JP6538660B2 - オーバーラッププライマー及び融解プローブを用いた一塩基多型の検出 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく診断分野に関するものであって、より具体的には、一塩基多型(SNP)を有する標的核酸中の配列多様性の増幅及び検出方法に関する。
蛍光標識された融解(melting)プローブを用いたPCRによるSNPの検出は、以前記載されている(例えば、Huang et al.,2011,PLoS ONE 6(4)e19206、Luo et al.,2011,J.Clin.Microbiol.,49(9)3132−3138、を参照)。従来の融解は、SNPを有しない、及び、SNPを有さない標的を用いた蛍光標識プローブのPCR後の融解温度を解析することにより機能する。うまく設計された融解プローブはSNPが存在しない場合、最も高い融解温度(Tm)を生じ、プローブ結合領域で発生する任意の塩基対の変化が、融解温度の変化(減少)を引き起こす。融解温度のシフトは、野生型(WT)及び変異体(MT)標的の識別に使用することができる。
核酸増幅によるサンプル中の標的核酸内の1以上のSNPの検出は、SNPの迅速かつ正確な検出方法を提供する。サンプル中の標的核酸内のSNPを検出するためのリアルタイムアッセイは、SNPを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブセットとして本明細書中に記載されている。他の方法と比較してSNPを検出するためのリアルタイムPCRの感受性の増大、並びに、サンプルの封じ込め(containment)及び増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムPCRの特徴の改善が、臨床検査室における日常的な診断及びSNP検出に関するこの技術の実施を実現可能とする。
本明細書は、例えば、該標的核酸配列の一部を増幅することによって標的核酸中のSNPを検出する方法を提供するものであって、1以上のSNPを含むことが既知又は疑われている任意の標的核酸配列であってもよく、例えば、標的核酸配列が、例えば、HIV、HCV、又はリファンピシン耐性MTBである。
米国特許第4683202号明細書、米国特許第4683195号明細書、米国特許第4800159号明細書、及び米国特許第4965188号明細書は、従来のPCR技術を開示している。PCRは、典型的には、選択された核酸鋳型(例えば、DNA又はRNA)に結合する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。実施形態において記載されている有用なプライマーは、標的核酸配列内で核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法による制限消化で精製される、または、合成して製造することができる。プライマーは、最大効率で増幅するためには、好ましくは一本鎖であるが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性し、すなわち、鎖を分離するために処理する。二本鎖核酸を変性する一つの方法としては、加熱によるものである。
FRET技術(例えば、米国特許第4,996,143号明細書、米国特許第5,565,322号明細書、米国特許第5,849,489号明細書、及び米国特許第6,162,603号明細書を参照)は、ドナー蛍光成分及び対応するアクセプター蛍光成分が互いにある一定の距離内に配置される場合、2つの蛍光成分の間にエネルギー移転が起こり、可視化される、又は、他の方法で検出及び/又は定量化される、という概念に基づいている。ドナーは、適切な波長の光照射によって励起された場合、一般的にアクセプターにエネルギーを移転する。アクセプターは、典型的には、異なる波長の光放射の形として、移転されたエネルギーを再放出する。
本開示は、生物学的又は非生物学的サンプル中の標的核酸中のSNPの存在又は非存在を検出方法を提供する。本発明によって提供される方法は、サンプル汚染、偽陰性、及び偽陽性の問題を回避する。方法は、1又は対のプライマーを使用してサンプルから標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも1つのサイクル工程、増幅産物に融解プローブを接触させること含むハイブリダイゼーション工程、及び検出工程を実行することを含む。複数サイクル工程が実施され、好ましくは、サーモサイクラー中で実施される。開示された方法は、サンプル中の標的核酸中のSNPの存在又は非存在を検出するために、選択された設計に応じて、野生型又はSNP特異的なプローブを用いて実施することができる。
本発明の実施形態は、さらに、サンプル中の標的核酸内のSNPを検出するための製造品又はキットを提供する。製造品は、適切な包装材料とともに、標的核酸中のSNPを検出するために使用するプライマー及び融解プローブを含むことができる。サンプル中の標的核酸中のSNPを検出するための代表的なプライマー及び融解プローブは、標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。また、キットは、DNAの固定、ハイブリダイゼーション、及び検出に必要な、適切に包装された試薬及び材料を含むこともでき、例えば、固体支持体、緩衝剤、酵素、及びDNAスタンダードが含まれる。プライマー及び融解プローブの設計方法は本明細書に開示され、標的核酸分子を増幅し、ハイブリダイズするプライマー及び融解プローブの代表的な例が提供される。
従来のプローブ融解方法
