ES2284021T3 - Procedimiento rapido para detectar microorganismos en muestras de alimentos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para determinar la presencia de microorganismos en una muestra, que comprende las etapas de: (a) capturar dichos microorganismos, si están presentes, (b) extraer ácidos nucleicos de dichos microorganismos, comprendiendo dichos ácidos nucleicos ácidos nucleicos diana, (c) realizar una reacción de detección de ligasa (LDR) en dichos ácidos nucleicos diana.
Description
Procedimiento rápido para detectar
microorganismos en muestras de alimentos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento rápido y eficaz para determinar la presencia de
microorganismos en una muestra de alimento.
En la cadena de fabricación de productos
alimentarios, incluyendo productos lácteos, bebidas y cervezas, el
control y la monitorización microbiológica son de vital importancia
para confirmar la seguridad y la calidad de las bebidas y los
productos lácteos. Las mismas consideraciones se aplican para la
calidad del agua. Por tanto, la detección, identificación y
caracterización de microorganismos son una meta importante en la
microbiología analítica y alimentaria, además del control del
agua.
En muchos laboratorios e institutos de
investigación se están desarrollando nuevos procedimientos de prueba
para detectar o examinar microorganismos (McCabe y col., 1999,
Mol Genet Met 66: 205-211; Cockerill y
Thomas, 2002, ASM News 68 número 2:
77-83).
En estos desarrollos se ha puesto énfasis en
alternativas para las diversas etapas/procedimientos de incubación
e incubación previa con el fin de ahorrar tiempo. Muchos
procedimientos nuevos, por ejemplo PCR en tiempo real usando un
ciclador de luz (Roche Diagnostics Corp. Basilea, Suiza), reducirán
el tiempo total de examen de cinco días a un día, pero se necesitan
procedimientos más rápidos y especialmente procedimientos más
selectivos y de discriminación para el tipo de microorganismo
objeto de investigación.
En particular, la industria alimentaria se
encuentra con el problema de detectar e identificar mínimas
cantidades de microorganismos contaminantes en grandes cantidades
de producto que va a procesarse para el consumo. Es un requisito
esencial que los microorganismos contaminantes deban detectarse e
identificarse rápidamente en vista de las grandes cantidades de
productos y sus costes asociados. Obviamente, los contaminantes
deben detectarse preferentemente antes de que el producto haya
alcanzado el usuario final. Preferentemente, los flujos de producto
deben monitorizarse continuamente. Por tanto, es otra meta
proporcionar pruebas de detección económicas. Las micromatrices son
muy eficaces y fidedignas, pero generalmente representan un gran
coste de monitorización. Por tanto se necesitan micromatrices
versátiles que puedan usarse para diferentes pruebas y con un bajo
coste por micromatriz y/o prueba.
La detección, identificación y caracterización
de microbios es una meta importante en la microbiología analítica.
Las técnicas independientes del cultivo representan un medio rápido
y flexible para estudiar comunidades bacterianas. La estrategia más
completa para caracterizar poblaciones microbianas consiste
probablemente en la secuenciación de clones de ADNr 16S - 23S y la
reconstrucción filogenética (Weissburg y col., 1991, J.
Bacteriol. 173: 697-703; Anthony y col.,
2000, J.Clin.Microbiol: 38: 781-788).
El empleo de sondas de ácido nucleico específicas para grupos
complementarias a ARNr 16S o 23S ha proporcionado un marco para
estudiar poblaciones microbianas en sistemas complejos. Los
microorganismos eucariotas, tales como levaduras y hongos, pueden
identificarse de un modo similar, por ejemplo caracterizando el
ARNr 18S y 28S.
Sin embargo, el ARN es notoriamente inestable.
Como consecuencia, deben tomarse extremadas medidas de calidad para
conservar las características del ARN.
Por otra parte, el ADN se considera más estable.
Además, la hibridación de ADN-ADN genómico completo
ha sido una piedra angular de la determinación de especies
microbianas. Sin embargo, la hibridación de ADN-ADN
genómico completo no se usa ampliamente debido a que no está
fácilmente implementada.
Varios cientos de diferentes especies pueden
considerarse como un microorganismo contaminante. Es de importancia
fundamental identificar con precisión el microorganismo
contaminante.
La presente invención está dirigida a
proporcionar un procedimiento específico para efectuar la
identificación rápida y específica de microorganismos contaminantes
en grandes cantidades de comestibles. La invención está dirigida
además al uso de filtros y micromatrices en dicho procedimiento,
además de un kit para determinar la presencia de microorganismos en
una muestra.
La presente invención se refiere a un
procedimiento específico que efectúa la identificación rápida y
específica de microorganismos contaminantes en grandes cantidades
de comestibles. Se ha desarrollado un procedimiento basado en la
detección de secuencias de nucleótidos específicas para especies y/o
específicas para cepas que se identifican y se amplifican
específicamente y posteriormente se detectan en una micromatriz
usando tecnología de oligonucleótidos Zipcode direccionables y de
micromatrices de ADN.
La presente invención se refiere a
procedimientos para reunir e identificar microorganismos
contaminantes en comestibles y en el control de agua.
En particular, la presente invención se refiere
a un procedimiento para determinar la presencia de microorganismos
en una muestra, que comprende las etapas de:
(a) capturar dichos microorganismos, si están
presentes,
(b) extraer ácidos nucleicos de dichos
microorganismos, comprendiendo dichos ácidos nucleicos ácidos
nucleicos diana,
(c) realizar una reacción de detección de ligasa
(LDR) en dichos ácidos nucleicos diana, que comprende:
- (c1)
- proporcionar un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácido nucleico, comprendiendo dicha primera sonda de ácido nucleico una secuencia I específica para diana localizada en 3’ complementaria a una parte bien diferenciada de dicho ácido nucleico diana y comprendiendo dicha segunda sonda de ácido nucleico una secuencia II específica para diana localizada en 5’ complementaria a una segunda parte de dicho ácido nucleico diana localizado esencialmente adyacente a y en 3’ de dicha secuencia I específica para diana, en el que dicha primera sonda de ácido nucleico comprende además una sección I de unión del cebador localizada en 5’ (PBS(I)) y posiblemente un relleno, y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una sección II de unión del cebador localizada en 3’ (PBS(II)) y posiblemente un relleno, y opcionalmente en el que la primera sonda de ácido nucleico y/o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además una región que es (i) esencialmente complementaria a una región correspondiente de una sonda de captura en una micromatriz y (ii) esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleico diana (ZipComcode), y que está localizada entre la secuencia específica para diana y la sección de unión del cebador;
- (c2)
- incubar dicho ácido nucleico diana con dicha primera sonda de ácido nucleico y dicha segunda sonda de ácido nucleico en condiciones que permitan la hibridación de ácidos nucleicos complementarios,
- (c3)
- conectar cualquier sonda esencialmente adyacente, y
- (c4)
- amplificar cualquier ácido nucleico sonda conectado, en el que la amplificación se inicia mediante la unión de cebador de ácido nucleico específico para una sección de unión del cebador, proporcionándose así ácidos nucleicos diana amplificados,
(d) hibridar los ácidos nucleicos diana
amplificados de la etapa (c) con una sonda de captura que está
presente en una micromatriz de flujo, y opcionalmente comprende una
región esencialmente complementaria al ZipComcode (Zipcode), y
(e) detectar los ácidos nucleicos diana
hibridados de la etapa (d), en los que se determina la presencia de
un microorganismo.
En la presente memoria descriptiva y las
reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un",
"una", "el" y "la" incluyen las referencias en
plural, y viceversa, a menos que el contexto indique claramente lo
contrario. A menos que se defina lo contrario, todos los térmicos
técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo
significado que normalmente entiende un experto en la materia.
En general se tomará una muestra o espécimen
como una parte de algo que se ha producido, por ejemplo comestibles,
productos lácteos, bebidas y cerveza, presentado para la inspección
o mostrado como evidencia de la calidad del todo.
El presente procedimiento puede aplicarse a los
microorganismos que son conocidos por contaminar comestibles,
productos lácteos, cerveza y otras bebidas, por ejemplo los
microorganismos presentados en la tabla 1. Como tal, la presente
invención se refiere a un procedimiento para determinar la presencia
de microorganismos en una muestra, que comprende las etapas de
reunir dichos microorganismos, si están presentes, extraer ácidos
nucleicos de dichos microorganismos, específicamente amplificar
dichos ácidos nucleicos, y analizar los ácidos nucleicos
amplificados, en los que se determina la presencia de dichos
microorganismos. Además, la presente invención se refiere a un
procedimiento para determinar la presencia de microorganismos en una
muestra, que comprende las etapas de reunir dichos microorganismos,
si están presentes, extraer ácidos nucleicos de dichos
microorganismos y analizar los ácidos nucleicos, en los que se
determina la presencia de dichos microorganismos.
Como será evidente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicho microorganismo se selecciona del grupo constituido por
microorganismos eucariotas y/o procariotas, además de virus. El
microorganismo puede seleccionarse del grupo que comprende algas,
arqueas, bacterias, virus, nematodos, protozoos, microsporas y
hongos, incluyendo levaduras, mohos y micorrizas.
Similarmente, se apreciará que la presente
invención se refiera a un procedimiento como se describe en este
documento, en el que dicho microorganismo se selecciona del grupo
constituido por microorganismos de origen alimentario y que se
transmiten por el agua.
A este respecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicho microorganismo se selecciona del grupo de bacterias
constituido por Escherichia, Salmonella, Shigella,
Mycobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Listeria, Leuconostoc,
Bacillus, Staphylococcus, Clostridium, Vibrio, Enterococcus,
Enterobacter, Yersinia, Legionella, Campylobacter, Streptococcus,
Micrococcus, Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes,
Microbacterium, Acinetobacter y Enterobacteriaceae/coliformes y
de los mohos Aspergillus, Neurospora, Geotrichum, Blakeslea,
Penicillium, Rhizomucor, Rhizopus y Trichoderma, y de las
levaduras Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Rhodotorula,
Torulopsis, Trichosporon y Saccharomyces. Además, la
presente invención se refiere a un procedimiento como se describe en
este documento, en el que dicho microorganismo se selecciona del
grupo constituido por una (sub)especie del género
Escherichia, Salmonella, Shigella, Mycobacterium, Lactobacillus,
Lactococcus, Listeria, Leuconostoc, Bacillus, Staphylococcus,
Clostridium, Vibrio, Enterococcus, Enterobacter, Yersinia,
Legionella, Campylobacter, Micrococcus, Pseudomonas, Flavobacterium,
Alcaligenes, Microbacterium, Acinetobacter,
Enterobacteriaceae/coliformes y Streptococcus, y de los
mohos Aspergillus, Neurospora, Geotrichum, Blakeslea,
Penicillium, Rhizomucor, Rhizopus y Trichoderma, y de las
levaduras Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Rhodotorula,
Torulopsis, Trichosporon y Saccharomyces, por ejemplo
como se explica en la tabla 1.
Con el fin de aumentar la cantidad de
microorganismos presentes en una muestra, dichos microorganismos, si
están presentes, pueden cultivarse en medios. Por consiguiente, la
presente invención se refiere a un procedimiento como se describe
en este documento, en el que dicho procedimiento, por ejemplo la
etapa (a) de antes, va precedido de un enriquecimiento de
microorganismos, que comprende (i) crecimiento de dichos
microorganismos en medios selectivos, o (ii) crecimiento de dichos
microorganismos en medios no selectivos. El crecimiento de dichos
microorganismos en medios selectivos favorecerá preferentemente el
crecimiento de los microorganismos de interés, mientras que el
crecimiento en medios no selectivos mantendrá el crecimiento de la
mayoría de los microorganismos, por ejemplo, que no favorecen
especialmente el crecimiento de un microorganismo particular.
Las técnicas de laboratorio habituales para
reunir microorganismos en grandes cantidades de disoluciones o
materiales sólidos llevan tiempo. Con el fin de salvar esta etapa de
enriquecimiento previo que lleva tiempo según técnicas de
laboratorio habituales, tales como las defendidas por AOAC
(Asociación de Comunidades Analíticas), la presente invención reúne
inmediatamente el microorganismo contaminante concentrándolo. Por
consiguiente, la presente invención se refiere a un procedimiento
como se describe en este documento, en el que dicho procedimiento,
por ejemplo la etapa (a) de antes, va precedido de un
enriquecimiento de microorganismos, que comprende concentrar los
microorganismos. Dicha reunión y captura pueden realizarse por medio
de centrifugación, filtración, tal como filtración de una
disolución acuosa o líquida en la que van a capturarse todas las
partículas mayores del tamaño de tamizado, sedimentación, fuerzas
electrostáticas, coagulación, floculación, captura de
microorganismos por anticuerpos y/o captura de microorganismos por
ligandos.
Además, el procedimiento según la presente
invención puede aplicar microfiltración para reunir o capturar los
microorganismos contaminantes, por ejemplo el procedimiento de
selección microanalítica (MAS). La meta final en la microfiltración
en membrana es lograr una baja resistencia al flujo, una alta
resistencia química y una distribución de tamaños de poros bien
controlada de los filtros de membrana con el fin de obtener un alto
flujo operacional, largos tiempos de permanencia (por ejemplo una
larga vida/tiempo de funcionamiento del microtamiz) y buen
comportamiento de separación. Preferentemente, los filtros de
microtamiz según la presente invención se caracterizan por finas
capas de membrana con poros uniformemente dimensionados. Para la
mayoría de las aplicaciones, la capa de membrana se sujeta por un
soporte. Un microtamiz que tiene una capa de filtración o tamizado
relativamente fina con una alta densidad de poros y una estrecha
distribución de tamaños de poro sobre un soporte macroporoso
mostrará un comportamiento de separación de satisfactorio a bueno o
incluso excelente y una alta velocidad de flujo. En suspensiones
muy diluidas será importante tener una rápida determinación del
tipo y concentración de partículas, tales como por ejemplo zumos de
frutas contaminados con microorganismos. La baja resistencia al
flujo del microtamiz permite que una gran cantidad de líquido pase a
través del filtro en una pequeña cantidad de tiempo, en el que los
microorganismos contaminantes (si están presentes) se concentran en
una superficie muy pequeña (20 - 100 mm^{2}). Esta rápida
concentración de los mi-
croorganismos contaminantes ayuda en la simplificación y la calidad del posterior análisis de estos microorganismos.
croorganismos contaminantes ayuda en la simplificación y la calidad del posterior análisis de estos microorganismos.
En este aspecto, la presente invención se
refiere a microfiltración de flujo cruzado como se describe por
Daufin y col. (2001), (Daufin y col. (2001) Trans IchemE, 79:
89-102). La microfiltración de flujo cruzado puede
usarse para la eliminación de micropartículas tales como
microorganismos contaminantes de cualquier fluido diferente. Por
consiguiente, la microfiltración de flujo cruzado puede aplicarse
industrialmente en alimentos, agua y procedimientos biológicos.
Por tanto, la presente invención aplica una
nueva tecnología de microfiltración que se ha descrito por la
solicitud de patente WO02/43937 (por Aquamarijn Holding Ltd.).
Además, la presente invención aplica una nueva tecnología de
microfiltración que ha sido desarrollado por CEPAration B.V.
(Helmond, los Países Bajos). CEPAration produce y desarrolla
membranas y módulos cerámicos de fibra hueca para aplicaciones que
varían desde la microfiltración hasta la separación de gases a alta
temperatura. Estos productos combinan las ventajas de las membranas
de fibra hueca polimérica con las propiedades excepcionales y
duraderas de membranas cerámicas. CEPAration tiene su emplazamiento
de producción y desarrollo en Helmond, los Países Bajos
(http://www.ceparation.com).
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicha filtración se realiza usando un filtro Aquamarijn®
filtro o un filtro CEPAration®. Por ejemplo, puede usarse nitruro
de silicio como membrana, y silicio como soporte, o el filtro puede
comprender una membrana cerámica de fibra hueca. El tamaño de poros
puede estar, por ejemplo, entre 0,5 y 1,2 micrómetros o entre 0,15
y 1,4 micró-
metros.
metros.
