CN104962558A - 检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物及pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一对检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物ompA-F：5’-actcaaggaagagcggatca-3’；下游引物ompA-R：5’-gcttcagcagaaccaactcc-3’。本发明还提供包含有上述引物的PCR检测试剂盒。本发明的试剂盒操作简单方便，特异性和敏感性高；结果判定直观，电泳后眼观即可。

Description

检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物及PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物及PCR检测试剂盒。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）可引起家鸭、鹅、火鸡及多种家禽和野禽发病，导致的鸭的疾病称为鸭传染性浆膜炎（duck infectious serositis）。本菌易感染1～8周龄的鸭，尤其是2～3周龄的小鸭，一周龄以下或8周龄以上的鸭极少发病。本病的感染率有时可达90%以上，死亡率从5%至75%不等。目前鸭传染性浆膜炎在我国各养鸭省区均有发生，且发病率和死亡率很高，是危害养鸭业的重要细菌病之一，给养鸭业造成重大经济损失。

鸭疫里默氏杆菌血清型众多，目前报道确认的有21个血清型，我国目前至少存在13个血清型（1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14和15型），其中1、2和10型是流行的优势血清型。各血清型菌株间缺乏有效的交叉免疫保护，给疫苗预防带来了很大难度。

鸭疫里默氏杆菌感染在临床症状和剖检病变方面与大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌感染有相似的地方，容易引起误诊，应用分子生物学方法确诊该病至关重要。目前报道的检测鸭疫里默氏杆菌的方法有细菌分离培养、玻板凝集试验、试管凝集试验、琼脂扩散试验、荧光抗体技术、间接免疫酶组织化学法、聚合酶链反应（PCR）等。PCR方法简便、快速、特异性和敏感性好，在临床诊断中得到广泛的推广应用。

发明内容

本发明提供了一对检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物及相应的PCR检测试剂盒。本发明的试剂盒能够大批量检测临床样本，并且耗时短，成本低，操作简单方便。

本发明提供一对检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：

上游引物ompA-F：5’- actcaaggaagagcggatca -3’

下游引物ompA-R：5’- gcttcagcagaaccaactcc -3’。

上游引物ompA-F和下游引物ompA-R均位于鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A（ompA）基因上。

本发明的第二个目的是提供一种鸭疫里默氏杆菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：

上游引物ompA-F：5’- actcaaggaagagcggatca -3’

下游引物ompA-R：5’- gcttcagcagaaccaactcc -3’。

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

进一步地，所述阳性对照为含有鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A（ompA）基因的部分核苷酸序列的重组质粒，该部分核苷酸序列的长度为809bp，具体序列参见序列表中SEQ ID No.3。

本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，是以待测DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物电泳，若扩增到约809bp的DNA片段，判为阳性；反之，判为阴性。

优选地，所述PCR反应条件为：94℃ 5min，35个循环（94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s），最后72℃ 5min。

本发明的第四个目的是提供一种鸭疫里默氏杆菌的检测方法，是以待测DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物电泳，若扩增到约809bp的DNA片段，则检测到鸭疫里默氏杆菌。

优选地，所述PCR反应条件为：94℃ 5min，35个循环（94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s），最后72℃ 5min。

本发明的第五个目的是提供上述特异性引物、试剂盒、序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列在制备检测鸭疫里默氏杆菌的试剂中的应用。

本发明的试剂盒的优越性包括以下方面：

a．试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用，本发明中的试剂盒在检测样品时只需要移液器、移液器枪头、PCR仪以及台式离心机，普通实验室均可使用本试剂盒检测样本。

b．结果判定直观，电泳后眼观即可。

c．操作人员不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测。

d．成本低廉，经济实惠，大多使用者均可接受。

本发明提供了一种从临床样本或纯培养菌中检测鸭疫里默氏杆菌核酸的PCR方法，该方法不受鸭疫里默氏杆菌血清型的限制，能够检测各种血清型的鸭疫里默氏杆菌，具有广阔的应用前景。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明试剂盒的特异性检测实验结果；其中，泳道M为DL2000分子量标准；泳道1-5为鸭疫里默氏杆菌；泳道6-7为大肠杆菌；泳道8-9为沙门氏菌；泳道10-11为巴氏杆菌。

图2为本发明试剂盒的敏感性检测实验结果；其中，泳道M为DL2000分子量标准；泳道1-7的DNA模板量分别为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

