CN106811542B - 用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法，包括芯片载体，该芯片载体上固载有经化学修饰的用于检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的核苷酸探针；包括待测样品DNA提取、样品PCR扩增、PCR产物与芯片杂交、芯片杂交后的处理、杂交芯片的扫描及结果判读的步骤。优点是：针对每种弧菌变异区序列设计的特异性探针，显著提高了检测的特异性。本发明提高了鉴定参虾贝养殖区环境及生物体致病弧菌群的能力，同时极大地缩短了检测时间。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测领域，特别涉及用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法。
背景技术
随着人工养殖迅速发展，养殖水域生态变化，弧菌病已经成为海水养殖动物主要的细菌性病害之一。在世界各地养殖参虾贝水产动物中，由弧菌属(Vibrio)细菌引起的弧菌病(Vibriosis)是普遍流行且危害最大的细菌性疾病，给水产养殖业造成了严重的经济损失。研究表明，弧菌属中的副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌和灿烂弧菌在弧菌种群中占优势，广泛存在于自然海水中，导致弧菌病发生，且具有流行广、发病率高、危害大、死亡率高等特点，给参虾贝等海水动物的养殖造成了巨大的影响。因此，急需一种检测速度快、准确性高、特异性强的参虾贝养殖区致病弧菌的检测方法。
目前，海洋微生物检测方法一般为生化检测法，但该方法存在培养周期长，操作繁琐，特异性差等缺点。同时，由于自然环境中仅有小于1％左右的微生物为可培养，而基因芯片不需要活的细菌，只需有DNA即可。现有基因芯片设计的探针多是针对16S rRNA基因，而16S rDNA用于致病弧菌的检测比较保守，由于信息位点较少，因此构建的系统稳定性较差，用于鉴定亲缘关系较接近的细菌，容易产生偏差，引起假阳性，影响检测结果的准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可并行性的快速、高效、准确的检测参虾贝养殖区环境及生物体六种致病弧菌群的基因芯片和使用方法。
本发明的技术方案是：
一种用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片，包括芯片载体，其特殊之处在于：所述的芯片载体上固载有经化学修饰的用于检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的核苷酸探针，所述的用于检测副溶血弧菌的探针使用thermostable direct hemolysin和multidrug resistance protein为靶基因、所述的用于检测溶藻弧菌的探针使用23rDNA为靶基因、所述的用于检测鳗弧菌的探针使用methyl-accepting chemotaxis protein为靶基因、所述的用于检测哈维氏弧菌的探针使用glycolipid transfer protein为靶基因、所述的用于检测创伤弧菌的探针使用methyl-accepting chemotaxis protein为靶基因、所述的用于检测灿烂弧菌的探针使用putativepermeases of the drug/metabolite transporter为靶基因。各探针的基因序列如下：
进一步的，所述化学修饰为氨基修饰。
一种用于检测参虾贝养殖区环境及生物体致病弧菌群基因芯片的使用方法，包括待测样品DNA提取步骤；样品PCR扩增步骤；PCR产物与芯片杂交步骤；芯片杂交后的处理步骤；杂交芯片的扫描及结果判读的步骤，其特殊之处在于：所述的样品PCR扩增步骤中针对致病弧菌群不同菌种靶基因所设计的PCR扩增的引物序列如下：
所述的样品PCR扩增步骤中扩增体系为：PCR Mix 12.5μL；上游引物(20μmol/L)0.2μL；下游引物(20μmol/L)1μL；模板DNA 1μL；ddH2O 10.3μL；扩增程序为：①95℃5min；②95℃30s；③61℃或55℃30s；④72℃45s，返回到②35个循环；⑤72℃10min；⑥4℃保存。
进一步的，扩增程序③中，DJ1、DJ2、DJ6、DJ11退火温度为61℃；DJ7、D8、DJ13、DJ17退火温度为55℃。
本发明的有益效果：
通过副溶血弧菌使用thermostable direct hemolysin和multidrug resistanceprotein为靶基因、溶藻弧菌使用23rDNA为靶基因、鳗弧菌使用methyl-acceptingchemotaxis protein为靶基因、哈维氏弧菌使用glycolipid transfer protein为靶基因、创伤弧菌使用methyl-accepting chemotaxis protein为靶基因、灿烂弧菌使用putativepermeases of the drug/metabolite transporter为靶基因，设计针对副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的特异性探针，进行氨基修饰后，制作可用于快速检测参虾贝养殖区环境及生物体致病弧菌群的基因芯片，采用多重PCR技术同时扩增6种致病弧菌靶基因，在基因芯片上平行、快速地鉴定致病弧菌群。所设计的基因芯片能并行性的快速高效检测参虾贝养殖区环境及生物体6种致病弧菌，并且具有更加特异性和敏感性的特点。此外，针对每种弧菌变异区序列设计的特异性探针，显著提高了检测的特异性。本发明提高了鉴定参虾贝养殖区环境及生物体致病弧菌群的能力，同时极大地缩短了检测时间。
