CN101627133A - 用于金黄色葡萄球菌检测的dna芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对金黄色葡萄球菌特异的核酸探针,其用于检测并鉴定生物样品中的金黄色葡萄球菌。更具体地说,本发明涉及用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的DNA芯片,来自金黄色葡萄球菌的23S rRNA基因固定在所述芯片上。与常规细菌培养方法相比,根据本发明的DNA芯片的应用可以节约时间并精确地诊断细菌感染。
Description
技术领域
本发明涉及一种对金黄色葡萄球菌特异的核酸探针,其用于检测并鉴定生物样品中的金黄色葡萄球菌。更具体地说,本发明涉及一种用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的DNA芯片,来自金黄色葡萄球菌的23SrRNA基因的核酸探针被固定在所述芯片上。
背景技术
如果病原生物不能被正确鉴定并控制,由于病原生物在人类血液、流体和组织中存在和活动而导致的传染病可发展成致命疾病。最近,存在抗生素物质的滥用、移植的免疫抑制剂的过量使用、和抗癌治疗的药物的过量使用。结果,病原生物经历了基因中的连续或交替变化并且所述生物的培养速度逐渐减小。病原生物的适应使得难以使用传统诊断方法诊断传染病。由于一些厌氧生物显示了足够的致病性,能使人类产生严重疾病,生物样品中的病原微生物的快速检测和精确鉴定在传染病的治疗中是相当重要的。
金黄色葡萄球菌是一种感染性病原微生物,能够引起皮肤感染、软组织感染、化脓性关节炎、肺炎、脓血症、食物中毒等,从而当其没有被正确的抗生素治疗时会导致发病和死亡。金黄色葡萄球菌感染在鼻部带菌者中频繁出现,由于感染了MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)或者具有鼻部MRSA感染的患者很可能在重症监护室就医,感染从被感染患者传播到其他未感染者的可能性很高。因此,利用选择性检测进行正确预防是很重要的。
因此,对引起传染病的金黄色葡萄球菌的检测和鉴定的各种方法已经进行了长时间的研究和开发。尽管微生物检测的技术已经取得了显著的进步,但仍很艰苦并且只能提供较低的灵敏度和特异性。
除病毒之外,所有原核生物都含有编码原核5S、16S和23S rRNA分子的同源染色体的rRNA基因。在真核生物中,这些rRNA分子为5SrRNA、5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA,它们大体上与原核分子类似。前面已经描述了用于在生物样品中特别是非病毒生物或者非病毒生物群中的特定rRNA子序列进行检测的核酸探针。常规诊断方法中的许多问题可通过利用所述核酸探针与公知的聚合酶链反应(PCR)技术的结合来解决。待扩增的目的基因的选择在诊断的核酸探针技术中非常重要,并且rRNA基因,尤其是23S rRNA基因常常被作为靶序列。已经报道,来自rRNA基因的核酸探针序列在适当的严格条件下很难与来自非目标物种的微生物的核酸发生交叉反应(P.Wattiau等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,56:816-819,2001;D.A.Stahlm等人,J.Bacteriol.,172:116-124,1990;Boddinghaus等人,J.Clin.,Microbiol.,28:1751-1759,1990;T.Rogall等人,J.Gen.Microbiol.,136:1915-1920,1990;T.Rogall等人,Int.J.System.Bacteriol.,40:323-330,1990;K.Rantakokko-Jalava等人,J.Clin.,Mirobiol.,38(1):32-39,2000;Park等人,J.Clin.,Mirobiol.,38(11):4080-4085,2000;A.Schmalenberger等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,67(8):3557-3563,2001;WO 98/55646;US 6025132;以及US 6277577).
本发明的发明人已经提交了涉及使用对所述感染性生物特异的核酸序列作为探针以便检测并鉴定非病毒感染性生物的DNA芯片的专利申请(WO2003/095677A1),并且进行了研究来提高DNA芯片的灵敏度。
因此,本发明的发明人付出了极大的努力来快速精确地检测来自据称感染了金黄色葡萄球菌的患者的样品中的金黄色葡萄球菌。结果,本发明的发明人从金黄色葡萄球菌基因组的23S rRNA基因中分离了对金黄色葡萄球菌特异的不同序列,使用该序列作为金黄色葡萄球菌检测的探针构建了DNA芯片,并确定可使用该DNA芯片以快速精确的方式检测金黄色葡萄球菌,从而完成了本发明。
发明内容
本发明的主要目的是提供用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的DNA芯片,包括对金黄色葡萄球菌特异的从金黄色葡萄球菌基因组的23SrRNA基因中分离的序列的寡核苷酸固定在其上。
本发明的另一目的在于提供包括寡核苷酸的用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的探针。
为了实现上述目的,本发明提供了包括一个或多个寡核苷酸的用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的探针,所述寡核苷酸选自由具有序列号:1-8的核苷酸序列的寡核苷酸的组成的组。
本发明还提供了用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的DNA芯片,其中所述探针被固定于基板上。
在本发明中,DNA芯片优选在其上固定有具有序列号:1-8核苷酸序列的所有寡核苷酸。
通过下列详细说明和所附的权利要求书,本发明的其他特征和实施方式将更加完全明显。
附图说明
图1A示出了设计用于包括金黄色葡萄球菌的样品的盲试验的DNA芯片的示意图,图1B示出了在包括金黄色葡萄球菌的样品的盲试验中由ArrayWorks微阵列扫描仪检测的DNA芯片上的杂交结果。
图2A示出了设计用于包括金黄色葡萄球菌的样品的盲试验的DNA芯片的示意图,图2B示出了在包括金黄色葡萄球菌的样品的盲试验中由ArrayWorks微阵列扫描仪检测的DNA芯片上的杂交结果。
具体实施方式
