CN105705660A - 使用重叠引物和熔解探针检测单核苷酸多态性 - Google Patents
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Abstract
本申请描述了在生物或非生物样品中的靶核酸中检测存在或不存在单核苷酸多态性(SNP)的方法。该方法可包括使用引物进行扩增的步骤,利用熔解探针杂交的步骤,和检测步骤,其中熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示SNP存在于样品中,而其中不存在熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示样品中不存在SNP。
Description
发明领域
本发明涉及基于聚合酶链反应(PCR)的诊断学领域,且更特别地,涉及扩增和检测具有单核苷酸多态性(SNP)的靶核酸的序列变异的方法。
发明背景
通过使用荧光标记的熔解探针的PCR检测SNPs先前已有描述(见例如,Huang等人, 2011, PLoS ONE 6(4) e19206和Luo等人, 2011, J. Clin.
Microbiol., 49(9)3132-3138)。传统的熔解通过在不存在SNP和存在SNP的情况下,分析具有靶的荧光标记探针的后-PCR熔解温度而进行。精心设计的熔解探针产生熔解温度(Tm),其在不存在SNP的情况下最高,且探针结合区域中发生的任何碱基对改变引起熔解温度的偏移(降低)。熔解温度的偏移可被用来区分野生型(WT)和突变(MT)靶。
不幸的是,一些目的SNPs位于非-保守的基因区域,在那里附近的序列异质性导致探针熔解温度的不想要的偏移。这使得难以将具有沉默突变的WT序列与相关的目的SNPs区分开。与微生物药物抗性有关的SNPs是这样的一些实例,其中赋予药物抗性的特异性SNPs位于含有附近的WT沉默突变的基因区域。在这样的情况下,在目的SNP附近的探针结合区域中的任何沉默突变也可产生探针熔解温度的偏移并产生假阳性结果。因此,需要更精确和有效的方式以在靶核酸中仅检测目的SNP。本发明的实施方案可解决现存序列异质性问题并使得精心设计的熔解探针能够仅检测目的SNP,而不干扰附近的沉默突变。
发明概述
本发明的实施方案涉及用于在生物学或非-生物学样品中快速检测靶核酸中存在或不存在SNP的方法和试剂盒,例如,通过在单个检验管中的实时聚合酶链反应检测一个或多个SNPs。
在一个实施方案中,提供在样品中检测靶核酸中的SNP的方法。用于检测SNP的方法包括以下步骤:进行扩增步骤,其包括使样品与具有第一野生型核酸序列的寡核苷酸引物接触,其当任何靶核酸存在于样品中时产生扩增产物;进行杂交步骤,其包括使扩增产物与具有预定熔解温度的第二野生型核酸序列的寡核苷酸熔解探针接触,其中寡核苷酸熔解探针的第二野生型核酸序列与寡核苷酸引物的第一野生型核酸序列重叠并在所述SNP所位于的靶核酸区域上,在一端延伸出来一个或多个核苷酸;和检测扩增产物中存在或不存在SNP,其中所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示SNP存在于样品中,而其中不存在所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示样品中不存在SNP。
在另一个实施方案中,提供用于在样品中检测靶核酸中的SNP的备选方法。检测SNP的备选方法包括以下步骤:进行扩增步骤,其包括使样品与具有野生型核酸序列的寡核苷酸引物接触,当任何靶核酸存在于样品中时产生扩增产物;进行杂交步骤,其包括使扩增产物与具有预定熔解温度的SNP特异性核酸序列的寡核苷酸熔解探针接触,其中寡核苷酸熔解探针的SNP特异性核酸序列与寡核苷酸引物的野生型核酸序列重叠,并在所述SNP所位于的靶核酸区域上,在一端延伸出来一个或多个核苷酸;和检测扩增产物中存在或不存在所述SNP,其中所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示样品中不存在SNP,而其中不存在所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示样品中存在SNP。
在又一个实施方案中,提供用于在样品中检测靶核酸中的SNP的寡核苷酸引物和探针集。引物和探针集可包括在可提供检测SNP的试剂盒中。试剂盒可包括具有第一野生型核酸序列的寡核苷酸引物,其当任何靶核酸存在于样品中时产生扩增产物;和具有预定熔解温度的第二野生型核酸序列的寡核苷酸熔解探针,其中寡核苷酸熔解探针的第二野生型核酸序列与寡核苷酸引物的第一野生型核酸序列重叠,并在所述SNP所位于的靶核酸区域上,在一端延伸出来一个或多个核苷酸;其中凭借所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示SNP存在于样品中和凭借不存在所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示样品中不存在SNP,检测扩增产物中存在或不存在所述SNP。在另一个实施方案中,提供用于在样品中检测靶核酸中的SNP的备选的寡核苷酸引物和探针集。备选的寡核苷酸引物和探针集可包括在可提供检测SNP的试剂盒中。试剂盒可包括具有野生型核酸序列的寡核苷酸引物,其当任何靶核酸存在于样品中时产生扩增产物;和具有预定熔解温度的SNP特异性核酸序列的寡核苷酸熔解探针,其中寡核苷酸熔解探针的SNP特异性核酸序列与寡核苷酸引物的第一野生型核酸序列重叠并在所述SNP所位于的靶核酸区域上,在一端延伸出来一个或多个核苷酸;其中凭借所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示样品中不存在SNP和其中不存在所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示SNP存在于样品中,检测扩增产物中存在或不存在所述SNP。试剂盒也可包括三磷酸核苷、核酸聚合酶,和核酸聚合酶的功能所必需的缓冲剂。试剂盒也可包括使用引物、探针,和发荧光部分来检测样品中存在或不存在SNP的包装插页和用法说明书。