図5及び表1を参照し、プラスミドDNA(配列番号:2〜9)を、非対称PCRを用いて増幅し、直後に閉鎖したチューブシステムで融解解析を行った。非対称PCRは、大量のフォワードプライマー、わずかなリバースプライマー、及び過剰のプローブを含んでいた。この従来のプローブ融解方法におけるプライマー及びプローブ設計は、重ならないように設計された。プローブ(配列番号:1)は、5’末端をフルオロフォア(F)で標識し、3’末端を、非結合プローブの蛍光を消光してプローブ伸長からの増幅を防止するように機能するブラックホールクエンチャー(Q)で標識した。
オーバーラッピングプライマー及び野生型プローブを用いたプローブ融解方法
図6及び表IIを参照して、プラスミドDNA(配列番号:12〜19)は、非対称PCRを用いて増幅し、直後に閉鎖チューブシステム中で、融解分析を実施した。非対称PCRは、大量のフォワードプライマー、わずかなリバースプライマー、及び過剰のプローブを含んだ。プローブ(配列番号:11)は、リバースプライマー(配列番号:10)に重なるように設計され、プローブ−プライマー相互作用を避けるためにリバースプライマーと同じセンス側で設計された。プローブは、5’末端をフルオロフォアで標識し、3’末端を非結合プローブの蛍光を消光してプローブ伸長の増幅を防止するように機能するブラックホールクエンチャーで標識した。
オーバーラッピングプライマー及びSNP特異的プローブを用いたプローブ融解方法
図7及び表IIIを参照して、プラスミドDNA(配列番号:12〜19)は、非対称PCRを用いて増幅し、直後に閉鎖したチューブシステムで融解解析を行った。非対称PCRは、大量のフォワードプライマー、わずかなリバースプライマー、及び過剰のプローブを含んだ。プローブ(配列番号:20)は、リバースプライマー(配列番号:10)に重なるように設計され、プローブ−プライマー相互作用を避けるためにリバースプライマーと同じセンス側で設計された。プローブは、5’末端をフルオロフォアで標識し、3’末端を非結合プローブの蛍光を消光してプローブ伸長の増幅を防止するように機能するブラックホールクエンチャーで標識した。
Claims (13)
- サンプル中の標的核酸内の一塩基多型(SNP)を検出する方法であって、該方法が:
サンプルと、任意の標的核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を生成する第1の野生型核酸配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、を接触させることを含む増幅工程の実施;
増幅産物と、オリゴヌクレオチド融解プローブと、を接触させることを含むハイブリダイズ工程の実施であって、該オリゴヌクレオチド融解プローブが、事前定義された融解温度を有する第2の野生型核酸配列を含み、ここで、該オリゴヌクレオチド融解プローブの該第2の野生型核酸配列が、該第1の野生型核酸配列の長さに対して少なくとも80%の最小オーバーラップで該オリゴヌクレオチドプライマーの該第1の野生型核酸配列とオーバーラップし、ここで該オリゴヌクレオチド融解プローブの該第2の野生型核酸配列は、該オーバーラップ上の該オリゴヌクレオチドプライマーの該第1の野生型核酸配列と同じ配列を有し、そしてここで該オリゴヌクレオチド融解プローブの該第2の野生型核酸配列は、該SNPが位置する場所の上の1ヌクレオチドが一端において、該オリゴヌクレオチドプライマーの該第1の野生型核酸配列の上で突出している;及び、
増幅産物においてSNPが存在する又は存在しないかの検出であって、ここで、オリゴヌクレオチド融解プローブの事前定義された融解温度の低下シフトが、サンプル中のSNPの存在の指標であって、ここで、オリゴヌクレオチド融解プローブの前記事前定義された融解温度の低下シフトの非存在が、サンプル中にSNPが存在しない指標である、
を含み、
ここで、該標的核酸は、該プライマーが該標的核酸にハイブリダイズする場所に位置する1以上のサイレント変異を有する非保存領域を含む、方法。 - オリゴヌクレオチド融解プローブは、5’末端が蛍光成分、及び、3’末端が非結合のオリゴヌクレオチド融解プローブの蛍光を消光するための対応するアクセプター成分で標識されている、請求項1に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド融解プローブの第2の野生型核酸配列が、SNPヌクレオチド変異に応じた複数の事前定義された融解温度を含むものであって、SNPヌクレオチド変異を区別する、請求項1又は2に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列及び/又はオリゴヌクレオチド融解プローブの核酸配列が、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列及び/又はオリゴヌクレオチド融解プローブの核酸配列が、40以下のヌクレオチドを有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸内の一塩基多型(SNP)を検出する方法であって、該方法が:
サンプルと、任意の標的核酸がサンプル中に存在する場合に増幅産物を生成する野生型核酸配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、を接触させることを含む増幅工程の実施;
増幅産物と、事前定義された融解温度を有するSNP特異的核酸配列を含むオリゴヌクレオチド融解プローブと、を接触させることを含むハイブリダイズ工程の実施であって、ここで、該オリゴヌクレオチド融解プローブの該SNP特異的核酸配列が、該野生型核酸配列の長さに対して少なくとも80%の最小オーバーラップで該オリゴヌクレオチドプライマーの該野生型核酸配列とオーバーラップし、ここで該オリゴヌクレオチド融解プローブの該SNP特異的核酸は、該オーバーラップ上の該オリゴヌクレオチドプライマーの該野生型核酸配列と同じ配列を有し、そしてここで該オリゴヌクレオチド融解プローブの該SNP特異的核酸は、該SNPが位置する場所の上の1ヌクレオチドが一端において、該オリゴヌクレオチドプライマーの該野生型核酸配列の上で突出している;及び、
