CN108823325B - 鸭疫里默氏菌Imp基因的应用及其PCR检测试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于鸭疫里默氏菌Imp基因的PCR检测试剂盒及其方法，所述试剂盒含有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对；其中鸭疫里默氏菌Imp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明通过以Imp基因为靶基因对鸭疫里默氏菌进行检测，具有显著的特异性和较高的灵敏度，对鸭疫里默氏菌的早期检测具有重要意义。

Description

鸭疫里默氏菌Imp基因的应用及其PCR检测试剂盒和方法
技术领域
本发明属于畜禽检测领域，涉及鸭疫里默氏菌Imp基因的应用，还涉及基于鸭疫里默氏菌Imp基因的PCR检测试剂盒和相应的检测方法。
背景技术
鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)是鸭传染性浆膜炎的病原菌，该病是危害养鸭业重要疫病之一。本病呈急性或慢性败血症过程，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎以及部分干酪样输卵管炎、关节炎为特征。发病率为10％-90％，病死率高达80％，一年四季均可发生。世界各养鸭地区几乎都有该病流行，给养鸭业造成了巨大的经济损失。传统鉴定RA通常检测其培养特性、形态染色、生理生化特征、菌体的某些化学组成等表型指标，但用表型指标鉴定鸭疫里默氏菌存在不足，易与大肠杆菌、沙门氏菌等混淆。另外，传统的鉴定方法操作复杂，费时费力，不利于及时诊断病因、检查病原和控制病情的蔓延。针对鸭疫里默氏菌这些特点，许多研究学者建立了一些检测技术，如荧光抗体技术、ELLSA、免疫组化等相继报道，但在实践中都有不同程度的局限性，如需要针对不同血清型的抗体作为检测试剂。为了能快速、准确、简便的检测鸭疫里默氏菌，以分子生物学为基础的检测鉴定方法在实践检验中不断的取得新进展，是取代传统检测方法最具潜力的检测方法之一，其中，PCR以其敏感、特异、简便、快速的特点成为分子生物学水平的重要检测技术之一。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供检测鸭疫里默氏菌Imp基因的试剂在制备检测鸭疫里默氏菌的试剂盒的应用；本发明的目的之二在于提供基于鸭疫里默氏菌Imp基因的PCR检测试剂盒；本发明的目的之三在于提供利用所述PCR检测试剂盒检测鸭疫里默氏菌的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.检测鸭疫里默氏菌Imp基因的试剂在制备检测鸭疫里默氏菌的试剂盒的应用，所述鸭疫里默氏菌Imp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.基于鸭疫里默氏菌Imp基因的PCR检测试剂盒，所述试剂盒含有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对；所述鸭疫里默氏菌Imp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述试剂盒还含有Premix Taq Mix酶。
优选的，所述试剂盒采用25μL反应体系，具体为：
Figure BDA0001746120370000021
3.利用所述PCR检测试剂盒检测鸭疫里默氏菌的方法，包括如下步骤：根据鸭疫里默氏菌Imp基因序列设计如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物，同时提取待检测样本DNA，然后以提取的样本DNA为模板，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物，进行PCR扩增，根据扩增结果进行结果判定。
优选的，所述PCR扩增的条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s；共30个循环，72℃延伸10min，降温至16℃。
优选的，所述结果判定方法为，将PCR扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下观察到445bp处单一扩增条带，说明待检测样本中含有鸭疫里默氏菌。
本发明的有益效果在于：本发明公开了检测鸭疫里默氏菌Imp基因的试剂在制备检测鸭疫里默氏菌的试剂盒的应用，通过该方法检测鸭疫里默氏菌，检测时间短，检测成本低，准确性高，可检测多个血清型。避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、检出率低、假阳性或假阴性较多等缺点，降低了检测成本。本发明的检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，结果判定简单。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为特异性实验及部分临床菌株的检测结果(泳道1-8：RA CH-1(RCH)、RA CH-2、RCAD0166、RA ATCC11845、RCAD0150、RCAD0135、RCAD0147、RCAD088；泳道9：E.coli O6；泳道10：Salmonella paratyphi A CMCC50001；泳道11：Salmonella.typhimurium CMCC 50115；泳道12：Pasteurella.multiocida ATCC 6529；泳道13：ddH2O)。