在一些实施方案中,方法和试剂盒可包括已用供体和相应的受体(acceptor)荧光部分标记的探针,或可包括用于标记探针的发荧光(fluorophoric)部分。在某些这样的实施方案中,寡核苷酸(引物和/或探针)具有40个或更少的核苷酸(例如,30个或更少的核苷酸,25个或更少的核苷酸,20个或更少的核苷酸等)。在某些实施方案中,寡核苷酸的长度介于8和40个核苷酸之间(如8和30之间,8和25之间,8和20之间)。在某些实施方案中,寡核苷酸的长度介于12和40个核苷酸之间(如12和30之间,12和25之间,12和20之间)。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸,例如,改变核酸杂交稳定性(与未修饰的核苷酸相比)。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个保守修饰的变异。在一些实施方案中,寡核苷酸熔解探针可包括允许二级结构形成的核酸序列。寡核苷酸熔解探针可用在5’末端的荧光部分,和在3’末端的对应的用以猝灭未结合的熔解探针的荧光的受体部分标记。寡核苷酸熔解探针的核酸序列可提供能使荧光猝灭的随机卷曲构象,除非寡核苷酸探针与它的靶杂交。这样的二级结构形成通常导致第一(例如,荧光团)和第二(例如,猝灭剂)荧光部分之间的空间邻近。例如,非-杂交的寡核苷酸熔解探针可被猝灭或仅为微弱荧光的,但寡核苷酸熔解探针在与其靶杂交时可变为更强荧光的。在从它的靶变性后,寡核苷酸熔解探针可以返回到其猝灭或弱荧光状态。因此,熔解探针-靶复合物的荧光强度以靶-依赖性方式随着温度增加而降低,产生不同的源自熔解峰的针对每个靶的熔解温度值。在一些实施方案中,寡核苷酸熔解探针的核酸序列包括多个取决于所述SNP核苷酸变异的预定熔解温度,其区分所述SNP核苷酸变异。在一些实施方案中,靶核酸包含含有一个或多个突变的非保守区域,所述突变位于寡核苷酸引物与靶核酸杂交之处。在一些实施方案中,扩增步骤在第二寡核苷酸引物的存在下进行。
除非另外限定,本文所用的所有技术和科学术语具有如本发明所属邻域的普通技术人员通常理解的相同意义。虽然与本文所描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实践或试验本发明,下文描述了合适的方法和材料。此外,材料、方法,和实施例仅仅是示例性的并不意图为限制性的。在附图和以下的描述中列出了本发明的一个或多个实施方案的细节。本发明的其它特征、目的,和优点将从附图和详细的说明书,以及从权利要求书中变得显而易见。
附图简述
图1显示待在含有SNP的不同WT种群中检测到的示例性SNP的示意图,其中所述SNP位于具有附近的序列异质性的非-保守基因区域。
图2显示检测SNP的示例性引物和探针设计的示意图,其中引物序列将在待检测的SNP之前的一个碱基对“引导”PCR开始,并且重叠熔解探针具有与所述引物相同的序列,并多延伸一个碱基对,所述碱基对覆盖该SNP位置。
图3显示利用用于检测SNP的重叠引物和探针设计的示例性PCR反应的示意图。
图4显示利用用于检测SNP的重叠引物和探针设计的PCR反应产物的示例性熔解曲线分析的示意图。
图5显示传统的熔解曲线分析。
图6显示在其中探针包括野生型序列的实施方案中利用重叠引物和探针设计的熔解曲线分析。
图7显示在其中探针包括SNP特异性序列的实施方案中利用重叠引物和探针设计的熔解曲线分析。
发明详述
通过核酸扩增在样品中检测靶核酸中一个或多个SNPs提供一种快速和精确的检测SNPs的方法。本文描述了用于在样品中检测靶核酸中的SNP的实时测定法,如用于检测SNPs的寡核苷酸引物和探针集。用于检测SNPs的实时PCR与其它方法相比增加的灵敏性,以及实时PCR的改进的特征(包括样品容量和扩增产物的实时检测),使得为临床实验室中的常规诊断和SNP检测实施这一技术为切实可行的。
本发明的实施方案允许,例如,在不同的WT种群中检测一种特定的SNP (图1)。实施方案包括利用重叠寡核苷酸引物和探针设计(也称为堆叠的寡核苷酸引物和探针)检测SNP的方法,其中寡核苷酸引物和寡核苷酸熔解探针的序列彼此重叠,用以检测位于非-保守基因区域并含有附近的沉默突变的目的SNP。可将引物序列(正向或反向)设计为会在待检测的SNP之前一个或多个碱基对‘引导’PCR开始,并且可将重叠熔解探针设计为具有与所述引物相同的序列,但与所述引物相比多延伸一个或多个碱基,以延伸越过和覆盖靶核酸的SNP位置(图2)。可将引物设计为,在不考虑靶核酸上的引物区域的序列多样性的情况下,对‘引导’PCR反应而言是足够耐用和稳健的。适宜的引物设计可包括修饰碱基(稳定剂(stabilizer)),其改进引物在存在错配(序列多样性)的情况下的结合能力。这种方式,在不考虑在引物所杂交区域的靶核酸的初始多样性的情况下,PCR扩增产物将全部具有掺入生成的扩增子中的相同引物序列(图3)。可将引物和探针序列设计为使得探针完全与引物重叠,且探针延伸出来至少一个碱基以覆盖在靶或扩增子上的待检测的目的SNP (例如,在一些实施方案中,探针的3’端延伸超过引物的3’端至少一个碱基,而在其它实施方案中,探针的5’端延伸超过引物的5’端至少一个碱基)。这种方式,非目的的和可在靶中目的SNP附近存在的任何其它SNPs将通过引物延伸(扩增子)而沉默且不影响探针的熔解温度。备选地,可将引物和探针序列设计成为使得探针序列并非完全与引物序列重叠,只要被探针所重叠的引物序列部分覆盖非目的的和在待检测的目的SNP附近存在的任何SNP。例如,探针序列和引物序列之间的最少重叠可以是至少70%-至少90%,在某些实施方案中为至少80%或至少85%或至少90%。用重叠寡核苷酸引物和探针的PCR产物的熔解分析允许检测扩增产物中存在或不存在所述SNP,其中所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示SNP存在于样品中(图4)。
所述方法可包括进行至少一个循环步骤,其包括使用一个或多个引物或一对或多对引物在样品中扩增靶核酸分子(例如,含有待检测的目的SNP的基因靶)的一个或多个部分。如本文所用的术语“引物”、“多个引物”,和“引物对”指与靶核酸序列的区域特异性退火,且在适当条件下由此启动合成的寡核苷酸引物。可将每种所讨论的引物设计为与靶核酸退火并与靶核酸分子中待检测的目的SNP邻近,使得每个扩增产物的至少一部分含有对应于各自靶和SNP的核酸序列(如果存在的话)。可将引物设计为退火至目的SNP的邻近,例如,邻接、附近、稍微上游,或稍微下游,例如,相距1、2、3,或更多个核苷酸。因此,使样品与具有第一野生型核酸序列的引物接触可在任何靶核酸存在于样品时产生扩增产物,无论是否目的SNP存在于靶核酸分子中。本文中,在术语“野生型核酸序列”中的“野生型”关于待分析的靶核酸的序列而确定。