在一个方面,本发明涉及用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的探针,其包括含有来自金黄色葡萄球菌基因组的23S rRNA基因的对金黄色葡萄球菌特异的序列的寡核苷酸。
在本发明中,将金黄色葡萄球菌的23S rRNA核苷酸序列与已经通过多序列比对进行了序列鉴定的其他微生物的序列进行比较,以确定对金黄色葡萄球菌特异的序列,并使用对金黄色葡萄球菌特异的序列选择候选探针,从而合成对金黄色葡萄球菌特异的探针。
在另一方面,本发明涉及用于检测并鉴定对金黄色葡萄球菌特异的DNA芯片,包括来自金黄色葡萄球菌基因组的23S rRNA基因的对金黄色葡萄球菌特异的序列的寡核苷酸被固定在所述芯片上。
在本发明中,用于检测金黄色葡萄球菌的DNA芯片通过将用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的所述合成探针利用醛-胺相互作用固定在载玻片上而构建。
另外,为了验证用于检测金黄色葡萄球菌的所述探针和DNA芯片的特异性,分离标准菌株的基因组以用作PCR的模板,然后将得到的PCR产物在DNA芯片上杂交,从而确定DNA芯片在金黄色葡萄球菌检测中是有效的。此外,与常规培养方法的金黄色葡萄球菌检测率受到抗生素加入的影响的事实相反的是,通过实验结果可以确定本发明的DNA芯片在加入抗生素的情况下也显示了高检测效率。
下列定义用于解释在下面列出的在本发明的不同实施方式中使用的术语和表达方式。
“分离的”核酸分子是从在天然核酸源中存在的其他核酸分子中分离的一种核酸分子。例如,关于基因组DNA,术语“分离的”包括从与基因组DNA天然相关的染色体分离的核酸分子。
术语“探针”或者“核酸探针”指的是具有与待测目标碱基序列充分互补以便杂交的碱基序列的单链序列特异性寡核苷酸。
“合成”指的是与细菌或者真菌rRNA互补的探针可处于单一状态或者与其他探针结合。另外,探针可与盐或者缓冲液结合,并可处于干燥状态,作为沉淀处于酒精溶液中,或者处于水溶液中。
术语“目标”指的是来自生物样品的具有与本发明的核酸探针互补的碱基序列的核酸分子。目标核酸可以是单链或者双链DNA(如果合适的话,通过下面的扩增得到)或者RNA,并包含与至少一种寡核苷酸探针至少部分互补的序列。
短语“生物样品”指的是从其中可找到感兴趣的目标序列的样本诸如临床样品(脓液,唾液,血液,尿液等),环境样品,细菌克隆,污染或纯净培养物,纯化核酸等。
“寡核苷酸”指的是核苷酸聚合物,一般包括大约10个到大约100个核苷酸长度,但其长度可大于100个核苷酸或者小于10个核苷酸。
“核苷酸”指的是包括磷酸基团、5-碳糖和含氮碱基的核酸亚单位。在RNA中5-碳糖为核糖。在DNA,其为2-脱氧核糖。对于5-核苷酸而言,糖包括碳-5上的羟基(-OH)。该术语还包括所述亚单位的类似物。
术语“同源性”是相同的同义词,指的是在序列对比时,例如被称为90%同源性的多聚核酸在相同位置具有90%相同的碱基对。
“杂交”涉及互补序列与目标核酸(待测序列)的退火。两种含有互补序列的核酸聚合物能够发现彼此并通过碱基配对相互作用退火是公认的现象。
术语“引物”涉及能够作为用于引物合成的起始点、与待复制核酸链互补的延伸产物的单链DNA寡核苷酸序列。引物的长度和序列必须被设计成使它们能引发延伸产物的合成。优选地,引物为大约5-50个核苷酸长。特定长度和序列将取决于所需DNA或RNA目标的复杂性,以及引物使用条件诸如温度和离子强度。
在这里使用的术语“标记”指的是任何可与核酸连接的可用于提供检测(优选可定量)信号的原子或分子。标记可提供可通过荧光、放射、比色、比重、X-射线衍射或者吸收、磁以及类似物检测的信号。
“杂交”指的是在两个单链核酸序列之间通过两个互补碱基之间的沃森-克里克碱基配对或者非标准碱基配对形成复合物。
短语“探针特异性”指的是探针的一种特性,描述了其区分目标和非目标序列的能力。从这个角度来说,术语“特异”指的是核苷酸序列可与限定的目标序列杂交,并且基本上不与非目标序列杂交,或者与非目标序列的杂交可被忽略。探针特异性取决于序列和测定条件。
术语“标准菌株”包括在该领域可从市场上购买或者很容易得到的那些菌株。
探针的鉴定
每个探针需要对感兴趣的微生物具有特异性。根据本发明的特异探针设计如下。首先,仅仅存在于感兴趣的微生物中的特定核苷酸序列通过将来自所有可能微生物种类的核苷酸序列进行多序列比对来鉴定。多序列比对使用来自细菌的23S rRNA基因和来自真菌的18S rRNA基因进行。许多来自23S rRNA基因和18S rRNA基因的片段被选择作为候选探针。第二,候选探针的特异性通过使用本领域技术人员公知的BLAST分析与含有核苷酸序列的公共数据库比较来确定,以将菌株应用于杂交,从而选择与感兴趣的微生物反应的探针作为用于鉴定的探针。第三,候选探针的灵敏性通过将其用于各种生物样品的临床试验来测定。
本发明的探针包括至少15-mer寡核苷酸并优选与待测目标序列的精确补体具有70%、80%、90%或者超过95%的同源性。那些探针长大约50个核苷酸。当然,包括超过50个核苷酸的探针也可被使用。在本发明中使用的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和修饰的核苷酸例如次黄嘌呤核苷或者基本上不改变杂交特性的含有修饰基团的核苷酸。
探针的使用
本发明的探针可被用于诊断目的,按照所有已知杂交技术,尤其是按照在被称为“DOT-BLOT”的过滤器上点沉积(Maniatis等人,MolecularCloning,Cold Spring Harbor,1982),被称为“SOUTHERN BLOT”的DNA转移技术(Southern,E.M.,J.Mol.Biol.98:503,1975)或者被称为“NORTHERN BLOT”的RNA转移技术,研究生物样品中目标核酸的存在或不存在。
本发明的探针还可在增强了以核酸探针为基础的测定的特异性的夹心杂交系统中使用。在以核酸探针为基础的测定中的夹心杂交原理和用途已经被描述(例如:Dunn和Hassel,Cell,12:23-36;1977;Ranki等人,Gene,21:77-85;1983)。夹心杂交技术使用捕获探针和/或检测探针,所述探针能够与目标核酸的两个不同区域杂交,并且至少一个所述探针(一般为检测探针)能够与对被研究的物种或者物种群特异的目标杂交。应当理解,捕获探针和检测探针必须具有至少部分不同的核苷酸序列。虽然直接杂交测定具有良好的动力学,但夹心杂交在更高的信噪比方面是有利的。此外,夹心杂交可增加以核酸探针为基础的测定的特异性。构成夹心杂交过程的关键阶段的培育和随后的清洗阶段都在大约20℃与65℃之间的恒定温度下进行。已知核酸杂交具有取决于杂交碱基数目(温度随着杂交的长度而增加)并且取决于杂交碱基的性质以及取决于每个杂交碱基的相邻碱基的性质的离解温度。通过简单常规试验,在夹心杂交技术中使用的温度应当显然地被选择为低于在给定探针与互补序列目标之间形成的杂交的半离解温度。