附图说明
图1为副溶血弧菌VP2和VP3特异性探针基因芯片验证结果图；
图2为溶藻弧菌VA2特异性探针基因芯片验证结果图；
图3为鳗弧菌LA3和LA4特异性探针基因芯片验证结果图；
图4为哈维氏弧菌VH1和VH2特异性探针基因芯片验证结果图；
图5为创伤弧菌VV7特异性探针基因芯片验证结果图；
图6为灿烂弧菌VS3和VS6特异性探针基因芯片验证结果图；
图7为副溶血弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；
图8为溶藻弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；
图9为鳗弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；
图10为哈维氏弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；
图11为创伤弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；
图12为灿烂弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；
图13为副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌混合模版基因芯片检测结果图；
图14为溶藻弧菌环境菌株基因芯片检测结果图；
图15为未知病原菌XZBYJ01基因芯片检测结果图；
图16为未知病原菌XZBYJ02基因芯片检测结果图。
具体实施方式
实施例1探针的设计及合成
1、目标检测菌种及靶基因
本发明选择参虾贝养殖区环境及生物体中重要的常见致病弧菌群作为检测对象，包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌。副溶血弧菌使用thermostable direct hemolysin和multidrug resistance protein为靶基因、溶藻弧菌使用23rDNA为靶基因、鳗弧菌使用methyl-accepting chemotaxis protein为靶基因、哈维氏弧菌使用glycolipid transfer protein为靶基因、创伤弧菌使用methyl-acceptingchemotaxis protein为靶基因、灿烂弧菌使用putative permeases of the drug/metabolite transporter为靶基因。
2、探针设计
本发明采用18-30bp的寡核苷酸探针。探针参数基本要求是特异性和高效性的杂交，应满足以下条件：①探针Tm值保持相近，在上下10℃范围内浮动；②形成二聚体和发夹结构的连续互补碱基数少于4个；③探针与非目标基因序列的连续匹配碱基数少于7个碱基；④探针与目标基因的错配碱基数少于4个碱基。
本发明针对不同菌种靶基因共设计10条探针，如表1所示：
表1探针信息表
3、探针合成
将表1的探针在5’端加上15个T的间隔臂，以减少DNA杂交时的空间位阻，提高杂交效率。同时在探针5’端进行氨基修饰，以备下一步与玻片上的醛基交联，将探针固定在玻片上。如表2所示：
表2合成探针信息表
实施例2基因芯片的制作
利用实施例1设计的探针制备用于检测参虾贝养殖区环境及生物体中重要的常见致病弧菌群的基因芯片，具体步骤如下：
1、探针母液的配制
用双蒸水将合成的探针(表2)稀释成100μmol/L的母液，再用点样缓冲液稀释至浓度20μmol/L；
2、点样前的准备
取100μL移至96/384孔板的A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1、H1、I1、J1孔，在K1孔加入100μL点样缓冲液；
3、点样
用美国Bio-Dot公司的AD1500基因芯片点样仪按照预先设定好的程序在醛基化基片上进行非接触式点样；每点点样量为0.5μL，点直径为200μm，点心间距为1.5mm，点样时环境相对湿度55-65％，温度23℃；
4、基因芯片的制备
将表2中经合成的检测探针以表3所示的点阵形式分布在醛基基片上，每条探针重复3次；
表3
5、点样后的处理
将点完样的芯片放到盛有探针固定增效剂的可密闭的敞口容器内，密闭后静置于30℃烘箱过夜，得到用于检测参虾贝养殖区环境及生物体中重要的常见致病弧菌群基因芯片。
实施例3
用于检测参虾贝养殖区环境及生物体中重要的常见致病弧菌群基因芯片(实施例2制备的)的使用方法，具体步骤如下：
1、待测样品采集及处理
将获得的水样用8μm无菌滤膜除去杂质，之后用0.22μm的滤膜过滤并收集滤膜，用无菌铝箔包裹，-20℃下保存；
泥样取自养殖环境底部2-5cm处底泥100g，采集样品于冰盒中运送至实验室；
动物样品用无菌剪刀剪取，无菌水冲洗3次，装入冻存管，放入液氮保存。
2、模板DNA制备
水样和泥样DNA分别用OMEGA水样DNA提取试剂盒(OMEGA Water DNA Kit,D5525)和土壤DNA提取试剂盒(OMEGA Soil DNA Kit,D5625)提取，动物样品致病菌DNA用天根细菌基因组试剂盒提取。
3、引物和探针的设计
从副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌6种不同致病弧菌相应基因序列以及部分相邻菌种的上述基因的序列，进行多基因序列比对，对每种致病菌引物进行设计，从而建立了由10条寡核苷酸探针和8对引物组成的参虾贝养殖区环境及生物体中重要的常见致病弧菌群基因芯片。