图2为灵敏度评价实验检测结果(泳道1-9：DNA模板含量分别为150ng、15ng、1.5ng、150pg、15pg、1.5pg、150fg、15fg和1.5fg；泳道10：ddH2O；泳道M：DL2000bp分子量标准)。
具体实施方式
下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、鸭疫里默氏菌PCR方法的建立
设计特异性扩增鸭疫里默氏菌的引物对：通过生物信息学分析从鸭疫里默氏菌基因组DNA序列中找到Imp基因，Imp在其它革兰氏阴性菌中高度保守，具有多种重要的生物学功能，除了参与脂多糖输出装配到外膜的过程，还与菌体被膜的生成和细菌有机溶剂耐受性有关。将之作为鸭疫里默氏菌检测靶基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示。
(1)引物设计
将该基因的DNA序列输入到引物设计软件Primer Premier 5.0中设计引物，设置产物大小范围为100-500bp，从备选引物对中选择出引物，引物序列如下(引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成)：
上游引物：5’-aaaagaaaatgacttacct-3’(SEQ ID NO.2)；
下游引物：5’-tacatttgtataggtcctg-3’(SEQ ID NO.3)；
(2)DNA模板的制备
将鸭疫里默氏菌各种血清型的菌株分别接种至10ml的胰酶大豆肉汤液体培养基中，在37℃增菌12h后，取1ml菌液放入1.5ml的离心管中，3000r/min离心10min弃上清液后无菌双蒸水重悬，再在12000r/min离心5min，弃上清液，收集菌体。用无菌双蒸水重新悬浮菌体，在沸水浴中煮15分钟，立即取出，在-20℃放置30min；37℃解冻后，12000r/min离心5min，取上清液放置-20℃备用。
(3)PCR检测
PCR检测体系为25μL反应体系，具体为：Premix Taq Mix酶12.5μl，10μM引物对1.0μl，模板溶液1-2.5μl，最后用双蒸水补至25μl。PCR检测反应程序：先95℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环结束后，72℃延伸10min，降温至16℃结束。
(4)判断标准
所述判断具体为：取PCR扩增产物5μl，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观察，如果电泳结果出现相应的445bp单一扩增条带，则说明样品中含有鸭疫里默氏菌；如果没有出现相应的445bp单一扩增条带，则样品中不含有鸭疫里默氏菌。
结果：取PCR扩增产物5μl，采用1％的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯照射下观察到445bp单一扩增条带，说明所建立的PCR方法能检测鸭疫里默氏菌。
实施例2、鸭疫里默氏菌PCR检测方法特异性评价
分别按照实施1中DNA模板提取方法和PCR检测方法，对大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、多种血清型鸭疫里默氏菌菌株(保藏菌株或血清学试验鉴定为鸭疫里默氏菌的临床分离菌株，如表1所示)进行检测。
表1.特异性评价所用菌株及PCR试验检测结果
菌株编号 保藏号或临床分离鉴定的菌株 菌株名称及血清型 PCR结果
RA CH-1(RCH) CCTCC NO.M2017702 鸭疫里默氏菌血清1型 +
RA CH-2 鉴定血清型的临床分离株 鸭疫里默氏菌血清2型 +
RCAD0166 鉴定血清型的临床分离株 鸭疫里默氏菌血清2型 +
RA ATCC11845 ATCC11845 鸭疫里默氏菌血清6型 +
RCAD0150 鉴定血清型的临床分离株 鸭疫里默氏菌血清6型 +
RCAD0135 鉴定血清型的临床分离株 鸭疫里默氏菌血清7型 +
RCAD0147 鉴定血清型的临床分离株 鸭疫里默氏菌血清11型 +
RCAD088 鉴定血清型的临床分离株 鸭疫里默氏菌血清11型 +
E.coli O6 ATCC25922 大肠杆菌O6血清型 -
Salmonella Paratyphi A CMCC(B)50001 甲型副伤寒沙门氏菌 -
Salmonella.typhimurium CMCC(B)50115 鼠伤寒沙门氏菌 -
Pasteurella.multiocida ATCC 6529 多杀性巴氏杆菌 -
表1中，-：PCR结果为阴性：+：PCR结果为阳性。
特异性实验的检测结果见图1，从图1中可知，除了各血清型的鸭疫里默氏菌外，其余菌株在445bp处均没有特异扩增条带。
实施例3.鸭疫里默氏菌PCR检测方法灵敏度评价实验
以实施例1提取得到的鸭疫里默氏菌模板DNA经过OD260/280的测定，鸭疫里默氏菌总DNA溶液的浓度为150ng/μl，用无菌水做10倍梯度稀释，共稀释8个梯度，每个梯度分别取2μL加入PCR反应体系，按照实施例1步骤(3)中方法对DNA模板进行PCR扩增检测。取PCR扩增产物5μL，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像仪中观察凝胶电泳结果如图2所示。由图2可知，在第5条泳道可以看到清晰的条带，所对应DNA浓度15pg，具有极高的灵敏性。