Se entenderá que la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicha concentración va seguida de la separación de los
microorganismos del resto de la muestra. Además, la concentración y
separación pueden realizarse simultáneamente.
Puede usarse una amplia variedad de técnicas de
coloración y/o teñido con el fin de mejorar el reconocimiento de
los microorganismos en la superficie del microtamiz. Los
microtamices son preferentemente inertes, lo que hace posible el
uso de todos los agentes y productos químicos de tinción sin colorar
o atacar la superficie del microtamiz. Dicho microtamiz pueden
usarse de nuevo.
El procedimiento de selección microanalítica
(MAS) presentado también puede aplicarse para el control de calidad
del agua en general y del agua potable en particular en la presencia
de microorganismos contaminantes, tales como por ejemplo
Cryptosporidium, Escherichia coli y Legionella. En la
industria cárnica también puede aplicarse el procedimiento MAS para
seguir microorganismos contaminantes, tales como por ejemplo
contaminaciones de Campylobacter y Salmonella.
Con el fin de caracterizar el microorganismo
contaminante, la presente invención puede emplear técnicas conocidas
para identificar el ácido nucleico del microorganismo en cuestión.
La presente invención se refiere preferentemente a la técnica de
amplificación múltiplex y de marcado descrita más adelante.
El término "ácido nucleico" como se usa en
este documento significa un polímero compuesto de nucleótidos, por
ejemplo desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Los términos
"ácido ribonucleico" y "ARN" como se usa en este
documento significan un polímero compuesto de ribonucleótidos. Los
términos "ácido desoxirribonucleico" y "ADN" como se usan
en este documento significan un polímero compuesto de
desoxirribonucleótidos. Los términos "oligonucleótido",
"cebador" y "sonda" como se usan en este documento denotan
multímeros de nucleótidos de cadenas sencillas de aproximadamente
10 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. El término
"polinucleótido" como se usa en este documento se refiere a
polímeros de cadenas sencillas o dobles compuestos de monómeros de
nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos
de longitud, normalmente de más de aproximadamente 100 nucleótidos
de longitud hasta aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud.
Se entenderá que la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dichos ácidos nucleicos se eligen del grupo constituido por
ADN, ARNr, ARNt, ARNm, ARN completo y ARNtm (naturaleza dual
similar a ARNt y ARNm; también conocido como ARN 10Sa o SsrA).
Con el fin de caracterizar el ácido nucleico de
un microorganismo contaminante, es decir, el ácido nucleico diana,
dicho ácido nucleico se aísla normalmente del microorganismo
contaminante después de que dicho organismo haya sido recogido o
capturado. En general, el aislamiento de ácidos nucleicos de
microorganismos requiere como una de las primeras etapas la lisis
de dicho microorganismo. Será aparente que las estrategias
lisogénicas celulares empleadas dependen de la naturaleza de los
microorganismos contaminantes. En general puede usarse un
tratamiento con una lisozima, un pectinolítico o un tratamiento
mecánico tal como sonicación o un molino de perlas para lisar las
células. Un procedimiento tradicional es la inyección directa de
muestras bacterianas en una disolución de fenol caliente, tal como
se describe por Selinger y col. (2000, Nature Biotechnol.
18, 1262-1268). Alternativamente, las
células pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y
romperse mecánicamente antes del aislamiento con una disolución
ácida de fenol. Los procedimientos clásicos para aislar ácidos
nucleicos que se refieren a combinaciones de degradación
enzimática, extracción orgánica y precipitación en alcohol y/o
sales son muy conocidos en la técnica y contemplados por la presente
invención. En este aspecto, las técnicas para aislar ácidos
ribonucleicos se describen en Current Protocols in Molecular
Biology, Wiley & Co, EE.UU. La presente invención también
se refiere a una rápida purificación a pequeña escala de ADN y ARN
de muestras clínicas. Este último procedimiento puede basarse en el
lisado y las propiedades de inactivación de nucleasas del agente
caotrópico tiocianato de guanidinio (GuSCN) y las propiedades de
unión a ácido nucleico de partículas de sílice o diatomeas en
presencia de este agente, tal como se describe por Boom y col.
(1999; J. Clin. Microbiol. 37: 615-619).
La mayoría de las especies de ARNm microbiano
sólo tienen una semivida de minutos, principalmente debido a la
actividad de RNasas. Por tanto, la velocidad requerida para
estabilizar la población de ARN, es decir, para detener o disminuir
la degradación de ARN, es crucial. En este respecto pueden emplearse
diversos inhibidores de actividad de la ribonucleasa tales como,
por ejemplo, dietilpirocarbonato, ácido aurintricarboxílico, etc.,
en procedimientos de aislamiento de ARN, y pertenecen al
conocimiento general común respecto al aislamiento de ARN, y se
incorporan en este documento. La lisis de dicho microorganismo
contaminante puede realizarse antes o después de estabilizar la
población de ácido nucleico. La presente invención también se
refiere a una disolución de parada que contiene etanol y fenol,
como se ha descrito para el aislamiento de ARN completo de E.
coli (Ye y col., 2001, J. Microbiol. Procedures 47,
257-272). Esta disolución de parada puede usarse
satisfactoriamente para otras bacterias
gram-negativas. Además, la presente invención
contempla el uso de la disolución RNAlater® (Ambion y Qiagen). La
principal ventaja de esta última disolución es la rápida
estabilización de la población de ARNm, permitiendo que las
muestras se guarden durante un largo periodo de tiempo en
condiciones apropiadas antes del aislamiento de ARN. Es
especialmente útil para la reunión de muestras cuando no es posible
el aislamiento inmediato de ARN.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicha etapa de extraer ácidos nucleicos de dichos
microorganismos comprende lisar los microorganismos.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
procedimiento como se describe en este documento, que comprende
además inactivar RNAsas.
Puede usarse una etapa de enriquecimiento debido
a que la mayoría de los ARNm de bacterias no tienen una cola de
poli A+ y por tanto son difíciles de separar del ARN completo. La
presente invención se refiere a una etapa de enriquecimiento para
ARNm mediante eliminación del ARN ribosómico como se describe por
Affymetrix (http://www.affymetrix.com/index.affx). Además, la
presente invención incorpora un procedimiento para aislar ARNm de
E. coli mediante poliadenilación en extractos de células
brutas con polimerasa I de poli A+ de E. coli y purificación
mediante cromatografía en oligo-dT como se describe
por Wendisch y col. (Wendisch y col. (2001) Anal. Biochem.
290: 205 - 213).
Están disponibles una variedad de kits de
aislamiento de ARN de diferentes fuentes comerciales, por ejemplo
de Ambion, Qiagen, Sigma-Aldrich y otras, que pueden
usarse satisfactoriamente en el procedimiento de la presente
invención.
Como se describe anteriormente para el
aislamiento de ARN, en el aislamiento de ADN el procedimiento para
lisar el microorganismo depende del tipo de microorganismo, por
ejemplo mohos, hongos, levaduras, bacterias
gram-negativas o gram-positivas. En
este aspecto, las técnicas para aislar ADN se describen en
Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Co,
EE.UU. Un procedimiento conveniente es sumergir las células en agua
en ebullición. Por ejemplo, en el caso de organismos
gram-positivos, tales como Lactobacillus, las
células pueden suspenderse en un tampón, tal como tampón STE (NaCl
100 mM, Tris-HCl 50 mM, EDTA de sodio 10 mM, pH 7,5)
e incubarse a 37ºC con lisozima (por ejemplo 10 mg/ml) durante un
espacio de tiempo apropiado, por ejemplo 15 minutos. En el caso de
organismos gram-negativos, tales como por ejemplo
Salmonella, el ADN genómico de las muestras puede extraerse
y purificarse usando puntas Genomic (Qiagen) usando un conjunto
Genomic DNA buffer (Qiagen). En el caso de mohos o hongos, tales
como por ejemplo Aspergillus, las células pueden suspenderse
en tampón OM y tratarse con un pectinolítico, por ejemplo Glucanex®
(Novozymes, Dinamarca). Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en el
que dicho lisado se elige del grupo constituido por un tratamiento
con una lisozima, un pectinolítico o tiocianato de guanidinio, o
mediante un tratamiento mecánico tal como sonicación o el uso de un
molino de perlas, inyectando los microorganismos en fenol caliente,
y congelación ultrarrápida de los microorganismos en nitrógeno
líquido seguido por un tratamiento mecánico.
Están disponibles una variedad de kits de
aislamiento de ADN genómico de diferentes fuentes comerciales, por
ejemplo de Gentra, Promega, Qiagen y otras, que pueden usarse
satisfactoriamente en los procedimientos de la presente
invención.
La concentración del ácido nucleico aislado
puede estimarse mediante espectrofotometría a 260 nm.
Después de aislar los ácidos nucleicos de los
microorganismos contaminantes, dichos ácidos nucleicos tienen que
analizarse. En general sólo están presentes cantidades mínimas de
microorganismos contaminantes. Por tanto pueden amplificarse los
ácidos nucleicos aislados o una parte específica de los mismos, es
decir, el ácido nucleico diana. En caso de que el ácido nucleico
diana sea ARN, dicho ARN puede convertirse en primer lugar en ADNc
antes del análisis. Se entenderá que los términos "ácidos
nucleicos amplificados" y "mezcla de ácidos nucleicos
amplificados" como se usan a lo largo de la invención tienen
esencialmente el mismo significado.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
procedimiento como se describe en este documento, en el que dicho
ácido nucleico es ARNr, ARNt, ARNm, ARN completo o ARNtm y en el que
dicho ARNr, ARNt, ARNm, ARN completo o ARNtm se convierte en ADNc,
por ejemplo, mediante la actividad de una transcriptasa inversa,
como es muy conocido en la técnica.
El experto en la materia conoce diversas
técnicas para amplificar ADN y/o ADNc. Todas estas técnicas están
contempladas por la presente invención. Por consiguiente, la
presente invención se refiere a un procedimiento como se describe
en este documento, en el que dicho ácido nucleico es ADN y/o ADNc, y
en el que dicho ADN y/o ADNc se amplifica usando una técnica de
amplificación tal como bDNA, captura híbrida, SDA, TMA, PCR, LCR,
TAS, 3SR, NASBA y amplificación de Q\beta, como se explica en
Versalovic y Lupski 2002, Trends Microbiology 10:
S15-S21.
La presente invención contempla especialmente
amplificación múltiplex, tal como PCR múltiplex. La amplificación
múltiplex, tal como PCR múltiplex, permite la amplificación y, por
tanto, el análisis de dos o más dianas simultáneamente. Esta
técnica de amplificación se usa para selección genética, análisis de
microsatélites y otras aplicaciones en las que es necesario
amplificar varios productos en una única reacción. Mediante
experimentación rutinaria, el experto en la materia podrá optimizar
las condiciones de reacción en vista de que tiene múltiples pares
de cebadores en una única reacción que pueden aumentar la
probabilidad de dímeros de cebadores y otros productos no
específicos que pueden interferir con la amplificación de productos
específicos. Además, las concentraciones de pares de cebadores
individuales frecuentemente necesitan optimizarse ya que
frecuentemente se amplifican diferentes amplicones múltiplex con
diferentes eficiencias, y múltiples pares de cebadores pueden
competir entre sí en la reacción. El experto en la materia hará
consideraciones similares y optimizará las condiciones para las
otras técnicas de amplificación anteriormente descritas para
amplificaciones múltiplex, es decir, amplificación de más de una
diana.
Además, la presente invención se refiere a la
amplificación directa de ARN, tal como por ejemplo mediante un
procedimiento de Tyras modificado, en el que se usa un cebador/sonda
que comprende un sitio de reconocimiento por la ARN polimerasa y
sitio de reconocimiento complementario al ácido nucleico diana.
Después de aislar el ácido nucleico diana, las
sondas y/o cebadores se hibridan con dicho ácido nucleico diana.
Los cebadores pueden usarse para amplificar dicho ácido nucleico
diana. Alternativamente, las sondas pueden ligarse y pueden
amplificarse con cebadores que reconocen específicamente regiones
sobre dichas sondas (véase más adelante). Las sondas y/o cebadores
pueden marcarse. Por tanto, la marca puede incorporarse durante la
etapa de amplificación o unirse después de la amplificación. Por
consiguiente, la presente invención se refiere a un procedimiento
como se describe en este documento, en el que el ácido nucleico
amplificado se marca. Prácticamente cualquier marca que produce una
señal detectable, cuantificable y que puede unirse al ácido nucleico
amplificado puede usarse conjuntamente con los procedimientos y
matrices de la invención (véase más adelante). Marcas adecuadas
incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, radioisótopos,
fluoróforos, cromóforos, restos quimioluminiscentes, etc. En
realizaciones en las que la marca se une al ácido nucleico
amplificado, la marca puede unirse a cualquier parte del ácido
nucleico, que incluye el extremo libre o una o más de las bases.
Preferentemente, la posición de la marca no interferirá con la
hibridación, detección u otras modificaciones posteriores a la
hibridación del ácido nucleico marcado. Pueden usarse una variedad
de diferentes protocolos para generar los ácidos nucleicos
marcados, como se conoce en la técnica, en la que tales
procedimientos se basan normalmente en la generación enzimática de
ácido nucleico marcado usando un cebador inicial y ácido nucleico
plantilla. Los cebadores marcados pueden emplearse para generar el
ácido nucleico amplificado marcado. Alternativamente, la marca puede
incorporarse dentro del ácido nucleico durante la primera síntesis
de cadena o posterior síntesis, etapas de marcado o amplificación
con el fin de producir ácido nucleico amplificado marcado. La marca
también puede incorporarse directamente al ARNm usando modificación
química de ARN con derivados de marcas reactivas o modificación
enzimática usando sustratos marcados. Procedimientos
representativos para producir ácido nucleico amplificado marcado se
describen en las solicitudes de los EE.UU. de número de serie:
08/859.998; 08/974.298; 09/225.998.
Los ácidos nucleicos amplificados pueden
marcarse, por ejemplo, mediante las marcas y las técnicas descritas
anteriormente. Alternativamente, pueden marcarse mediante cualquier
otra técnica conocida en la técnica. Técnicas preferidas incluyen
procedimientos directos de marcado químico y procedimientos de
marcado enzimático tales como usando cinasa y traducción por
muescas. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un
procedimiento como se describe en este documento, en el que el
ácido nucleico diana amplificado puede marcarse durante la
amplificación, o el ácido nucleico diana amplificado puede marcarse
después de la amplificación.
Puede emplearse una variedad de diferentes
marcas en las que tales marcas incluyen marcas fluorescentes, marcas
fosforescentes, marcas isotópicas, marcas enzimáticas, marcas
particuladas, etc. Por ejemplo, marcas adecuadas incluyen
fluorocromos, por ejemplo isotiocianato de fluoresceína (FITC),
rodamina, tal como rodamina 123, R6G, IRDyes^{MR}, Texas Red,
ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína
(6-FAM),
2’,7’-dimetoxi-4’,5’-dicloro-6-carboxifluoresceína
(JOE),
6-carboxi-X-rodamina
(ROX), TET, JOE, NED, (ET-)ROX,
6-carboxi-2’,4’,7’,4,7-hexacloro-fluoresceína
(HEX), 5-carboxifluoresceína
(5-FAM) o
N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxi-rodamina
(TAMRA), fluor 488^{MR}, colorantes de cianina, por ejemplo Cy5,
Cy3, Cy2, colorantes BODIPY, por ejemplo Biodipy^{MR} 630/650,
Biodipy 530, Biodipy^{MR} FL, Alexa tal como Alexa542,
Alexafluor^{MR} 532, etc. Marcas isotópicas adecuadas incluyen
marcas radiactivas, por ejemplo ^{32}P, ^{33}P, ^{35}S,
^{3}H. Otras marcas adecuadas incluyen partículas de tamaño que
poseen dispersión de la luz, propiedades fluorescentes o que
contienen múltiples fluoróforos encerrados. La marca puede ser un
sistema de dos fases en el que el cebador y/o la sonda están
conjugados a biotina, haptenos, etc. que tienen un componente de
unión de alta afinidad, por ejemplo avidina, anticuerpos
específicos, etc. El componente de unión está conjugado a una marca
detectable, por ejemplo una marca enzimática que puede convertir un
sustrato en un producto cromogénico, una marca fluorescente, una
marca isotópica, etc.
