specific mold DNA to be detected by the specific mold detection microarray of the present embodiment has a GC-rich base sequence.
  • the action of DMSO facilitates separation of the GC sequence, and after separation. It is presumed that the amplification efficiency is remarkably improved.
  • amplification of specific mold DNA using the novel primer in the present embodiment provides a higher amplification efficiency than when simply adding DMSO to the PCR reaction solution. Can be done.
  • the microarray for detecting specific molds of the present embodiment the detection accuracy of fungus of the genus Eurotium and Aspergillus penicilliosides, which was difficult to detect at a practical level by the conventional method, It is possible to greatly improve.
  • DMSO has the above-mentioned effects, but also has the property of reducing enzyme activity when added in excess. For this reason, when preparing the PCR reaction liquid of this embodiment, it is preferable to add an enzyme (DNA polymerase) last as a mixing order of components. In addition, when performing detection on a large number of samples, it is preferable to add the enzyme second from the end and add the genomic DNA of the sample last, considering workability. Furthermore, an enzyme with a hot start function (an enzyme modified so as to exhibit DNA synthesis activity only after being exposed to a predetermined high temperature (temperature of DNA denaturation step such as 95 ° C.)) is used as the enzyme. It is preferable.
  • a hot start function an enzyme modified so as to exhibit DNA synthesis activity only after being exposed to a predetermined high temperature (temperature of DNA denaturation step such as 95 ° C.) is used as the enzyme. It is preferable.
  • DMSO dimethyl methacrylate
  • the concentration it is preferable to add DMSO before mixing the enzyme, mix well, and adjust the concentration to a final concentration of 0.5 to 7% by volume. More preferably, the final concentration is 0.5 to 5% by volume, and the final concentration is more preferably 5% by volume.
  • the final concentration of DMSO in the PCR reaction solution is less than 0.5% by volume, the effect of DMSO is small, especially in the presence of contaminating genomes, the target species Eurotium mold and Aspergillus penicillioides mold DNA May be difficult to amplify, and the detection sensitivity may decrease.
  • the final concentration of DMSO is larger than 7% by volume, the activity of the DNA synthase is easily inhibited and may be deactivated. For this reason, it is difficult to amplify DNA including not only the target species but also the hybrid species, and there is a possibility that the detection sensitivity may be reduced or detection may not be possible.
  • reagents for other components in the PCR reaction solution, that is, a nucleic acid synthesis substrate, a nucleic acid synthase, a labeling component, a buffer solution and the like, commonly used reagents can be used as appropriate.
  • the nucleic acid amplification apparatus is a PCR apparatus that amplifies the ITS1 region of rDNA of a specific mold in a sample using the dedicated PCR reaction solution in the present embodiment.
  • the above-mentioned PCR reaction solution can be placed in a general thermal cycler (Thermal Cycler temperature control device).
  • the novel primer pair capable of amplifying the DNA of the specific mold contained in the PCR reaction solution of the present embodiment is obtained when the mold of Eurotium and / or Aspergillus penicillios mold is present in the sample.
  • the ITS1 region can be amplified.
  • the specific mold DNA of the detection target of the present embodiment is amplified to some extent by itself, but if non-target contaminants coexist, it is sufficiently at a practical level. It could not be amplified. That is, when a conventional PCR reaction solution is used, even if europium mold and / or Aspergillus penicillides mold is present in the sample, due to the characteristics of the genomic DNA, it can be efficiently detected until it can be detected. It was difficult to amplify. In addition, if the sample contains a contaminant that is amplified by a conventional primer pair, the DNA of the contaminant is competitively amplified and it is difficult to sufficiently amplify and detect the target mold. Met.
  • the specific mold DNA to be detected in the present embodiment can be more efficiently amplified by the nucleic acid amplification device. Even when the bacterium is contained, specific mold can be detected using the specific mold detection microarray of the present embodiment.
  • the conventional PCR reaction solution detection was not possible unless the mold to be detected was at least 1/6 in the mixed genomic DNA for Eurotium spp. And 1/3 for A. penicillioides.
  • the conventional PCR reaction solution cannot be put to practical use for detecting specific molds in an environment where various molds may exist.
  • the PCR reaction solution of this embodiment as shown in the following examples, even when 6 ng of contaminants are present, it is possible to detect if the detection target mold is 0.1 ng (100 pg). It is.
  • the label detection apparatus detects a label bound to an amplification product (DNA fragment) hybridized to the probe on the microarray.
  • a general device such as a fluorescence scanning device can be used.
  • the fluorescence intensity of the amplification product labeled with Cy5-dCTP contained in the PCR reaction solution is detected by a label detection device.
  • the label component used in the specific mold detection system of the present embodiment is not limited to Cy5-dCTP, and it is possible to label using other label components such as a radioisotope and digoxigenin.
  • the probes consisting of SEQ ID NOs: 1 to 3 are those consisting of sequences suitable for the detection of fungi belonging to the genus Eurotium.
  • the probe consisting of 9 consists of a sequence suitable for detecting mold of Aspergillus penicillioides.
  • the PCR reaction solution used in this embodiment contains DMSO at a predetermined concentration, which promotes denaturation of mold DNA of the genus Eurotium and Aspergillus penicilliosides and formation of secondary structures. As a result, the malfunction of the PCR reaction can be reduced, and the amplification reaction of the DNA of the mold to be detected can be promoted.
  • a novel primer pair primer pair comprising a base sequence specified by SEQ ID NOs: 10 and 11
  • Ampdirect (R) (manufactured by Shimadzu Corporation) was used as a PCR reaction solution, and 10 ⁇ l of the following composition was prepared. 1.5 ⁇ Amp addition-1 2.0 ⁇ l 2.5 ⁇ Amp addition-2 2.0 ⁇ l 3.5 ⁇ Ampdirect 2.0 ⁇ l 4). Nucleic acid synthesis substrate dNTPmixture 0.5 ⁇ l (DCTP; 400 ⁇ M, dATP, dTTP, dGTP; 500 ⁇ M each) 5. Forward primer (SEQ ID NO: 10: synthesized by Operon Technology Co., Ltd.) 0.5 ⁇ l (10 pmol / ⁇ l) 6).
  • Reverse primer (SEQ ID NO: 11: same as above) 0.5 ⁇ l (10 pmol / ⁇ l) 7). Nucleic acid synthase NovaTaq 0.1 ⁇ l 8). Labeling component 1 mM Cy5-dCTP 0.1 ⁇ l 9. Genome of target molds and contaminants Molds of major species of the genus Eurotium (A1, JCM1575 Eurotium herbariorum (FHWiggers) Link, obtained from RIKEN BioResource Center) 0.1 ng (100 pg) 10. Water (water until 10.0 ⁇ l overall)
  • DNA was amplified by the nucleic acid amplification apparatus (TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (R) Gradient manufactured by Takara Bio Inc.) under the following conditions. 1.95 ° C 10 minutes 2.95 ° C 30 seconds 3.56 ° C 30 seconds 4.72 ° C 60 seconds (40 cycles of 2-4) 5.72 ° C 10 minutes 6.4 ° C hold ⁇
  • Gene silicon (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) is used for the microarray, and SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 are used.
  • a buffer solution (3 ⁇ SSC ⁇ citric acid-saline solution, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.> is added with 0.3% SDS (sodium dodecyl sulfate, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.)) to the PCR amplification product.
  • SDS sodium dodecyl sulfate, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.
  • the microarray was allowed to stand at 45 ° C. for 1 hour. Next, PCR products that were not hybridized using the buffer were washed from the microarray.
  • the fluorescence intensity was measured by applying the microarray to a label detection device (GenePix4100A, manufactured by Molecular Devices).
  • the fluorescence intensity is excited by laser light to emit the labeled component (Cy5), and the light quantity is replaced with an electrical signal on the light receiving surface of a photomultiplier tube (PMT) mounted in the detector, which is digitized.
  • PMT photomultiplier tube mounted in the detector
  • This fluorescence intensity is an intensity index in the apparatus, has no unit, and is calculated with correction so that the background value is zero.
  • such a microarray detection was performed using the same amplification product in four separate microarrays to which the same probe was immobilized. And each fluorescence intensity was measured and the fluorescence intensity for every probe was computed by taking the average of 5 times. The result is shown in FIG.
  • “Test number” is a serial number assigned to each test.
  • “Examples” the numbers of Examples and Reference Examples are shown after “actual” and “reference”, respectively.
  • “Genome” indicates the type and amount of genomic DNA contained in the PCR reaction solution
  • “Euro contamination (ng)” indicates the type and amount of Eurotium mold
  • “Asper contamination” indicates Aspergillus penicillioides.