本发明的探针还可用在竞争性杂交方案中。在竞争性杂交中,目标分子与在特异探针和其补体之间的杂交形成竞争。目标分子越多,在探针及其补体之间形成的杂交数量越低。表示特异目标存在的阳性信号通过与没有加入目标的系统相比的杂交反应的降低来确认。在特定实施方式中,适当标记的特异寡核苷酸探针与目标分子杂交。接着,将混合物转移到与特异探针互补的寡核苷酸固定在其中的受体中(例如微量滴定板孔中)并继续杂交。在洗涤之后,根据使用的标记测定优选定量测定互补寡核苷酸与探针之间的杂交。
另外,本发明的探针可在反向杂交中使用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6230-6234,1989)。在这种情况下,目标序列首先使用5’生物素化引物通过进行PCR来酶扩增。在第二步骤中,当扩增产物与固定在固相载体上的特异寡核苷酸杂交时对其进行检测。反向杂交无需扩增步骤也可进行。在该特定情况下,在样品中存在的核酸必须在杂交之前被特异或者非特异标记或者修饰,例如化学地或者通过加入特定染料。
本发明的核酸探针可被包含在可用于快速确定感兴趣的病原体存在或不存在的试剂盒中。试剂盒包括对于测定这些病原体所需的所有成分。在通用概念中,试剂盒包括标记探针的稳定制剂,用于目标和探针多聚核苷酸杂交的干燥或者液体形式的杂交溶液,以及用于洗涤和除去不需要和非双螺旋的多聚核苷酸的溶液,用于检测标记双螺旋的底物,以及任选地用于标记检测的仪器。
本发明的更具体的实施方式包括利用夹心测定的概念的试剂盒。该试剂盒可包括用于从患者收集样品的第一成分,诸如刮擦装置或者纸尖、用作容器的小瓶以及用于样品的分散和裂解的缓冲液。第二成分可包括用于目标和探针多核苷酸杂交以及用于通过清洗除去不需要和非双螺旋形式的干燥或液体形式的介质。第三成分包括与一部分目标多聚核苷酸互补的未标记核酸探针固定于其上或者与其结合的固相载体。在多个目标分析的情况下,对其自身的核糖体RNA特异的多个捕获探针可被应用于试纸的不同分散区域。第四种成分可含有与相同rRNA链的第二和不同区域互补的标记探针,第三种成分的固定的未标记核酸探针与其杂交。这里描述的探针成分包括干燥形式诸如冻干的核酸或者沉淀形式诸如酒精沉淀的核酸或者处于缓冲溶液中的探针的组合。标记物可以是上面描述的标记物的任何一种。例如,探针可使用常规方法生物素化,并且生物素化探针的存在可通过加入与酶结合的抗生物素蛋白诸如辣根过氧化物酶并与底物接触来检测,当与过氧化物反应时,所述底物可视觉监测或者通过使用比色计或者分光光度计的仪器来监测。与放射性标记方法相比,这种标记方法和其他酶类型的标记物具有成本低、灵敏度高并且相对安全的优点。用于标记探针检测的各种试剂和用于试剂盒的其他各种材料诸如说明、阳性和阴性对照以及用于进行混合并使各种组分反应的容器可使所述测定试剂盒更完善。
DNA芯片
本发明的探针还在DNA芯片中使用。在优选实施方式中,本发明提供了一种DNA芯片,其中核酸探针被固定在固相载体上。通过将各种碱基序列的DNA片段高密度布置在狭窄基板上形成的DNA芯片,其用于通过固定DNA和与其互补的未知DNA样品之间的杂交而发现未知样品的关于DNA的信息。探针寡核苷酸固定于其上的固相载体的例子包括无机材料,诸如玻璃和硅,以及聚合材料诸如丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯。固相载体的表面可以是平坦的或者具有多个孔。探针通过3’端或5’端的共价键被固定在基板上。固定可通过常规技术来实现,例如,使用静电力,乙醛包被的载玻片和与合成的寡聚相连接的氨基之间的结合或者点样在氨基包被的载玻片、L-赖氨酸包被的载玻片或者硝酸纤维素包被的载玻片上。
本发明的一种实施方式包括当合成探针时将碱基与探针3’位置上的氨基残基结合,接着将其共价结合到乙醛包被的载玻片上。
各种探针在固体基板上的固定和布置通过针微阵列、喷墨、光刻、电阵列等进行。在本发明的一个实施方式中,探针分别溶解在缓冲液中并且得到的溶液使用通过已知方法(Yoon等人,J.Microbiol.Biotechnol.,10(1):21-26,2000)制备的微阵列点样器点样到基板上。微阵列点样器的基本原理是精密构造的针从平板上选取探针DNA并将其输送到由计算机指定的位置。对于由微阵列点样器输送的探针的固定来说,固定化反应可以在45%到65%、优选50%到55%的湿度下至少进行一个小时,并且其保持至少6小时以利于探针3’位置的氨基与包被在载玻片上的醛基之间的反应。
为了检测来自活的有机体的或者本身就是活的有机体的细胞,如果需要的话,这些细胞的RNA和/或DNA可通过使用化学和/或物理方法部分或全部裂解细胞得到,并与可被检测的本发明的一种或多种探针接触。这种接触可在合适的载体上进行,例如处于液体介质或者溶液中的尼龙滤膜、硝酸纤维素、或者纤维素。
这种接触可在次最佳的、最佳的条件下或者在限制条件下进行。所述条件包括温度、反应物浓度、降低核酸配对的最佳温度的物质的存在(例如甲酰胺,二甲亚砜和尿素)以及明显减少反应体积和/或加速杂交形成的物质的存在(例如硫酸葡聚糖,聚乙二醇或苯酚)。
探针制备
为了得到大量核酸探针,人们可使用常规克隆方法克隆所需序列,例如Maniatis,T.等人在Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,New York,1982中描述的方法,或者人们可通过使用从市场购买的DNA合成仪化学合成探针。
本发明的探针可通过常规方法制备。典型地引入了两种方法。第一种方法是制备单链探针。制备包含需要数目的核苷酸的单链探针的代表性的例子包括通过自动DNA合成仪的二甲氧基三苯甲基(DMT)断裂法,所述方法包括除去DMT基团以释放5’羟基用于偶联反应,偶联并加帽。由此得到的探针使用荧光染料(异硫氰酸荧光素酯,FITC)标记以确定感兴趣的核酸存在与否。作为替代,与单链DNA模板互补的DNA探针通过将引物与模板DNA退火并使用Klenow片段和用荧光染料标记的dNTP由引物/模板复合物进行延伸反应来制备。由此制备的探针由于其荧光染料而显示了高灵敏度和特异性。
第二种方法是双链探针的制备。通过使用特异的限制性酶消化基因组DNA或者质粒DNA能够制备具有所需基因区域或碱基片段的探针。一种随机引发方法是通过将六种随机六聚物与模板DNA杂交来合成具有各种长度的荧光标记的探针。作为替代,荧光标记的探针可通由T4多核苷酸激酶将32P转移到DNA的5′端来合成。另外,探针可通过使用DNase I分解双链DNA分子并使用DNA聚合酶I和荧光标记的dNTP进行DNA复制来合成。由此得到的双链探针被变性以形成随后用在杂交反应中的单链DNAs。