Como tal, en ciertas realizaciones, los
cebadores dirigidos a diferentes ácidos nucleicos diana pueden
marcarse de manera diferenciada. Por "marcado diferenciado" y
"contienen una marca diferente" se entiende que los cebadores
dirigidos a diferentes ácidos nucleicos diana están marcados de
manera diferenciada entre sí de tal manera que pueden distinguirse
simultáneamente entre sí.
Una realización de la invención se refiere a la
combinación de (1) reacción de detección de ligasa múltiplex (LDR)
y (2) reacción en cadena de la polimerasa múltiplex (PCR). La
reacción de detección de ligasa (LDR) es un ensayo sensible para
detectar polimorfismos de un sólo nucleótido (SNP), como se describe
por Favis y col., (2000, Nature Biotechnology 18: 561 -
564). Una diferencia en un sólo nucleótido a lo largo del ARNr 16S
puede emplearse para distinguir entre secuencias de diferentes
microorganismos, como se describe por Busti y col. (2002, BMC
Microbiology 2: 27-39). Similarmente, las
diferencias en un sólo nucleótido a lo largo del ARNr 18S, 23S o
28S pueden emplearse para distinguir entre secuencias de diferentes
microorganismos. Puede diseñarse un conjunto de dos sondas (sonda I
y II) basado en la secuencia diana que va a detectarse, de la que
al menos se conoce una parte. Ambas sondas contienen una región en
el extremo (el extremo 3’ y el 5’ de las sondas I y II respectivas)
que puede hibridarse con la sección conocida de la secuencia diana.
En otras palabras, una sonda (sonda I) comprende una región Ir que
se hibrida específicamente con una región diana, estando localizada
dicha región Ir en el extremo 3’ final de la sonda I. Dicha sonda I
comprende además una sección de unión del cebador (PBS(I))
localizada en 5’ de la región Ir. Dicha sonda I y/o II puede
contener una región de relleno. Por ejemplo, dicha región de
relleno en la sonda I puede localizarse entre la región Ir y
PBS(I). La sonda II comprende una región IIr que se hibrida
específicamente con una región diana, estando localizada dicha
región IIr en el extremo 5’ final de la sonda II. Dicha sonda II
comprende además una sección de unión del cebador (PBS(II))
localizada en 3’ de la región IIr. La sonda I o sonda II puede
comprender adicionalmente un ZipComcode localizado entre la región
Ir y PBS(I) o la región IIr y PBS (II), respectivamente. El
ZipComcode (ZCc) es una secuencia única para la identificación de
productos eventualmente amplificados. El ZCc hibridará con su
complemento el Zipcode presente en, por ejemplo, un microchip (sonda
de captura; véase más adelante). Con la hibridación, la región
diana Ir de la sonda I está localizada adyacente a la región diana
IIr de la sonda II. El ZCc y la PBS están localizados en los
extremos de las sondas y no pueden hibridarse con la secuencia
diana. Cuando ambas sondas se hibridan con la secuencia diana y
están localizadas adyacentes entre sí, las sondas pueden ligarse
usando una ligasa, tal como por ejemplo Pfu ADN ligasa.
Después del ligamiento, las sondas ligadas pueden amplificarse
usando al menos un cebador que puede hibridarse con una sección de
unión del cebador. Preferentemente, la amplificación se lleva a
cabo por PCR, usando la sonda I con una PBS(I) que se
diferencia de la sonda II con PBS(II). Por tanto, el cebador
I que se une a la región caracterizada por PBS(I) se
diferenciará del cebador II que se une a la región caracterizada por
PBS(II). Se apreciará que si el cebador I comprende una
secuencia sustancialmente complementaria a PBS(I), entonces
el cebador II comprende una secuencia sustancialmente idéntica a
PBS(II), y viceversa, que si el cebador I comprende una
secuencia sustancialmente idéntica a PBS(I), entonces el
cebador II comprende una secuencia sustancialmente complementaria a
PBS(II). Uno de los cebadores puede estar marcado, por
ejemplo en su extremo 5’. Preferentemente, el primer cebador está
marcado en su extremo 5’. Por tanto, el segundo cebador puede
comprender un ZipComcode localizado en el extremo 5’. Como tal, en
un múltiplex, el procedimiento puede funcionar usando un cebador
común, por ejemplo hibridando con PBS(I), y un cebador
específico de la sonda, por ejemplo hibridando con PBS(II).
Se apreciará que el cebador común puede hibridarse con
PBS(II), mientras que el cebador específico de la sonda se
hibrida con PBS(I). En otra realización, la sonda I contiene
una
marca.
marca.
Por tanto, en el procedimiento según la presente
invención, dicho ácido nucleico y/o ADNc puede amplificarse usando
la reacción de detección de ligasa, que comprende una primera sonda
de ácido nucleico complementaria a una parte bien diferenciada de
dicho ácido nucleico diana y una segunda sonda de ácido nucleico
complementaria a una segunda parte de dicho ácido nucleico diana
localizado esencialmente adyacente a dicha parte bien diferenciada
de dicho ácido nucleico diana, en el que dicha primera sonda de
ácido nucleico comprende además una sección de unión del cebador
localizada en 5’ y posiblemente un relleno, y dicha primera o dicha
segunda sonda de ácido nucleico comprende una etiqueta ZipComcode
localizada en 3’ que es esencialmente no complementaria a dicho
ácido nucleico diana y una sección de unión del cebador, que en caso
de dicha segunda sonda de ácido nucleico está localizada en 3’ del
ZipComcode. El procedimiento comprende además incubar dicho ácido
nucleico y/o ADNc, permitir la hibridación de ácidos nucleicos
complementarios, conectar cualquier sonda esencialmente adyacente
(mediante ligamiento) y amplificar cualquier ácido nucleico sonda
conectado, en el que la amplificación se inicia mediante la unión
de cebadores de ácido nucleico específicos para las secciones de
unión del cebador.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
procedimiento como se describe en este documento, en el que dicha
etapa de conexión comprende el uso o actividad de una ligasa, tal
como T4 ligasa, o una ligasa termoestable tal como Taq ADN
ligasa, Pfu ADN ligasa, Tth ADN ligasa o
Ampligasa^{MR}.
Una estructura típica de sondas ligadas es la
siguiente:
I: 5’-PBS(I) - [relleno] - región I
específica para diana - - - región II específica para
diana - [relleno] - [ZCc] - [relleno] -
PBS(II)-3’, o
II: 5’-PBS(I) - [relleno] - [ZCc] -
[relleno] - región I específica para diana - - - región
II específica para diana - [relleno] -
PBS(II)-3’.
La estructura típica de la sonda ligada después
de la amplificación es:
I: 5’-[Marca] - PBS(I) - [relleno] -
región I específica para diana - región II específica para diana -
[relleno] - [ZCc] - [relleno] - PBS(II)- 3’, y
II: 5’- PBS(I) - [relleno] - [ZCc] -
[relleno] - región I específica para diana - región II específica
para diana - [relleno] - PBS(II) - [marca] -3’.
(las regiones entre corchetes son
opcionales)
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicha sonda I y/o sonda II comprende una región de relleno.
En este aspecto, una región de relleno pretende separar regiones
estructurales tales como PBS, ZCc, Ir o IIr, evitándose o
minimizándose así el impedimento estérico.
Como ya se explica anteriormente, se apreciará
que la marca pueda unirse a al menos uno de los cebadores y/o
sondas, o alternativamente pueda incorporarse durante la
amplificación. La marca es, por ejemplo, una marca fluorescente.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un
procedimiento como se describe en este documento, en el que al
menos un cebador contiene una marca, y preferentemente una marca
fluorescente.
Se apreciará que los híbridos
ARN-ADN puedan actuar como sustratos para T4 ADN
ligasa, como se describe por Charani Ranasinghe y Andrew A. Hobbs,
Affiliations en Elsevier Trends Journals Technical Tips Online,
[consejo]01519 "A simple method to obtain the 5’ ends of
mRNA sequences by direct ligation of cDNA-RNA
hybrids to a plasmid vector".
Subsidiariamente, una de las sondas I o II o
cebadores contiene un sitio de unión de ARN polimerasa. Las sondas
ligadas se amplifican posteriormente mediante la actividad de una
ARN polimerasa, por ejemplo ARN polimerasa T4, T7 o SP6.
Los marcadores genéticos representan (marcan la
localización de) loci específicos en el genoma de una especie o
especie íntimamente relacionada. Un muestreo de diferentes genotipos
en este loci del marcador revela variación genética. Entonces, la
variación genética en el loci del marcador puede describirse y
aplicarse a diagnósticos y similares. La variación genética entre
especies puede atribuirse a sustituciones de un sólo nucleótido en
el ADN o los ARNr 16S, 18S, 23S y/o 28S. La región de unión de diana
de las sondas puede adaptarse correspondientemente. Por ejemplo,
puede proporcionarse un conjunto de cuatro sondas I, comprendiendo
cada una de las cuales un nucleótido final en 3’ diferente, por
ejemplo la sonda I-A, sonda I-C,
sonda I-G y sonda I-T, que contienen
el nucleótido A, C, G y T respectivamente en su extremo 3’.
Entonces, será ventajoso si la PBS de cada sonda I es específica y
se corresponde con dicho nucleótido final. En otras palabras, la PBS
de cada sonda I se hibrida con un cebador I diferente. Por tanto,
la presente invención contempla la sonda I-A con
PBS(I-A), que se hibrida con el cebador
I-A correspondiente, la sonda I-C
con PBS (I-C), que se hibrida con el cebador
I-C correspondiente, la sonda I-G
con PBS(I-G), que se hibrida con el cebador
I-G correspondiente, y la sonda I-T
con PBS(I-T), que se hibrida con el cebador
I-T correspondiente. Cada uno de dichos cebadores
I-A, IC, I-G y I-T
puede comprender una marca diferente. El experto en la materia
apreciará que pueden concebirse variaciones sobre este tema, por
ejemplo, en las que el marcador genético está localizado dentro de
la región diana de las sondas, o en el extremo 5’ final de la sonda
II. En el caso de que el marcado genético esté localizado en la
sonda II, la PBS(II) puede adaptarse como se describe
anteriormente para la sonda I. Además, la PBS, es decir,
PBS(I) y PBS(II), puede ser idéntica o diferente.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que la sonda I, es decir, dicha primera sonda de ácido nucleico,
y/o la sonda II, es decir, dicha segunda sonda de ácido nucleico,
se hibrida específicamente con un marcador genético.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que se proporcionan 4 variantes de la sonda I, es decir, dicha
primera sonda de ácido nucleico, siendo dichas 4 variantes
sustancialmente idénticas, excepto en que cada una de las 4
variantes contiene un nucleótido diferente en su extremo 3’ final.
Por tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento como
se describe en este documento, en el que cada una de dichas 4
variantes contiene una sección I de unión del cebador diferente. En
otra realización, la presente invención se refiere a un
procedimiento como se describe en este documento, en el que al
menos se proporcionan dos grupos de pares de primeras y segundas
sondas de ácido nucleico, en el que cada grupo de primeras y
segundas sondas de ácido nucleico se hibrida con un ácido nucleico
diana específico, y comprende un sitio I y/o II de unión del
cebador específico. En otro aspecto, la invención se refiere a un
procedimiento como se describe en este documento, en el que al menos
se proporcionan dos grupos de pares de primeras y segundas sondas
de ácido nucleico, en el que cada grupo de primeras y segundas
sondas de ácido nucleico se hibrida con un ácido nucleico diana
específico, y la primera sonda de ácido nucleico de cada grupo
comprende un ZipComcode específico. Como tal, el ZipComcode puede
localizarse en la primera sonda de ácido nucleico entre la
secuencia I específica para diana y la secuencia I de unión del
cebador. En otro aspecto, la primera sonda de ácido nucleico se une
o acopla con su extremo 5’ al extremo 3’ de dicha segunda sonda de
ácido nucleico, posiblemente mediante una región de relleno (véase,
por ejemplo, la figura 4, que proporciona un concepto
generalizado). Se entenderá que después de ligar la secuencia I
específica para diana a la secuencia II específica para diana
resulta una sonda circular.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que cada uno de los cebadores que se unen a cada una de las
diferentes secciones I de unión del cebador de dichas 4 variantes
contiene una marca fluorescente diferente.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que se proporciona un conjunto de dos sondas adyacentes para los
microorganismos como se define anteriormente. Por tanto, las sondas
pueden acoplarse.
El procedimiento descrito en este documento se
refiere a la detección simultánea de diversos microorganismos
contaminantes, proporcionando al menos un conjunto, y
preferentemente más de un conjunto de dos sondas, diseñadas
específicamente para identificar y/o caracterizar la presencia de un
microorganismo contaminante (múltiplex). Los diferentes conjuntos
de sondas no deben hibridarse preferentemente de manera cruzada, ya
que por otra parte la temperatura de fusión Tm de los diferentes
conjuntos de sonda/cebadores es aproximadamente similar, por
ejemplo, no variando más de aproximadamente 12ºC. Programas
informáticos comúnmente disponibles, tales como Probe Match,
Universidad del Estado de Michigan, East Lansing, Michigan EE.UU.,
software Oligo 5.0 (PE Biosystems, Foster City, California,
EE.UU.), y el uso del algoritmo ClustalW, pueden facilitar el diseño
de sondas específicas. Preferentemente, los cebadores/sondas tienen
una temperatura de fusión Tm entre aproximadamente
37-85ºC o 50-80ºC o
55-75ºC o 60-72ºC. Como tal, la
presente invención también se refiere a la amplificación múltiplex
(véase anterior-
mente).
mente).
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, que
comprende proporcionar al menos un conjunto de dos cebadores, en el
que el primer cebador (cebador A) comprende una marca localizada en
5’ y una región A que se hibrida específicamente con una primera
región de ácido nucleico diana, estando localizada dicha región A
en el extremo 3’ final del cebador A, y en el que el segundo cebador
(cebador B) comprende un ZipComcode localizado en 3’ y una región B
que se hibrida específicamente con una segunda región de ácido
nucleico diana, estando localizada dicha región B en el extremo 5’
final del cebador B; estando localizada la región diana de la
primera región de ácido nucleico diana en 3’ adyacente a la segunda
región de ácido nucleico diana; incubar dicho ácido nucleico diana
con dicho cebador A y dicho cebador B en condiciones que permitan
la hibridación de ácidos nucleicos complementarios; conectar
cualquier cebador esencialmente adyacente; e hibridar los cebadores
conectados con una sonda de captura, que comprende una región
esencialmente complementaria al ZipComcode, y que está presente en
una micromatriz de flujo. Como tal, dicho cebador A puede
hibridarse específicamente con un marcador genético. En otro aspecto
se proporcionan 4 variantes del cebador A, siendo dichas 4
variantes sustancialmente idénticas, excepto que cada una de las 4
variantes contiene un nucleótido diferente en su extremo 3’ final,
y cada una de las 4 variantes contiene una marca fluorescente
diferente.
Los ácidos nucleicos amplificados o mezcla de
ácidos nucleicos amplificados pueden analizarse después de recoger
el microorganismo contaminante, el aislamiento de su ácido nucleico
y amplificación. Un procedimiento conveniente para analizar dicho
ácido nucleico amplificado o dicha mezcla de ácidos nucleicos
amplificados es mediante la determinación de la secuencia de los
mismos. Las técnicas para determinar la secuencia de ácidos
nucleicos son muy conocidas en la técnica. Por consiguiente, la
presente invención se refiere a un procedimiento como se describe
en este documento, en el que el análisis comprende determinar la
secuencia de la mezcla de ácidos nucleicos amplificados. Dicha
secuencia puede determinarse mediante medios enzimáticos, químicos o
físicos. La secuencia determinada del organismo contaminante puede
compararse con secuencias guardadas en una base de datos. Por
tanto, la etapa de análisis en el procedimiento para caracterizar
microorganismos posiblemente presentes en una muestra según la
presente invención puede comprender proporcionar un medio legible
informático que lleve datos de salida del ordenador que tiene una
base de datos que caracteriza microorganismos basados en secuencias
de nucleótidos, proporcionar un ordenador y algoritmo, procesar los
datos de salida del ordenador para determinar el
microorganismo.