  • the type and amount of the contamination, and the type and amount of the contamination mold are displayed in the “contamination”.
  • “ ⁇ ” indicates that the conditions are the same as in the upper column. Further, the fluorescence intensity of 30 or more is indicated by a thick frame. The same applies to the test results from FIG. Moreover, it shows in FIG. 3 about the kind of mold
  • Example 2 Test No. (2): Target genome (only Aspergillus penicillides mold), new primer pair, DMSO concentration 2% The test was carried out in the same manner as in Example 1 except that 0.1 ng of the genomic DNA of Aspergillus penicilloides (B1, Aspergillus penicilloides, JCM22961 Aspergillus penicillioides Spegazzini) was used as the target genome in the PCR reaction solution. The result is shown in FIG.
  • Test number (7) The target genome (only Aspergillus penicilliosides mold and contaminants), new primer pair, DMSO concentration 2% The test was carried out in the same manner as in Example 4 except that 0.1 ng of Aspergillus penicillides mold (B1) genomic DNA was used as the target genome in the PCR reaction solution, without including the europium mold. went. The result is shown in FIG.
  • Test No. (8) Target genome (major species A2 of Eurotium), new primer pair, DMSO concentration 2% Among the target genomes in the PCR reaction solution, 0.1 ng of the genome DNA of other major species 2 (A2, NBRC8157 Eurotium tonophilum Otsuki) is used as the fungus of the genus Eurotium, and the genome of Aspergillus penicillioides species (B1) The test was performed in the same manner as in Example 4 except that 0.1 ng of DNA was used. The result is shown in FIG.
  • Test number (9) Target genome (major species A3 of Eurotium), new primer pair, DMSO concentration 2% The same as in Example 7 except that 0.1 ng of genomic DNA of other major species 3 mold (A3, JCM1568 Eurotium chevalieri L. Mangin) was used as the fungus of the genus Eurotium out of the target genome in the PCR reaction solution. The test was conducted. The result is shown in FIG.
  • Test number (11) Target genome (major species A5 of the genus Eurotium), new primer pair, DMSO concentration 2% As in Example 7, except that 0.1 ng of genomic DNA of other major species 5 (A5, JCM1580 Eurotium repens de Bary) was used as the fungus of the genus Eurotium out of the target genome in the PCR reaction solution. The test was conducted. The result is shown in FIG.
  • Example 11 Test No. (12): Target genome (major species A6 of Eurotium), new primer pair, DMSO concentration 2% Among the target genomes in the PCR reaction solution, Example 7 was used except that 0.1 ng of genomic DNA of other major species 6 mold (A6, JCM22942 Eurotium rubrum Konig et al.) was used as mold of the genus Eurotium. The test was conducted in the same manner. The result is shown in FIG.
  • Test number (13) Target genome (Aspergillus vitricola B2), new primer pair, DMSO concentration 2%
  • Aspergillus penicillioids Synonym Aspergillus vitricola
  • B2 NBRC8155 Aspergillus penicillioides
  • the test was conducted in the same manner as in Example 4 except that 0.1 ng of genomic DNA of Otsuki)) was used. The result is shown in FIG.
  • Test No. (14) Target genome (Aspergillus penicillides 2 types B1, B2), new primer pair, DMSO concentration 2% Examples except for the use of 0.1 ng of both B1 and B2 DNAs of Aspergillus penicilloid molds as the target genome in the PCR reaction solution, together with the genome of the fungus of the genus Eurotium (A1 0.1 ng) The test was conducted in the same manner as in No. 4. The result is shown in FIG.
  • Test number (15): Target genome exists, new primer pair, DMSO concentration 0% As the target genome in the PCR reaction solution, a fungus genome of the genus Eurotium (A1 0.1 ng) and a mold of Aspergillus penicillides (B1 0.1 ng) were used, and other points were not added to the PCR reaction solution. Were tested in the same manner as in Example 4. The result is shown in FIG.
  • Example 15 Test No. (16): Target genome exists, new primer pair, DMSO concentration 0.5% The test was performed in the same manner as in Example 14 except that a PCR reaction solution containing 0.5% by volume of DMSO was used. The result is shown in FIG.
  • Example 16 Test number (17): Target genome exists, new primer pair, DMSO concentration 2% The test was performed in the same manner as in Example 14 except that a PCR reaction solution containing 2% by volume of DMSO was used. The result is shown in FIG.
  • Example 17 Test number (18): with target genome, new primer pair, DMSO concentration 5% The test was performed in the same manner as in Example 14 except that a PCR reaction solution containing 5% by volume of DMSO was used. The result is shown in FIG.
  • Example 18 Test No. (19): Target genome exists, new primer pair, DMSO concentration 7% The test was performed in the same manner as in Example 14 except that a PCR reaction solution containing 7% by volume of DMSO was used. The result is shown in FIG.
  • the length of the DNA sequence of this amplification product also corresponds to twice or more of the amplification product 309 bp of the same kind of DNA in Example 2.
  • a long amplification product obtained by using a primer pair including such a conventional reverse primer may be referred to as a long chain
  • a short amplification product from the novel primer of the above embodiment may be referred to as a short chain.
  • Test number (21) Primer pair with target genome, including conventional reverse primer, DMSO concentration 2% The test was performed in the same manner as in Example 16 except that a primer pair consisting of the base sequences specified by SEQ ID NOs: 10 and 12 was used. The result is shown in FIG.
  • the effects of the specific mold detection microarray and the specific mold detection microarray of the above embodiment will be described based on the test results.
  • the fluorescence intensity (light quantity) in the test result is 50 or more
  • the image data output from the label detection device GenePix4100A
  • the intensity is a level that can be identified with the naked eye, It is likely that the target genome is detected.
  • the fluorescence intensity in the test result is less than 30 to 50, it is hardly discernable with the naked eye, but a reaction is clearly seen and the possibility of detecting the target genome is considered to be relatively high.
  • fungi belonging to the genus Eurotium as shown in Examples 4 and 7 to 11, it is possible to detect all six major species in the presence of impurities.
  • the amount of light that is effective or relatively ineffective for the probe consisting of the sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 or the probes complementary to these is relatively High light intensity is detected. Therefore, the reliability of detection can be further improved by using these together with the probe consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the probe consisting of a complementary sequence thereto.
  • the molds A1 to A6 are frequent species that occupy most of the fungi of the genus Eurotium, and according to the microarray for detecting the specific fungus of the above embodiment and the method of use thereof, the fungus of the genus Eurotium is almost genus. Can be detected specifically by level.
  • Aspergillus penicilliosides As shown in Examples 6, 12, and 13, effective detection was obtained with many probes in any strain of Aspergillus penicillides and Aspergillus vitricola.
  • the PCR reaction solution of Example 5 contains genomic DNA of Aspergillus restrictus (AR) and Aspergillus versicolor (AV), which are molds of related species not belonging to the genus Aspergillus but belonging to the Penicillioides species.
  • AR Aspergillus restrictus
  • AV Aspergillus versicolor
  • the fungus of the genus Eurotium and the mold of Aspergillus penicilliosides are mixed, and impurities Even in an environment where there is, it is possible to detect these simultaneously and individually.
  • the microarray for detecting specific molds of the above-described embodiment and the method of using the same it is possible to selectively detect molds of the genus Eurotium and molds of Aspergillus penicillides.
  • Example 16 and Reference Example 3 shown in the figure differ only in the primer pair contained in the PCR reaction solution, and the others were tested under the same conditions. That is, in Example 16, the novel primer pair in the above embodiment is used, and in Reference Example 3, a primer pair including a conventional reverse primer is used. Of the fluorescence intensities obtained by these tests, the fluorescence intensity of Example 16 is approximately 2.5 to 17 times the fluorescence intensity of Reference Example 3 when compared with probes that react well.
  • DMSO works better when a short amplification product is obtained than when a long amplification product is obtained. That is, in the probe of SEQ ID NO: 3, when the primer pairs of Reference Examples 2 and 3 are used, the fluorescence intensity is increased 1.9 times by containing 2% by volume of DMSO in the PCR reaction solution. On the other hand, when the novel primer pairs of Example 14 and Example 16 were used, the fluorescence intensity was increased 5.7 times by containing 2% by volume of DMSO in the PCR reaction solution.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and it goes without saying that various modifications can be made within the scope of the present invention.
  • the novel primer and DMSO in the present invention are contained as a PCR reaction solution and the same effects as in the present invention can be obtained, other components can be appropriately changed.
  • the mold to be detected in the present embodiment is not limited to the one in the library or the cultural property storage area, for example, dry foods such as spices and grains, and those in the storage of dry industrial products such as leather and cotton. As long as it belongs to the genus or Aspergillus penicillioides, it can be detected anywhere.