所述方法也可包括杂交步骤,其包括使扩增产物与具有第二野生型核酸序列的熔解探针接触,其中熔解探针的第二野生型核酸序列的序列与引物的第一野生型核酸序列重叠(即与之相同),并在所述SNP所位于的靶核酸区域上,在一端延伸出来一个或多个核苷酸。在一些实施方案中,探针的核酸序列在SNP所位于的靶核酸区域上,在其3’端延伸出一个或多个核苷酸。在其它实施方案中,探针的核酸序列在SNP所位于的靶核酸的区域上,在其5’端延伸出来一个或多个核苷酸。根据测定法所选择的设计,熔解探针可包含一个或多个预定熔解温度分布型,其包括例如熔解探针从完全匹配的野生型核酸靶上熔解,或不杂交的第一预定温度。因此,熔解探针的预定熔解温度的降低偏移的观察结果可指示野生型熔解探针和核酸靶的序列错配,即样品靶核酸中存在SNP。这是由于野生型熔解探针的序列错配和靶中SNP的存在导致熔解探针的较低熔解温度(当与完全匹配的熔解探针和无SNP的野生型靶序列比较时)。熔解探针的熔解温度分布型也可包括,例如,第二预定熔解温度,在该温度下具有野生型序列的熔解探针从核酸靶中的已知SNP上熔解,使得当观察到第二预定熔解温度时,不仅确定SNP的存在,而且还可从核酸靶的SNPs的各种可能性中区分出SNP的特性(identity)。在这种方式中,对于特定的靶,可以预定或标准化取决于多种可能的SNP核苷酸变异特性的多个预定熔解温度,其区分SNP核苷酸变异(见例如,图6)。熔解温度可通过针对在探针区域下的单一位置的每个特定碱基对变化(dA、dT、dC,或dG)的实验来确立。
备选地,熔解探针可包含用于待检测的已知SNP的SNP特异性序列。在这种情况下,一个预定的熔解温度分布型可包括第一预定温度,在此温度下,SNP特异性熔解探针从完全匹配的含有SNP的核酸靶上熔解,因此预定熔解温度的观察结果可指示在靶核酸序列中存在特定SNP,因为与含有SNP的靶核酸序列完全匹配的SNP特异性熔解探针不会导致熔解温度的降低偏移。此外,在这种情况下,SNP特异性熔解探针的预定熔解温度的降低偏移可指示在SNP特异性熔解探针和核酸靶的序列错配,例如,在样品中不存在SNP和存在野生型核酸,或存在不同的SNP。如果靶核酸分子已知具有多个具有检测意义(of interest for detection)的SNPs,可如上面所解释,设计多个熔解探针,所述各探针具有用于检测和表征多个目的SNPs的野生型序列或SNP特异性序列。
扩增产物的存在表示样品中存在靶核酸。存在或不存在熔解探针的预定熔解温度的降低偏移表示样品的靶核酸靶中存在或不存在SNP。根据靶核酸是否含有待检测的目的SNP,本发明方法产生的扩增产物将含有与可检测的熔解探针互补的靶核酸序列,所述探针可被设计为含有野生型序列或者SNP特异性序列,这取决于如上所述的测定法设计。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤,和检测步骤,其中样品与一个或多个可检测的熔解探针接触,用于在样品中检测靶核酸序列中存在或不存在目的SNP。
SNP检测方法的实施方案能够在单一PCR管中检测和区分野生型靶核酸和含有SNP的靶核酸。本文描述的方法可被设计为在单一PCR反应中同时检测野生型和含有SNP的靶核酸序列二者,并区分它们。
如本文所用的,术语“扩增”指合成与模板核酸分子(例如,人免疫缺陷病毒(HIV)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB),或丙型肝炎病毒(HCV)的靶核酸分子)的单链或双链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性,在低于引物的熔解温度的温度使引物与模板核酸退火,并从引物经酶促延伸以生成扩增产物。扩增通常需要三磷酸脱氧核糖核苷、DNA聚合酶(例如,Platinum® Taq)和适宜的缓冲剂和/或用于聚合酶的最适活性的辅因子(例如,MgCl2和/或KCl)的存在。
术语“引物”在本文中如本领域技术人员已知那样使用并指寡聚化合物,主要指寡核苷酸,但也指能够通过模板-依赖性DNA聚合酶“引导”DNA合成的修饰的寡核苷酸,即例如寡核苷酸的3’-端提供游离的3’-OH基团,在那里其它的"核苷酸"可通过模板-依赖性DNA聚合酶连接,建立3’-5’磷酸二酯键,由此使用三磷酸脱氧核苷并由此释出焦磷酸。一般来说,基于已知的模板序列设计引物。一个引物引导正义链,而另一个引导靶DNA或cDNA的互补链。可对一致的靶DNA或RNA (即,具有相同序列的靶)或对混合的靶DNAs或RNAs (即,具有由保守序列侧接的不同插入序列的靶)实施PCR。对于混合的DNAs/RNAs (例如,含有序列异质性),如果靶的序列与错配的引物(即,耐受性引物)具有足够的互补性,甚至错配的引物也可在PCR反应中起作用。
术语“杂交”指一个或多个探针与扩增产物的退火。杂交条件通常包括低于探针的熔解温度,但避免探针的非-特异性杂交的温度。
术语“热稳定性聚合酶”指热稳定的聚合酶,即,酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成,且当经受升高的温度达实现双链模板核酸的变性所必要的时间时,不会造成不可逆的变性。一般来说,合成在每个引物的3’端起始并沿着模板链以5’-3’方向进行。热稳定的聚合酶分离自黄栖热菌(Thermus fiavus)、红栖热菌(T. ruber)、嗜热栖热菌(T.
thermophilus)、水生栖热菌(T. aquaticus)、乳栖热菌(T. lacteus)、红色栖热菌(T.
rubens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus),和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)。但是,非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定法中,只要补充酶。
术语“其互补部分(complement)”指既与给定核酸长度相同,又与给定核酸精确互补的核酸。
当就核酸而言使用术语“延长”或“延伸”时,指当另外的核苷酸(或其它类似分子)被掺入到核酸中时。例如,核酸任选地通过掺入核苷酸的生物催化剂,例如通常在核酸的3’末端加上核苷酸的聚合酶来延伸。
在两个或更多个核酸序列的情况下,术语“相同的”或百分比“同一性”指当比较和比对最大对应关系时,例如,如使用技术人员可获得的序列比较算法或通过通过目检所测量的,相同的或具有特定百分比的相同核苷酸的,两个或更多个序列或子序列。适合于测定百分比序列同一性和序列类似性的示例性算法是BLAST程序,其描述于,例如,Altschul等人
(1990) “基本局部比对搜索工具(Basic local alignment search tool)” J. Mol. Biol.
215:403-410, Gish等人 (1993) “通过数据库类似性搜索的蛋白编码区域的鉴定(Identification of protein coding
regions by database similarity search)” Nature Genet. 3:266-272, Madden等人 (1996) “网络BLAST服务器的应用(Applications of network BLAST server)” Meth. Enzymol.