有利地,本发明的探针可被标记。任何常规标记都可使用。探针可通过放射性示踪物例如32P,35S,125I,3H和14C来标记。放射性标记可按照任何常规方法来进行,例如使用放射性标记核苷酸、聚核苷酸激酶(具有或不具有通过磷酸酶的去磷酸化)、末端转移酶或者连接酶在3′或5′位置进行末端标记。用于放射性标记的另一种方法是本发明的探针的化学碘化,其导致几个125I原子在探针上的结合。
如果一种本发明的探针具有放射性以便用于与非放射性RNA或DNA杂交,则检测杂交的方法将取决于使用的放射性示踪物。一般说来,自体放射照相术,液体闪烁,伽马计数或者使人们能够检测由放射性示踪物发出的电离射线的任何其他常规方法都可采用。通过将本发明的探针与具有下列免疫学或物理性质的残基结合,非放射性标记也可被使用,免疫学性质包括(例如抗原或半抗原)、对于一些试剂的亲和力(例如配体)、提供可检测的酶反应的性质(例如酶,辅酶,酶底物或者参加酶反应的底物),物理性质诸如荧光、任何波长的光的发射和吸收。特异检测由探针和目标形成的杂交的抗体也可采用。
当化学合成的本发明的探针和腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷以及它们的易与其他化学残基结合的尿嘧啶残基能够检测探针或者在探针与互补DNA或RNA片段之间形成的杂交时,可以使用非放射性标记。
目标
为了提供用于利用结构探针检测的临床样品中微生物的检测和鉴定的底物,从样品中提取核酸。可使用各种标准技术或者市售试剂盒从样品中提取核酸。例如,允许从组织样品中分离RNA或者DNA的试剂盒可购自Qiagen,Inc.(Chatsworth,CA)和Stratagene(La Jolla,CA)。例如,QIAamp血液试剂盒允许从血液(新鲜,冰冻或者干燥)以及骨膜、体液或者细胞悬液中分离DNA。QIAamp组织试剂盒允许从组织例如肌肉、器官和肿瘤中分离DNA。
在确定生物样品是否含有可指示所需病原体存在的rRNA或rDNA的优选方法中,核酸可通过声波断裂从细胞中释放,例如按照由Murphy等人在美国专利5374522中公开的方法。用于裂解细胞的其他已知方法包括应用酶、渗透压休克、化学处理和玻璃珠涡流。适于从微生物中释放可进行本文中公开的杂交的核酸的其他方法已经由Clark等人在美国专利US5837452和Kacian等人在美国专利5364763中描述。
在rRNA释放之后或者同时,标记探针可在加速剂的存在下加入并在最佳杂交温度下培养一段时间以达到明显杂交反应。在双链核酸目标的情况下,建议在进行检测步骤之前先变性。双链核酸的变性可通过已知的化学、物理或者酶变性来进行,特别是在高于80℃的合适温度下加热进行。
另外,与探针杂交的目标DNA常常通过两种方法来制备。第一种方法是在使用Southern印迹或者Northern印迹中使用的方法。使用合适的限制性酶消化基因组DNA或者质粒DNA并通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA片段并使用。第二种方法是通过PCR扩增所需的DNA区域。PCR的例子包括使用相同量的正向和反向引物的最典型的PCR,非对称PCR中双链和单链带可通过不对称地加入引物得到,多重PCR中可通过同时加入多种引物一次扩增多个目标DNA,连接酶链反应(LCR)中目标DNA使用特异的4种引物和连接酶扩增并且通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测定荧光量,以及其他PCR,诸如热启动PCR,Nest-PCR,DOP-PCR(退化寡核苷酸引物PCR),RT-PCR(逆转录PCR),半定量RT-PCR,实时PCR,RACE(cDNA末端的快速扩增),竞争性PCR,STR(短串联重复),SSCP(单链构象多态性),DDRT-PCR(差异显示反向转录酶)等等。
已经发现来自相对同源样本(诸如血液、细菌克隆、病毒斑或者脑脊髓液)的粗提物比来自更复杂样本(诸如尿液、唾液或者粪便)的更适于用作独特PCR产物扩增的模板(Mullis等人,Shibata in PCR:ThePolymerase Chain Reaction,eds.,Birkhauser,Boston,pp.47-54,1994)。含有相对较少待扩增材料(即目标核酸)拷贝的样品诸如脑脊髓液,可直接加入到PCR中。血样在PCR中由于红细胞的抑制性质而造成特定问题。红细胞必须在PCR中使用血液之前被除去;有两种经典并可从市场上得到的方法用于此目的(例如QIAamp血液试剂盒,经过Chelex 100柱[BioRad]的通路等)。核酸从选择用于结核分支杆菌直接检测的样本唾液中的提取要求事先净化以杀死或者抑制其他细菌种类的生长。这种净化典型地通过使用N-乙酰基L-半胱氨酸和NaOH处理样品(Shinnick和Jones,supra)来实现。该净化过程仅仅在唾液样本需要在分析之前进行培养时才是必须的。
本发明的优选实施方式包括使用分离样品的DNA作为模板通过不对称PCR制备基因片段。基因片段通过加入1∶5比例的正向和反向引物同时进行PCR得到。
使用的引物与普遍存在于细菌中的16S rRNA或23S rRNA的区域对应(Pirkko K.等人,Clin.Microbiol.,36(8),2205-2209,1999),这些引物如下:
引物1-S(正义):P-TTGTACACACCGCCCGTC(序列号:9,1585Fw),
引物1-A(反义):Cy3-TTTCGCCTTTCCCTCACGGTACT(序列号:10,23Br),
引物2-S(正义):P-AGTACCGTGAGGGAAAGGGGAA(序列号:12,23BFw),
引物2-A(反义):Cy3-TGCTTCTAAGCCAACATCCT(序列号:12,MS37R),
引物3-S(正义):P-AGGATGTTGGCTTAGAAGCA(序列号:13,MS37F),
引物3-A(反义):Cy3-CCCGACAAGGAATTTCGCTACCTT(序列号:14,MS38R)。
在上述引物中,位置如图1中所示,与5’端结合的字母“F”表示异硫氰酸荧光素酯(FITC)。目标DNA使用5-FITC结合的引物扩增,然后通过荧光来确定扩增的目标DNA与核酸探针之间的杂交以确信传染源的鉴定。为了得到不能由上述引物扩增的区域,通过多序列比对和BLAST设计另外的引物。