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Abstract

　図書館、文化財保管場、その他乾燥した各種工業製品や食品の保管庫など乾燥した環境下でよく繁殖する特定カビを短期間かつ高精度で検出可能とする。　配列番号１～９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１～９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化した特定カビ検出用マイクロアレイ。

Description

特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法
　本発明は、環境中の真菌を分子生物学的手法によって検出するためのカビ検出技術に関し、特に図書館や文化財保管場などにおける乾燥状態で多く発生する特定カビを検出するための特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法に関する。
　図書館や文化財保管場などは、図書や文化財が損傷しないように、空気環境が管理され、高湿度を好む一般的なカビは比較的生えにくい環境となっている。
　しかしながら、カビには、６０～７０％ＲＨやそれ以下の低湿度下で多く発生する好乾性カビも存在する。このようなカビとしては、例えばユーロチウム属（Eurotium　spp.）における各種カビ、及びアスペルギルス属におけるアスペルギルス　ペニシリオイデス種（Aspergillus　penicillioides）のカビ（以下、これらを特定カビ、対象カビ又は検出対象カビと称する場合がある）を挙げることができる。
　これらのカビは、図書館や文化財保管場のような乾燥した環境下においても繁殖するカビであり、その繁殖によって図書や文化財に害を与える危険性をもっている。
　したがって、その繁殖を防止するために、これらのカビを定期的に測定検出することは、図書及び文化財保護のために重要である。
　一方、これらのカビのような空中浮遊真菌類（糸状菌、酵母等）を採取するためには、通常１週間から１０日以上を要する上、その同定を行うためには、さらに多くの日数を要するという問題があった。また、同定には熟練した専門家が必要であり、一般の人が手軽に行い得るものではなかった。
　すなわち、従来、一般的には、カビを培養してコロニーを形成させ、肉眼及び顕微鏡による観察を行うことで同定を行っていたため、カビの採取を開始してからその同定を完了するまでには、およそ３～４週間という長期間を要するという問題があった。また、担当者の技量によって、カビの検出精度が異なってしまうという問題もあった。
　これに対し、カビの同定を分子生物学的手法により行うことも提案されている。
　例えば、特許文献１には、所定のプライマーを用いてカビのＤＮＡを増幅し、得られた増幅産物の電気泳動を行うことで、対象となるカビの存否を検出する方法が記載されている。
　また、特許文献２及び３には、所定のプライマーを用いてカビやダニのＤＮＡを増幅するとともに、カビやダニを検出するための所定のプローブを用い、増幅したＤＮＡ断片を、プローブにハイブリダイズさせることにより検出する方法が記載されている。
　これらの検出方法によれば、カビの培養を行う必要がないため、カビの検出に要する時間を大きく低減することが可能である。
特開２００６－６１１５２号公報 特開２００７－２０２４６２号公報 特開２００８－３５７７３号公報
　しかしながら、これらの方法を用いても、上述したユーロチウム属のカビとアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビは、検出精度が低く、夾雑物が存在する場合には、ほとんど検出できないという問題があった。
　その主たる原因は、これらのカビのＤＮＡがＧＣリッチな配列を有する（二本鎖ＤＮＡにおいて、３つの水素結合により対合するＧとＣの対の割合が相対的に多く存在する）点にあると考えられる。すなわち、このＧＣリッチな配列により、ＰＣＲ（polymerase　chain　reaction　ポリメラーゼ連鎖反応）においてＤＮＡが乖離しにくく、また乖離しても二次構造を形成しやすく、十分に増幅できないためであると推定される。
　その結果、これらのカビのＤＮＡの増幅産物は得られにくく、検出精度が低かったと考えられる。さらに、夾雑物が存在する場合には、このような低い検出精度が一層低下するため、現実の環境下でこれらのカビを特定して検出することはできず、実用的なレベルでの検出を行うことは非常に困難であった。
　また、特許文献１のカビ検出方法では、カビの１８ＳｒＤＮＡ領域を増幅しているが、これらは真菌類において共通性に富む遺伝子領域であるため、多種多様な真菌類の同領域が増幅されてしまう。このため、得られたＤＮＡ断片の存否を、電気泳動により検出しても、真菌類の存否を検出できるのみであり、種は勿論のこと、属や科を特定することはできなかった。
　また、特許文献２及び３には、検出対象のカビとしてアスペルギルス属のカビが記載されているが、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビについては記載されておらず、当該種類のカビを特定して検出することはできない。また、ユーロチウム属のカビとしてユーロチウム　ヘルバリオルム種（Eurotium　herbariorum）が記載されているが、ユーロチウム属レベルの検出については、記載されていない。
　すなわち、特許文献２及び３に記載の発明によれば、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビ、及びユーロチウム属のカビを特定して、その存否を的確に検出することはできなかった。
　そこで、本発明者らは鋭意研究し、ユーロチウム属とアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビを好適に特定し得る新規プローブを開発することに成功し、本発明を完成させた。また、これらのカビの検出精度を向上させることができる新規プライマー対を開発することにも成功した。さらに、ＰＣＲ反応液中に所定の割合のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えることで、検出精度を顕著に向上させることに成功した。
　本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、好乾性カビであるユーロチウム属とアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビを検出するための新規プローブを固定化した特定カビ検出用のマイクロアレイを提供することを目的とする。また、これらのカビの検出精度を向上させ得る新規プライマー対及び／又はジメチルスルホキシドを含有するＰＣＲ反応液を用いて得られた増幅産物を新規プローブにハイブリダイズさせることで、これらの特定カビを夾雑物の存在下でも検出可能とする特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出システムの使用方法を提供することを目的とする。
　本発明の特定カビ検出用マイクロアレイは、配列番号１～９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１～９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化した構成としてある。
　また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号３に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号２に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、ユーロチウム属（Eurotium　spp.）のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、ユーロチウム属のカビを検出する構成とすることも好ましい。
　また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号７に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号６に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号８に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス　ペニシリオイデス種（Aspergillus　penicillioides）におけるアスペルギルス　ペニシリオイデス系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス　ペニシリオイデス系統のカビを検出する構成とすることも好ましい。
　また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号５に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号９に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス　ペニシリオイデス種（Aspergillus　penicillioides）におけるアスペルギルス　ビトリコラ系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス　ビトリコラ系統のカビを検出する構成とすることも好ましい。
　また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸が増幅され、試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する構成とすることも好ましい。
　また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイにおいて、上記ＰＣＲ反応液が、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５～７容量％含有する構成とすることも好ましい。
　また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法は、ユーロチウム属（Eurotium　spp.）のカビ、又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス　ペニシリオイデス種（Aspergillus　penicillioides）のカビを検出するための特定カビ検出用マイクロアレイに、配列番号１～９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１～９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化し、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸を増幅し、試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する方法としてある。
　また、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法において、上記ＰＣＲ反応液に、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５～７容量％含有させることも好ましい。
　本発明によれば、マイクロアレイを用いた特定カビの検出において、ユーロチウム属のカビ、及びアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビの検出感度を大きく向上させることができ、夾雑菌の存在下、対象カビ濃度が低濃度であってもこれらをそれぞれ選択的に検出することが可能となる。
本発明の実施形態における新規プライマー対のカビ遺伝子における位置を示す図である。 実施例１－６、参考例１の試験結果を示す図である。 実施例、参考例で使用したゲノムの種類と菌株を示す図である。 実施例７－１３の試験結果を示す図である。 実施例１４－１８、参考例２，３の試験結果を示す図である。 本発明の実施形態におけるプライマーの影響について示す図である。 本発明の実施形態におけるＤＭＳＯ濃度の影響について示す図である。 本発明の実施形態におけるＤＭＳＯ濃度とプライマーの影響について示す図である。
　以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
［マイクロアレイ］
　本実施形態のマイクロアレイは、本実施形態の検出対象である特定カビを検出するための所定のプローブの少なくともいずれか１つを、基板上に固定化したものであれば特に限定されるものではなく、例えばスポット型ＤＮＡマイクロアレイ、合成型ＤＮＡチップなどを用いることができる。