Otro procedimiento conveniente para caracterizar
los microorganismos contaminantes es mediante la realización de un
análisis de polimorfismos de la longitud de fragmentos amplificados
(AFLP) como se describe, por ejemplo, por Vos y col. (1995
Nucleic Acids Research 23:4407-4414). En una
realización, AFLP se usa para identificar ácidos nucleicos
amplificados de manera diferenciada, que entonces se convierten en
sondas de polinucleótido que mapean polimorfismos. Los ADN de AFLP
amplificados de manera diferenciada se convierten en sondas de
polinucleótido mediante aislamiento de fragmentos de AFLP
polimórficos individuales de una mezcla de fragmentos en un producto
de amplificación de AFLP, seguido por el uso de los fragmentos
aislados como sondas de polinucleótido en hibridaciones con
productos de amplificación ADN inmovilizado. Otros procedimientos
representativos para identificar AFLP se describen en la solicitud
internacional número de serie: WO98/30721.
Por tanto, la detección e identificación de
microorganismos mediante selección de alto rendimiento requiere
marcadores específicos para especies de fácil uso. Por consiguiente,
la presente invención contempla el análisis de AFLP por medio de la
generación de fragmentos genómicos (fragmentos de AFLP polimórfico)
mediante la digestión de ADN genómico con una o más enzimas de
restricción. Estos fragmentos genómicos pueden diferenciarse en el
tamaño. Los fragmentos de AFLP polimórfico de interés pueden
seleccionarse y analizarse, por ejemplo, mediante clonación y
determinación de secuencias. Los fragmentos resultantes pueden
tratarse con Blast frente a varias bases de datos, por ejemplo las
bases de datos IECB de la Universidad de Viena:
(www.probebase.net), TIGR
(www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html) o Genbank
(www.ncbi.nlm.nih.gov). Se eliminan todas las secuencias
obtenidas que muestran homologías internas o externas y que quedan
fuera del intervalo de Tm deseado, por ejemplo
50 - 80ºC. Las secuencias restantes que son específicas para especies se llaman "secuencias/etiquetas distintivas". Estas secuencias/etiquetas distintivas pueden aplicarse tanto como cebadores, además de como sondas de captura en la etapa de amplificación y en la identificación de micromatrices.
50 - 80ºC. Las secuencias restantes que son específicas para especies se llaman "secuencias/etiquetas distintivas". Estas secuencias/etiquetas distintivas pueden aplicarse tanto como cebadores, además de como sondas de captura en la etapa de amplificación y en la identificación de micromatrices.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicho ácido nucleico es ADN, y en el que dicho ADN se somete
a AFLP.
El experto en la materia apreciará que los
marcadores de AFLP^{(MR)} para la construcción del mapa genético
en plantas y microorganismos pueden usarse en la presente invención
y pueden acelerar el análisis del genoma. Preferentemente, la
detección e identificación de microorganismos de origen alimentario
y/o que se transmiten por el agua por selección de alto rendimiento
puede realizarse mediante marcadores específicos para especies de
fácil uso.
Otra realización de la presente invención se
refiere al uso de matrices, por ejemplo micromatrices, para el
análisis de los ácidos nucleicos amplificados. Las matrices pueden
contener miles de puntos de ADN. Una única matriz tiene el
potencial de una amplia capacidad de identificación, es decir, de
una vez pueden analizarse muchos microorganismos contaminantes
diferentes en una micromatriz.
Además, el procedimiento de la invención no
requiere laboriosas hibridaciones cruzadas y puede proporcionar una
base de datos abierta de perfiles de hibridación, evitándose las
limitaciones de las hibridaciones ADN-ADN
tradicionales.
En presencia de una plantilla de apareamiento
perfecto, las sondas pueden ligarse mediante la acción de una ADN
ligasa. Después de ligarse, dichas sondas pueden amplificarse. A
continuación, las sondas ligadas, que pueden o pueden no estar
amplificadas, se ponen en contacto con una sonda de captura en
condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación son muy
conocidas en la técnica o pueden determinarse sin dificultad por el
experto en la materia, véase por ejemplo "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual" segunda edición (Sambrook y col., 1989) y
"Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel
y col., eds., 1987, y actualizaciones periódicas). Dicha sonda de
captura comprende una secuencia complementaria respecto a la
secuencia de ácido nucleico diana, o una parte de la misma, tal
como ZCc. Las sondas de captura pueden localizarse en una
micromatriz. Por tanto, la micromatriz comprende las secuencias
complementarias de las secuencias de ácido nucleico diana, es
decir, la sonda de captura. Es conocida la localización de la sonda
de captura en la micromatriz.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicho análisis comprende hibridar los ácidos nucleicos
amplificados o dicha mezcla de ácidos nucleicos amplificados a una
sonda de captura, hibridando dicha sonda de captura específicamente
a dichos ácidos nucleicos amplificados o dicha mezcla de ácidos
nucleicos amplificados. El término "hibridar específicamente"
se refiere a un apareamiento perfecto entre una región del analito,
por ejemplo ZCc del producto amplificado, y la sonda de captura en
la micromatriz. Hibridar específicamente tiene en cuenta la
longitud, contenido de G/C y condiciones de hibridación, tales como
sal y temperatura, como es conocido por el experto en la
materia.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicha sonda de captura está localizada en una micromatriz. La
sonda de captura puede direccionarse espacialmente en la
micromatriz.
Las micromatrices de la presente invención
pueden ser de cualquier tamaño deseado, desde dos puntos hasta
10^{6} puntos o incluso más. Los límites superiores e inferiores
en el tamaño del sustrato están determinados exclusivamente por las
consideraciones prácticas de trabajo con sustratos extremadamente
pequeños o grandes.
Para un tamaño de sustrato dado, el límite
superior sólo está determinado por la capacidad para crear y
detectar los puntos en la micromatriz. El número de puntos
preferido en una micromatriz depende generalmente del uso
particular que se le va a dar a la micromatriz. Por ejemplo, la
secuenciación mediante hibridación requerirá generalmente matrices
grandes, mientras que la detección de mutaciones sólo puede requerir
una pequeña matriz. En general, las micromatrices contienen de 2 a
aproximadamente 10^{6} puntos, o de aproximadamente 4 a
aproximadamente 10^{5} puntos, o de aproximadamente 8 a
aproximadamente 10^{4} puntos, o entre aproximadamente 10 y
aproximadamente 2000 puntos, o de aproximadamente 20 a
aproximadamente 200 puntos.
Además, no todos los puntos en la micromatriz
necesitan ser únicos. De hecho, en muchas aplicaciones se desean
redundancias en los puntos a efectos de actuar como controles
internos.
Se ha descrito una variedad de técnicas para
sintetizar y/o inmovilizar matrices de polinucleótidos, incluyendo
síntesis in situ, en las que los polinucleótidos se
sintetizan directamente sobre la superficie del sustrato (véase,
por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.744.305 concedida a
Fodor y col.) y la unión de polinucleótidos previamente
sintetizados a la superficie de un sustrato en localizaciones
discretas (véase, por ejemplo, el documento WO98/31836).
Procedimientos adicionales se describen en el documento WO98/31836
en las páginas 41-45 y 47-48, entre
otros sitios. La presente invención es adecuada para uso con
cualquiera de estas técnicas actualmente disponibles o
desarrolladas más tarde.
La inmovilización de polinucleótidos previamente
sintetizados en diferentes direcciones espaciales da una matriz de
polinucleótidos cuyas secuencias pueden identificarse por sus
direcciones espaciales.
En realizaciones que suponen la síntesis in
situ de polinucleótidos, los polinucleótidos se sintetizan en
su modo usual. El esquema de síntesis da una matriz de
polinucleótidos cuyas secuencias pueden identificarse por sus
direcciones espaciales.
La naturaleza y geometría del sustrato sólido
dependerá de una variedad de factores, que incluye, entre otros, el
tipo de matriz (por ejemplo, unidimensional, bidimensional o
tridimensional) y el modo de unión (por ejemplo, covalente o no
covalente). Generalmente, el sustrato puede componerse de cualquier
material que permitirá la inmovilización de la sonda de captura,
por ejemplo polinucleótido, y que no se fundirá o degradará
sustancialmente de otro modo en las condiciones usadas para unir la
sonda de captura, por ejemplo hibridará y/o desnaturalizará ácidos
nucleicos. Además, si se contempla la inmovilización covalente, el
sustrato debe activarse con grupos reactivos que pueden formar un
enlace covalente con la sonda de captura que va a inmovilizarse.
Otros materiales adecuados a modo de ejemplo
para uso como sustratos en la presente invención incluyen óxidos
metálicos. Los óxidos metálicos proporcionan un sustrato que tiene
tanto una alta densidad de canales como una alta porosidad,
permitiendo matrices de alta densidad que comprenden diferentes
sustancias primeras de unión por unidad de superficie para la
aplicación de la muestra. Además, los óxidos metálicos son sumamente
transparentes para la luz visible. Los óxidos metálicos son
sustratos relativamente económicos que no requieren el uso de
ninguna tecnología de microfabricación típica y que ofrece un
control mejorado respecto a la distribución líquida sobre la
superficie del sustrato, tal como membrana de óxido metálico
fabricada electroquímicamente. Las membranas de óxidos metálicos
que tienen canales pasantes orientados pueden fabricarse mediante
grabado electroquímico de una hoja de metal. Los óxidos metálicos
considerados son, entre otros, óxidos de tántalo, titanio y
aluminio, además de aleaciones de dos o más óxidos metálicos y
óxidos metálicos dopados y aleaciones que contienen óxidos
metálicos. Las membranas de óxidos metálicos son transparentes,
especialmente si están mojadas, lo que permite ensayos usando
diversas técnicas ópticas. Tales membranas tienen canales pasantes
orientados con diámetro muy controlado y propiedades superficiales
químicas útiles. La solicitud de patente
EP-A-0975427 es a modo de ejemplo en
este respecto y se incorpora específicamente en la presente
invención.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicha micromatriz es una micromatriz de flujo. Por tanto, la
presente invención se refiere a un procedimiento como se describe
en este documento, en el que dicho sustrato es un sustrato poroso,
dicho sustrato puede ser una membrana de óxido metálico
electroquímicamente fabricada. Preferentemente, dicho sustrato
comprende óxido de aluminio.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicha micromatriz es Pam-Chip®.
La composición de las sondas de captura
inmovilizadas no es crítica. El único requisito es que puedan
hibridarse con un ácido nucleico diana de secuencia complementaria,
por ejemplo el ácido nucleico amplificado, si está presente. Por
ejemplo, las sondas de captura pueden componerse de todas las bases
de nucleótidos naturales o todas las sintéticas, o una combinación
de ambas. Ejemplos no limitantes de bases adecuadas modificadas
para uso con la invención momentánea se describen, por ejemplo, en
Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, G.
Fasman, Ed., CRC Press, 1989, páginas 385-392.
Aunque en la mayoría de los ejemplos los polinucleótidos estarán
compuestos completamente de bases naturales (A, C, G, T o U), en
ciertos casos puede preferirse el uso de bases sintéticas.
Además, aunque los esqueletos de las sondas de
captura estarán compuestos normalmente completamente de enlaces
fosfodiéster "nativos", pueden contener uno o más enlaces
modificados, tales como uno o más fosforotioatos, fosforamiditos u
otros enlaces modificados. Como ejemplo específico, uno o más
polinucleótidos inmovilizados pueden ser un ácido nucleico
peptídico (PNA) que contiene enlaces amida. Ejemplos adicionales de
bases y esqueletos modificados que pueden usarse conjuntamente con
la invención, además de procedimientos para su síntesis, pueden
encontrarse, por ejemplo, en Uhlman & Peyman, 1990, Chemical
Review 90(4):544-584; Goodchild, 1990,
Bioconjugate Chem. 1(3):165-186;
Egholm y col., 1992, J. Am. Chem. Soc.
114:1895-1897; Gryaznov y col., J. Am. Chem.
Soc. 116:3143-3144, además de la bibliografía
citada en todos los anteriores.
Como tal, las sondas de captura pueden incluir
polímeros de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, estando
conectado el ribonucleótido y/o los desoxirribonucleótidos juntos
mediante enlaces de 5’ a 3’. Las sondas de captura de la invención
pueden ser ácidos ribonucleicos, por ejemplo ácidos ribonucleicos
sentido o antisentido, fragmentos de longitud completa o parcial de
ARNc, fragmentos de longitud completa o parcial de ARNm y/o
ribo-oligonucleótidos. Alternativamente, las sondas
de captura de la invención pueden ser ácidos desoxirribonucleicos,
preferentemente secuencias de longitud completa de cadenas
sencillas o fragmentos de secuencias que codifican los ARNm
correspondientes. La forma de las sondas de captura debe elegirse
de tal manera que sean complementarias a y formen enlaces de
hidrógeno de Watson-Crick apropiados con el ácido
nucleico diana amplificado y/o sondas ligadas en una muestra.
Como se menciona anteriormente, las sondas de
captura pueden ser polímeros de análogos de nucleótidos sintéticos.
Tales sondas de captura pueden utilizarse en ciertas realizaciones
debido a su estabilidad superior en condiciones de ensayo. Las
modificaciones en la estructura nativa, que incluye alteraciones en
el esqueleto, azúcares o bases heterocíclicas, han mostrado que
aumentan la estabilidad intracelular y la afinidad de unión. Entre
los cambios útiles en la química del esqueleto están los
fosforotioatos; los fosforoditioatos, en los que los dos oxígenos
que no forman puentes están sustituidos con azufre; fosforamiditas;
fosfotriésteres de alquilo y boranofosfatos. Derivados de fosfato
quirales en a incluyen
3’-O-5’-S-fosforotioato,
3’-S-5’-O-fosforotioato,
3’-CH_{2}-5’-O-fosfonato y
3’-NH-5’-O-fosforamidato. Los ácidos
nucleicos peptídicos sustituyen todo el esqueleto de fosfodiéster
de ribosa por un enlace peptídico. Los ácidos nucleicos bloqueados
dan una estabilidad conformacional adicional del resto de azúcar
debido a enlaces adicionales entre grupos 2’-carboxilo y
5’-carboxilo o 4’-carboxilo de desoxirribosa. Las modificaciones de
azúcares también se usan para mejorar la estabilidad y afinidad. El
a-anómero de desoxirribosa puede usarse cuando la
base esté invertida con respecto al p-anómero
natural. El 2’-OH del azúcar ribosa puede alterarse para formar
azúcares de 2’-O-metilo o
2’-O-alilo, que proporcionan resistencia a la
degradación sin comprender afinidad. La modificación de las bases
heterocíclicas que encuentran uso en el procedimiento de la
invención son aquellas que pueden aparear bases apropiadas. Algunas
sustituciones útiles incluyen desoxitimidina por desoxiuridina;
desoxicitidina por
5-metil-2’-desoxicitidina y
5-bromo-2’-desoxicitidina. Se ha
mostrado que aumenta la afinidad y actividad biológica cuando se
sustituye
desoxitimidina y desoxicitidina por 5-propinil-2’-desoxiuridina y 5-propinil-2’-desoxicitidina, respectivamente.
desoxitimidina y desoxicitidina por 5-propinil-2’-desoxiuridina y 5-propinil-2’-desoxicitidina, respectivamente.
Ejemplos de bases de procedencia no natural que
pueden formar relaciones de apareamiento de bases incluyen, pero no
se limitan a, análogos de aza- y deaza-pirimidina,
análogos de aza- y deaza-purina y otros análogos de
bases heterocíclicas, en los que uno o más de los átomos de carbono
y nitrógeno de los anillos de purina y pirimidina han sido
sustituidos por heteroátomos, por ejemplo oxígeno, azufre, selenio,
fósforo y similares.