实施例4.鸭疫里默氏菌疑似菌株的检测
利用实施例1建立的鸭疫里默氏菌特异性PCR检测方法对四川周边20多个规模化养殖场的鸭群中分离的50株疑似鸭疫里默氏菌临床分离株进行检测，同时进行鸭疫里默氏菌16S rRNA引物鉴定，将二者结果进行比较。
结果：利用实施例1建立的鸭疫里默氏菌特异性PCR检测方法从中检测出46株疑似菌株呈阳性结果，这46株疑似菌株的16S rRNA鉴定结果也呈阳性，同时PCR产物测序结果与鸭疫里默氏菌的一致性均在90％以上，确定为鸭疫里默氏菌。通过本实施证明，所建立的鸭疫里默氏菌的特异性PCR方法具有非常高的可靠性。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 鸭疫里默氏菌Imp基因的应用及其PCR检测试剂盒和方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2610
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgaagccaa attttcaata taaagcattg gcaaaaaaca gctccaaaaa tactttactt 60
attttaatta tcctaatttt taacaatttt ttagcacaaa acacccctcg tacaaatgct 120
aaaaatattg aggataaatc tgtaaaaaag gacagcctat cccctcgtaa agaatccctc 180
gagggtaccg tgaaaatgca atccgaaaac caaaggaatg atgttcaaaa gaaaatgact 240
taccttaaca aaaaggccaa agtacagtat ttggatatga ctatagaggc agattacata 300
tccataaact gggaaaatgg agatattttc gcaagagggg agcaagacga aaatgggaaa 360
attataactc ccgcttcctc tactcaagca ggtaaaaaat acgaatataa cgaggttaag 420
tttaacttta aaaataaaaa ggctattgcc tacaatgcta gaaccgaaga acaggaaggc 480
gttattgtag ctcaaaaaac aaaaaaggta aacgactctg ttttctttat gcgaaacgga 540
gtttacacta ctgatgaata ttttttaaag aaaaaagaca gtcttgcaga ctatcattta 600
gcagcaccta atatcaaatt gattaaaggg aaaaatgcct caagggtaat tacaggacct 660
atacaaatgt acatagagca agtccctacc cctctagtaa tgccatttgc aatactcccc 720
ttttctgata aaagaaccgc aggcatctta attccgagtt ttggagaaag acaagatgta 780
ggttttttcc tgaataactt tggttattac caacctatag gtgaacactt tgatttaaaa 840
gtcttcttag atttttatac caaaggaagt tggaacattc gtcccgagct aggttataag 900
aaaaactaca agtataatgg tgtcttctct gcagatgtag gtactacagt gcacggtata 960
aaaggactca gtacctactc taaatctagt acttatcgta ttacttggcg gcatactcaa 1020
gatgctaaag ctaatccatt ttttaacttt tctgcctctg tagatatggt tagtaatcgt 1080
ttttacaaca atacaatcaa taacagttat atcttcaatc aagatgttct tagaacacaa 1140
cagaactccg ccattagcat taccaaaaaa tttctcaatc tacctataag catcacagga 1200
agtgccactt actctcaaaa tttcgccaca ggagatgtta atatcagact tcctcagctc 1260
aatgtaatga taaaccaatt ctacctattc aagcctaaaa caggcgtaag aactggtctt 1320
ctagaaaata tttatgtaaa cacagggcta tcgctagata actatgtaaa taccactcaa 1380
aagcaagcct tcacaaaaga tatgtggagt aatatgcaaa ctggtataaa aatccccgta 1440
tcattaacta ccaatacatc tgtaatgaag tattttacac tctctttggg cgcaaacttc 1500