　本実施形態の対象カビを検出するためのプローブは、配列番号１～９によりそれぞれ特定される塩基配列からなるＤＮＡ断片である。このうち、配列番号１、配列番号２、配列番号３により特定されるものが、ユーロチウム属のカビを検出するためのプローブであり、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９により特定されるものが、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビを検出するためのプローブである。
　これらの検出対象カビは、６０～７０％ＲＨ、あるいはそれ以下の低湿度下で多く発生する、好乾性カビである。このような好乾性カビは、低湿度に保たれている図書館や文化財保管場などでも生育し、図書や文化財を損傷し得るものである。
　本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、上記プローブにより、これらの特定カビをそれぞれ選択的に高感度で検出することができる。
　なお、より詳細に系統まで考慮すれば、配列番号４、配列番号５、配列番号９は、アスペルギルス　ビトリコラ（Aspergillus　vitricola）の系統を検出するためのプローブであり、配列番号６、配列番号７、配列番号８は、アスペルギルス　ペニシリオイデス（Aspergillus　penicillioides）の系統を検出するためのプローブである。分類学は発展途上にあり、現在の通説では、これらはいずれもアスペルギルス　ペニシリオイデス種として取り扱われている。
　これらの対象カビを検出するためのプローブは、いずれもそれぞれのカビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を探索して得られた塩基配列にもとづき作成されたものである。
　ここで、配列番号３のプローブによれば、実施例において後述するように、ユーロチウム属における、環境下で一般によく検出される頻出種である主要６種の菌株のＤＮＡを検出することが可能である。このため、配列番号３のプローブを使用することで、実用上は、ユーロチウム属に存在するほとんどのカビを特定的に検出することが可能になっている。本実施形態では、この配列番号３のプローブと共に、配列番号１及び配列番号２のプローブを補助的に使用することで、検出の確実性を向上させている。また、配列番号３のプローブと共に、配列番号１及び配列番号２のプローブのうちいずれか一方を補助的に使用してもよい。
　配列番号１は、ユーロチウム属におけるヘルバリオルム種（Eurotium　herbariorum）のカビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域から、配列番号２は、ユーロチウム属におけるトノフィラム種（Eurotium　tonophilum）のカビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域から、それぞれ選択されたものである。
　例えば、配列番号３のプローブが何らかの理由によりマイクロアレイに適切に固定化されなかった場合など、当該プローブでは検出できない場合に、配列番号１又は２のプローブによる検出が行われていれば、新たなマイクロアレイを使用して再確認を行うことができ、検出の確実性を向上させることが可能となる。
　配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９は、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビに特異的な配列であり、これらの配列からなるプローブは、上述したように、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビを選択的に検出することが可能である。
　ここで、後述する実施例によれば、アスペルギルス　ペニシリオイデス種におけるアスペルギルス　ペニシリオイデス系統のカビについては、配列番号７のプローブの蛍光強度が最も大きくなっている。このため、配列番号７のプローブを主たるプローブとして用いると共に、配列番号６のプローブ、及び／又は、配列番号８のプローブを補助的なプローブとして使用することも好ましい。これにより、アスペルギルス　ペニシリオイデス系統のカビの検出の確実性を向上させることが可能となる。
　また、同様に、アスペルギルス　ペニシリオイデス種におけるアスペルギルス　ビトリコラ系統のカビについては、配列番号５のプローブの蛍光強度が最も大きくなっている。このため、配列番号５のプローブを主たるプローブとして用いると共に、配列番号４のプローブ、及び／又は、配列番号９のプローブを補助的なプローブとして使用することも好ましい。これにより、アスペルギルス　ビトリコラ系統のカビの検出の確実性を向上させることが可能となる。
　さらに、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに、配列番号１～９の全てのプローブを固定化することで、ユーロチウム属及びアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビを同時に、かつそれぞれを特定して検出することが可能となる。
［プローブの合成］
　本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化される上記プローブは、いずれも２０ｍｅｒ（塩基）程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成できる。
　後述する実施例で用いた本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化した配列番号１～９の配列からなる各プローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用している。
　なお、後述する実施例で用いた配列番号１０及び１１の配列からなるプライマー対も同様に２０ｍｅｒ（塩基）程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用している。
　また、本実施形態における配列番号１～９の配列からなる各プローブとしては、当該配列そのものに限定されず、配列番号１～９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブを用いることができ、また配列番号１～９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや、配列番号１～９に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
　なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１で表される配列からなるＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１で表される配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃～約３０℃、好ましくは約１０℃～約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
　なお、配列番号１０及び１１の配列からなるプライマー対についても同様に、当該配列そのものに限定されず、配列番号１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対を用いることができる。また、配列番号１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対を用いることもできる。
［マイクロアレイの作成］
　本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、配列番号１～９の配列をそれぞれ備えたプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
　例えば、本実施形態のマイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡマイクロアレイを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをスライドガラス上に固定化することによって、作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することによってプローブを生成し、本実施形態のマイクロアレイを作成することができる。
［特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法］
　本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、図書館や文化財保管場等の室内空気から採取された試料に、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビが存在するか否かを検出するために使用する。
　このため、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイは、以下の工程により、例えば室内空気から採取された試料のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、得られた増幅産物を当該マイクロアレイに固定化したプローブにハイブリダイズさせることで使用する。
　まず、後述する専用のＰＣＲ反応液を用いて、核酸増幅装置により試料に含まれる特定のＤＮＡ領域を増幅する。
　そして、得られた増幅産物を本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ上のプローブにハイブリダイズさせ、標識検出装置により増幅産物の標識を検出することで、試料に特定カビのＤＮＡが含まれているか否かを検出する。
　次に、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法について、カビの採取工程から詳細に説明する。
（１）カビの採取
　まず、エアーサンプラーを用いて、図書館や文化財保管場の室内空気を採取する。採取した空気を専用培地に吹き付けて培養する。培地としては、好乾性カビの生育に適したＭ４０Ｙ培地やジクロラン-グリセロール（ＤＧ－１８）寒天培地などをエアーサンプラー用にストリップ形状にしたものを使用することが好ましい。培養条件としては、２５℃で暗所に６５時間以上静置することが好ましい。
　次に、１ストリップ中のコロニーを一括して採取し、事前にφ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたねじ口バイアル瓶に入れる。ねじ口バイアル瓶ごと液体窒素に浸して試料を凍結し、振盪装置により試料を破砕する。
（２）ＤＮＡの抽出
　試料からのゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl　trimethyl　ammonium　bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
（３）ＰＣＲ法による特定カビのｒＤＮＡにおけるＩＴＳ１領域の増幅
　本実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用プライマー対（配列番号１０及び１１のプライマー対）と、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド，終濃度で０．５～７容量％（以下、単に％と称する場合がある））、試料のゲノムＤＮＡ（ＤＮＡ抽出液）、及び上述したその他の所定の試薬を混合して、本実施形態のＰＣＲ反応液を作成する。
　なお、ＤＭＳＯは、融点が１８℃付近の単体の有機化合物であり、室温では通常液体状態となっている。
　本実施形態で使用するＰＣＲ反応液は、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）に規定の処方に従って作成することができる。
　なお、本実施形態で使用するＰＣＲ反応液にはＤＭＳＯが含まれるが、酵素は高濃度のＤＭＳＯによって容易に破壊され得る。このため、ＤＮＡ合成酵素はＰＣＲ反応液に最後に混合し、混合後は、核酸増幅装置により直ちに増幅反応を開始させることが好ましい。
　本実施形態において特定カビのＤＮＡ増幅用プライマー対（配列番号１０及び１１のプライマー対）を使用する場合、核酸増幅装置のＰＣＲ反応条件は、高い増幅効果を得るために、次のようなものにすることが好ましい。
（ａ）ＤＮＡ鎖の乖離（ＤＮＡ変性）工程　　　９３～９７℃　２０～４０秒
（ｂ）プライマーの対合（アニーリング）工程　５０～６０℃　１０～５０秒
（ｃ）ＤＮＡ合成工程　　　　　　　　　　　　７０～７４℃　５０～７０秒
　具体的には、ＰＣＲ反応条件を、例えば次のようなものにすることが好ましい。
（i）９５℃　１０分、（ii）９５℃　３０秒、（iii）５６℃　３０秒、（iv）７２℃　６０秒（（ii）～（iv）を４０サイクル）、（v）７２℃　１０分、（vi）４℃　∞（保持）