在PCR的优选实施方式中,将5μL的10X PCR缓冲液(100mMTris-HCl,pH 8.3,500mM KCl,15mM MgCl2),4μL的dNTP混合物(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,每种2.5mM),0.5μL的10pmol正向引物,2.5μL的10pmol反向引物,1μL的1/10稀释的模板DNA(100ng)和0.5μL的Taq聚合酶(5单位/μL,Takara Shuzo Co.,Shiga,Japan)混合,并将水加入到得到的混合物中至混合物总体积为50μL。进行10个循环的不对称PCR,每个循环包括在94℃下第一次变性7分钟,94℃下第二次变性1分钟,52℃下退火1分钟并72℃下延伸1分钟,和30个循环,每个循环包括在94℃下第三次变性1分钟,54℃下退火1分钟并72℃延伸1分钟,接着72℃延伸5分钟的最终延伸。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳确认。
杂交和洗涤
特定的杂交技术对于本发明来说不是必须的。杂交技术一般在现有技术中都有描述(Gall和Pardue,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A,63:378-383,1969;以及John等人,Nature,223:582-587,1969)。
杂交条件由“严谨性”来确定,也就是说操作条件的严格。当以更严格的条件进行时杂交变得更特异。严谨性是一种功能,尤其是探针/目标双螺旋的碱基组分以及两种核酸之间的错配程度的功能。严紧性同样是杂交反应的参数功能,例如在杂交液中存在的离子样本的浓度和类型,变性剂的性质和浓度和/或杂交温度。必须进行杂交反应的条件的严谨性尤其取决于所使用的探针。所述这些数据都是已知的并且合适条件在每种情况下能够通过常规实验确定。一般说来,取决于使用的探针长度,杂交反应的温度在大约20℃与65℃之间,尤其是在35℃与65℃之间,在浓度大约为0.8到1M的盐溶液中进行。
标记寡核苷酸探针与核酸目标之间的核酸杂交可通过使用Hogan等人在美国专利5030557中公开的“未标记Helper探针”来增强。Helper探针是与由测定探针标定的目标核酸不同的目标核酸结合的寡核苷酸,其将新的二级及三级机构施加于单链核酸的目标区域上,从而加快了测定探针的结合速度。
本领域技术人员可以理解,影响热稳定性的因素也可影响探针特异性,因此其必须受到控制。因此,应当确定解链方案,包括寡核苷酸/目标杂交体的解链温度(Tm)。优选在美国专利5283174中描述的方法。为了使用杂交保护测定测定Tm,使用了下列技术。探针:目标杂交体在含有十二烷基硫酸锂的琥珀酸锂缓冲液中在目标过量的情况下形成。等分的这些“预制”杂交体在杂交缓冲液中稀释并在从低于预期Tm(通常为55℃)开始并以2-5℃的增量增加的各种温度下培育5分钟。
然后使用适量碱性硼酸盐缓冲液稀释该溶液并将其在较低的温度(例如50℃)下培育10分钟。在这些条件下,在连接到杂交探针的那些相对“被保护”的同时,与单链探针连接的吖啶酯被水解。这被称作为杂交保护测定(“HPA”)。剩余的化学发光量与杂交体的量成正比,并通过加入过氧化氢然后加入碱在光度计中测定。将该数据作为最大信号(通常来自最低温度)的百分比对温度作图。Tm被定义为最大信号保持50%的点处的温度。
除上述方法外,寡核苷酸/目标杂交体解链温度还可通过本领域技术人员公知的同位素法来测定。应当注意,对于给定杂交体的Tm,其可基于使用的溶液而变化,因为其热稳定性取决于不同盐、去垢剂和在热变性过程中影响相对杂交稳定性的其他溶质的浓度(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab Publ.编著,9.51(第二版),1989)。
杂交条件可依赖于多种参数来监测,例如杂交温度,介质的成分的性质和浓度,以及形成的杂交体被洗涤时的温度。杂交和洗涤温度根据探针(其核酸组成、种类和长度)有一个上限值,本文中描述的探针的最大杂交或洗涤温度大约为30℃到60℃。在更高的温度下,双螺旋与在探针和目标之间形成的杂交体的离解(或者变性)竞争。优选的杂交介质包括大约3X SSC(1X SSC=0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠,pH 7.0),大约25mM pH 7.1的磷酸缓冲液,和20%去离子甲酰胺,0.02%聚糖体,0.02%牛血清白蛋白,0.02%聚乙烯吡咯烷酮和大约0.1mg/mL剪切的变性鲑鱼精子DNA。优选的洗涤培养基包括大约3X SSC,25mM pH 7.1的磷酸盐缓冲液和20%去离子甲酰胺。但是,当将修饰引入探针和介质中时,探针可得到所需特异性的温度应当根据已知关系进行变化。从这个角度讲,还应当注意的是,一般说来,DNA:DNA杂交体比RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的稳定性低。基于待检测杂交体的性质,杂交条件应当被相应调整以实现特异检测。
在本发明的优选实施例中,将杂交缓冲液(6XSSPE(0.15M NaCl,5mM C6H5Na3O7,pH 7.0),20%(v/v)甲酰胺)与PCR扩增的目标基因混合,将得到的混合物施加到探针固定于其上的载玻片上,然后将反应在30℃下进行6小时,使所述探针可与所述目标互补杂交。然后顺序使用3XSPE,2XSSPE和1XSSPE洗涤载玻片,每次5分钟。
形成的杂交体可按照常规方法通过使用荧光或者放射性同位素标记目标来定量。标记可通过标记引物的使用或者在扩增的聚合酶步骤中使用结合的标记核苷酸来进行。
实施例
此后,将通过下列实施例对本发明进行详细描述。但是,对本领域技术人员来说应当理解的是,这些实施例是用于提供对本发明的更好地理解,而不应被解释为对本发明的范围的限制。
实施例1:用于鉴定金黄色葡萄球菌的候选DNA探针的选择
为了检测并鉴定金黄色葡萄球菌,构建对金黄色葡萄球菌特异的探针。为了构建特异探针,选择对金黄色葡萄球菌特异的候选探针。将在基因库中列举的金黄色葡萄球菌的23S rRNA序列通过多序列比对与已知微生物的那些序列进行比较,以确定仅仅在金黄色葡萄球菌中存在的特异序列,从而构建候选探针。候选探针在金黄色葡萄球菌的23S rRNA基因中选择。候选探针的特异性通过使用BLAST分析比较微生物之间的序列相似性来确定。结果,由此筛选的候选探针在下表1中示出。
表1:对金黄色葡萄球菌特异的候选探针
探针号 | 序列 | 命名 | 序列号 |
1 | AGGACGACATTAGAC | Sau001 | 1 |
2 | CAAAGGACGACATTAGACGA | Sau001-20 | 2 |