266:131-141, Altschul等人(1997) “缺口BLAST和PSI-BLAST:新一代蛋白数据库搜索程序(Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of
protein database search programs)”Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402,和Zhang等人 (1997) “PowerBLAST:一种用于交互式或自动序列分析和注释的新的网络BLAST应用(PowerBLAST:
A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis
and annotation)” Genome Res. 7:649-656。
在寡核苷酸的情况下,“修饰的核苷酸”指其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被为该寡核苷酸提供所需特性的不同核苷酸替代的改变。本文所述的寡核苷酸中可被取代的示例性修饰的核苷酸包括:例如,C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基(propynyl)-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮(deaza)-2-脱氧黄苷、吡唑并嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-0-甲基核糖(methyl
Ribo)-U、2'-0-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。本发明的寡核苷酸中可被取代的许多其它修饰的核苷酸在本文被提及或以别的方式为本领域已知。在某些实施方案中,修饰的核苷酸取代修饰寡核苷酸的熔解温度(Tm)(与对应的未修饰寡核苷酸的熔解温度相比)。为进一步说明,在本发明的一些实施方案中,某些修饰的核苷酸取代可减少非-特异性核酸扩增(例如,最大限度地减少引物二聚体形成等),增加预期的靶扩增子的收率和/或等。这些类型的核酸修饰的实例描述于,例如美国专利号6,001,611中。
靶核酸和寡核苷酸
本说明书提供通过扩增例如靶核酸序列的一部分,检测靶核酸中的SNP的方法,所述靶核酸序列可以是已知的或疑似包含一个或多个SNPs的任何靶核酸序列,例如来自例如HIV、HCV,或耐利福平的MTB的靶核酸序列。
为检测靶核酸序列中的SNP,可制备扩增靶核酸序列的引物和探针。同样,可由本领域技术人员使用常规方法评价功能性变体的特异性和/或灵敏性。代表性的功能性变体可包括,例如,在本文公开的引物和/或探针中的一个或多个缺失、插入,和/或取代。例如,可提供引物或探针的基本相同的变体,其中所述变体具有与一个原始引物和探针,或其互补部分的至少,例如80%、90%,或95%的序列同一性。可鉴定任何引物和/或探针的功能活性变体,其在本文所述的方法或试剂盒中提供与各自原始序列相比类似或更高的特异性和灵敏性。
如上文所详述,引物(和/或探针)可经化学修饰,即引物和/或探针可包含修饰的核苷酸或非-核苷酸化合物。那么探针(或引物)为修饰的寡核苷酸。“修饰的核苷酸” (或“核苷酸类似物”)经一些修饰而不同于天然“核苷酸”,但仍由碱基或碱基样化合物、呋喃戊糖或呋喃戊糖-样化合物、磷酸部分或磷酸-样部分,或其组合组成。例如,“标记”可与“核苷酸”的碱基部分连接,由此获得“修饰的核苷酸”。在“核苷酸”中的天然碱基也可由例如,7-脱氮嘌呤(deazapurine)替代,同样由此获得“修饰的核苷酸”。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请可互换使用。“修饰的核苷”(或“核苷类似物”)通过以上对“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式的一些修饰而不同于天然核苷。
寡核苷酸(包括扩增靶核酸序列的修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物)可使用,例如,计算机程序例如OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade,
Colo.)设计。当设计要用作扩增引物的寡核苷酸时,重要的特征包括,但不限于,促进检测(例如,通过电泳)的适宜大小的扩增产物,用于一对引物成员的类似的熔解温度,和每个引物的长度(即,需要引物的长度足以序列-特异性退火和启动合成,但不可长到导致在寡核苷酸合成期间使得保真性降低)。通常,寡核苷酸引物的长度为8-50个核苷酸(例如,长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48,或50个核苷酸)。在一些实施方案中,引物具有40个或更少的核苷酸和/或长度在8和40个核苷酸之间。在其它实施方案中,引物具有30个或更少的核苷酸和/或长度在8和30个核苷酸之间。在其它实施方案中,引物具有25个或更少的核苷酸和/或长度在8和25个核苷酸之间。在某些实施方案中,寡核苷酸引物的长度在12和40个核苷酸之间(如12和30之间,12和25之间)。
除了一组引物外,本发明方法可使用一个或多个探针,以检测在靶核酸序列中存在或不存在SNP。术语“探针”指经合成方法或生物方法产生的核酸(DNA或RNA),其通过设计或选择,含有允许它们在规定的预定严格性(stringencies)下,特异性地(即,优先地)与“靶核酸”杂交的特定核苷酸序列。“探针”可称为“检测探针”,意指它检测靶核酸。在本发明的一些实施方案,所述探针可用至少一个荧光标记物标记。在一个实施方案中,探针可用供体荧光部分,例如荧光染料,和对应的受体荧光部分,例如猝灭剂标记。
设计要用作杂交探针的寡核苷酸可以类似于设计引物的方式进行。本发明的实施方案可使用单一探针或探针对用于检测扩增产物。取决于实施方案,探针使用可包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。像引物一样,探针通常具有类似的熔解温度,且每个探针的长度对于序列-特异性杂交发生必须是足够的,但不可长到导致在合成期间使得保真性降低。通常, 寡核苷酸探针的长度为8-50个核苷酸(例如,长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48,或50个核苷酸)。在一些实施方案中,探针具有40个或更少的核苷酸和/或长度在8和40个核苷酸之间。在其它实施方案中,探针具有30个或更少的核苷酸和/或长度在8和30个核苷酸之间。在其它实施方案中,探针具有25个或更少的核苷酸和/或长度在8和25个核苷酸之间。在某些实施方案中,寡核苷酸探针在12和40个之间。在其它实施方案中,探针具有30个或更少的核苷酸和/或长度在12和30个核苷酸之间。在其它实施方案中,探针具有25个或更少的核苷酸和/或长度在12和25个核苷酸之间。在一些实施方案中,寡核苷酸探针的长度在15和40个之间(如在15和30之间,15和25之间)的核苷酸(例如,16、18、20、21、22、23、24,或25个核苷酸)。
构建体可包括各含有一个引物或探针核酸分子的载体。构建体可被例如用作对照模板核酸分子(control template
nucleic acid molecules)。适用于本发明的载体经市售获得和/或通过本领域的常规重组核酸技术方法产生。适用于所述方法的构建体通常,除了引物和探针核酸分子之外,还包括编码用于选择所需构建体和/或转化子的可选择的标记物(例如,抗生素抗性基因),和复制起点的序列。载体系统的选择通常取决于几个因素,包括但不限于,宿主细胞的选择、复制效率、选择性、可诱导性,和回收的容易性。
含有引物和探针核酸分子的构建体可在宿主细胞中增殖。如本文所用的,术语宿主细胞意欲包括原核生物和真核生物,例如酵母、植物和动物细胞。原核生物宿主可包括大肠杆菌(E.
coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。真核生物宿主包括酵母例如酿酒酵母(S.