（４）マイクロアレイによるハイブリダイズ及び蛍光検出
　次に、ＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ上に滴下して、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化されたプローブにハイブリダイスしたＰＣＲ増幅産物の標識を検出する。
　具体的には、例えば次のように行うことができる。
　まず、ＰＣＲ増幅産物に所定の緩衝液を混合し、９４℃で５分間加温することで、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に乖離させる。これを氷上にて急冷し、マイクロアレイに滴下する。
　次に、マイクロアレイを４５℃で１時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイスしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流す。
　そして、マイクロアレイを標識検出装置にかけて標識の検出を行い、試料中に特定カビが存在するか否かを検出する。
［ＰＣＲ反応液］
　本実施形態で使用するＰＣＲ反応液は、例えば以下のような組成とすることが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP；４００μＭ、dATP、dTTP、dGTP；５００μＭ　each）　５容量％）、フォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　５容量％）、リバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　５容量％）、核酸合成酵素（ＮｏｖａＴａｑ　１容量％）、標識成分（１ｍＭ　Ｃｙ５－ｄＣＴＰ　１容量％）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ　２容量％）、試料のゲノム（所定量、例えば０．１ｎｇ～３００ｎｇ）、緩衝液（６０容量％）、及び残りの容量％の成分として水を含むものとすることが好ましい。なお、緩衝液は、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社　島津製作所）のＰＣＲ処方における緩衝液として、Ａｍｐ　ａｄｄｉｔｉｏｎ－１、Ａｍｐ　ａｄｄｉｔｉｏｎ－２、及びＡｍｐｄｉｒｅｃｔをそれぞれ２０容量％ずつ含有させることができる。
　このＰＣＲ反応液において、特定カビのＤＮＡ増幅用のプライマー対のフォワードプライマー（正プライマー）としては、配列番号１０の配列からなるものを使用し、リバースプライマー（逆プライマー）としては、配列番号１１の配列からなるものを使用する。
　図１に示すように、フォワードプライマーは、真菌類のｒＤＮＡ（リボソームＤＮＡ）における１８Ｓから選択された配列からなる新規プライマーである。また、リバースプライマーは、同５．８Ｓから選択された配列からなる新規プライマーである。
　なお、塩基配列には方向性があり、配列番号に示される塩基配列は、５’末端から３’末端方向の配列を示している。
　これらの新規プライマー対を用いた場合、検出対象の特定カビであるユーロチウム属のカビ、又はアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのゲノムＤＮＡを増幅すると、同図に示すように、主としてＩＴＳ１領域の塩基配列からなるおよそ２５０～３３０ｂｐ（base　pair　塩基対）の短鎖の増幅産物が得られる。
　これらの新規プライマー対を用いて、例えばユーロチウム属のカビ（JCM1575　Eurotium　herbariorum（F.H.Wiggers）Link）のＤＮＡを増幅した場合、２５８ｂｐの増幅産物が得られる。また、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビ（JCM22961　Aspergillus　penicillioides　Spegazzini）のＤＮＡを増幅した場合、３０９ｂｐの増幅産物が得られる。
　一方、フォワードプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーを用い、かつリバースプライマーとして、例えば２８Ｓにおける塩基配列からなる既存の各種プライマーを用いてこれらのカビのＤＮＡを増幅する場合、後述する比較例２（配列番号１０及び配列番号１２のプライマー対を使用）に示されるように、ユーロチウム属のカビでは約５８０ｂｐ、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビでは約６５０ｂｐの長鎖の増幅産物が得られる。
　このように、本実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用のプライマー対（配列番号１０及び１１のプライマー対）を用いることにより、従来のおよそ１／２あるいはそれ以下の長さのＤＮＡ断片を得ることができる。本発明の発明者らは、このような短いＤＮＡ断片を使用することで、マイクロアレイに固定されたプローブとのハイブリダイズ効率を向上させることに成功している。
　ここで、増幅産物の塩基長が２５０ｂｐ未満の場合、ユーロチウム属及びアスペルギルス　ペニシリオイデス種のゲノムＤＮＡ中において、その短鎖の増幅産物を得るためのプライマー対と類似した配列が存在する可能性が高くなり、ＩＴＳ１領域以外の部分が多数増幅される。その結果、対象カビが存在していても、蛍光強度が低下し、検出精度が低下する場合がある。また、このような部分の領域内に、本実施形態の新規プローブとハイブリダイズする配列が含まれていると、誤反応を引き起こし、対象カビを特定的に検出することが困難となる。一方、増幅産物の塩基長が３３０ｂｐを上回る場合は、これ以下の場合と比較してハイブリダイズの効率が低くなり、検出感度が低下する場合がある。
　また、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、ＰＣＲ反応において、鋳型となるゲノムＤＮＡとプライマーとの非特異的な結合を抑制し、特異的な結合を促進する。また、１０容量％濃度で約５℃程度、溶解温度（Ｔｍ，二本鎖ＤＮＡ〈ｄｓＤＮＡ〉の半分が一本鎖分子に乖離するのに必要な温度）を低下させることにより、ＤＮＡの変性（ｄｓＤＮＡの鎖状分子二本が、乖離して一本鎖のｓｓＤＮＡになること）を促進する。さらに、ＧＣ繰り返し配列などによる二次構造を抑制して直鎖状にする。すなわち、一本鎖ＤＮＡが捩れや折れ曲がりなど立体的な構造をとることを防止する。
　本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイによる検出対象の特定カビのＤＮＡは、ＧＣリッチな塩基配列を有しているが、このようなＤＭＳＯの作用によって、ＧＣ配列が分離しやすくなり、また分離後の二次構造化を抑制することができ、増幅効率が顕著に向上したと推測される。特に実施例で示されるように、特定カビのＤＮＡを本実施形態における新規プライマーを用いて増幅することにより、ＰＣＲ反応液に単にＤＭＳＯを添加した場合に比較してより一層高い増幅効率を得ることができるようになっている。
　その結果、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用することで、従来の手法では実用的なレベルでの検出が困難であった、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビの検出精度を、大きく向上させることが可能となっている。
　なお、ＤＭＳＯは、上記のような効果がある一方、過剰に添加した場合には酵素活性を低下させる性質も有している。このため、本実施形態のＰＣＲ反応液を作成するにあたっては、成分の混合順序として、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を最後に添加することが好ましい。また、多数の試料に対する検出を行う場合は、作業性を考慮して、酵素を最後から２番目に添加し、最後に試料のゲノムＤＮＡを添加することが好ましい。さらに、酵素としては、ホットスタート機能を付加したもの（所定の高温（９５℃などのＤＮＡ変性工程の温度）に曝されて初めて、ＤＮＡ合成活性を発揮するように、修飾された酵素）を用いることが好ましい。いずれの場合にも、酵素を入れる前にＤＭＳＯを添加して、よく混合した上で、その濃度を終濃度で０．５～７容量％になるようにしておくことが好ましい。また、終濃度で０．５～５容量％になるようにすることがより好ましく、終濃度で５容量％になるようにすることがさらに好ましい。
　ＰＣＲ反応液におけるＤＭＳＯの終濃度が０．５容量％未満の場合は、ＤＭＳＯの効果が小さく、特に夾雑ゲノムが混在する場合における、対象種であるユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが増幅されにくくなるため、検出感度が低下する場合がある。一方、ＤＭＳＯの終濃度が７容量％より大きい場合は、ＤＮＡ合成酵素の活性が阻害されやすく、失活する場合もある。このため、対象種のみならず夾雑種も含めてＤＮＡ増幅が行われにくくなり、検出感度が低下するか、又は検出不能となるおそれがある。
　ＰＣＲ反応液におけるその他の成分、すなわち核酸合成基質、核酸合成酵素、標識成分、及び緩衝液等については、一般に使用されている試薬を適宜使用することができる。
［核酸増幅装置］
　核酸増幅装置は、本実施形態における専用のＰＣＲ反応液を使用して、試料における特定カビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅するＰＣＲ装置である。一般的なサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　温度制御装置）に、上記専用のＰＣＲ反応液を入れて構成することができる。
　本実施形態のＰＣＲ反応液に含まれる特定カビのＤＮＡを増幅可能な新規プライマー対は、試料中にユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビが存在する場合には、そのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅することができる。
　一方、従来のＰＣＲ反応液では、本実施形態の検出対象の特定カビのＤＮＡを単独ではある程度までは増幅するものの、非対象の夾雑菌が並存していると、実用化可能なレベルで十分に増幅することはできなかった。
　すなわち、従来のＰＣＲ反応液を用いた場合、試料中にユーロチウム属のカビ及び／又はアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビが存在していても、そのゲノムＤＮＡの特性上、これを検出しうるまで効率的に増幅することは困難であった。また、試料中に、従来のプライマー対により増幅される夾雑菌が含まれている場合には、その夾雑菌のＤＮＡが競合して増幅され、対象カビを十分に増幅して検出することが困難であった。
　これに対して、本実施形態における上記専用のＰＣＲ反応液を用いれば、核酸増幅装置により、本実施形態の検出対象の特定カビのＤＮＡをより効率的に増幅することができ、試料中にその他の夾雑菌が含まれている場合でも、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを用いて、特定カビを検出することが可能となっている。
　具体的には、従来のＰＣＲ反応液では、検出対象カビが、混在ゲノムＤＮＡ中に少なくともEurotium　spp.では１／６、A.penicillioidesでは１／３より多くなければ検出できなかった。また、ＰＣＲ反応液１０μｌ中に検出対象カビが０．２ｎｇ存在している場合、単独なら検出できたが、夾雑物（混在ゲノムＤＮＡ）が０．２ｎｇ存在すればもはや検出することが困難であった。このため、従来のＰＣＲ反応液は、様々なカビが存在し得る環境下で、特定カビを検出するために実用化できるものではなかった。
　これに対し、本実施形態のＰＣＲ反応液では、以下の実施例で示されるように、夾雑物が６ｎｇ存在する場合でも、検出対象カビが０．１ｎｇ（１００ｐｇ）存在すれば検出することが可能である。
　なお、図１に示すように、本実施形態の増幅産物には、５．８Ｓ領域の配列も部分的に含まれるが、上述したように５．８Ｓ領域は真菌類に共通する配列を備えており、種を特定可能な配列はＩＴＳ１領域にあることから、本実施形態のＰＣＲ反応液を用いて増幅される領域をＩＴＳ１領域と称している。
［標識検出装置］
　標識検出装置は、マイクロアレイ上でプローブにハイブリダイスした増幅産物（ＤＮＡ断片）に結合している標識を検出する。この標識検出装置としては、蛍光スキャニング装置など一般的なものを用いることができる。
　本実施形態では、ＰＣＲ反応液に含まれるＣｙ５－ｄＣＴＰによって標識された増幅産物の蛍光強度を、標識検出装置により検出している。
　なお、本実施形態の特定カビ検出システムにおいて使用する標識成分は、Ｃｙ５－ｄＣＴＰに限定されるものではなく、放射性同位元素やジゴキシゲニンなどその他の標識成分を用いて標識することも可能である。