3 | CGAAGCGTGCGATTG | Sau003 | 3 |
4 | AGGCGAAGCGTGCGATTGGA | Sau003-20 | 4 |
5 | TGGATTGCACGTCTAAGCAG | Sau004-20 | 5 |
6 | CAAATCCGGTACTCGTTAAG | Sau005-20 | 6 |
7 | GAGTCTTCGAGTCGTTGATT | Sau03-20 | 7 |
8 | TCTTCGAGTCGTTGA | Sau3 | 8 |
实施例2:核酸探针的合成
为了构造DNA芯片,化学合成在上面的实施例1中筛选的候选探针。将单核苷酸(Proligo Biochemie GmbH Hamburg Co.)引入到Expedite 8900核酸合成系统(PE Biosystems Co.)中并输入所需核苷酸序列和比例以提供0.05μmol纯核酸探针。得到的探针通过电泳来确认。
实施例3:DNA芯片的构造
为了将DNA探针固定在固相载体上,使用氨基-醛基共价键。合成的寡核苷酸探针的3′端使用氨基连接柱(Cruachem,Glasgow,Scotland)以氨基残基修饰以便固定在载玻片上。对于载玻片,使用醛基包被的载玻片(CEL Associates,Huston,TX)。
将探针溶解在3X SSC(0.45M NaCl,15mM C6H5Na3O7,pH 7.0)点样液中。使用微阵列点样器(MicroGrid Spotter,Biorobotics Inc,England)将得到的溶液点样在载玻片表面上。将载玻片在大约55%的湿度下保持1小时然后空气干燥6小时,使DNA探针可固定在载玻片上。所有探针以100pmol的浓度以250-275μm的间隔点样。为了评估固定效率,将载玻片使用SYBRO green II(Molecular Probe,Inc.,Leiden,Netherlands)染色。
实施例4:目标DNA的分离和扩增
从在下表2中列举的59种标准菌株中提取DNA。
[表2]59种标准菌株源
种类 | 革兰氏染色 | 来源 | 种类 | 革兰氏染色 | 来源 |
淋球菌 | - | ATCC10150 | 鲍氏不动杆菌 | - | KCTC2771 |
脑膜炎奈瑟球菌 | - | ATCC13100 | 啮蚀艾肯氏菌 | - | ATCC51724 |
嗜肺性军团病菌 | - | 临床分离 | 伊氏放线菌 | - | ATCC12102 |
单核细胞增多性李司忒氏菌 | + | ATCC700603 | 产琥珀酸厌氧螺菌 | - | ATCC29305 |
摩根氏菌 | - | ATCC25830 | 嗜水气单胞菌 | - | KCCM32586 |
普通拟杆菌 | - | KCCM11423KCCM8482 | 大肠杆菌 | - | ATCC25922 |
卵形拟杆菌 | - | ATCC8483 | 产气肠杆菌 | - | KCCM11783ATCC29751 |
多形拟杆菌 | - | ACTC5015 | 阴沟肠杆菌 | - | KCCM40044 |
脆弱拟杆菌 | - | ATCC25282 | 粪肠球菌 | + | ATCC19433 |
洋葱伯克霍尔德菌 | - | ATCC25416 | 屎肠球菌 | + | ATCC19434 |
粘膜炎布兰汉球菌 | - | KCCM4006ATCC43617 | 人苍白杆菌 | - | ATCC49188 |
创伤弧菌 | - | KCTC2962 | 人心杆菌 | - | ATCC14900 |
霍乱弧菌 | - | KCTC2715 | 白喉杆菌 | + | ATCC51696 |
肠炎沙门氏菌 | - | KCCM12021 | 食酸丛毛单胞菌 | - | ATCC9355 |
鼠伤寒沙门菌 | - | KCCM40253 | 肺炎杆菌 | - | AATCC700603 |
粘质沙雷菌 | - | KCTC1299 | 产酸克雷伯菌 | - | ATCC43863 |
华德萨特菌 | - | ATCC51579 | 脑膜脓毒性金黄杆菌 | - | ATCC13253 |
宋内志贺菌 | - | KCCM11903 | 艰难梭菌 | + | ATCC9689 |
弗氏志贺菌 | - | ATCC11836 | 多枝梭菌 | + | ATCC25582 |
铜绿假单胞菌 | - | KCTC1636 | 金氏金菌 | - | ATCC23330 |
金黄色葡萄球菌 | + | KCTC1621 | 大消化链球菌 | + | ATCC29328 |
表皮葡萄球菌 | + | KCTC1917 | 厌氧消化链球菌 | + | ATCC27337 |
粘滑口腔球菌 | + | ATCC17931 | 普氏消化链球菌 | + | KCTC3319 |
Sterntrophomonas maltophila | - | ATCC13637 | 牙龈卟啉单胞菌 | + | ATCC33277 |
变异链球菌 | + | KCCM11823 | 坏死梭杆菌 | - | ATCC25286 |
ATCC25175 | |||||
绿色链球菌 | + | ATCC35037 | 奇异变形杆菌 | - | KCCM11381 |
无乳链球菌 | + | KCCM11957 | 普通变形杆菌 | - | KCCM11539 |
化脓链球菌 | + | KCCM11817 | 嗜泡沫嗜血杆菌 | - | ATCC13252 |
肺炎链球菌 | + | KCCM40410 | 流感嗜血杆菌 | - | ATCC51907 |
弗氏柠檬酸杆菌 | - | ATCC51579 |
微生物样本在合适的培养基上生长并悬浮在200μL的无菌蒸馏水中。将悬液以14000rpm离心10分钟。弃去上层清液,得到小球。
对于革兰氏阴性菌,将小球加入到180μL的ATL溶液(组织裂解液,DNeasy Tissue Kit,QIAGEN)中。将20μL蛋白酶K加入到溶液中以溶解细胞。得到的溶解产物在55℃下培养1小时。将培养物涡流15秒并与200μL的AL溶液(裂解液,DNeasy Tissue Kit,QIAGEN)混合。得到的混合物在70℃下培养10分钟。将培养物与200μL的乙醇(100%)混合。将得到的溶液加载到安放在2mL管中的DNeasy迷你柱中并在8000rpm或更高的速度下离心1分钟。弃去在管中收集的溶液。将500μL的AW1溶液(洗液1,DNeasy Tissue Kit,Qiagen)吸入柱中然后8000rpm离心1分钟。弃去洗脱液并将500μl的AW2溶液(洗液n 2,DNeasy Tissue Kit,Qiagen)再次吸入柱中,然后1500rpm离心3分钟。将DNeasy膜干燥然后弃去洗脱物。将干燥的DNeasy迷你柱放在管中并在室温下放置15分钟,然后8000rpm离心1分钟以洗去基因组DNA。