aataatgtat taactacaaa aactctaaac aaaagctaca accctataag taacaccaca 1560
gtaaatacct accaaaataa tattgctggg tactctactt tttctacttc cgctggttta 1620
cagaccgtaa tttatgggca agctaatttt aggaaaggag caaggataca agccataaga 1680
catatggttt ctcctagtgt gagcttttct tatacacctg actttggtaa atctaattgg 1740
ggatattacc gaaactttta cggtgcagat ggttctataa attcttattc tatatttgaa 1800
ggaagtattt ttggaacacc ctcccgtggg ctatctcaaa ctatcagctt taacatcaat 1860
aataatattg aaatgaaagt tcggtctaag acagactcta ctggagttaa aaagattaaa 1920
atatttgaaa atatcaatat ttctggaggc tataactttg cggctgaaaa attcaaatgg 1980
tcagctttca atatcagttc tcaaaactca ttctttgata ataagctgaa tataaactct 2040
agcctttcat tagaccctta taaaatagtg tttagttcag actccaacat aggagaacga 2100
gtggataagt ttggatattt taaccttcaa aattttaatg ttcaactatc ttatcctcta 2160
agtagtgctt tattcgcaag taaagacaag gacaaccaag caaagtataa aaccaaaggc 2220
agtataatgc aagagaaata ttcttttgat gatgataact atgcctattt tgaacagcct 2280
tggacactaa acatcaatgc taattacaac tactcaaagg ctcaaacaag atttggtact 2340
aaagtagctt ccataggact agatggtaac ataaaattaa ctccattttg gactatcagt 2400
ggtagtaccc attacgattt aattagcaaa gagttagctt acggaagatt aggcttctct 2460
agagaccaaa ggagttttac tatcaacttt aactgggtac ctttcggaag gtttaaggtc 2520
tatgattttt tcatcggcat caaagccaac atattaagag acgcagtaaa atacagagaa 2580
cgtagtttcc cacaacaaag cgatttttaa 2610
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaagaaaat gacttacct 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacatttgta taggtcctg 19

Claims (4)

1.检测鸭疫里默氏菌Imp基因的试剂在制备检测鸭疫里默氏菌的试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对，所述鸭疫里默氏菌Imp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.基于鸭疫里默氏菌Imp基因的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有PremixTaq Mix酶、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对，所述鸭疫里默氏菌Imp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种非疾病诊断目的检测鸭疫里默氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：根据鸭疫里默氏菌Imp基因序列设计如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物，同时提取待检测样本DNA，然后以提取的样本DNA为模板，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物，进行PCR扩增，根据扩增结果进行结果判定；所述结果判定方法为，将PCR扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下观察到445bp处的单一扩增条带，则说明待检测样本中含有鸭疫里默氏菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30 s，72℃延伸30 s；共30个循环，72℃延伸10 min，降温至16℃。
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