本发明的一种鸭疫里默氏杆菌PCR检测试剂盒包括：

1．2×PCR TaqMix 5支（250μl/支）；

2．上游引物ompA-F 1支（50μl/支）；

3．下游引物ompA-R 1支（50μl/支）；

4．阳性对照DNA 1支（250μl/支）

5．阴性对照DNA 1支（250μl/支）；

6．灭菌去离子水 1支（1000μl/支）。

上述试剂盒可检测50份样本，-20℃冻存，保存期为1年。

其中，2×PCR TaqMix由市场购买；

上游引物ompA-F的序列为：

5’-actcaaggaagagcggatca-3’，

下游引物ompA-R的序列为：

5’-gcttcagcagaaccaactcc-3’。该引物序列可由人工合成。

阳性对照DNA：以鸭疫里默氏杆菌的基因组DNA为模板，以本发明中涉及的ompA-F和ompA-R为引物，扩增目的片段。扩增程序为：94℃5min，35个循环（94℃30s，60℃30s，72℃40s），最后72℃ 5min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用商品化试剂盒回收、纯化目的DNA片段，与pMD 19-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布含80μg/ml氨苄青霉素的营养肉汤琼脂平板，过夜培养后挑取单克隆菌株，接种到含80μg/ml氨苄青霉素的5ml营养肉汤内，37℃，200rpm，培养至对数生长期，经测序鉴定正确的菌株为阳性菌株。用细菌DNA提取试剂盒提取阳性菌株中的重组质粒pMD-ompA，作为阳性对照；

阴性对照DNA：多杀性巴氏杆菌CVCC386购买于中国兽医药品监察所。取甘油冻存的CVCC386菌株5μl，接种到5ml营养肉汤内，37℃，200rpm，培养至对数生长期，用细菌DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，作为阴性对照；

灭菌去离子水：去离子水121℃高压灭菌30min。

实施例2

本发明的鸭疫里默氏杆菌PCR检测试剂盒的使用方法为：

    1．从纯细菌培养物、病死鸭的脑组织、心血、肝脏、脾脏、肺脏等病料中提取总DNA。DNA的提取可使用商品化试剂盒。

    2．将试剂盒中的2×PCR TaqMix、上游引物ompA-F、下游引物ompA-R、灭菌去离子水和提取的DNA模板配制成PCR反应液，总体系50μl。同时用试剂盒中的阳性对照DNA作为模板，扩增阳性对照；用试剂盒中的阴性对照DNA作为模板，扩增阴性对照。PCR反应液的具体配制方法如表1：

表1

3．将上述配制好的PCR反应液置于PCR仪中，扩增目的片段，扩增程序如下：94℃5min，35个循环（94℃30s，60℃30s，72℃40s），最后72℃ 5min。

    4．电泳观察：取扩增产物各5μl，5μl/泳道DL2000分子量标准，以1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳30min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。扩增目的片段大小为809bp。

5．结果判定：阳性对照扩增到目的片段，阴性对照无目的片段时试验成立。若样品中扩增到约809bp的DNA片段，判为阳性；若无约809bp的DNA片段，判为阴性。

将扩增产物进行测序，其核苷酸序列为鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A（ompA）基因的部分核苷酸序列，长度为809bp。测序得到的核苷酸序列如下：ACTCAAGGAAGAGCGGATCATTTTGCTTTATCAACAGGTTTAGGTACAAACATTTGGTTAACTAAGAACTTTGGTCTTGGTATCCAAGGGGATTATGTTTCTACTCCAGTAGATAAGTCTAGATTGGCTAACTTTTGGCAAGCGTCAGCTTCATTGAACTTTAGATTTGGTAACAGAGATAAGGATAAGGATGGAGTGTTAGATAAAGACGATTTATGTTCAGAAACACCAGGTTTACCTGAATTCCAAGGTTGTCCAGATACAGATGGTGACGGTGTTCCAGATAAAGATGATAACTGTCCAGAAGTAGCAGGACCAGTAGAAAACAATGGTTGCCCTTGGCCAGATACAGACAAAGATGGTGTATTGGATAAAGACGATGCTTGTGTTGATGTAGCAGGACCAGCTGAAAATAACGGTTGCCCTTGGCCAGATACAGATAATGATGGAGTATTAGATAAAGATGATAAGTGTCCTAATGTTCCAGGTCTTCCAGAATACAAAGGTTGTCCTAAGCCTCAGGAAGCGTATGCAGTTGAAGCAACAGGAGCATTAAAGGGTATATTCTTTAACTTTAATAAAGCATCTATCAGATCTGAATCTAATACTAAGTTAGATCAAGCTGCTGAAGTGATTAAGTCTTCTAACGGAGGTACTTTCTTAGTAGTTGGTCATACAGATGTTAAAGGTAATGCTAACTATAACTTGAAACTTTCTAGAGAAAGAGCTGCATCTGTAGTAGCTGCTTTAGAAGCTAGAGGTGTTAACCCATCTCAGTTAAAATCTAAAGGAGTTGGTTCTGCTGAAGC

实施例3

本发明试剂盒的特异性检测

用细菌DNA提取试剂盒提取分离自鸭的20株大肠杆菌、20株沙门氏菌、15株巴氏杆菌、35株鸭疫里默氏杆菌的基因组DNA，以这些DNA样本作为模板，用本发明中的试剂盒进行PCR检测。结果表明，大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌均为阴性，鸭疫里默氏杆菌均为阳性，表明试剂盒特异性良好。