Las sondas de captura inmovilizadas pueden ser
tan sólo cuatro, o nada menos que cientos, o incluso más,
nucleótidos de longitud. Como sondas de captura según la invención
se consideran ácidos nucleicos que en la técnica normalmente se
refieren como oligonucleótidos y también aquellos denominados en lo
sucesivo ácidos nucleicos. Por tanto, las matrices de la presente
invención son útiles no sólo en aplicaciones en las que los ácidos
nucleicos diana amplificados o las sondas ligadas se hibridan con
matrices inmovilizadas de sondas de captura relativamente cortas
(tales como, por ejemplo, que tienen una longitud de aproximadamente
6, 8, 10, 20, 40, 60, 80 ó 100 nucleótidos), sino también en
aplicaciones en las que las sondas de captura relativamente cortas
se hibridan con matrices de ácidos nucleicos diana inmovilizados.
Las sondas de captura de la matriz pueden ser de cualquier
secuencia deseada.
En otra realización, la micromatriz de la
invención comprende una sonda de captura que comprende la secuencia
Zipcode que es esencialmente complementaria a un ZipComcode (ZCc)
correspondiente. La sonda de captura que comprende la secuencia
Zipcode puede motearse o sintetizarse en una localización específica
en la micromatriz. La secuencia Zipcode es una única secuencia
identificadora que es complementaria a la secuencia ZipComcode de
la sonda que se usó para amplificar el ácido nucleico. La presente
invención se refiere particularmente a micromatrices y al uso de
las mismas, que comprenden de 20 a 30 oligonucleótidos base únicos,
por ejemplo 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30
oligonucleótidos base, llamados Zipcode, que están acoplados a un
sustrato tridimensional poroso en localizaciones conocidas, como se
describe por van Beuningen y col., (2001, Clinical Chemistry
47: 1931-1933). Estos Zipcode hibridan
específicamente con moléculas que contienen secuencias que son
complementarias a los Zipcode, es decir, los ZipComcode. Mediante la
unión de estos ZipComcode a cebadores fluorescentes mediante una
reacción de ligadura-amplificación, las
micromatrices de Zipcode pueden usarse para detectar e identificar
microorganismos, tales como por ejemplo especímenes microbianos.
Debido a que los Zipcode representan secuencias artificiales
únicas, las micromatrices que comprenden Zipcode pueden usarse como
una plataforma universal para el reconocimiento molecular
simplemente cambiando las secuencias específicas del gen unidas a
los ZipComcode.
La detección de marca en una localización
específica sobre la micromatriz, tal como PamChip, indica la
presencia de un producto de hibridación entre el producto ligado y
la secuencia Zipcode en la micromatriz.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que dicha sonda de captura hibrida específicamente con un
ZipComcode correspondiente. El ácido nucleico diana amplificado o
ácidos nucleicos hibridados con una sonda de captura correspondiente
o sondas en una micromatriz pueden dar como resultado un patrón de
hibridación. El patrón de hibridación, que incluye la intensidad de
hibridación, puede ser característico para un microorganismo
dado.
Será aparente que la presente invención se
refiere a un procedimiento como se describe en este documento, en
el que una señal se detecta después de hibridar los ácidos nucleicos
específicamente amplificados o las sondas ligadas con la sonda de
captura. Dicha señal es preferentemente una señal fluorescente o
fosforescente, y dicha señal fluorescente o fosforescente puede
detectarse mediante una cámara CCD o mediante barrido láser, tal
como por ejemplo FD10 System® (Olympus) o una Pamalyzer® (PamGene
NV).
Como ya se menciona anteriormente, el precio de
una micromatriz presenta el mayor coste por prueba. Con el fin de
disminuir el precio por prueba, la micromatriz puede someterse
simultáneamente a más de una muestra. Como tal se contempla que
cada muestra individual se someta al procedimiento de la presente
invención hasta la etapa de hibridación, es decir, de cada muestra
individual, los microorganismos se capturan (etapa a), después de
lo que los ácidos nucleicos se extraen (etapa b), que posteriormente
se someten a una reacción de detección de ligasa. A continuación,
los ácidos nucleicos diana amplificados procedentes de todas las
muestras probadas (etapa c) se hibridan colectivamente con las
sondas de captura en una única micromatriz (etapa d) y se detectan
los ácidos nucleicos diana hibridados (etapa e). El par de sondas
usadas por muestra puede ser idéntico, por ejemplo, detección del
mismo ácido nucleico diana, o puede ser diferente por muestra, por
ejemplo, detección de diferentes ácidos nucleicos diana. Sin
embargo, con el fin de diferenciar entre ácidos nucleicos diana
amplificados de diferentes muestras o entre diferentes ácidos
nucleicos diana amplificados procedentes de una única muestra, cada
sonda, y por tanto, el ácido nucleico diana amplificado, debe poder
designarse y detectarse por separado. De ahí que cada sonda
comprenda una etiqueta bien diferenciada e individualmente
identificable, tal como un ZipComcode particular complementario a
una sonda de captura bien diferenciada en la micromatriz. Aunque
los pares de sondas de ácido nucleico pueden detectar los mismos
ácidos nucleicos diana en diferentes muestras, cada ácido nucleico
diana amplificado procedente de cada muestra puede seguirse debido
a su etiqueta bien diferenciada correspondiente a una dirección
específica en la micromatriz. En una realización alternativa, las
sondas no comprenden etiquetas, sino que sólo los cebadores usados
para la amplificación comprenden una etiqueta diferenciada e
individualmente identificable, tal como ZCc. Obviamente aplican las
mismas consideraciones que se mencionan anteriormente ya que las
etiquetas deben ser diferentes por muestra y/o por sonda, haciendo
cada muestra y/o sonda individual identificable. Por consiguiente,
la presente invención se refiere a un procedimiento como se
describe en este documento, en el que los ácidos nucleicos diana
amplificados procedentes de al menos dos muestras se hibridan con
sondas de captura presentes en una única micromatriz.
Los datos obtenidos por los procedimientos de la
presente invención pueden analizarse adicionalmente, posiblemente
de un modo automatizado. Por ejemplo, el patrón de hibridación
obtenido puede compararse con patrones de hibridación guardados en
una base de datos. En este aspecto, la presente invención también se
refiere a un programa informático guardado en un medio legible
informático que puede realizar la comparación del patrón de
hibridación obtenido con los patrones de hibridación guardados en
la base de datos. Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un ordenador que comprende un medio legible informático
que puede realizar los procedimientos descritos anteriormente. Por
tanto, la presente invención se refiere a un medio legible
informático que comprende un programa informático que puede
realizar el procedimiento descrito anteriormente. Además, la
presente invención se refiere a un programa informático que puede
mostrar una página web en un ordenador remoto, permitiendo el uso
del procedimiento descrito anteriormente.
En otra realización, la presente invención se
refiere a kits para determinar la presencia de microorganismos en
una muestra que comprende los elementos esenciales de los
procedimientos de la presente invención, por ejemplo, dichos kits
pueden comprender un filtro, posiblemente medios para extraer ácidos
nucleicos de dichos microorganismos, medios para amplificar
específicamente dichos ácidos nucleicos, posiblemente medios para
analizar los ácidos nucleicos amplificados, por ejemplo
micromatrices, tales como micromatrices de flujo, posiblemente
tampones y/o un manual de instrucciones.
La caracterización de poblaciones microbianas
mixtas no se ha logrado fácilmente mediante los procedimientos
actuales y tiene un amplio potencial de aplicación. En la mayoría de
los entornos en los que se encuentran bacterias está presente una
mezcla compleja de especies que puede cambiar como respuesta a las
condiciones locales o evolucionan con el tiempo. Generalmente, los
procedimientos microbiológicos clásicos no son muy adecuados para
el estudio de estos sistemas debido a que se basan en el cultivo y
posterior aislamiento de colonias individuales. Esto sólo puede
recuperar una parte de las especies presentes y también da como
resultado un gran número de cepas que deben caracterizarse. Los
procedimientos moleculares que suponen la amplificación de genes
conservados de poblaciones complejas y su posterior caracterización,
mediante clonación y secuenciación, o hibridación, proporcionan
alternativas al cultivo, pero siguen siendo complejos.
Adicionalmente, la etapa de amplificación también puede introducir
márgenes de error.
En poblaciones de células que crecen
activamente, cada célula contiene muchas copias de la secuencia
específica para el ARN ribosómico que se usa ampliamente para
identificar especies bacterianas (Woese 1987, Microbiol.
Rev. 51:221-271). Debido a esta
"amplificación" natural de estas secuencias dentro de células
activas es posible detectar estas secuencias sin amplificación
(Small J. y col. 2001 App. Environ. Micro.
67:4708-4716). Por tanto, se presenta un
procedimiento para la extracción e identificación directa de ARN
ribosómico en una superficie de matriz tridimensional. Esto permite
potencialmente la rápida identificación en paralelo de una amplia
gama de especies en una muestra sin la necesidad de amplificación o
marcado enzimático. El procedimiento presentado en este documento
demuestra que la monitorización casi en tiempo real de comunidades
bacterianas complejas será posible, que tendrá muchas aplicaciones
en muchas áreas.
Por tanto, se apreciará que la presente
invención se refiera a los procedimientos descritos anteriormente,
en los que dicha etapa de análisis comprende hibridar una sonda de
apilamiento con los ácidos nucleicos, mezcla de ácidos nucleicos
y/o ADNc, siendo dicha sonda de apilamiento complementaria para una
región de ARNr 16S, 18S, 23S o 28S, proporcionándose así un
complejo de ácido nucleico/sonda de apilamiento. Dicha etapa de
análisis puede comprender adicionalmente hibridar dicho complejo de
ácido nucleico/sonda de apilamiento con una sonda de captura,
siendo dicha sonda de captura complementaria a una región del ácido
nucleico diferente del complejo de ácido nucleico/sonda de
apilamiento. Dicha sonda de captura puede ser específica para un
microorganismo. La sonda de apilamiento puede estar marcada. La
región de ARNr 16S, 18S, 23S o 28S puede estar conservada (entre
especies).
Será evidente para el experto en la materia que
la presente invención se refiere al uso de un filtro y una
micromatriz como se menciona en este documento en el procedimiento
de la presente invención. Por tanto, la presente invención se
refiere al uso de al menos un par de una primera sonda de ácido
nucleico y una segunda sonda de ácido nucleico como se definen
anteriormente, incluyendo sondas acopladas, al uso de un filtro como
se describe anteriormente y al uso de al menos un conjunto de dos
cebadores como se define anteriormente en los procedimientos según
la invención.
Antes de describir adicionalmente el objeto de
la invención debe entenderse que la invención no se limita a las
realizaciones particulares de la invención descritas en este
documento ya que pueden hacerse variaciones de las realizaciones
particulares y todavía quedan dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas. También debe entenderse que la
terminología empleada es con el fin de describir realizaciones
particulares y no pretende ser limitante. En cambio, el alcance de
la presente invención se establecerá mediante las reivindicaciones
adjuntas.
Los siguientes ejemplos y figuras se ofrecen a
modo de ilustración y no a modo de limitación. Sin embargo, el
contenido de dichos ejemplos y figuras puede generalizarse en el
concepto de la presente invención.
La fig. 1 Alineación de secuencia de especies de
estafilococo. Las sondas de estafilococo que comprenden una cola T
están unidas a la micromatriz (chip). Se describe la sonda de
apilamiento, que comprende una secuencia común a S. aureus, S.
epidermidis y S. saprophiticus, que contiene una marca en su
extremo 3’;
la fig. 2 Señal de hibridación de diferentes
especies de estafilococo en PamChip a 55ºC;
la fig. 3 Señal de hibridación de diferentes
especies de estafilococo en PamChip a 65ºC;
la fig. 4 Reacción de detección de ligasa
seguida por amplificación por PCR.
A: sonda que comprende dos regiones cSeq1 y
cSeq2 que hibridan específicamente con la región diana, dos regiones
de unión del cebador cMse y Eco y un ZipComcode (ZIP).
B1: para la cepa 1, hibridación específica de la
sonda con cSeq1 y cSeq2 con sus secuencias complementarias Seq1 y
Seq2 de la región diana, respectivamente, después de lo cual se liga
la muesca de cadenas sencillas (ss). Para la cepa 2, hibridación de
la sonda con cSeq1 y cSeq2 con sus secuencias complementarias Seq1 y
Seq2 de la región diana, respectivamente. Sin embargo, debido a una
mutación en el sitio 3’ de cSeq2, hay un desapareamiento entre
cSeq2 y Seq2 de la región diana. Por tanto, no puede ligarse la
muesca de cadenas sencillas (ss).
B2: para la cepa 1, la ligadura de la muesca ss
da como resultado una sonda circular. Para la cepa 2, la sonda
permanece lineal.
B3: para la cepa 1, la hibridación con un
cebador complementario a Mse facilita la extensión de este cebador,
por ejemplo mediante PCR, resultando una plantilla con el siguiente
orden de regiones,
5’-Mse-Seq1-Seq2-cZIP-cEco-3’,
y complementario a la sonda de A. Para la cepa 2, la hibridación
con un cebador complementario a Mse facilita la extensión limitada
de este cebador, por ejemplo mediante PCR, resultando una plantilla
acortada complementaria a la sonda de A y con el siguiente orden de
regiones, 5’-Mse-Seq1-3’, faltando,
por tanto, las regiones Seq2, cZIP y cEco.
B4: para la cepa 1 se extiende el cebador
marcado Eco, complementario a la región cEco de la plantilla de la
etapa B3. Pueden repetirse las etapas B3 y B4, resultando una
amplificación exponencial. Puede detectarse el producto de
extensión marcado, tal como por ejemplo mediante hibridación de
dicho producto con su región ZipComcode (ZIP) con una sonda de
captura complementaria en una micromatriz. Para la cepa 2, el
cebador marcado Eco no puede hibridarse con una plantilla y
extenderse. Por consiguiente, sólo es posible una amplificación
lineal con el cebador Mse.
la fig. 5 Comparación de productos de
detección de diversas serovariedades enterica de S.
enterica ssp.
la fig. 6 Lista de regiones sonda a modo de
ejemplo para diversas serovariedades enterica de S.
enterica ssp.
la fig. 7 Comparación de los modelos de
serovariedades enterica de S. enterica ssp. detectados
en leche en polvo (lado izquierdo) y carne de pollo (lado derecho),
respectivamente, usando un único PamChip.
Se elaboró el procedimiento de selección
microanalítica (MAS) de la presente invención y se examinó el
rendimiento de los microtamices Aquamarijn a escala de laboratorio
y en tres plantas piloto diferentes.
1 En una fábrica de productos lácteos,
dependiendo de las dimensiones de las partículas de leche, se aplica
un microtamiz con un diámetro de poro de aproximadamente 0,5 - 1,2
micrómetros. A una presión de 1 kPa se mide un flujo promedio de
2000 l/m^{2}h (litros por m^{2} de área superficial de membrana
por hora). Cuando el proceso del presente procedimiento se aplica
en la eliminación de microorganismos en leche, la mayor parte de la
caseína en la leche pasa a través de la membrana del microtamiz y
entra en el permeado. En experimentos con leche desnatada "con
adiciones" (inoculada con diferentes números de unidades
formadoras de colonias (ufc) de Bacillus subtilis) con un
microtamiz de 0,5 micrómetros pudieron recogerse y detectarse 1 ufc
de Bacillus subtilis por litro de leche.
2 En una industria de bebidas, dependiendo de la
naturaleza de las bebidas, se aplica una microtamiz con un diámetro
de poro de aproximadamente 0,5 - 1,2 micrómetros. A una presión de 1
kPa se mide un flujo promedio de 3500 l/m^{2}h (litros por
m^{2} de área superficial de membrana por hora). Cuando se
aplicaron estos microtamices pudieron eliminarse microorganismos de
alteración en bebidas. En experimentos con bebidas "con
adiciones" (inoculadas con diferentes números de unidades
formadoras de colonias (ufc) de Aspergillus niger) con un
microtamiz de 0,8 micrómetros pudieron recogerse y detectarse 1 ufc
de Aspergillus niger por litro de zumo.