cerevisiae)、稷酒裂殖酵母(S. pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris),哺乳动物细胞例如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、昆虫细胞,和植物细胞例如拟南芥(Arabidopsis
thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)。构建体可使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术引入宿主细胞。例如,磷酸钙沉淀、电传孔,热休克、脂质转染法、微注射,和病毒介导的核酸转移是将核酸引入宿主细胞的普通方法。此外,裸DNA可直接递送至细胞(见例如,美国专利号5,580,859和5,589,466)。
聚合酶链反应
(PCR)
美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159,和4,965,188公开常规PCR技术。PCR通常使用与选择的核酸模板(例如,DNA或RNA)结合的两个寡核苷酸引物。可用于所公开的实施方案的引物包括能够用作在靶核酸序列中起始核酸合成的点的寡核苷酸。引物可通过常规方法从限制消化中纯化,或它可经合成方法产生。为了最大的扩增效率,引物优选地为单链的,但引物可以是双链的。双链引物首先被变性,即经处理使链分开。使双链核酸变性的一个方法是通过加热。
如果模板核酸是双链的,在可将其用作PCR的模板前有必要将两个链分开。链分开可通过任何合适的变性方法完成,所述方法包括物理、化学或酶方法。分离核酸链的一个方法涉及加热核酸,直至它大部分变性(例如,大于50%、60%、70%、80%、90%或95%变性)。使模板核酸变性所必需的加热条件将,例如取决于缓冲盐浓度和要变性的核酸的长度和核苷酸组成,但通在约90℃-约105℃的范围内维持一段时间,这取决于反应的特征例如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒-4分钟(例如,1分钟-2分钟30秒,或1.5分钟)。
如果双链模板核酸经加热变性,则允许反应混合物冷却至促进每个引物与所述靶核酸分子(例如,其含有SNP)上的它的靶序列退火的温度。复性的温度通常是从约35℃至约65℃ (例如,约40℃至约60℃;约45℃至约50℃)。复性时间可以是从约10秒至约1分钟(例如,约20秒至约50秒;约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调节至提高聚合酶的活性或使其活性最优化的温度,即足以从退火引物发生延伸,以生成与模板核酸互补的产物的温度。所述温度应足以从每个与核酸模板退火的引物合成延伸产物,但不应高到使得延伸产物从其互补模板上变性(例如,用于延伸的温度通常介于约40℃至约80℃的范围内(例如,约50℃至约70℃;约60℃)。延伸时间可从约10秒至约5分钟(例如,约30秒至约4分钟;约1分钟至约3分钟;约1分钟30秒至约2分钟)。
PCR测定法可采用引物和探针核酸例如RNA或DNA (cDNA)。模板核酸不必纯化;它可以是复杂混合物的次级级分,例如包含在人细胞中的含有SNP的核酸。含有SNP的核酸分子可通过常规技术例如描述于诊断学分子微生物学:原理和应用(Diagnostic
Molecular Microbiology: Principles and Applications) (Persing等人(eds), 1993, 美国微生物学协会(American
Society for Microbiology),华盛顿特区)中的那些技术,从生物学样品中提取。核酸可从任何数目的来源(如质粒),或天然来源(包括细菌、酵母、病毒、细胞器,或更高级的生物体例如植物或动物)获得。
寡核苷酸引物在诱导引物延伸的反应条件下,与PCR试剂组合。例如,链延伸反应通常包括50 mM
KCl、10 mM Tris-HCl (pH 8.3)、15 mM MgCl2、0.001%
(w/v)明胶、0.5-1.0 µg变性模板DNA、50皮摩尔的各寡核苷酸引物、2.5 U的Taq聚合酶,和10% DMSO)。反应通常含有每一种为150-320 µM的dATP、dCTP、dTTP、dGTP,或其一种或多种类似物。
新合成的链形成可用于该反应的后续步骤的双链分子。链分开、退火,和延伸的步骤可根据需要而多次重复进行,以产生所需量的与靶核酸分子对应的扩增产物。该反应的限制因素是存在于反应中的引物、热稳定性酶,和三磷酸核苷的量。循环步骤(即,变性、退火,和延伸)优选重复至少一次。为用于检测,循环步骤的数目将,例如,取决于样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物,将需要更多的循环步骤以扩增足以检测的靶序列。通常地,循环步骤重复至少约20次,但可重复多达40、60,或甚至100次。
荧光共振能量转移
(FRET)
FRET技术(见,例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489,和6,162,603)是基于这样的概念:当供体荧光部分和对应的受体荧光部分被定位在彼此的一定距离内时,在两个荧光部分之间发生能量转移,其可以被可视化或以其它方式检测到和/或量化。当通过合适的波长的光辐射激发供体时,供体通常将能量转移至受体。受体通常以不同波长的光辐射形式重新发射转移的能量。
在一个实施例中,寡核苷酸熔解探针可含有供体荧光部分和对应的猝灭剂,其以并非光的形式驱散转移的能量。当熔解探针是完整的且不与其靶杂交时,在两个荧光部分之间通常发生能量转移,使得来自供体荧光部分的荧光发射被猝灭。当熔解探针与其靶核酸序列杂交时,荧光部分和对应的猝灭剂变得在空间上(speciallly)分开,而熔解探针变得荧光更强。通常使用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。通常使用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。通常使用的黑暗猝灭剂包括黑洞猝灭剂(BlackHole Quenchers™) (BHQ) (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.)、Iowa Black™
(Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa)、BlackBerry™猝灭剂650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.)。
荧光分析可使用,例如,光子计数落射荧光(epifuoroscent)显微镜系统(其含有用于在特定范围监测荧光发射的适宜的二向色镜(dichroic
mirror)和滤光器),光子计数光电倍增器系统,或荧光计进行。启动能量转移的激发可用氩离子激光、高强度水银(Hg)弧光灯、纤维光学光源,或用于在所需的范围内激发的适当过滤的其它高强度光源进行。
如本文所用的关于供体和对应的受体荧光部分,"对应的"指具有重叠供体荧光部分的激发光谱的发射光谱的受体荧光部分。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应该比供体荧光部分的发射光谱的最大波长大至少100
nm。因此,有效的非-放射性能量转移可在其间产生。
通常选择荧光供体和对应的受体部分用于:(a)高效率Forster能量转移;(b)大的最终Stokes偏移(>100 nm);(c)尽可能进入红色可见光谱部分(>600 nm)的发射偏移;和(d)向比由在供体激发波长激发所产生的拉曼水荧光发射更高的波长的发射偏移。例如,可选择具有其在激光谱线附近的激发最大值(例如,氦-镉442 nm或氩488 nm)、高消光系数、高量子产率,及其荧光发射与对应的受体荧光部分的激发光谱良好重叠的供体荧光部分。可选择具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射良好重叠,和在红色可见光谱部分(>600