对于革兰氏阳性菌,将小球悬浮在180μL的溶菌酶溶液(20mMTris-Cl,pH 8.0,2mM EDTA,1.2% Triton X-100,20mg/ml溶菌酶)中并在37℃下培养30分钟。将由此得到的培养物与25μL1的蛋白酶K和200μL的AL溶液(裂解液,DNeasy Tissue Kit,QIAGEN)混合。将得到的混合物在70℃下培养30分钟。并且以上面描述的同样的方式进行分离基因组DNA的后续步骤。
使用上述从标准菌株中分离的DNA作为模板并使用如下引物进行PCR。在进行PCR时与探针结合的DNA通过使用具有连接在其5’端的Cy3的反向引物的扩增来检查,所述引物使用荧光物质标记以便检测。下面的三对引物同时用于PCR反应:
引物1-S(正义):P-TTGTACACACCGCCCGTC(序列号:9,1585Fw)
引物1-A(反义):Cy3-TTTCGCCTTTCCCTCACGGTACT(序列号:10,23BR);
引物2-S(正义):P-AGTACCGTGAGGGAAAGGCGAA(序列号:11,23BFw)
引物2-A(反义):Cy3-TGCTTCTAAGCCAACATCCT(序列号:12,MS37R);
引物3-S(正义):P-AGGATGTTGGCTTAGAAGCA(序列号:13,MS37F)和引物3-A(反义):Cy3-CCCGACAAGGAATTTCGCTACCTT(序列号:14,MS38R)
上面的序列的5’末端的“P”表示磷酸基团并且“Cy3”表示荧光物质Cy3。
PCR反应如下进行:含有5μL的10X PCR缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.3),500mM KCl,15mM MgCl2),1μL的dNTP混合物(dATP,dGTP,dCTP和dTTP各10mM),1μL的10pmol正向引物,1μL的10pmol反向引物,1μL的1/10-稀释的DNA模板(100ng)和0.2μL的Taq聚合酶(5单位/μL,Solgent Co.,Korea)的PCR混合物加入蒸馏水至终体积为50μL。在下列条件下进行PCR:在94℃下第一次变性5分钟,10个循环的94℃下第二次变性50秒,56℃下退火50秒并72℃延伸70秒,和20个循环的94℃下第三次变性50秒,58℃下退火50秒并72℃延伸70秒,接着72℃下5分钟的一个最终延伸。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳确认。分析显示合成了每种菌株的双链DNA。
使用PCR纯化试剂盒(Qiagen,Co.)纯化扩增的DNA产物以加入1μL的Lamda核酸外切酶(New England Biolabs,Inc.,Netherlands),然后在37℃下反应1小时,从而得到单链DNA。Lamda核酸外切酶是通过选择性消化降解具有连接在其5’末端的磷酸基团的DNA链的酶。因此,使用具有连接在其5’端的磷酸基团的正向引物的PCR导致DNA链具有磷酸基团,其被Lamda核酸外切酶处理以降解为具有与其连接的磷酸基团的双链DNA,从而得到具有连接在其5’末端的荧光物质Cy3的剩余单链。
实施例5:杂交和洗涤
为了确定候选探针的特异性和灵敏性,通过将在上述实施例4中制备的PCR产物应用到在上述实施例3中制备的候选探针固定在其上的DNA芯片上进行杂交。如果候选探针显示对于其物种的阳性杂交信号,则其被另外检测与来自上面58种菌株的基因组DNA的交叉反应(特异性)。
将DNA芯片以水蒸气水合然后浸入70%乙醇中以除去没有固定在DNA芯片的载玻片上的任何探针。在杂交反应过程中,荧光可通过连接到载玻片表面上的醛基而导致杂交信号的增强,因而相应地降低了固定在芯片上的特异探针的杂交信号。为了防止杂交信号的任何降低,将DNA芯片转移到封闭液(1.3g NaBH4,375mLPBS,125mL 100%乙醇)中然后摇动5分钟。将DNA芯片使用0.2% SDS洗涤5分钟然后以无菌水洗涤5次,每次1分钟。将DNA芯片在1500rpm下离心3分钟以除去载玻片上的水分。
将在实施例4中扩增的50μL的DNA片段与6X SSPE杂交缓冲液(20X SSPE:3M NaCl,0.2M NaH2PO4-H2O,0.02M EDTA,pH 7.4;20%(v/v)甲酰胺,Sigma Co.,St.Louis,MO)混合至最终体积为200μL。将得到的混合物溶液施加到探针固定于其上的载玻片上并以探针夹应力密封培育室(Sigma Co.,St.Louis,MO)覆盖。
在杂交室中加入湿组织以防止杂交过程中载玻片周围脱水,然后在静态培养箱中在30℃反应8小时以上以诱导互补结合。杂交完成后,使用3X SSPE(0.45M NaCl,15mM C6HsNa3O7,pH 7.0)然后使用1X SSPE(0.15M NaCl,5mM C6HsNa3O7,pH 7.0)洗涤载玻片,分别洗涤5分钟。载玻片表面上的剩余湿气通过离心除去(15,000rpm 3分钟)。
实施例6:杂交体的检测
使用Arrayworks微阵列扫描仪(ArrayWorks,Applied Precision,Inc.,USA)进行杂交体检测。杂交结果在下表3中列出。
表3
实施例7:盲试验
对于金黄色葡萄球菌的盲实验使用在实施例3中构建的DNA芯片进行。设计用于盲试验的DNA芯片在图1A和2A中示出,其中标记指的是上表1中列举的探针。标记“M”指的是与下列序列对应的位置标记物:氨基3′-AAAAAAAAAAAAAAA-5′-FITC。空白指的是与探针溶解于其中的缓冲液(3X SSC)对应的阴性对照。
六十四位感染了病原体的患者参加盲试验。样品通过培养1天后得到。从患者收集的感染样品通过培养方法确认。
将基因组DNA从培养样品中的分离如下。对于体液样品来说,在EDTA管或者光滑管中收集10mL体液。当样品量超过10mL时,将其在5000rpm下离心15分钟。当样品量少于10mL时,将其在14000rpm下离心15分钟并将由此形成的沉淀收集在1.5mL管中。将体液样品悬浮在180μL溶菌酶溶液(20mM Tris-Cl,pH 8.0,2mM EDTA,1.2%TritonX-100,20mg/mL溶菌酶)中。将得到的悬浮液在37℃下培养30分钟。
将培养物与20μL蛋白酶K和200μLAL溶液(裂解液,QIAamp DNABlood Mini Kit,QIAGEN)温和地混合。将混合物在55℃下培养2小时然后在95℃下培养10分钟。将培养物与200μL100%乙醇混合。