3 En una fábrica de cerveza, dependiendo de la
naturaleza de las cervezas, se aplica un microtamiz con un diámetro
de poro de aproximadamente 0,5 - 1,2 micrómetros. A una presión de 2
kPa se mide un flujo promedio de 2500 l/m^{2}h (litros por
m^{2} de área superficial de membrana por hora). Cuando se
aplicaron estos microtamices pudieron eliminarse microorganismos de
alteración en bebidas. En experimentos con cerveza "con
adiciones" (cerveza inoculada con diferentes números de unidades
formadoras de colonias (ufc) de Kluyveromyces lactis) y con
un microtamiz de 0,8 micrómetros pudieron recogerse y detectarse 1
ufc de Kluyveromyces lactis por litro de cerveza.
Cuando van a introducirse nuevas técnicas
analíticas, por ejemplo el procedimiento de MAS, es importante
confirmar esta técnica cara a cara con técnicas comúnmente usadas.
Por tanto, el procedimiento de MAS se compara con el procedimiento
de "recuento en placa" (PC) (JECFA).
\newpage
En los experimentos, las muestras con diferentes
concentraciones de células de levaduras se han analizado usando
ambos procedimientos. Los resultados obtenidos muestran que con la
técnica de MAS se contaron un mayor número de células de levaduras
que con el procedimiento de PC. Esto puede explicarse por el hecho
de que con la técnica de MAS pueden contarse todas las células
individuales que forman una colonia, mientras que en el
procedimiento de PC estas células juntas contarían como una única
célula después del cultivo. En la detección por MAS también van a
contarse células menos viables que no habrían podido multiplicarse
en medio agar y por tanto no se encuentran en el procedimiento de
"recuento en placa".
Los microorganismos recogidos que usan la
tecnología de MAS pueden caracterizarse e identificarse
adicionalmente aplicando herramientas de biología molecular
microbiana, véanse a continuación los ejemplos.
Según la necesidad se elige el procedimiento más
apropiado para aislar ARN. Se usan y comparan diversos
procedimientos para aislar ARN completo de microorganismos. El
procedimiento tradicional es la inyección directa de muestras
bacterianas dentro de una disolución de fenol caliente (Selinger y
col., 2000, Nature Biotechnol. 18,
1262-1268). Alternativamente, las células se
congelan rápidamente en nitrógeno líquido y se rompen mecánicamente
antes del aislamiento con disolución ácida de fenol.
Las células de organismos
gram-positivos se congelan en hielo seco, se
descongelan y se sonican 3 veces durante 10 s con un ultrasonidos
de micropunta. La potencia se ajusta a aproximadamente 30 W. La
lisis se indica mediante una suspensión celular transparente.
Los procedimientos descritos anteriormente son
convenientes para aislar ARN.
Posteriormente se ha probado la disolución
RNAlater® (Ambion y Qiagen). En particular, se ha examinado la
permeabilidad de RNAlater® para diferentes especies microbianas,
incluyendo Saccharomyces, Lactococcus, Leuconostoc y
Lactobacillus. Para estas cuatro especies los resultados
obtenidos varían de suficientes a buenos.
Además, se prueban una variedad de kits de
aislamiento de ARN, disponibles de diferentes fuentes comerciales
(Ambion, Qiagen, Sigma-Aldrich y otras), y se
califican como convenientes.
El procedimiento para lisar el microorganismo
varía dependiendo del tipo de microorganismo.
Después de eliminar los microorganismos de la
superficie del microtamiz, las células se suspendieron mediante
agitación durante al menos 20 s en 300-500 \mul de
agua destilada estéril. El ADN se extrajo después de la lisis
celular mediante inmersión de los tubos en agua en ebullición
durante 10 min. El residuo celular se sedimentó mediante
centrifugación (13 krpm durante 10 s) y el sobrenadante que contenía
el ADN se eliminó y se transfirió a un tubo limpio.
Un procedimiento alternativo estaba basado en
las propiedades de lisis e inactivación de nucleasas del agente
caotrópico tiocinato de guanidio (GuSCN) y las propiedades de unión
a ácidos nucleicos de partículas de sílice o diatomeas en presencia
de este agente como se describe por Boom y col. (Boom y col., 1990,
J. Clin. Microbiol 28:495-503).
En caso de organismos
gram-positivos, que incluyen Lactobacillus,
las células se suspendieron en 500 \mul de tampón STE (NaCl 100
mM, Tris-HCl 50 mM, EDTA de sodio 10 mM, pH 7,5) y
se incubaron a 37ºC con 100 \mul de lisozima (10 mg/ml) durante
15 minutos. Las células tratadas con lisozima se trataron
adicionalmente según las instrucciones del kit QIAgen DNeasy Tissue
(Westburg, Leusden, los Países Bajos).
En caso de organismos
gram-negativos, que incluyen Salmonella, los
ADN genómicos de las muestras se extrajeron y purificaron usando
puntas Genomic (Qiagen) con el conjunto Genomic DNA buffer (Qiagen),
o el kit de purificación de ADN genómico Wizard^{MR}
(Promega).
En caso de mohos u hongos como
Aspergillus, las células se suspendieron en 500 \mul de OM
(medio osmótico: MgSO_{4} 1,2 M, Na_{2}HPO_{4} 8,4 mM,
NaH_{2}PO_{4} 1,6 mM, pH 5,8), y se incubaron a 30ºC con 50
\mul de Glucanex® (Novozymes, Dinamarca) durante
15-30 minutos. Las células tratadas con
pectinolítico se trataron adicionalmente según las instrucciones
del kit QIA ADN miniprep o el kit aislamiento de ADN genómico
Puregene (Gentra).
La concentración de ADN aislado según los
diversos procedimientos se estimó mediante espectrofotometría a 260
nm (Gene Quant II ARN/ADN calculator®, Amersham Pharmacia Biotech,
Woerden, los Países Bajos).
Se ha diseñado un conjunto de 20^{4}
(20-mero) secuencias de ADN Zipcode (Gerry y col.,
1999, J.Mol.Biol. 292: 251-262). Todos estos
Zipcode se han tratado con Blast con ayuda de:
- Base de datos microbiana TIGR:
www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html o con
- Genbank; www.ncbi.nlm.nih.gov
- IECB de la Universidad de Viena:
www.sondabase.net.
Además, se excluyeron de análisis adicionales
todos los Zipcode que mostraban homologías internas o externas,
todos los Zipcode que quedaban fuera del intervalo de Tm deseado (60
- 72ºC) y los Zipcode que son difíciles de sintetizar, por ejemplo,
una fila de 5 o más dGTP.
Los 180 Zipcode restantes se sintetizaron y
proporcionaron por el proveedor Proligo (París, Francia), Eurogentec
(Lieja, Bélgica) o Metabion (Martinsried, Alemania).
Las micromatrices se prepararon usando chips Pam
diseñados para inmovilizar covalentemente oligonucleótidos
modificados como se describe en la patente WO99/02266.
El moteo de los 180 oligonucleótidos Zipcode
modificados (20-meros) se realizó usando un sistema
de dosificación accionado por piezoeléctrico de no contacto
(BioChip arrayer Packard, Perkin Elmer).
También se motearon oligonucleótidos de control
positivos y negativos en los Zipcode que contenían la
micromatriz.
De los 180 Zipcode seleccionados moteados en la
micromatriz, las secuencias complementarias, es decir, los
oligonucleótidos que comprenden el ZipComcode, se obtuvieron de los
proveedores Proligo (París, Francia), Eurogentec (Lieja, Bélgica) o
Metabion (Martinsried, Alemania).
Estos oligonucleótidos ZipComcode se usaron en
reacciones con SNPWave^{MR} como se describe en el ejemplo 4.
En el ejemplo 6 se presentan los resultados
obtenidos con esta micromatriz universal de ADN de captura.
Las sondas para LDR se diseñaron para ser
específicas para el ADNr. Las sondas se diseñaron para ser
específicas para las secuencias 16S o 23S de los grupos bacterianos
objeto de investigación, además de para las secuencias 18S o 28S de
los grupos de levaduras y hongos objeto de investigación. Para cada
uno de estos grupos se evaluó un número sustancial de secuencias de
ADNr, se recogieron en subgrupos y se alinearon usando el algoritmo
ClustalW. Éste dio una secuencia consenso para cada grupo con un
corte del 75% (que significa que 3 de cada 4 secuencias
determinadas tenían la secuencia consenso en una posición dada).
En este caso se usó una sonda II común, es
decir, común para todos los grupos bacterianos, grupos de levaduras
o grupos de hongos objeto de investigación. La identificación
específica se efectuó mediante la sonda I de discriminación. La
especificidad de cada conjunto de pares de sondas se examinó con la
herramienta Probe Match para garantizar que no se produce
hibridación cruzada entre sondas y entre sondas y secuencias
diana.
Todos los cebadores se diseñaron para que
tuvieran valores de temperatura de fusión (Tm) con las sondas
correspondientes de entre 60 y 72ºC. Los cebadores I de
discriminación (que comprenden una secuencia idéntica a PBS I) se
adquirieron con una molécula Cy3 en su posición extrema 5’,
mientras que los cebadores II comunes (que comprenden una secuencia
complementaria a PBS II) comprendían un ZipComcode y un fosfato en
su posición extrema 5’.
La reacción de LDR se llevó a cabo en un volumen
final de 20 \mul que contenía KCl 20 mM, MgCl_{2} 10 mM,
Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NP40 al 0,1%, ATP 0,01 mM,
DTT 1 mM, 2 pmol de cada sonda I de discriminación, 2 pmol de cada
sonda II común y 1 - 500 fmol del producto de ADN aislado
/secuencias diana (véase el ejemplo 2).
Esta mezcla de reacción se precalentó durante 2
min a 94ºC y se centrifugó en una microcentrífuga Eppendorf durante
20 s, entonces se añadió 1 \mul de 4 U/\mul de Pfu ADN
ligasa (Stratagene, La Jolla, California). El LDR se cicló durante
40 vueltas de 94ºC durante 30 s y 64ºC durante 4 min en un ciclador
térmico rápido para PCR (Hybaid, Reino Unido).
\newpage
Los productos de reacción de LDR se hibridaron
con la micromatriz Pamchip en la que se han moteado las secuencias
Zipcode que son complementarias a los ZipComcode.
A partir de los siguientes microorganismos,
véase la tabla 1, el ADN genómico se aisló y purificó usando el kit
genómico de Qiagen (Westburg, Leusden, los Países Bajos). El ADN
plantilla primario se preparó usando las enzimas de restricción
EcoRI y Mse1.
El análisis de AFLP se realizó como se describe
por Vos y col., anteriormente, excepto que se omitió la selección
de perlas de estreptavidina. Las PCR se realizaron usando pares de
cebadores procedentes de cada uno de los dos conjuntos de
cebadores. Todos los cebadores en el conjunto de EcoRI incluyeron la
secuencia flanqueada E: 5’ - GACTGCGTACCAATTC- 3’) [SEQ ID Nº: 1]
con 1 ó 3 extensiones de pares de bases. Los cebadores del conjunto
de Msel tienen la secuencia M: 5’ - GATGAGTCCTGAGTAA - 3’ [SEQ ID
Nº: 2] con 1 ó 3 extensiones de pares de bases. Las combinaciones
de cebadores (E_{A} y M_{C}) y (E_{C} y M_{A}) se usaron
para la amplificación previa de la plantilla microbiana primaria.
Para reducir el número de fragmentos de AFLP se usaron tres
nucleótidos selectivos por cebador para generar fragmentos de AFLP
a partir de las plantillas secundarias. Las bandas de AFLP se
marcaron con una sonda radiactiva según las instrucciones del
fabricante (Amersham Pharmacia). Las bandas de AFLP marcadas se
separaron mediante electroforesis en geles de secuenciación
desnaturalizantes de poliacrilamida al 6% (p/v) y se visualizaron
mediante la exposición de película para rayos X al gel secado. Las
bandas de aislamiento de los fragmentos de AFLP y de AFLP diana de
clonación en la autorradiografía se ajustaron al área
correspondiente en el gel y los fragmentos de AFLP apropiados en el
intervalo de 20 a 250 nucleótidos se suprimieron del gel secado.
Las bandas se eluyeron del gel mediante incubación en 100 \mul de
agua destilada a 4ºC durante 1 h.
Para cada una de las especies se eligieron al
azar 5 bandas en el intervalo de 20 a 250 nucleótidos, se aislaron
como se describe para las bandas de AFLP, se amplificaron y se
clonaron en un vector de PCR adecuado, por ejemplo
pGEM-T (Promega, Leiden, los Países Bajos) o
pCR2,1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Ca, EE.UU.).
Después de clonar en el huésped K12 de
Escherichia coli se secuenciaron 5 colonias de cada banda
transformada seleccionada usando el kit de secuenciación de ADN
Sequenase version 2.0 (United States Biochemicals, Cleveland, Ohio,
EE.UU.). La determinación de la secuencia de ADN en los clones K12
de E. coli permitieron a los cebadores de PCR diseñarse para
cada secuencia de ADN única usando el software Oligo 5.0 (PE
Biosystems, Foster City, California, EE.UU.). Los productos de PCR
se analizaron en geles de agarosa Metaphor al 4% (p/v) (FMC,
Rockland, Me, EE.UU.).
Todas las secuencias de ADN obtenidas de los
experimentos con AFLP^{MR} han sido tratadas con Blast con ayuda
de las bases de datos Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov), TIGR
(www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html) o IECB de la
Universidad de Viena: www.sondabase.net. Además, se
eliminaron todas las secuencias de ADN obtenidas de los
experimentos de AFLP^{MR} que mostraban homologías internas o
externas y quedan fuera del intervalo de Tm deseado (50 -
75ºC).
Las secuencias restantes, que son específicas
para especies, se llamaron "secuencias/etiquetas distintivas".
El proveedor sintetizó secuencias/etiquetas distintivas adecuadas en
el intervalo de 20-60 nucleótidos (Proligo, París,
Francia o Eurogentec, Lieja, Bélgica, o Metabion, Martinsried,
Alemania).
Estas secuencias/etiquetas distintivas se han
usado para desarrollar la amplificación múltiplex y/o tipificación
de micromatrices.
Las micromatrices se preparan usando chips Pam
diseñados para inmovilizar covalentemente oligonucleótidos
modificados según la enseñanza del documento WO95/11755, como se
describe en el ejemplo 3.
La micromatriz de Zipcode universal junto con
secuencias de control positivas y negativas se diseña como se
describe en el ejemplo 3.
Las muestras de ADN/ARN objeto de investigación
se amplifican y se marcan en presencia de los cebadores apropiados
según el protocolo de LDR como se describe en el ejemplo 4. La mitad
de los productos de reacción con SNPWav^{MR} se analizan en una
estación MegaBACE. La otra mitad de los productos de reacción con
SNPWave^{MR} se hibridan con la micromatriz Zipcode.
Las incubaciones se realizan en una incubadora
termostáticamente controlada que sujeta un chip que está constituido
por cuatro micromatrices. Cada micromatriz se hibrida con una
muestra que emite pulsaciones hacia adelante y hacia atrás de la
disolución diana a través de los poros del sustrato de micromatriz
usando una bomba de jeringa Microlab 500 (Hamilton, Nevada, EE.UU.)
a una velocidad de 20 \mul por 10 segundos. La monitorización en
tiempo real de la reacción es posible con un microscopio Olympus
BX41 o FD10 (Olympus, Tokio, Japón) con una cámara CCD de 8 bit
(Kappa OptoElectronics GmbH, Alemania y programa de captura
asociado).
Cada matriz se humedece previamente (mediante
bombeo) con 2 lavados de 25 \mul de PBS más Tween 20 al 0,1%
(Sigma), luego se aclara dos veces con 25 \mul de 0,6 x SSC
durante 30 segundos antes de la hibridación. La hibridación y
detección se lleva a cabo en un volumen de 25 \mul de 0,6 x SSC
con bombeo continuo de la mezcla arriba y abajo de la matriz. La
diana, bien 5 \mul de producto de PCR (aproximadamente 0,2 pmol)
a 95ºC directamente desde el ciclador de PCR, o bien 0,5 pmol de la
diana apropiada, se añade a la disolución de hibridación sobre la
matriz. Después de añadir la diana al tampón de hibridación sobre la
matriz se permite que la hibridación continúe durante 20 minutos a
una temperatura fijada previamente de 55ºC, para permitir que la
hibridación alcance el equilibrio. Se captura una imagen de
Microsoft Windows bitmap (BMP) en el momento en el que la
disolución de hibridación está por debajo de la matriz, y entonces
la temperatura se aumenta aproximadamente 1ºC cada 2 minutos. Se
captura una imagen distinta para cada aumento de un grado en la
temperatura.