nm)发射的对应的受体荧光部分。
可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄(Lucifer
Yellow)、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸盐、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4’-异硫代-氰酰芪-2,2’-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4’-异硫代氰酰苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯,和4-乙酰氨基-4’-异硫代氰酰芪-2,2’-二磺酸衍生物。代表性的受体荧光部分,取决于所用的供体荧光部分,包括LC
Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯(Lissamine rhodamine B sulfonyl chloride)、四甲基罗丹明异硫代氰酸盐、罗丹明x异硫代氰酸盐、赤藓红异硫氰酸酯(erythrosine
isothiocyanate)、荧光素、二乙撑三胺五乙酸酯,或镧系离子(例如,铕,或铽)的其它螯合物。可获得供体和受体荧光部分,例如从Molecular
Probes (Junction City, Oreg.)或Sigma Chemical
Co. (St. Louis, Mo.)。
供体和受体荧光部分可通过连接臂与适宜的探针寡核苷酸连接。每个连接臂的长度是重要的,因为连接臂将影响供体和受体荧光部分之间的距离。用于本发明目的的连接臂的长度是以埃(Å)计的从核苷酸碱基至荧光部分的距离。一般来说,连接臂是从约10 Å至约25 Å。连接臂可具有在WO 84/03285中描述的种类。WO
84/03285也公开了用于将连接臂与特定的核苷酸碱基连接,并且也用于将荧光部分与连接臂连接的方法。
受体荧光部分例如LC Red 640-NHS-酯可与C6-亚磷酰胺(Phosphoramidites) (可从ABI
(Foster City, Calif.)或Glen Research
(Sterling, Va.)获得)组合,以产生例如LC Red 640-亚磷酰胺。将供体荧光部分例如荧光素与寡核苷酸连接的常用的接头(linker)包括硫脲接头(FITC-衍生的,例如,购自Glen Research或ChemGene (Ashland, Mass.)的荧光素-CPG's)、酰胺-接头(荧光素-NHS-酯-衍生的,例如购自BioGenex (San Ramon, Calif.)的荧光素-CPG),或在寡核苷酸合成后荧光素-NHS-酯连接所需要的3’-氨基-CPGs。
在样品中检测靶核酸中的
SNP
本公开内容提供用于在生物学或非-生物学样品中检测靶核酸中存在或不存在SNP的方法。由本发明提供的方法避免了样品污染、假阴性,和假阳性的问题。所述方法包括进行至少一个循环步骤(该步骤包括使用一个或一对引物,从样品扩增靶核酸分子的一部分)、杂交步骤(包括使扩增产物与熔解探针接触),和检测步骤。优选在一个热循环仪中进行多个循环步骤。所公开的方法可使用野生型或SNP特异性探针(根据选择的设计)进行,以在样品中检测靶核酸中存在或不存在SNP。
如本文所述的,扩增产物可使用利用FRET技术的标记熔解探针检测。一种FRET形式(format)利用用两个荧光部分标记的一个单链熔解探针。当第一荧光部分用合适波长的光激发时,吸收的能量根据FRET的原理被转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间,标记的熔解探针与靶DNA (即,扩增产物)结合,结果,激发的荧光部分和猝灭剂部分变得在空间上彼此分离。结果,在不存在猝灭剂的情况下激发第一荧光部分时,可检测到来自第一荧光部分的荧光发射。
也可使用与FRET结合的分子信标利用本发明的实时PCR方法来检测扩增产物的存在。分子信标技术使用用第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常为猝灭剂,和荧光标记通常位于探针的每一端。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如,发夹)的序列的探针寡核苷酸。由于探针内形成二级结构,当探针在溶液中时,两个荧光部分在空间上接近。在与靶核酸(即,扩增产物)杂交后,探针的二级结构被破坏和荧光部分变得彼此分开,以致在用合适波长的光激发后,可检测到第一荧光部分的发射。
取决于测定法的设计,存在FRET可指示在样品中存在靶核酸,而不存在FRET可指示样品中不存在靶核酸。例如,杂交探针的预定熔解温度的降低偏移指示样品中存在SNP,而其中不存在杂交探针的预定熔解温度的降低偏移指示样品中不存在SNP。
可使用的代表性生物学样品包括,但不限于皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤,和软组织感染。生物学样品的收集和贮存方法是本领域技术人员已知的。生物学样品可经处理(例如,通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒),以释放核酸,或者在一些情况下,生物学样品可与PCR反应组分和适宜的寡核苷酸直接接触。
熔解曲线分析是可包括在循环分布型(cycling profile)中的步骤。熔解曲线分析是基于DNA在称为熔解温度(Tm)的特征性温度下熔解的事实,该温度定义为DNA双链的一半分开成单链时的温度。DNA的熔解温度主要取决于其核苷酸组成。因此,富含G和C核苷酸的DNA分子比具有丰富的A和T核苷酸的那些具有更高的Tm。通过检测信号失去时的温度,可确定探针的熔解温度。类似地,通过检测信号产生时的温度,可确定探针的退火温度。取决于测定法的设计,来自扩增产物的熔解探针的实际预定熔解温度(在使用具有s SNP特异性序列的熔解探针的情况下),或从预定熔解温度的降低偏移(在使用具有s 野生型序列的熔解探针的情况下)可证实在样品的靶核酸序列中存在或不存在SNP。
在每个热循环仪运行中,对照样品也可以循环。阳性对照样品可使用,例如对照引物和对照探针,扩增核酸对照模板(并非所述靶核酸序列的扩增产物)。阳性对照样品也可扩增,例如,含有核酸分子的质粒构建体。这样的质粒对照可以在内部扩增(例如,在所述样品内)或在与患者的样品并行的单独样品运行中扩增。每个热循环仪运行也可包括例如缺乏靶模板DNA的阴性对照。这样的对照是扩增、杂交,和/或FRET反应的成功或失败的指标。因此,对照反应可容易地确定例如,引物进行序列-特异性退火和启动延长的能力,以及探针进行序列-特异性杂交和使FRET发生的能力。
在一个实施方案中,本发明的方法包括避免污染的步骤。例如,利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法描述于美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中,以减轻或消除一次热循环仪运行和下次运行之间的污染。
与FRET技术结合的常规PCR方法可被用来实施所述方法。在一个实施方案中,使用LightCycler®仪器。以下专利应用描述如用于LightCycler®技术的实时PCR:WO 97/46707、WO
97/46714,和WO 97/46712。
应该理解,本发明的实施方案不受一种或多种商业可获得的仪器配置的限制。