将得到的溶液加载到安放在2mL管中的QIAamp旋转柱上并8000rpm离心1分钟。弃去收集在管中的溶液。将500μL AW1溶液(洗液1,QIAamp DNA Blood Mini Kit,Qiagen)吸入到柱中,然后将柱8000rpm离心1分钟。弃去洗脱物并将500μL AW2溶液(洗液2,QIAamp DNA BloodMini Kit,Qiagen)再次吸入柱中,然后将柱14000rpm离心1分钟。弃去洗脱物并将QiAamp旋转柱转移到1.5mL管中。
将300μLAE溶液(洗脱液,DNA Blood Mini Kit,QIAGEN)置于管中并在室温下静置15分钟,然后8000rpm离心3分钟。将洗脱的基因组DNA与750μL 100%乙醇混合并在-20℃静置1小时。将混合物在14000rpm离心20分钟。弃去含乙醇的上层清液并且将残留物干燥。由此得到的小球溶解在20μL无菌蒸馏水中并浓缩。
对于血液样品,将10mL血液置于EDTA管中并在4℃下1800rpm离心10分钟。将血浆层转移到1.5mL管中并14000rpm离心10分钟。将得到的沉淀转移到1.5mL管中,并且以与上面描述的相同方式进行分离基因组DNA的后续步骤。
用于扩增、杂交、洗涤和杂交体检测的步骤按照与上面实施例4和5中描述的相同方式进行。结果在下表4中显示,其中分母为样品应用的数目,分子为出现杂交信号的数目。
表4
血液 | 脑脊髓液 | 脓 | 唾液 | 尿液 | |
金黄色葡萄球菌 | 20/22 | 4/4 | 24/24 | 13/13 | 1/1 |
图1B和图2B显示了分别由Scanarray 5000测定的含有金黄色葡萄球菌的盲样品中图1A和2B的DNA芯片上的杂交结果。
工业实用性
如上面详细描述的那样,本发明提供了用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的DNA芯片,来自金黄色葡萄球菌的23S rRNA基因的寡核苷酸被固定于所述芯片上,并且本发明提供了包括所述寡核苷酸的用于检测并鉴金黄色葡萄球菌的核酸探针。与常规细菌培养方法相比,根据本发明的DNA芯片的应用能够节约时间并精确地诊断细菌感染。
虽然已经参照具体特征对本发明进行了详细描述,但对本领域技术人员来说显而易见的是,本说明书仅仅是为了描述优选的实施方式,而不是限制本发明的范围。因此,本发明的实际范围将由所附权利要求及其等同物来限定。本领域技术人员还应当理解,对这些实施方式的改变和修改都不偏离本发明的精神和范围。
序列表
FP09KR859.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>株式会社美迪基尼斯
<120>用于金黄色葡萄球菌检测的DNA芯片
<130>PP-B0375
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>1
aggacgacat tagac 15
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>2
caaaggacga cattagacga 20
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>3
cgaagcgtgc gattg 15
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>4
aggcgaagcg tgcgattgga 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>5
tggattgcac gtctaagcag 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
FP09KR859.ST25
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>6
caaatccggt actcgttaag 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>7
gagtcttcga gtcgttgatt 20
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>8
tcttcgagtc gttga 15
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>9
ttgtacacac cgcccgtc 18
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>10
tttcgccttt ccctcacggt act 23
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<220>
<223>primer
<400>11
agtaccgtga gggaaaggcg aa 22
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FP09KR859.ST25
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tgcttctaag ccaacatcct 20
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aggatgttgg cttagaagca 20
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<220>
<223>primer
<400>14
cccgacaagg aatttcgcta cctt 24
Claims (3)
1.用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的探针,其特征在于,包括一个或多个选自具有核苷酸序列序列号:1-8的寡核苷酸组的寡核苷酸。
2.用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的DNA芯片,其特征在于,权利要求1所述的探针固定在其基板上。
3.根据权利要求2所述的用于检测并鉴定金黄色葡萄球菌的DNA芯片,其特征在于,具有核苷酸序列序列号:1-8的所有寡核苷酸都被固定在基板上。
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