Las imágenes se analizan usando el software
ArrayPro (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EE.UU.). Las señales
medianas se calculan usando la eliminación de fondo de esquinas
locales para cada punto y los datos se exportan a Excel (Microsoft)
para análisis adicional.
Puede usarse cualquier procedimiento de ácidos
nucleicos que dé como resultado el aislamiento del ARN ribosómico.
En este ejemplo se usó el procedimiento de Boom (véase
anteriormente) para extraer ADN y ARN de un cultivo de S.
aureus (289) y S. epidermidis (286) después del deterioro
enzimático inicial de la lisostafina de la pared celular
bacteriana. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación de
0,5 ml de caldo y se volvieron a suspender en 100 \mul de agua.
Se añadió 1 \mul de una disolución de 1 mg/ml de lisostafina y la
suspensión se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Una alícuota de 2 \mul de este extracto se
calentó durante 2 minutos en presencia de 1 \mul de disolución 1
\muM de una sonda fluorescente marcada (sonda de apilamiento Staph
23S) complementaria para una región del ARNr 23S de estafilococo
(figura 1).
La mezcla de sondas de muestras calientes se
añadió inmediatamente a un PamChip húmedo (van Beuningen y col.
Clin. Chem. 47:1931-1933) moteado con tres
oligonucleótidos específicos para diferentes especies de
estafilococos (Anthony y col. (2000) J.Clin.Microbiol.
38:781-788) que contenían 25 \mul de una
disolución de 0,6 x SSC a 55ºC. El chip se monitorizó bajo un
microscopio de fluorescencia a la vez que se bombeaba la disolución
de hibridación a través de PamChip una vez cada 30 segundos y se
registraba cualquier señal. La señal se detectó en el plazo de 1
minuto. Se permitió que la hibridación continuara durante 10
minutos, tiempo después del cual la señal era muy intensa (figura
2). La identidad de cualquier secuencia detectada se confirmó
mediante el calentamiento de PamChip hasta 65ºC y se monitorizó
cualquier disminución en la señal fluorescente (figura 3). Se
detectó una señal específica del punto correspondiente a las
especies de las que se extrajo el ARNr.
Este experimento demuestra que es práctica la
rápida identificación de bacterias en paralelo, directa y específica
sin la necesidad de marcado o amplificación enzimática.
Para el análisis se eligieron las siguientes 20
cepas de Salmonella:
1. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Agona
2. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Anatum
3. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Bovismorbificans
4. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Braenderup
5. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Brandenburg
6. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad DT104
7. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Dublin
8. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Enteritidis
9. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Goldcoast
10. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Hadar
11. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Heidelberg
12. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Infantis
13. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Livingstone
14. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad München
15. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Newport
16. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Oraniënburg
17. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Panama
18. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Saintpaul
19. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Thyphimurium
20. Salmonella enterica ssp. enterica
serovariedad Virchow
Los cultivos puros se inocularon en caldo
nutriente y se cultivaron en o/n a 37ºC. Un ml de este cultivo o/n
se usó para el aislamiento de ADN usando el kit de aislamiento de
ADN genómico de Qiagen según los procedimientos recomendados por el
fabricante (Qiagen, Westburg, Leusden, los Países Bajos).
El análisis de AFLP se realizó usando la
combinación de cebadores NlaIII-TaqI como se
describe por Vos y col., Nucleic Acids Research
23(21), (1995), 4407-4414. Las PCR se
realizaron usando pares de cebadores procedentes de un cebador de
AFLP TaqI y NlaIII. Todos los cebadores de AFLP para NlaIII incluían
la siguiente secuencia flanqueada: 5’-
GACTGCGTACACTAG-3’ con 2 extensiones de pares de
bases. Los cebadores de AFLP para TaqI incluían todos la siguiente
secuencia flanqueada: 5’-GATGAGTCCTGAGCGA-3’ con 2
extensiones de pares de bases.
Se usaron cuatro cebadores NlaIII +2 en
combinación con cuatro cebadores TaqI +2 dando 16 combinaciones de
cebadores (todas las combinaciones posibles por emparejamiento). Los
cebadores NlaIII se marcaron en el extremo mediante fosforilación
del 5’-OH con ^{33}p-ATP como se describe por Vos
y col., Nucleic Acids Research 23(21), (1995),
4407-4414. Las 16 combinaciones de cebadores de AFLP
se usaron para generar AFLP en todas las 20 serovariedades de
Salmonella descritas en el "ejemplo 8". Las combinaciones de
cebadores de AFLP usadas se describen a continuación.
Los fragmentos de AFLP se separaron mediante
electroforesis en geles de secuenciación desnaturalizantes de
poliacrilamida al 6% (p/v) como se describe por Vos y col.,
Nucleic Acids Research 23(21), (1995),
4407-4414. Después de la electroforesis, los geles
se transfirieron a papel de 3 mm Whatman (Whatman plc, Kent, R.U.)
y se secaron sobre un secador de gel Slab gel dryer de BIORAD
(Biorad inc., Hercules, CA, EE.UU.). Todos los AFLP se visualizaron
mediante exposición del gel secado a película de rayos X (Eastman
Kodak, New Haven, CT, EE.UU.).
Las imágenes de autorradiografía de los AFLP de
las cepas de Salmonella del "ejemplo 8" se
inspeccionaron para fragmentos de AFLP potencialmente valiosos,
enfatizando en los fragmentos de AFLP que diferían entre las
diversas cepas. Se cortaron un total de 50 fragmentos potencialmente
interesantes del gel correspondiente secado y se volvieron a
hidratar durante 2 horas en 50 \mul de Tris-HCl 10
mM; EDTA 1 mM a pH 8,0. De este modo, los fragmentos de AFLP se
eluirán en la disolución acuosa. A continuación se usaron 10 \mul
de cada uno de los eluatos de AFLP para generar clones
recombinantes en E. coli usando el "kit de secuenciación
HTP Zero Blunt TOPO PCR Cloning" según las instrucciones
proporcionadas por el fabricante Invitrogen (Invitrogen Corp.,
Carlsbad, CA, EE.UU.). Los ADN plasmídicos se aislaron de 2 clones
de cada uno de los 50 acontecimientos de clonado usando el
procedimiento de aislamiento de ADN plasmídico alcalino de Bimboim
& Doly (Nucleic Acids Research 7[6], 1979,
1513-1523) dando 100 preparaciones de ADN
plasmídico. Los insertos de fragmentos de AFLP de cada uno de los
100 ADN plasmídicos se secuenciaron en un secuenciador de ADN
capilar MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ,
EE.UU.) usando el "kit DYEnamic ET Dye Terminator Kit"
(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.).
Se apareó la secuencia de los 50 fragmentos de
AFLP a la secuencia del genoma completo de Salmonella
thyphymurium LT2 (McCleland y col., Nature 413, [2001],
852-856; número de acceso a GenBank 16421550). Pudo
hacerse el seguimiento de todos los fragmentos hasta la secuencia
del genoma y para el análisis adicional se seleccionaron 36
segmentos genómicos correspondientes dispersos uniformemente por
todo el genoma completo.
Se usó el paquete de software
OLIGO-6 (MedSonda, Oslo, Noruega) para seleccionar
conjuntos de cebadores para PCR para la amplificación de los 36
segmentos de ADN genómico del "ejemplo 11" directamente a
partir de preparaciones de ADN genómico. Los conjuntos de cebadores
se seleccionaron para amplificar la secuencia que engloba los
fragmentos de AFLP originales y además al menos 50 pares de bases de
secuencias aguas arriba y aguas abajo. Además, el paquete
OLIGO-6 se usó para seleccionar cebadores de
secuenciación para la secuenciación directa de los productos de PCR
de los 36 pares de cebadores de PCR en dos direcciones. Las
reacciones de amplificación con los 36 pares de cebadores en 4
serovariedades seleccionadas de Salmonella (ejemplo 8) se
llevaron a cabo usando las mismas condiciones de PCR que para el
análisis de AFLP del "ejemplo 9", excepto que se usaron 10
pMol de cada cebador en un total de 50 \mul de volumen de
reacción. Veintisiete de los 36 pares de cebadores dieron un
producto de PCR bueno y uniforme en estos 4 ADN genómicos de
Salmonella. Estos 27 pares de cebadores se usaron
posteriormente para generar productos de PCR en las 20
serovariedades de Salmonella del "ejemplo 8".
Los fragmentos de PCR se secuenciaron en un
secuenciador de ADN capilar MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences,
Piscataway, NJ, EE.UU.) usando el kit "DYEnamic ET Dye
Terminator" (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.). Los
fragmentos se secuenciaron en dos direcciones usando los cebadores
de secuenciación seleccionados por el paquete de software
OLIGO-6.
Se alinearon las secuencias de los 20 productos
de PCR para cada uno de los 27 segmentos genómicos usando el
paquete de software ClustalW (libremente disponible del Instituto
europeo de Bioinformática, www.ebi.org, Hinxton, R.U.). En la
figura 6 se representa un ejemplo de 3 de tales alineamientos de
secuencias múltiples. En los 27 segmentos se identificaron un total
de 222 posiciones que tenían un polimorfismo potencial de un sólo
nucleótido (SNP). Un SNP se define en este contexto como una
posición de nucleótido en la que al menos una base se diferencia de
las otras bases en esa posición (figura 6); en la mayoría de los
casos se producirán dos variantes de secuencias en un cierto
porcentaje de los individuos probados, que se define como la
frecuencia alélica. Los SNP que tienen una frecuencia alélica de
aproximadamente el 50% son generalmente los más informativos.
Además de la frecuencia alélica, el contexto de la secuencia que
rodea el SNP es un aspecto importante para la selección de SNP.
Para el diseño de sondas de ligadura de la colección de SNP se
aplicaron los siguientes criterios principales:
\bullet Frecuencia alélica de aproximadamente
el 50%;
\bullet No más de 25 nucleótidos de SNP aguas
arriba y aguas abajo del SNP;
\bullet Un contenido G-C
promedio del 40 - 60% en los 25 nucleótidos aguas arriba y aguas
abajo del SNP.
Las sondas de
ligadura-amplificación tuvieron el siguiente diseño
(de 5’-3’), con segmentos a, b, c, d, e yendo desde el extremo 5’
hasta el extremo 3’ (figura 4A):
1. Segmento a de 20-30
nucleótidos complementario a la secuencia diana (figura 4A,
cSeq1);
2. Segmento b de 19 nucleótidos complementario
al cebador de amplificación 2 (figura 4A, cMse);
3. Segmento c de 19 nucleótidos idéntico al
cebador de amplificación 1 (figura 4A, Eco);
4. Segmento d de 24 nucleótidos que comprende la
secuencia ZipComcode (figura 4A, ZIP);
5. Segmento e de 20-30
nucleótidos complementario a la secuencia diana y localizado
inmediatamente aguas abajo del segmento a (figura 4A, cSeq2).
Todas las sondas se pidieron a Metabion GmbH
(Martinsried, Alemania).
Los cebadores de amplificación tuvieron la
siguiente secuencia:
Cebador 1 (Eco):
5’-FAM-GTAGACTGCGTACCAATTC-3’
Cebador 2 (Mse):
5’-GACGATGAGTCCTGAGTAA-3’
Los cebadores se pidieron a Metabion GmbH
(Martinsried, Alemania); FAM es el nombre para el colorante
fluorescente unido covalentemente al extremo 5’ del cebador 1 y se
usó para marcar los productos de amplificación.
Las reacciones de ligadura se llevaron a cabo en
un volumen de 10 \mul que contenía:
1,0 fMol de cada oligonucleótido de sonda de
ligadura-amplificación,
10^{4} moléculas de ADN diana de los
organismos que van a analizarse,
5 unidades de Taq ADN ligasa (New England
Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.),
1,0 \mul 10 x tampón etiqueta de Taq ADN
ligasa (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.), agua estéril
hasta un volumen final de 10 \mul.
La reacción de ligadura se incubó durante 30
segundos a 98ºC y posteriormente durante 20 horas a 55ºC en un
"iCycler" de Biorad (Biorad, Hercules, CA, EE.UU.).
Después de la ligadura se llevó a cabo un
tratamiento con exonucleasa para eliminar todas las sondas sin
reaccionar. Para este fin se añadieron 10 \mul de una disolución
que contenía 5 unidades de exonucleasa I y 5 unidades de
exonucleasa III en Tris-HCl 20 mM a pH 8,5. La
reacción se incubó 30 minutos durante 37ºC y a continuación durante
30 minutos a 80ºC.
Finalmente se llevó a cabo la reacción de
amplificación. Para este fin se añadieron 30 \mul de una
disolución que contenía 10 pMol del cebador 1, 10 pMol del cebador
2, 0,5 unidades de Amplitaq ADN polimerasa (Applied Biosystems,
Foster City, CA, EE.UU.), dNTP 0,35 mM (de una mezcla de dNTP 25 mM,
Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.) en
Tris-HCl 20 mM a pH 8,5. La PCR se llevó a cabo
usando las condiciones de amplificación como se describen por Vos y
col., Nucleic Acids Research 23(21), (1995),
4407-4414.
Las incubaciones se realizan en una incubadora
termostáticamente controlada que sujeta un chip que está constituido
por cuatro micromatrices. Cada micromatriz se hibrida con una
muestra que emite pulsaciones hacia adelante y hacia atrás de la
disolución diana a través de los poros del sustrato de micromatriz
usando una bomba de jeringa Microlab 500 (Hamilton, Nevada, EE.UU.)
a una velocidad de 20 \mul por 10 segundos. La monitorización en
tiempo real de la reacción es posible con un microscopio Olympus
BX41 o FD10 (Olympus, Tokio, Japón) con una cámara CCD de 8 bit
(Kappa OptoElectronics GmbH, Alemania y programa de captura
asociado).
Cada matriz se humedece previamente (mediante
bombeo) con 3 lavados de 50 \mul de 0,6 x SSPE (1 x SSPE = NaCl
150 mM, NaH_{2}PO_{4} 15 mM, EDTA 1 mM, pH 6,8). La hibridación
y detección se lleva a cabo en un volumen de 50 \mul de 0,6 x
SSPE que contiene 5 \mul de los productos de reacción (por
ejemplo, del ejemplo 15) con bombeo continuo de la mezcla de arriba
abajo de la matriz. La hibridación se lleva a cabo a 55ºC durante
10 minutos. Se captura una imagen TIFF de Microsoft de 12 bits al
final de los 10 minutos de hibridación.
Las imágenes se analizan usando el software
ArrayPro (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EE.UU.). Las señales
medianas se calculan usando la eliminación de fondo de esquinas
locales para cada punto y los datos se exportan a Excel (Microsoft)
para análisis adicional.
Se usó bacteriófago lambda de E. coli
(48.501 pares de base) para seleccionar un conjunto de 49 secuencias
ZIP. El genoma de ADN del bacteriófago se barrió usando el paquete
de software OLIGO-6 (MedSonda, Oslo, Noruega) para
seleccionar secuencias de 24-meros con una Tm de
aproximadamente 60ºC a NaCl 150 mM, sonda 100 pM, un contenido GC
del 40 - 60% y apareamiento mínimo de bases internas. A continuación
se representan como ejemplo 10 de tales secuencias ZIP derivadas de
lambda.