　以上説明したように、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイによれば、ユーロチウム属とアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビの検出精度を顕著に向上させることができ、誤検出等を大きく低減することが可能となる。
　すなわち、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイに固定化されたプローブのうち、配列番号１～３からなるプローブは、ユーロチウム属のカビの検出に適した配列からなるものであり、配列番号４～９からなるプローブは、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビの検出に適した配列からなるものである。これらのプローブを用いることにより、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビを実用レベルで特異的に検出することが可能となっている。
　また、本実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用プライマー対を用いることで、従来の半分以下の短い増幅産物を得ることができ、プローブとのハイブリダイズをより効率的に行うことが可能となっている。
　さらに、本実施形態で用いられるＰＣＲ反応液にはＤＭＳＯが所定の濃度で含有されており、これによって、ユーロチウム属とアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡの変性が促進されるとともに、二次構造の形成が抑制されてＰＣＲ反応の誤作動を低減させることができ、検出対象カビのＤＮＡの増幅反応を促進させることが可能となっている。
　また、このような短鎖の増幅産物を得ることができる新規プライマー対と、ＰＣＲ反応液におけるＤＭＳＯの相乗効果により、ユーロチウム属のカビとアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビをより効率的に増殖でき、本実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイにより、これらのカビを優れた精度で検出することができるようになっている。
　以下、本発明の特定カビ検出用マイクロアレイによるユーロチウム属のカビとアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビについての検出精度を確認するために行った実施例及び参考例について説明する。これらの実施例及び参考例では、いずれも配列番号１～９のプローブを全て固定化した上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用した。
（実施例１）
試験番号（１）：対象ゲノム（ユーロチウム属のカビのみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　上記実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用の新規プライマー対（配列番号１０及び１１により特定される塩基配列からなるプライマー対）を含有し、ＤＭＳＯを２容量％含有するＰＣＲ反応液を用いて、検出対象カビであるユーロチウム属の主要種１のカビ（Ａ１，JCM1575　Eurotium　herbariorum（F.H.Wiggers）Link）のゲノムＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応液に夾雑物は含まれていない。そして、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを使用して、増幅産物をハイブリダイズさせ、蛍光検出を行った。
　具体的には、ＰＣＲ反応液として、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを１０μｌ作成した。
１．５×Ａｍｐ　ａｄｄｉｔｉｏｎ－１　２．０μｌ
２．５×Ａｍｐ　ａｄｄｉｔｉｏｎ－２　２．０μｌ
３．５×Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ　２．０μｌ
４．核酸合成基質　ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ　０．５μｌ
　　（dCTP；４００μＭ、dATP、dTTP、dGTP；５００μＭ　each）
５．フォワードプライマー（配列番号１０：オペロンテクノロジー株式会社により合成）　０．５μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
６．リバースプライマー（配列番号１１：同上）　０．５μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
７．核酸合成酵素　ＮｏｖａＴａｑ　０．１μｌ
８．標識成分　１ｍＭ　Ｃｙ５－ｄＣＴＰ　０．１μｌ
９．対象カビ及び夾雑物のゲノム　ユーロチウム属の主要種１のカビ（Ａ１，JCM1575　Eurotium　herbariorum（F.H.Wiggers）Link，（独）理化学研究所バイオリソースセンターより入手）　０．１ｎｇ（１００ｐｇ）
１０．水（全体が１０．０μｌになるまで加水）
　このＰＣＲ反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（Ｒ）　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
１．９５℃　１０分
２．９５℃　３０秒
３．５６℃　３０秒
４．７２℃　６０秒（２～４を４０サイクル）
５．７２℃　１０分
６．４℃保持　∞
　マイクロアレイには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を使用し、これに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９によりそれぞれ特定される塩基配列からなるプローブと、これらに相補的なプローブとを固定化した。
　次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣ〈クエン酸－生理食塩水、株式会社ニッポンジーン社製〉に０．３％ＳＤＳ〈ドデシル硫酸ナトリウム、株式会社ニッポンジーン社製〉を添加）を混合して９４℃で５分間加温し、氷上にて急冷してマイクロアレイに滴下した。
　このマイクロアレイを４５℃で１時間静置した。次に、上記緩衝液を用いてハイブリダイスしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流した。
　そして、マイクロアレイを標識検出装置（GenePix4100A　Molecular　Devices社製）にかけて蛍光強度を測定した。蛍光強度は、レーザー光で励起して標識成分（Cy5）を発光させ、それを検出器内に取り付けた光電子倍増管（ＰＭＴ）の受光面にて光量を電気信号に置換し、それを数値化することで測定した。この蛍光強度は、当該装置での強度指標であり、単位はなく、バックグラウンドの数値が０になるように補正して算出される。また、このようなマイクロアレイによる検出を、同じプローブを固定化した別個の４つのマイクロアレイでも同様に、同一の増幅産物を用いて行った。そして、各蛍光強度を測定し、５回の平均をとることで、プローブ毎の蛍光強度を算出した。その結果を図２に示す。
　同図において、「試験番号」は、試験ごとに付された連番である。「実施例等」は、実施例、参考例の番号をそれぞれ「実」「参」の後に示す。「ゲノム」は、ＰＣＲ反応液に含まれるゲノムＤＮＡの種類と量を示し、「ユーロ混入（ｎｇ）」にはユーロチウム属のカビの種類と量が、「アスペル混入」にはアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビの種類と量が、「夾雑物混入」には夾雑物のカビの種類と量が、それぞれ表示されている。「↑」は上欄と同条件であることを示している。また、蛍光強度３０以上を太枠で示している。図４以降の試験結果についても同様である。また、実施例及び参考例で用いたカビの種類について、図３に示す。
（実施例２）
試験番号（２）：対象ゲノム（アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１，アスペルギルス　ペニシリオイデス，JCM22961　Aspergillus　penicillioides　Spegazzini）のゲノムＤＮＡのみを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
（実施例３）
試験番号（３）：対象ゲノム（アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ２，アスペルギルス　ビトリコラ，NBRC8155　Aspergillus　penicillioides（Synonym　Aspergillus　vitricola　Otsuki））のゲノムＤＮＡのみを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
（参考例１）
試験番号（４）：対象ゲノムなし、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液に、対象ゲノム及び夾雑物を混入させることなく、その他の条件は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
（実施例４）
試験番号（５）：対象ゲノム（ユーロチウム属のカビと夾雑物のみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビ（Ａ１）のゲノムＤＮＡのみを０．１ｎｇ用いるとともに、夾雑物（Ｃ，NBRC4026　Alternaria　alternata（Fries）Keissler，NBRC6348　Cladosporium　cladosporioides（Fresenius）de　Vries，（独）製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー本部　生物遺伝資源部門より入手，各３ｎｇ、合計６ｎｇ）をＰＣＲ反応液に添加した点以外は、実施例１と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
（実施例５）
試験番号（６）：対象ゲノムではないアスペルギルス　ペニシリオイデスの近縁種のＤＮＡ（ＡＶ，ＡＲ）を含む、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノムと共に、アスペルギルス　ペニシリオイデス種の近縁種のカビとして、アスペルギルス　レストリクタス（ＡＲ，JCM1727　Aspergillus　restrictus　G.Smith，（独）理化学研究所バイオリソースセンターより入手）、及びアスペルギルス　ヴェルシカラー（ＡＶ，JCM10258　Aspergillus　versicolor（Vuillemin）Tiraboschi，（独）理化学研究所バイオリソースセンターより入手）のゲノムＤＮＡをそれぞれ０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
（実施例６）
試験番号（７）：対象ゲノム（アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビと夾雑物のみ）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノムを含有させることなく、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図２に示す。
（実施例７）
試験番号（８）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ２）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種２のカビ（Ａ２，NBRC8157　Eurotium　tonophilum　Otsuki）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いると共に、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
（実施例８）
試験番号（９）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ３）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種３のカビ（Ａ３，JCM1568　Eurotium　chevalieri　L.Mangin）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
（実施例９）