制备物品
/
试剂盒
本发明的实施方案还提供用于制备物品或试剂盒,以在样品中检测靶核酸中的SNP。制备物品可包括用来检测靶核酸中的SNP的引物和熔解探针,以及合适的包装材料。用于在样品中检测靶核酸中的SNP的代表性引物和熔解探针能够与靶核酸分子杂交。此外,试剂盒也可包括用于DNA固定、杂交,和检测所需的合适包装的试剂和材料,这样的固体支持物、缓冲剂、酶,和DNA标准品。本文中公开了设计引物和熔解探针的方法,并提供扩增靶核酸分子并与其杂交的引物和熔解探针的代表性实例。
本发明的制备物品也可包括一个或多个用于标记熔解探针的荧光部分,或者,备选地,可将与试剂盒一起供应的熔解探针标记。例如,制备物品可包括用于标记熔解探针的供体和/或受体荧光部分。以上提供了合适的FRET供体荧光部分和对应的受体荧光部分的实例。
制备物品也可包括包装插页或包装标记,其上有使用引物和熔解探针在样品中检测靶核酸中存在或不存在SNP的使用说明。制备物品可另外包括用于进行本文公开的方法的试剂(例如,缓冲剂、聚合酶、辅因子,或防止污染的剂)。这样的试剂可以特定地用于本文所述的一种商业可获得的仪器。
本公开内容的实施方案将于以下实施例中进一步描述,这些实施例并不限制在权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明,其真正的范围在所附的权利要求书中阐明。应该理解,修饰可在不背离本发明的精神的情况下以所阐述的程序进行。
实施例
I
传统的探针熔解方法
参照图5和表I,在密闭管系统中使用不对称PCR扩增质粒DNA (SEQ ID NOs:
2-9)并随即进行熔解分析。不对称PCR含有丰富的正向引物、有限的反向引物,和过量的探针。在这种传统的探针熔解方法中的引物和探针设计被设计为不重叠的。探针(SEQ
ID NO: 1)在5’端用荧光团(F)标记,和3’末端用黑洞猝灭剂(Q)标记,后者起着猝灭未结合探针的荧光并且还防止由探针延伸而引起的扩增。
表
I
:用于传统探针熔解方法的靶和探针
SEQ ID NO | 序列 | |
1 | 探针(WT) | 5’- FTGTGGGTCAACCCC G AQ -3’ |
2 | 质粒WT01A | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCCGA -3’ |
3 | 质粒MT03A | 5’- CGCTTGT C GGTCAACCCCGA -3’ |
4 | 质粒MT05A | 5’- CGCTTG C GGGTCAACCCCGA -3’ |
5 | 质粒MT06A | 5’- CGCTTGT A GGTCAACCCCGA -3’ |
6 | 质粒MT07A | 5’- CGCTTG A GGGTCAACCCCGA -3’ |
7 | 质粒MT08A | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCC T A -3’ |
8 | 质粒MT09A | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCC A A -3’ |
9 | 质粒MT10A | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCC C A -3’ |
PCR条件:50uL总反应体积,其含有24uL洗脱缓冲剂(Tris,尼泊金甲酯,叠氮化钠)、1 µL质粒DNA (~1e4c/uL),加25 µL的预混液(曲辛(Tricine),醋酸钾,甘油,DMSO,吐温20,EDTA,叠氮化钠,dATP,dCTP,dGTP,dUTP,聚合酶,FWD引物,REV引物,探针)。
熔解分析(PCR后):在94℃5秒,接着30-80℃,斜率为0.06℃/秒。
传统熔解分析:最高熔解温度出现在WT探针和完全匹配的WT靶(WT01: ~63℃)。较低的Tm由发生在探针区域的任何SNP,包括沉默突变(MT03A-MT10A)引起。Tm偏移的量指示在探针区域的特定SNP的严格性和位置。
实施例
II
重叠引物和使用
WT
探针的探针熔解方法
参照图6和表II,在密闭管系统中使用不对称PCR扩增质粒DNA (SEQ ID NOs:
12-19)并随即进行熔解分析。不对称PCR含有丰富的正向引物、有限的反向引物,和过量的探针。探针(SEQ
ID NO: 11)被设计为与反向引物(SEQ ID NO: 10)重叠并设计成与反向引物同义,以避免探针-引物相互作用。探针在5’端用荧光团(F)标记,和3’末端用黑洞猝灭剂(Q)标记,所述黑洞猝灭剂用于猝灭未结合探针的荧光并且还防止由探针延伸引起的扩增。
表
II
:靶(
Tarets
)和堆叠的引物和
WT
探针
SEQ ID NO | 序列 | |
10 | 引物(WT) | 5’- GCGCTTGTGGGTCAACCCC -3’ |
11 | 探针(WT) | 5’- FCGCTTGTGGGTCAACCCC G Q -3’ |
12 | 质粒WT01 | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCCG -3’ |
13 | 质粒MT03 | 5’- CGCTTGT C GGTCAACCCCG -3’ |
14 | 质粒MT05 | 5’- CGCTTG C GGGTCAACCCCG -3’ |
15 | 质粒MT06 | 5’- CGCTTGT A GGTCAACCCCG -3’ |
16 | 质粒MT07 | 5’- CGCTTG A GGGTCAACCCCG -3’ |
17 | 质粒MT08 | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCC T -3’ |
18 | 质粒MT09 | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCC A -3’ |
19 | 质粒MT10 | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCC C -3’ |
PCR条件:50uL总反应体积含有24uL洗脱缓冲剂(Tris,尼泊金甲酯,叠氮化钠)、1 µL质粒DNA (~1e4c/uL),加25 µL的预混液(曲辛,醋酸钾,甘油,DMSO,吐温20,EDTA,叠氮化钠,dATP,dCTP,dGTP,dUTP,聚合酶,FWD引物,REV引物,探针)。
熔解分析(PCR后):在94℃5秒,接着30-80℃,斜率为0.06℃/秒。
在3’探针末端的3个SNP的阳性检测:使用堆叠的引物和探针的熔解分析指示了WT靶(WT01)和在探针区域(MT03、05、06,和07)的沉默突变的Tm相同(~66℃)。Tm偏移仅从位于3’探针末端(MT08、MT09,和MT10)的SNP’s发生,并且Tm偏移的量对于碱基对变化而言是特定的(MT08 Tm: ~64℃、MT09: ~61℃、MT10: ~59℃)。
实施例
III
重叠引物和使用
SNP
特异性探针的探针熔解方法
参照图7和表III,在密闭管系统中使用不对称PCR扩增质粒DNA (SEQ ID NOs:
12-19)并随即进行熔解分析。不对称PCR含有丰富的正向引物、有限的反向引物,和过量的探针。探针(SEQ
ID NO: 20)被设计为与反向引物(SEQ ID NO: 10)重叠并设计成与反向引物同义,以避免探针-引物相互作用。探针在5’端用荧光团标记,和3’末端用黑洞猝灭剂(Q)标记,所述黑洞猝灭剂用于猝灭未结合探针的荧光并且还防止由探针延伸引起的扩增。
表
III
:靶和堆叠的引物和
SNP
特异性探针
SEQ ID NO | 序列 | |
10 | 引物(WT) | 5’- GCGCITGTGGGTCAACCCC -3’ |
20 | 探针(SNP) | 5’- FCGCTTGTGGGTCAACCCC T Q -3’ |