1. Se aisló ADN de las 20 cepas bacterianas
descritas en el ejemplo 8;
2. Se seleccionó un conjunto de 17 SNP para
discriminar diversas serovariedades (ejemplos 9, 10, 11, 12 y
13);
3. Se diseñaron sondas de
ligadura-amplificación como se describen en el
ejemplo 14 usando 17 de las 49 secuencias ZIP (ZCc) del ejemplo
17;
4. Se llevó a cabo una reacción de
ligadura-amplificación como se describe en el
ejemplo 15;
5. Se fabricó una micromatriz usando chips Pam a
la que se inmovilizaron covalentemente 196 oligonucleótidos
complementarios en un formato de 14 por 14 usando 4 conjuntos de 49
oligonucleótidos: se moteó una matriz 7 x 7 de oligonucleótidos
(Zipcode) en cuádruple. Los números de oligonucleótidos 2, 3, 4, 5,
6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19 fueron
complementarios a las 17 secuencias ZIPComcode de las sondas de
ligadura-amplificación de la etapa 3. Los
oligonucleótidos 1, 8, 20 y 21 se usaron para fines de control.
6. Se hibridó una alícuota de los productos de
PCR de la etapa 4 con micromatrices de la etapa 5, como se describe
en el ejemplo 16;
7. Se analizaron las imágenes de micromatrices
como se describe en el ejemplo 16 (véase la figura 5).
La figura 5 representa los resultados de los
productos de PCR hibridados con un chip Pam (en cuádruple). La
micromatriz proporciona un único modelo para cada serovariedad,
permitiendo la detección e identificación. El modelo se caracteriza
por la hibridación por sí mismo, además de la intensidad de la
hibridación.
1. Se tomaron dos muestras, una de leche en
polvo y una de carne de pollo. Se tomaron muestras de 100 g, que
posteriormente se transfirieron a 250 ml de EEB (caldo de
enriquecimiento para enterobacterias), y se incubaron durante 16
horas a 37ºC. La carne de pollo se trituró antes de transferirla al
medio EEB usando una picadora de carne habitual para uso
doméstico;
2. Después de la incubación se tomó un ml de
muestras de caldo y se aisló el ADN de las dos muestras como se
describe en el ejemplo 8;
3. Se seleccionó un conjunto de 17 SNP para la
discriminación de las diversas serovariedades como se describe en
el ejemplo 18.
4. Se diseñaron las sondas de
ligadura-amplificación como se describe en el
ejemplo 14: se diseñaron 2 conjuntos de 17 sondas cada uno
(ZIPComcode) usando 34 de las 49 secuencias ZIP del ejemplo 17.
Estos conjuntos de sondas eran idénticos, con la excepción de las
secuencias ZIPComcode, que eran completamente diferentes;
5. Se llevaron a cabo las reacciones de
ligadura-amplificación como se describen en el
ejemplo 15; el conjunto 1 de sondas se usó para tomar una muestra
procedente de la leche en polvo, el conjunto 2 de sondas se usó
para tomar una muestra procedente de la carne de pollo;
6. Se fabricó una micromatriz usando chips Pam
como se describe en el ejemplo 18. Los 17 oligonucleótidos
(Zipcode) complementarios a los 17 ZIPComcode del conjunto 1 de
sondas se localizaron por duplicado en el lado izquierdo del chip
Pam; los 17 oligonucleótidos (ZIPcode) complementarios a los 17
ZIPComcode del conjunto 2 de sondas se localizaron por duplicado en
el lado derecho del chip Pam;
7. Se mezclaron dos alícuotas de los productos
de PCR de la etapa 5 de la muestra 1 y muestra 2, respectivamente,
y se hibridaron con micromatrices de la etapa 6, como se describe en
el ejemplo 17;
8. Se analizaron las imágenes de las
micromatrices como se describe en el ejemplo 17 (véase la figura
7).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
<110> CHECK-POINTS BV
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<120> Procedimiento rápido para detectar
microorganismos en muestras de alimentos
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<130>
CHE-001-PCT
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<140> PCT/EP2004/005951
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-06-02
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 03447138.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-06-02
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
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<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipgactgcgtac caattc
\hfill16
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<210> 2
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgatgagtcct gagtaa
\hfill16
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<210> 3
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipgactgcgtac actag
\hfill15
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<210> 4
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipgatgagtcct gagcga
\hfill16
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<210> 5
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 5
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<210> 6
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 6
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<210> 7
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<210> 8
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<211> 24
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<212> ADN
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<223> - -
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> - -
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<400> 9
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\hfill24
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<210> 10
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> - -
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<400> 10
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\hfill24
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<210> 11
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> - -
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipgccttacata catctgtcgg ttgt
\hfill24
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<210> 12
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<400> 12
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\hskip1cm 000
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<210> 13
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> - -
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipacacatacga ttctgcgaac ttca
\hfill24
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<210> 14
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> - -
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipttacaggatg tgctcaacag acgt
\hfill24
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<210> 15
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> - -
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipgctcacaata attgcatgag ttgc
\hfill24
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<210> 16
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> - -
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<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcacgcactg actgacagac tgct
\hfill24
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<210> 17
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<211> 75
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<212> ADN
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Staphylococcus
epidermidis
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Staphylococcus aureus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcctcaatg tttcctgctg taatcttttt tttt
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus
epidermidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcctcaatg ttttcttgta caatcttttt tttt
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus
saprophyticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcctcaatg ttttcttgtc tgatcttttt tttt
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttgytcga acgaacaacc ccaacatcct ctcagata
\hfill38
Claims (46)
1. Un procedimiento para determinar la
presencia de microorganismos en una muestra, que comprende las
etapas de:
(a) capturar dichos microorganismos, si están
presentes,
(b) extraer ácidos nucleicos de dichos
microorganismos, comprendiendo dichos ácidos nucleicos ácidos
nucleicos diana,
(c) realizar una reacción de detección de ligasa
(LDR) en dichos ácidos nucleicos diana, que comprende:
- (c1)
- proporcionar un par de una primera sonda de ácido nucleico y una segunda sonda de ácido nucleico, comprendiendo dicha primera sonda de ácido nucleico una secuencia I específica para diana localizada en 3’ complementaria a una parte distinta de dicho ácido nucleico diana y comprendiendo dicha segunda sonda de ácido nucleico una secuencia II específica para diana localizada en 5’ complementaria a una segunda parte de dicho ácido nucleico diana localizado esencialmente adyacente a y en 3’ de dicha secuencia I específica para diana, en el que dicha primera sonda de ácido nucleico comprende además una sección I de unión del cebador localizada en 5’ (PBS(I)) y posiblemente un relleno, y dicha segunda sonda de ácido nucleico comprende una sección II de unión del cebador localizada en 3’ (PBS(II)) y posiblemente un relleno; y en el que la primera sonda de ácido nucleico o la segunda sonda de ácido nucleico comprende además una región (ZipComcode) que es (i) esencialmente complementaria a una región correspondiente de una sonda de captura en una micromatriz después de la amplificación y (ii) esencialmente no complementaria a dicho ácido nucleico diana, y (iii) que está localizada entre la secuencia específica para diana y la sección de unión del cebador;
- (c2)
- incubar dicho ácido nucleico diana con dicha primera sonda de ácido nucleico y dicha segunda sonda de ácido nucleico en condiciones que permitan la hibridación de ácidos nucleicos complementarios,
- (c3)
- conectar cualquier sonda esencialmente adyacente,
- (c4)
- proporcionar al menos un conjunto de dos cebadores, en el que el primer cebador (cebador I) es esencialmente idéntico a la sección I de unión del cebador, y el segundo cebador (cebador II) es esencialmente complementario a la sección II de unión del cebador, en el que dicho primer o dicho segundo cebador está marcado, con la condición de que:
- -
- el cebador II esté marcado si el ZipComcode está localizado en la primera sonda de ácido nucleico,
- -
- el cebador I esté marcado si el ZipComcode está localizado en la segunda sonda de ácido nucleico, o
- -
- el cebador I esté marcado si el ZipComcode está localizado en la primera sonda de ácido nucleico,
- (c4)
- amplificar cualquier ácido nucleico sonda conectado, iniciándose la amplificación mediante la unión de un cebador de ácido nucleico específico para una sección de unión del cebador, proporcionándose así ácidos nucleicos diana amplificados,
(d) hibridar los ácidos nucleicos diana
amplificados de la etapa (c) con una sonda de captura que está
presente en una micromatriz y comprende una región esencialmente
complementaria al ZipComcode (Zipcode), y
(e) detectar los ácidos nucleicos diana
hibridados de la etapa (d), por lo que se determina la presencia de
microorganismos.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicha primera sonda de ácido nucleico y/o dicha segunda
sonda de ácido nucleico se hibrida con un marcador genético.
3. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que se proporcionan 4 variantes de
dicha primera sonda de ácido nucleico, siendo dichas 4 variantes
sustancialmente idénticas, excepto que cada una de las 4 variantes
contiene un nucleótido diferente en su extremo 3’ final y cada una
de las 4 variantes contiene un sitio I de unión del cebador
diferente.
4. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que se proporcionan al menos dos
grupos de pares de primeras y segundas sondas de ácido nucleico, en
el que cada grupo de primeras y segundas sondas de ácido nucleico
se hibrida con un ácido nucleico diana específico, y comprende un
sitio I y/o II de unión del cebador específico.
5. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que se proporcionan al menos dos
grupos de pares de primeras y segundas sondas de ácido nucleico, en
el que cada grupo de primeras y segundas sondas de ácido nucleicos
se hibrida con un ácido nucleico diana específico, y la primera
sonda de ácido nucleico de cada grupo comprende un ZipComcode
específico.
6. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho microorganismo se selecciona
del grupo constituido por microorganismos eucariotas, procariotas
y/o virales.
7. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho microorganismo se selecciona
del grupo constituido por microorganismos de origen alimentario y
que se transmiten por el agua.
8. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho microorganismo se selecciona
del grupo constituido por Escherichia, Salmonella, Shigella,
Mycobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Listeria, Leuconostoc,
Bacillus, Staphylococcus, Clostridium, Vibrio, Enterococcus,
Enterobacter, Yersinia, Legionella, Campylobacter, Streptococcus,
Micrococcus, Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes,
Microbacterium, Acinetobacter, Enterobacteriaceae/coliformes,
Aspergillus, Neurospora, Geotrichum, Blakeslea, Penicillium,
Rhizomucor, Rhizopus, Trichoderma, Kluyveromyces, Candida,
Hansenula, Rhodotorula, Torulopsis, Trichosporon y
Saccharomyces.
9. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha etapa (a) va precedida de
un enriquecimiento de microorganismos, que comprende:
(a) crecimiento de dichos microorganismos en
medios selectivos, o
(b) crecimiento de dichos microorganismos en
medios no selectivos.
10. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha etapa (a) va precedida de
un enriquecimiento de microorganismos, que comprende concentrar los
microorganismos.
11. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha etapa de capturar
microorganismos se elige del grupo constituido por:
(a) filtración de una disolución acuosa, en la
que se capturan todas las partículas mayores del tamaño de
tamizado,
(b) captura de microorganismos por
anticuerpos,
(c) captura de microorganismos por ligandos,
(d) centrifugación,
(e) sedimentación,
(f) fuerzas electrostáticas,
(g) coagulación, y
(h) floculación.
12. El procedimiento según la reivindicación
11, en el que dicha filtración comprende el uso de un filtro que
tiene un tamaño de poro de aproximadamente entre 0,15 y 1,4 \mum,
y preferentemente entre aproximadamente 0,5 y 1,2 \mum.
13. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 11 ó 12, en el que dicha filtración comprende el
uso de un filtro que comprende una membrana cerámica de fibra hueca
o nitruro de silicio.
14. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, en el que dicha filtración comprende el
uso de un filtro Aquamarijn® o un filtro CEPAration®.
15. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha captura va seguida de la
separación de los microorganismos del resto de la muestra.
16. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha extracción de ácidos
nucleicos de dichos microorganismos comprende lisar los
microorganismos.
17. El procedimiento según la reivindicación
16, en el que dicho lisado se elige del grupo constituido por un
tratamiento con una lisozima, un pectinolítico o tiocianato de
guanidinio o mediante un tratamiento mecánico tal como sonicación o
el uso de un molino de perlas, mediante inyección de los
microorganismos en fenol caliente, y congelación ultrarrápida de
los microorganismos en nitrógeno líquido seguido por un tratamiento
mecánico.
18. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, que comprende además inactivar RNAsas.
\newpage
19. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en el que dichos ácidos nucleicos se
eligen del grupo constituido por ADN, ARNr, ARNt, ARNm, ARN completo
y ARNtm.
20. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en el que dicho ZipComcode está localizado
en la primera sonda de ácido nucleico entre la secuencia I
específica para diana y la secuencia de unión del cebador I.
21. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha primera sonda de ácido
nucleico está acoplada con su extremo 5’ al extremo 3’ de dicha
segunda sonda de ácido nucleico, posiblemente mediante una región
de relleno.
22. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, en el que dicha etapa de conexión (c3)
comprende el uso de una ligasa.
23. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 22, en el que dicho ARNr, ARNt, ARNm, ARN
completo o ARNtm se convierte en ADNc.
24. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23, en el que dicho ácido nucleico o dicho
ADNc se amplifica usando una técnica de amplificación seleccionada
del grupo constituido por PCR y LCR.
25. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24, en el que el ácido nucleico diana
amplificado está marcado.
26. El procedimiento según la reivindicación
25, en el que el ácido nucleico diana amplificado se marca durante
la amplificación.
27. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26, en el que dicha amplificación es
amplificación múltiplex.
28. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27, en el que dicho primer cebador está
marcado en su extremo 5’.
29. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, en el que dicha marca es una marca
fluorescente o una fosforescente.
30. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 29, en el que dicha marca fluorescente o
fosforescente se elige del grupo constituido por FAM, TET, JOE, NED,
HEX, (ET-)ROX, FITC, Cy2, Cy3, Cy5, Texas Red, TAMRA, Alexa, fluor
488^{MR}, Biodipy^{MR} FL, rodamina 123, R6G, Biodipy 530,
Alexafluor^{MR} 532 e IRDyes.
31. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 30, en el que dicha sonda de captura hibrida
específicamente con dichos ácidos nucleicos diana amplificados.
32. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 31, en el que dicha sonda de captura comprende
un Zipcode que es esencialmente complementario a un ZipComcode
correspondiente.
33. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 32, en el que dicho Zipcode hibrida
específicamente con un ZipComcode correspondiente.
34. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 33, en el que dicha sonda de captura puede
direccionarse espacialmente sobre dicha micromatriz.
35. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 34, en el que dicha micromatriz es una
micromatriz de flujo.
36. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 35, en el que dicha micromatriz es
Pamchip®.
37. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 36, en el que se detecta una señal después de
hibridar los ácidos nucleicos específicamente amplificados con la
sonda de captura.
38. El procedimiento según la reivindicación
37, en el que dicha señal es una señal fluorescente o una
fosforescente, y dicha señal fluorescente o fosforescente es
detectada por una cámara CCD o por barrido láser, por ejemplo FD10
System® o Pamalyzer®.
39. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 38, en el que los ácidos nucleicos diana
amplificados procedentes de al menos dos muestras se hibridan con
sondas de captura presentes es una única micromatriz.
40. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 39, en el que los ácidos nucleicos diana
amplificados hibridados con las sondas de captura correspondientes
en una micromatriz de flujo dan como resultado un modelo de
hibridación.
41. El procedimiento según la reivindicación
40, en el que dicho modelo de hibridación se compara con modelos de
hibridación guardados en una base de datos.
42. Un kit para determinar la presencia de
microorganismos en una muestra, que comprende un filtro, medios
para capturar microorganismos, medios para extraer ácidos nucleicos
de dichos microorganismos, medios para amplificar específicamente
dichos ácidos nucleicos, que comprende las sondas y cebadores como
se definen en la reivindicación 1, una micromatriz que comprende
sondas de captura con Zipcode, medios para analizar los ácidos
nucleicos amplificados y un manual de instrucciones.
43. El kit según la reivindicación 42, en el
que dicha micromatriz es una micromatriz de flujo.
44. Uso de al menos un par de una primera sonda
de ácido nucleico y una segunda sonda de ácido nucleico como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41.
45. Uso de un filtro como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 en el procedimiento según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41.
46. Uso de al menos un conjunto de dos
cebadores como se define en cualquiera de las reivindicaciones 28 a
30 en el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
41.
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