試験番号（１０）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ４）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種４のカビ（Ａ４，JCM1565　Eurotium　amstelodami　Mangin）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
（実施例１０）
試験番号（１１）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ５）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種５のカビ（Ａ５，JCM1580　Eurotium　repens　de　Bary）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
（実施例１１）
試験番号（１２）：対象ゲノム（ユーロチウム属の主要種Ａ６）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムのうち、ユーロチウム属のカビとして、その他の主要種６のカビ（Ａ６，JCM22942　Eurotium　rubrum　Konig　et　al.）のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例７と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
（実施例１２）
試験番号（１３）：対象ゲノム（アスペルギルス　ビトリコラ　Ｂ２）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム（Ａ１　０．１ｎｇ）と共に、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのうち、Ｂ１と同種かつ別個の系統のアスペルギルス　ビトリコラ（Ｂ２，NBRC8155　Aspergillus　penicillioides（Synonym　Aspergillus　vitricola　Otsuki））のゲノムＤＮＡを０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
（実施例１３）
試験番号（１４）：対象ゲノム（アスペルギルス　ペニシリオイデス２種　Ｂ１，Ｂ２）あり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム（Ａ１　０．１ｎｇ）と共に、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのうち、Ｂ１とＢ２の両方のＤＮＡをそれぞれ０．１ｎｇ用いた点以外は、実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図４に示す。
（実施例１４）
試験番号（１５）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度０％
　ＰＣＲ反応液における対象ゲノムとして、ユーロチウム属のカビのゲノム（Ａ１　０．１ｎｇ）と、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１　０．１ｎｇ）を用い、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを添加することなく、その他の点は実施例４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
（実施例１５）
試験番号（１６）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度０．５％
　ＤＭＳＯを０．５容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
（実施例１６）
試験番号（１７）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　ＤＭＳＯを２容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
（実施例１７）
試験番号（１８）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度５％
　ＤＭＳＯを５容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
（実施例１８）
試験番号（１９）：対象ゲノムあり、新規プライマー対、ＤＭＳＯ濃度７％
　ＤＭＳＯを７容量％含有するＰＣＲ反応液を用いた点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
（参考例２）
試験番号（２０）：対象ゲノムあり、従来のリバースプライマーを含むプライマー対、ＤＭＳＯ濃度０％
　配列番号１０及び１２により特定される塩基配列からなるプライマー対を使用した点以外は、実施例１４と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
　ここで、配列番号１０及び１２により特定される塩基配列からなるプライマー対を用いて、ユーロチウム属の主要種１のカビ（Ａ１，JCM1575　Eurotium　herbariorum（F.H.Wiggers）Link）のＤＮＡを増幅すると、５７６ｂｐの増幅産物が得られる。この増幅産物のＤＮＡ配列の長さは、実施例１における同種のＤＮＡの増幅産物２５８ｂｐの２倍以上に相当する。また、同様に、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビ（Ｂ１，JCM22961　Aspergillus　penicillioides　Spegazzini）のＤＮＡを増幅すると、６４３ｂｐの増幅産物が得られる。この増幅産物のＤＮＡ配列の長さも、実施例２における同種のＤＮＡの増幅産物３０９ｂｐの２倍以上に相当する。以下、このような従来のリバースプライマーを含むプライマー対を用いて得られた長い増幅産物を長鎖と称し、上記実施形態の新規プライマーによる短い増幅産物を短鎖と称する場合がある。
（参考例３）
試験番号（２１）：対象ゲノムあり、従来のリバースプライマーを含むプライマー対、ＤＭＳＯ濃度２％
　配列番号１０及び１２により特定される塩基配列からなるプライマー対を使用した点以外は、実施例１６と同様にして試験を行った。その結果を図５に示す。
　次に、上記の試験結果にもとづいて、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及び特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法の効果について説明する。
　上記各実施例及び参考例において、試験結果における蛍光強度（光量）が、５０以上の場合は、標識検出装置（GenePix4100A）から出力される画像データにおいて、肉眼で識別可能なレベルの強度であり、対象ゲノムを検出している可能性が高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、３０～５０未満の場合は、肉眼ではほとんど識別できないが、明らかに反応が見られ、対象ゲノムを検出している可能性が比較的高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、１０～３０未満の場合は、明らかに反応が見られるが、対象ゲノム以外の類似するゲノムを検出している可能性も高いと考えられる。試験結果における蛍光強度が、１０未満の場合は、試験番号８に示されるように、ノイズの検出と考えられる。以上のことから、以下の説明では、蛍光強度３０以上を有効な検出として説明している。
＜１．特定カビの検出＞
　まず、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法による対象カビの特定的検出について、図２及び図４を参照して説明する。
　参考例１に示されるように、ＰＣＲ反応液に検出対象カビが含まれていない場合、有効な光量は検出されていない。
　これに対し、実施例１～３に示されるように、ＰＣＲ反応液に検出対象カビが含まれている場合は、それぞれのカビに対応するプローブの多くに有効な光量が検出されている。また、実施例４～６に示されるように、夾雑物存在下においても、検出することができている。
　また、ユーロチウム属のカビについては、実施例４，実施例７～１１に示されるように、夾雑物存在下、主要な６種全てについて検出することが可能になっている。特に、Ａ２～Ａ６のユーロチウム属のカビについては、配列番号１，２で表される配列からなるプローブ、又はこれらと相補的な配列からなるプローブにも有効な光量、あるいは有効ではないものの比較的高い光量が検出されている。よって、これらを配列番号３で表される配列からなるプローブ及びこれと相補的な配列からなるプローブと共に補助的に使用することで、検出の確実性をより向上させることが可能である。
　また、これらＡ１～Ａ６のカビは、ユーロチウム属のカビのうちの多くを占める頻出種であり、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビをほぼ属レベルで特定的に検出することができる。
　次に、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビについては、実施例６，１２，１３に示されるように、アスペルギルス　ペニシリオイデス、及びアスペルギルス　ビトリコラのいずれの系統でも、多くのプローブで有効な検出が得られている。
　また、実施例５のＰＣＲ反応液には、アスペルギルス属でペニシリオイデス種ではない近縁の種のカビである、アスペルギルス　レストリクタス（ＡＲ）、及びアスペルギルス　ヴェルシカラー（ＡＶ）のゲノムＤＮＡが含まれているが、これらについては、有効な検出は得られず、偽陽性反応は見られなかった。
　したがって、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビを選択的に特定できることがわかる。
　また、実施例７～１３の結果から明らかなように、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビが混在し、かつ夾雑物が存在する環境下においても、これらを同時に、かつそれぞれを特定して検出することが可能になっている。
　このように、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイ、及びその使用方法によれば、ユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビを、それぞれ選択的に検出することが可能である。
＜２．プライマーの影響＞
　次に、上記実施形態における特定カビのＤＮＡ増幅用の新規プライマー対（配列番号１０及び１１に示す塩基配列からなるプライマー対）が、対象カビの検出精度に与える影響について、図６を参照して説明する。なお、図６において、注目すべき部分を太枠で示している。図７及び図８においても同様である。
　同図に示す実施例１６と参考例３とは、ＰＣＲ反応液に含まれるプライマー対のみが相違し、その他については同一条件で試験を行ったものである。すなわち、実施例１６では上記実施形態における新規プライマー対を使用し、参考例３では従来のリバースプライマーを含むプライマー対を使用している。
　これらの試験による蛍光強度のうち、良く反応しているプローブについて比較すると、実施例１６の蛍光強度は、参考例３の蛍光強度のおよそ約２．５～１７倍となっている。
　これは、上記実施形態における新規プライマー対を用いて検出対象カビのゲノムＤＮＡを増幅すると、参考例３のプライマー対を用いる場合の約半分の短鎖の増幅産物が得られることによるものと推定される。このような短鎖の増幅産物は、長鎖の増幅産物に比較して、プローブとのハイブリダイズ効率が高いと考えられる。
　その結果、上記実施形態における新規プライマー対を使用して短鎖の増幅産物を生成し、これを上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイを用いてプローブにハイブリダイズさせることで、検出対象カビをより高い精度で検出することが可能になっていると考えられる。
＜３．ＤＭＳＯ濃度の影響＞
　次に、ＰＣＲ反応液のＤＭＳＯ濃度が、対象カビの検出精度に与える影響について、図７を参照して説明する。
　実施例１４～１８に示されるように、ユーロチウム用プローブの配列番号３に示す塩基配列からなるプローブでは、ＤＭＳＯ濃度が０％の時に比較して、ＤＭＳＯ濃度が０．５％，２％で約６倍、ＤＭＳＯ濃度が５％で約１０倍、ＤＭＳＯ濃度が７％で約３倍に蛍光強度が増加している。
　また、アスペルギルス　ペニシリオイデス用の多くのプローブでも、ＤＭＳＯ濃度が０％の時に比較して、ＤＭＳＯ濃度が０．５％～７％の場合に蛍光強度の増加が認められ、特にＤＭＳＯ濃度が５％の場合に大きく増加している。