12 | 质粒WT01A | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCCG -3’ |
13 | 质粒MT03A | 5’- CGCTTGT C GGTCAACCCCG -3’ |
14 | 质粒MT05A | 5’- CGCTTG C GGGTCAACCCCG -3’ |
15 | 质粒MT06A | 5’- CGCTTGT A GGTCAACCCCG -3’ |
16 | 质粒MT07A | 5’- CGCTTG A GGGTCAACCCCG -3’ |
17 | 质粒MT08A | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCC T -3’ |
18 | 质粒MT09A | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCC A -3’ |
19 | 质粒MT10A | 5’- CGCTTGTGGGTCAACCCC C -3’ |
PCR条件:50uL总反应体积含有24uL洗脱缓冲剂(Tris、尼泊金甲酯、叠氮化钠)、1 µL质粒DNA (~1e4c/uL),加25 µL的预混液(曲辛,醋酸钾,甘油,DMSO,吐温20,EDTA,叠氮化钠,dATP,dCTP,dGTP,dUTP,聚合酶,FWD引物,REV引物,探针)。
熔解分析(PCR后):在94℃5秒,接着30-80℃,斜率为0.06℃/秒。
在3’探针末端的1个SNP的阳性检测:使用堆叠的引物和探针的熔解分析指示来自仅与MT08靶匹配的MT08探针(MT08 probe only
with matching MT08 target)的最高Tm
(~65℃)。在探针区域的所有其它突变(用靶MT03、05、06,和07、MT09,和MT10标示)引起偏移的Tm
(~60-62℃)。
虽然为清楚和理解的目的,已经以某种详细的方式描述(described in some detail)了前述发明,本领域技术人员从本公开内容的阅读中将清楚地知道,在背离本发明的真正范围的情况下,可进行各种形式和细节的改变。例如,上述的所有技术和仪器可以在各种组合中使用。
Claims (15)
1. 一种在样品中检测靶核酸中的单核苷酸多态性(SNP)的方法,该方法包括:
- 进行扩增步骤,其包括使所述样品与包含第一野生型核酸序列的寡核苷酸引物接触,当任何靶核酸存在于所述样品中时产生扩增产物;
- 进行杂交步骤,其包括使所述扩增产物与寡核苷酸熔解探针接触,所述寡核苷酸熔解探针包含具有预定熔解温度的第二野生型核酸序列,其中所述寡核苷酸熔解探针的第二野生型核酸序列与所述寡核苷酸引物的第一野生型核酸序列重叠,并在所述SNP所位于的靶核酸区域上,在一端延伸出来一个或多个核苷酸;和
- 检测所述扩增产物中存在或不存在所述SNP,其中所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示所述样品中存在所述SNP,而其中不存在所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示所述样品中不存在所述SNP。
2. 权利要求1的方法,其中所述寡核苷酸熔解探针用在5’末端的荧光部分和在3’末端的对应的用以猝灭未结合的寡核苷酸熔解探针的荧光的受体部分标记。
3. 权利要求1或2的任一项的方法,其中所述寡核苷酸熔解探针的第二野生型核酸序列包括多个取决于所述SNP核苷酸变异的预定熔解温度,其区分所述SNP核苷酸变异。
4. 权利要求1-3的任一项的方法,其中所述靶核酸包含含有一个或多个突变的非保守区域,所述突变位于所述寡核苷酸引物与靶核酸杂交之处。
5. 权利要求1-4的任一项的方法,其中所述寡核苷酸引物的核酸序列和/或所述寡核苷酸熔解探针的核酸序列包含至少一个修饰的核苷酸。
6. 权利要求1-5的任一项的方法,其中所述寡核苷酸引物的核酸序列和/或所述寡核苷酸熔解探针的核酸序列包含至少一个保守修饰的变异。
7. 权利要求1-6的任一项的方法,其中所述寡核苷酸引物的核酸序列和/或寡核苷酸熔解探针的核酸序列具有40个或更少的核苷酸。
8. 一种在样品中检测靶核酸中的单核苷酸多态性的方法,该方法包括:
- 进行扩增步骤,其包括使所述样品与包含野生型核酸序列的寡核苷酸引物接触,当任何靶核酸存在于所述样品中时产生扩增产物;
- 进行杂交步骤,其包括使所述扩增产物与包含具有预定熔解温度的SNP特异性核酸序列的寡核苷酸熔解探针接触,其中所述熔解探针的SNP特异性核酸序列与所述寡核苷酸引物的野生型核酸序列重叠,并在所述SNP所位于的靶核酸区域上,在一端延伸出来一个或多个核苷酸;和
- 检测所述扩增产物中存在或不存在所述SNP,其中所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示所述样品中不存在所述SNP,而其中不存在所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示所述样品中存在所述SNP。
9. 权利要求8的方法,其中所述寡核苷酸熔解探针用在5’末端的荧光部分和在3’末端的对应的用以猝灭未结合的寡核苷酸熔解探针的荧光的受体部分标记。
10. 权利要求8或9的任一项的方法,其中所述寡核苷酸熔解探针的SNP特异性核酸序列包括多个取决于所述SNP核苷酸变异的预定熔解温度,其区分所述SNP核苷酸变异。
11. 一种用于在样品中检测靶核酸中的单核苷酸多态性(SNP)的,包含寡核苷酸引物和寡核苷酸探针集的试剂盒,其包含:
- 含有第一野生型核酸序列的寡核苷酸引物,其当任何靶核酸存在于所述样品中时产生扩增产物;和
- 包含具有预定熔解温度的第二野生型核酸序列的寡核苷酸熔解探针,其中所述寡核苷酸熔解探针的第二野生型核酸序列与所述寡核苷酸引物的第一野生型核酸序列重叠,并在所述SNP所位于的靶核酸区域上,在一端延伸出来一个或多个核苷酸;
其中凭借所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示所述样品中存在所述SNP,和凭借不存在所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示所述样品中不存在所述SNP,检测所述扩增产物中存在或不存在所述SNP。
12. 一种用于在样品中检测靶核酸中的单核苷酸多态性(SNP)的,包含寡核苷酸引物和寡核苷酸探针集的试剂盒,其包含:
- 含有野生型核酸序列的寡核苷酸引物,其当任何靶核酸存在于所述样品中时产生扩增产物;和
- 包含具有预定熔解温度的SNP特异性核酸序列的寡核苷酸熔解探针,其中所述寡核苷酸熔解探针的SNP特异性核酸序列与所述寡核苷酸引物的第一野生型核酸序列重叠并在所述SNP所位于的靶核酸区域上,在一端延伸出来一个或多个核苷酸;
其中凭借所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示所述样品中存在所述SNP和凭借不存在所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示所述样品中不存在所述SNP,检测所述扩增产物中存在或不存在所述SNP。
13. 权利要求11或12的任一项的试剂盒,其中所述寡核苷酸熔解探针用荧光部分,和对应的用以猝灭未结合的寡核苷酸熔解探针的荧光的受体部分标记。
14. 权利要求13的试剂盒,其中所述寡核苷酸熔解探针用在5’末端的荧光部分和在3’末端的对应的用以猝灭未结合的寡核苷酸熔解探针的荧光的受体部分标记。
15. 权利要求11-14的任一项的试剂盒,其中所述寡核苷酸熔解探针的核酸序列包括多个取决于所述SNP核苷酸变异的预定熔解温度,其区分所述SNP单核苷酸变异。
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