増幅産物においてSNPが存在する又は存在しないことの検出であって、ここで、オリゴヌクレオチド融解プローブの事前定義された融解温度の低下シフトが、サンプル中にSNPが存在しないことの指標であって、ここで、オリゴヌクレオチド融解プローブの事前定義された融解温度の低下シフトの非存在が、サンプル中にSNPが存在することの指標である、
を含み、
ここで、該標的核酸は、該プライマーが該標的核酸にハイブリダイズする場所に位置する1以上のサイレント変異を有する非保存領域を含む、方法。 - オリゴヌクレオチド融解プローブは、5’末端が蛍光成分、及び、3’末端が非結合のオリゴヌクレオチド融解プローブの蛍光を消光するための対応するアクセプター成分で標識されている、請求項6に記載の方法。
- オリゴヌクレオチド融解プローブのSNP特異的核酸配列が、SNPヌクレオチド変異に応じた複数の事前定義された融解温度を含むものであって、SNPヌクレオチド変異を区別する、請求項6又は7に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸における一塩基多型(SNP)を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブセットを含むキットであって、以下:
任意の標的核酸がサンプル中に存在する場合に増幅産物を生成する第1の野生型核酸配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー;
及び、
事前定義された融解温度を有する第2の野生型核酸配列を含むオリゴヌクレオチド融解プローブであって、ここで、該オリゴヌクレオチド融解プローブの該第2の野生型核酸配列が、該第1の野生型核酸配列の長さに対して少なくとも80%の最小オーバーラップで該オリゴヌクレオチドプライマーの第1の野生型核酸配列とオーバーラップし、ここで該オリゴヌクレオチド融解プローブの該第2の野生型核酸配列は、該オーバーラップ上の該オリゴヌクレオチドプライマーの該第1の野生型核酸配列と同じ配列を有し、そしてここで、該オリゴヌクレオチド融解プローブの該第2の野生型核酸配列は、該SNPが位置する場所の上の1ヌクレオチドが一端において、該オリゴヌクレオチドプライマーの該第1の野生型核酸配列の上で突出している、オリゴヌクレオチド融解プローブ;
を含み、
ここで、オリゴヌクレオチド融解プローブの事前定義された融解温度の低下シフトが、サンプル中にSNPが存在する指標であり、オリゴヌクレオチド融解プローブの前記事前定義された融解温度の低下シフトの非存在が、サンプル中にSNPが存在しない指標であることによって、増幅産物におけるSNPの存在又は非存在を検出するものであり、
ここで、該標的核酸は、該プライマーが該標的核酸にハイブリダイズする場所に位置する1以上のサイレント変異を有する非保存領域を含む、キット。 - サンプル中の標的核酸における一塩基多型(SNP)を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブセットを含むキットであって、以下:
任意の標的核酸がサンプル中に存在する場合に増幅産物を生成する野生型核酸配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー;及び、
事前定義された融解温度を有するSNP特異的核酸配列を含むオリゴヌクレオチド融解プローブであって、ここで、該オリゴヌクレオチド融解プローブの該SNP特異的核酸配列が、該野生型核酸配列の長さに対して少なくとも80%の最小オーバーラップで該オリゴヌクレオチドプライマーの該野生型核酸配列とオーバーラップし、ここで該オリゴヌクレオチド融解プローブの該SNP特異的核酸は、該オーバーラップ上の該オリゴヌクレオチドプライマーの該野生型核酸配列と同じ配列を有し、そしてここで該オリゴヌクレオチド融解プローブの該SNP特異的核酸は、該SNPが位置する場所の上の1ヌクレオチドが一端において、該オリゴヌクレオチドプライマーの該野生型核酸配列の上で突出している、オリゴヌクレオチド融解プローブ;
を含み、
ここで、オリゴヌクレオチド融解プローブの事前定義された融解温度の低下シフトが、サンプル中にSNPが存在する指標であり、オリゴヌクレオチド融解プローブの前記事前定義された融解温度の低下シフトの非存在が、サンプル中にSNPが存在しない指標であることによって、増幅産物におけるSNPの存在又は非存在を検出するものであり、
ここで、該標的核酸は、該プライマーが該標的核酸にハイブリダイズする場所に位置する1以上のサイレント変異を有する非保存領域を含む、キット。 - オリゴヌクレオチド融解プローブが、蛍光成分、及び、非結合のオリゴヌクレオチド融解プローブの蛍光を消光するための対応するアクセプター成分で標識されている、請求項9又は10に記載のキット。
- オリゴヌクレオチド融解プローブは、5’末端が蛍光成分、及び、3’末端が非結合のオリゴヌクレオチド融解プローブの蛍光を消光するための対応するアクセプター成分で標識されている、請求項11に記載のキット。
- オリゴヌクレオチド融解プローブの核酸配列が、SNPヌクレオチド変異に応じた複数の事前定義された融解温度を含むものであって、SNPヌクレオチド変異を区別する、請求項9〜12のいずれか1項に記載のキット。
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