表4副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌和灿烂弧菌的靶基因的扩增引物
4、PCR扩增
(1)PCR反应体系
将表5中所示试剂分别加入PCR管中，震荡混匀，瞬时离心。
表5PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| Mix | 12.5 |
| 上游引物(20μmol/L) | 0.2 |
| 下游引物(20μmol/L) | 1 |
| 模板DNA | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | 10.3 |
(2)PCR反应条件
将以上提取的DNA作为PCR扩增模板，分别以对应的引物和PCR扩增条件进行反应，用1％琼脂糖凝胶电泳检测、观察PCR扩增效果。
表6PCR反应条件
注：DJ1、DJ2、DJ6、DJ11退火温度为61℃；DJ7、D8、DJ13、DJ17退火温度为55℃。
5、荧光标记PCR产物
(1)取各模板PCR合并后的产物8μL于无菌的0.2mL离心管中，作为模板；
(2)向每个样品管中加入杂交缓冲液8μL和1μL阳控，震荡混匀，瞬时离心
(3)将离心后的样品管放入PCR仪，99℃变性3min，立即冰浴3min，瞬时离心，然后，进行下一步芯片杂交。
6、杂交
(1)芯片预杂交
①将预杂交缓冲液在50℃预热；
②预杂交缓冲液与鲑精DNA按照体积比10:1的比例混合，置于PCR仪上99℃变性5min，立即冰浴3min，然后用移液器加到芯片的点样区，用适当大小的原位杂交专用盖玻片覆盖点样区；
③将芯片放入湿盒，置于水浴锅，65℃，1h；预杂交结束后，用ddH2O冲洗，后离心干燥。
(2)样品与芯片杂交
①将芯片正面朝上，平放于桌面，将芯片围栏贴于各点样区之间，放上芯片盖片(有凸台的一面朝向芯片)，上端先接触芯片，再缓缓盖下；
②用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入16μL荧光标记后的样品，样品会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凹台和芯片表面之间形成一道液膜；(注意：不要震动盖片或芯片，以免破坏液膜。)
③将芯片放入湿盒，置于水浴锅，65℃，2h，避光；
④杂交完毕的芯片依次用洗液A(1×SSC，0.2％SDS)、洗液B(0.2×SSC)、洗液C(0.1×SSC)在振荡培养箱中150r/min各洗15min。
7、扫描芯片
芯片洗涤完毕后，离心干燥，放于微阵列芯片扫描仪上检测，电脑收集数据。
8、结果判定
一个有效的杂交结果要符合二点要求：(1)空白点的信号平均值，即背景平均值要小于10；(2)质控点信号的平均值要高于背景平均值10倍以上。阳性杂交信号还要符合：(1)阳性点的信号平均值要高于背景平均值10倍以上；(2)阳性点与质控点的平均值比值要在0.4以上。非特异性信号的判定标准为：(1)阳性点与质控点的平均值比值要小于0.35；(2)非特异性点的信号平均值要小于8倍的背景平均信号值。
实施例4
将实施例2制备得到的用于检测参虾贝养殖区环境及生物体中重要的常见致病弧菌群基因芯片的特异性效果验证
将实验菌株靶基因的扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后再进行杂交显色，用于基因芯片特异性验证。验证结果如图1至图6所示，10条探针都能特异性结合各自目标病原菌的靶基因，无非特异性杂交信号。因此，所有自主设计的探针具有高度的特异性。
图1为副溶血弧菌VP2和VP3特异性探针基因芯片验证结果图；图2为溶藻弧菌VA2特异性探针基因芯片验证结果图；图3为鳗弧菌LA3和LA4特异性探针基因芯片验证结果图；图4为哈维氏弧菌VH1和VH2特异性探针基因芯片验证结果图；图5为创伤弧菌VV7特异性探针基因芯片验证结果图；图6为灿烂弧菌VS3和VS6特异性探针基因芯片验证结果图。检测结果所示，10条探针都能特异性结合各自目标病原菌的靶基因。
实施例5
将实施例2制备得到的用于检测参虾贝养殖区环境及生物体中重要的常见致病弧菌群基因芯片的具体应用效果检测
采用模式菌株：副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌；环境菌株：溶藻弧菌；未知病原菌：XZBYJ01和XZBYJ02检测验证。结果如图7至图15所示，所有自主设计的探针用来检测相应的致病弧菌只能特异性结合相应的靶基因，无非特异性杂交信号。因此，所有自主设计的探针具有高度的特异性。图7为副溶血弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图8为溶藻弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图9为鳗弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；
图10为哈维氏弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图11为创伤弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图12为灿烂弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图13为副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌混合模版基因芯片检测结果图；图14为溶藻弧菌环境菌株基因芯片检测结果图；图15为未知病原菌XZBYJ01基因芯片检测结果图；经鉴定为灿烂弧菌，图16为未知病原菌XZBYJ02基因芯片检测结果图；经鉴定为溶藻弧菌。