实施例4

本发明试剂盒的敏感性检测

    提取鸭疫里默氏杆菌RA-GD菌株的基因组DNA，分光光度计方法测定其DNA初始浓度为282ng/μl，调整其浓度至10ng/μl，然后依次稀释10倍，共得到7个浓度的DNA模板，其浓度梯度分别为10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl。每个浓度的DNA各取1μl 作模板，分别用本发明涉及的试剂盒进行PCR扩增。检测结果表明，本发明中的试剂盒检测限量为100pg，说明敏感性良好。

实施例5

从规模化鸭场采集到疑是鸭疫里默氏杆菌感染的鸭头129个，无菌取适量脑组织，用通用型基因组DNA提取试剂盒从脑组织中提取总DNA，每份DNA样本取5μl作为模板，用本发明涉及的试剂盒分别进行检测。同时，将脑组织涂布在含8%绵羊血的巧克力平板上，置于37℃，含5%二氧化碳的培养箱内培养24h，进行细菌分离。两种方法的检测结果为：细菌分离方法中阳性的样本有93份，阴性的有36份。用本发明的试剂盒进行检测，上述93份阳性的样本全部为阳性；36个阴性样本中有19份为阳性，17份为阴性。两种方法的符合率为93+17/129＝85.27%。

有19份样本用两种方法检测得到了不同的结果，我们对这19份样本再次进行细菌分离，挑取了大量的单克隆菌株进行鉴定，最终分离到了鸭疫里默氏杆菌，并同时分离到较多的大肠杆菌和沙门氏菌，这说明鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌或沙门氏菌在鸭群中的混合感染是普遍存在的。试验结果证实，本发明的PCR方法比细菌分离方法敏感。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

                         序列表

 

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>  检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物及PCR检测试剂盒

  

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

actcaaggaa gagcggatca                                                   20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gcttcagcag aaccaactcc                                                   20

 

 

<210>  3

<211>  809

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

actcaaggaa gagcggatca ttttgcttta tcaacaggtt taggtacaaa catttggtta       60

 

actaagaact ttggtcttgg tatccaaggg gattatgttt ctactccagt agataagtct      120

 

agattggcta acttttggca agcgtcagct tcattgaact ttagatttgg taacagagat      180

 

aaggataagg atggagtgtt agataaagac gatttatgtt cagaaacacc aggtttacct      240

 

gaattccaag gttgtccaga tacagatggt gacggtgttc cagataaaga tgataactgt      300

 

ccagaagtag caggaccagt agaaaacaat ggttgccctt ggccagatac agacaaagat      360

 

ggtgtattgg ataaagacga tgcttgtgtt gatgtagcag gaccagctga aaataacggt      420

 

tgcccttggc cagatacaga taatgatgga gtattagata aagatgataa gtgtcctaat      480

 

gttccaggtc ttccagaata caaaggttgt cctaagcctc aggaagcgta tgcagttgaa      540

 

gcaacaggag cattaaaggg tatattcttt aactttaata aagcatctat cagatctgaa      600

 

tctaatacta agttagatca agctgctgaa gtgattaagt cttctaacgg aggtactttc      660

 

ttagtagttg gtcatacaga tgttaaaggt aatgctaact ataacttgaa actttctaga      720

 

gaaagagctg catctgtagt agctgcttta gaagctagag gtgttaaccc atctcagtta      780

 

aaatctaaag gagttggttc tgctgaagc                                        809

Claims (9)

1.一对检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列为：

上游引物ompA-F：5’- actcaaggaagagcggatca -3’

下游引物ompA-R：5’- gcttcagcagaaccaactcc -3’。

2.一种鸭疫里默氏杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：

上游引物ompA-F：5’- actcaaggaagagcggatca -3’

下游引物ompA-R：5’- gcttcagcagaaccaactcc -3’。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A基因的部分核苷酸序列的重组质粒，该部分核苷酸序列的长度为809bp，具体序列参见序列表中SEQ ID No.3。

5.权利要求2-4任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：是以待测DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物电泳，若扩增到约809bp的DNA片段，判为阳性；反之，判为阴性。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR反应条件为：94℃ 5min，35个循环（94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s），最后72℃ 5min。

7.一种鸭疫里默氏杆菌的检测方法，其特征在于：是以待测DNA为模板，利用权利要求2所述的特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物电泳，若扩增到约809bp的DNA片段，则检测到鸭疫里默氏杆菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR反应条件为：94℃ 5min，35个循环（94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s），最后72℃ 5min。

9.权利要求1所述的特异性引物、权利要求2-4任一所述的试剂盒、序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列在制备检测鸭疫里默氏杆菌的试剂中的应用。