　したがって、上記実施形態の特定カビ検出用マイクロアレイによれば、夾雑物が多く存在し、検出対象カビであるユーロチウム属のカビ及びアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビが比較的少ない環境下であっても、ＤＭＳＯを添加することで、蛍光強度を増大させ、より高い精度で検出できることがわかる。
　また、このような検出精度の向上効果は、次に説明するように、上記実施形態における新規プライマーを組み合わせることで、より一層増大させることが可能となっている。
＜５．ＤＭＳＯ濃度とプライマーの影響＞
　次に、ＰＣＲ反応液のＤＭＳＯ濃度、及び新規プライマー対が、対象カビの検出精度に与える影響について、図８を参照して説明する。
　同図には、ユーロチウム用の主たるプローブである配列番号３のプローブ、及びアスペルギルス　ペニシリオイデス用の主たるプローブである配列番号７のプローブについて、短鎖の増幅産物が得られる新規プライマー対を用いたとき、及び長鎖の増幅産物が得られる従来のリバースプライマーを含むプライマー対を用いたときのそれぞれにおける、ＤＭＳＯ濃度が０％，２％の場合の蛍光強度の比較結果が示されている。
　同図に示される通り、長鎖の増幅産物が得られる場合よりも、短鎖の増幅産物が得られる場合の方が、ＤＭＳＯが良く効くことがわかる。
　すなわち、配列番号３のプローブでは、参考例２及び３のプライマー対を用いた場合、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを２容量％含有させることで、蛍光強度は１．９倍に増加している。これに対し、実施例１４及び実施例１６の新規プライマー対を用いた場合、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを２容量％含有させることで、蛍光強度は５．７倍に増加している。
　また、配列番号７のプローブでは、参考例２及び３のプライマー対を用いた場合、ＤＭＳＯの効果が認められず、むしろ蛍光強度が低減している。これに対し、実施例１４及び実施例１６の新規プライマー対を用いた場合、ＰＣＲ反応液にＤＭＳＯを２容量％含有させることで、蛍光強度が３．６倍に増加している。
　これは、長鎖の増幅産物が得られる場合よりも、短鎖の増幅産物が得られる場合の方が、ＤＭＳＯを添加した場合のＰＣＲ増幅効率が高くなることによるものと推定される。
　このように、ＰＣＲ反応液に上記実施形態における新規プライマー対を含有させるとともに、ＤＭＳＯを含有させることで、対象カビの検出精度をより一層向上できることが明らかとなった。
　本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、ＰＣＲ反応液として本発明における新規プライマーとＤＭＳＯが含有され、本発明と同様の効果を奏することができるものであれば、その他の成分は適宜変更することが可能である。
　また、本実施形態における検出対象カビは、図書館や文化財保管場におけるものに限定されず、例えば香辛料や穀物などの乾燥食品、皮革や綿などの乾燥した工業製品の保管庫におけるものなど、ユーロチウム属又はアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビであれば、その検出場所はどこであってもかまわない。
　本発明は、図書館、文化財保管場、その他乾燥した各種工業製品や食品の保管庫など乾燥した環境下でよく繁殖するユーロチウム属のカビとアスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビを、短期間で検出する必要がある場合などに好適に利用することが可能である。

Claims (12)

  1. 　配列番号１～９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１～９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化したことを特徴とする特定カビ検出用マイクロアレイ。
  2. 　配列番号３に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号１に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号２に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、ユーロチウム属（Eurotium　spp.）のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、ユーロチウム属のカビを検出する
    　ことを特徴とする請求項１記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
  3. 　配列番号７に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号６に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号８に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス　ペニシリオイデス種（Aspergillus　penicillioides）におけるアスペルギルス　ペニシリオイデス系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス　ペニシリオイデス系統のカビを検出する
    　ことを特徴とする請求項１又は２記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
  4. 　配列番号５に示す塩基配列を有するプローブと、配列番号４に示す塩基配列を有するプローブ及び／又は配列番号９に示す塩基配列を有するプローブと、を固定化し、アスペルギルス　ペニシリオイデス種（Aspergillus　penicillioides）におけるアスペルギルス　ビトリコラ系統のカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせ、アスペルギルス　ビトリコラ系統のカビを検出する
    　ことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
  5. 　ユーロチウム属（Eurotium　spp.）のカビを検出するための、以下の（１）～（３）のいずれかのプローブを固定化した、及び／又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス　ペニシリオイデス種（Aspergillus　penicillioides）のカビを検出するための、以下の（４）～（６）のいずれかのプローブを固定化した
    　ことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
    　（１）配列番号１～３に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
    　（２）配列番号１～３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
    　（３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
    　（４）配列番号４～９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
    　（５）配列番号４～９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
    　（６）（４）又は（５）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
  6. 　配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸が増幅され、
    　前記試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する
    　ことを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
  7. 　前記プライマー対が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）であることを特徴とする請求項６載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
    　（Ａ）配列番号１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対。
    　（Ｂ）配列番号１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対。
  8. 　前記ＰＣＲ反応液が、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５～７容量％含有することを特徴とする請求項６又は７記載の特定カビ検出用マイクロアレイ。
  9. 　ユーロチウム属（Eurotium　spp.）のカビ、又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス　ペニシリオイデス種（Aspergillus　penicillioides）のカビを検出するための特定カビ検出用マイクロアレイに、
    　配列番号１～９のいずれかに示す塩基配列を有するプローブ、及び、配列番号１～９のいずれかに示す塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブからなる群より選択された少なくとも１のプローブを固定化し、
    　配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを備えたプライマー対と、試料のゲノムＤＮＡと、核酸合成酵素と、核酸合成基質とを含有するＰＣＲ反応液を使用して、ＰＣＲ法により核酸を増幅し、
    　前記試料のゲノムＤＮＡに、ユーロチウム属のカビ、及び／又は、アスペルギルス　ペニシリオイデス種のカビのＤＮＡが含まれている場合、これらのカビのゲノムＤＮＡを増幅して得られた核酸を、前記固定化されたプローブにハイブリダイズさせることにより特定する
    　ことを特徴とする特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
  10. 　前記ＰＣＲ反応液に、ジメチルスルホキシドを終濃度で０．５～７容量％含有させることを特徴とする請求項９記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
  11. 　ユーロチウム属（Eurotium　spp.）のカビを検出するための、以下の（１）～（３）のいずれかのプローブを固定化した、及び／又は、アスペルギルス属におけるアスペルギルス　ペニシリオイデス種（Aspergillus　penicillioides）のカビを検出するための、以下の（４）～（６）のいずれかのプローブを固定化した
    　ことを特徴とする請求項９又は１０記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
    　（１）配列番号１～３に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
    　（２）配列番号１～３に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
    　（３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
    　（４）配列番号４～９に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
    　（５）配列番号４～９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
    　（６）（４）又は（５）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
  12. 　前記プライマー対が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）であることを特徴とする請求項９～１１のいずれかに記載の特定カビ検出用マイクロアレイの使用方法。
    　（Ａ）配列番号１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマーを備えたプライマー対。
    　（Ｂ）配列番号１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号１１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーを備えたプライマー対。
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