以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连海洋大学
<120> 用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法
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acaccactaa acaccaaagc cgagccaatc 30
Claims (4)
1.一种用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片，包括芯片载体，其特征是：所述的芯片载体上固载有经化学修饰的用于检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的核苷酸探针，所述的用于检测副溶血弧菌的探针使用thermostabledirect hemolysin和multidrug resistance protein为靶基因、所述的用于检测溶藻弧菌的探针使用23rDNA为靶基因、所述的用于检测鳗弧菌的探针使用methyl-acceptingchemotaxis protein为靶基因、所述的用于检测哈维氏弧菌的探针使用glycolipidtransfer protein为靶基因、所述的用于检测创伤弧菌的探针使用methyl-acceptingchemotaxis protein为靶基因、所述的用于检测灿烂弧菌的探针使用putative permeasesof the drug/metabolite transporter为靶基因，各探针的基因序列如下：
副溶血弧菌 VP2 CAAGATCCCAGACGAGATCTCTGACGAT；
VP3 TTACGGGCGTGGCAATCGTCATTTGTATG；
溶藻弧菌 VA2 GCGCAGTCGCTAGATTGCGTGGA；
鳗弧菌 LA3 TCATCCGACGGCACAACCATAGCCCACC；
LA4 GCAATGCCGTTATCGCCGAAGAGCCT；
哈维氏弧菌 VH1 CGACGGGCACTTCACCAAAAGCG；
VH2 CTTAAGGTTTCTAAGTCGGTTGCTGGTTTC；
创伤弧菌 VV7 TCAACACCGACAGCGAAAGCATTCAAACCG；
灿烂弧菌 VS3 CGATTAAAGAGGTGATTCAGACCACTGAGC；
VS6 ACACCACTAAACACCAAAGCCGAGCCAATC。
2.根据权利要求1所述的用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片，其特征是：所述化学修饰为氨基修饰。
3.一种使用如权利要求1所述的基因芯片用于检测参虾贝养殖区环境致病弧菌群的方法，包括待测样品DNA提取步骤；样品PCR扩增步骤；PCR产物与芯片杂交步骤；芯片杂交后的处理步骤；杂交芯片的扫描及结果判读的步骤，其特征是：所述的样品PCR扩增步骤中针对致病弧菌群不同菌种靶基因所设计的PCR扩增的引物序列如下：
副溶血弧菌 VP2 上游引物 ATTTGGATGACCGAAGTAGACA；
下游引物 CACCCACAAGGTCGAAAGA；
VP3 上游引物 GTCAGTTGATCGGTTTATTCAG；
下游引物 GCGAGCGTTGTCAGGTGTAG；
溶藻弧菌 VA2 上游引物 ATGGGGGGACGGAGAAGG；
下游引物 TACAAGGGTGGTATTTCAAGG；
鳗弧菌 LA3、LA4 上游引物 CCGACAAACTGATTATTACTGC；
下游引物 TGAAGACTAAAGCGATTAACGT；
哈维氏弧菌 VH1、VH2 上游引物 ACTGGATGCAAACACGCTGA；
下游引物 TTGTTGCGCCCAGTGGTA；
创伤弧菌 VV7 上游引物 GATGCGGGCAATAACCTGAC；
下游引物 AGCAACCACTGCGAAGCCAC；
灿烂弧菌 VS3 上游引物 TGTTGCCGCCAACCAAACT；
下游引物 GGTCGCCACAAGATCCACT；
VS6 上游引物 CATACCGACATTGCCTTCC；
下游引物 CCAAGCGGGTTTACTGTTC；
所述的样品PCR扩增步骤中扩增体系为：浓度为20 μmol/L PCR上游引物0.2μL；浓度为20 μmol/L PCR下游引物1μL；模板DNA 1μL；ddH2O 10.3μL；
扩增程序为：①95℃、5min；②95℃、30s；③61℃或55℃、30s；④72℃、45s，返回到②35个循环；⑤72℃、10min；⑥4℃保存。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：扩增程序③中，副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌的退火温度为61℃；灿烂弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌的退火温度为55℃。
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