CN110241184A - 一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的rpa试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒及其检测方法。该试剂盒包含：含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液，醋酸镁，一对引物及一条探针。实验证明本发明的试剂盒灵敏度和特异性与qPCR法相当，整个反应时间在15min内完成，检测结果仅需要通过荧光曲线改变来判定。因此，本发明试剂盒具有快捷、高效、灵敏等优点，不仅为有效检测和鉴定鸭疫里默氏杆菌提供了技术手段，而且操作简便、快速，适用于临床兽医现场诊断和对鸭疫里默氏杆菌的科学研究。

Description

一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒及其用途

技术领域

本发明属于预防兽医学检验具体领域，涉及一种检测鸭疫里默氏杆菌的试剂盒及其用途，特别涉及一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA检测试剂盒及其用途。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)是革兰氏阴性短杆菌，可感染家鸭、鹅、雉鸡、火鸡、天鹅等(Glünder&Hinz,1989；Helfer&Helmboldt,1977)，自然条件下以家鸭最易感。本病可经消化道、呼吸道、皮肤伤口等多种途径感染，尤以脚蹼伤口最易感。家鸭(1-8周龄多见)感染后，可表现典型的纤维素性炎症，如纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等，部分慢性感染表现出神经症状和生长障碍等临床特征(Leavitt S&Ayroud M,1997)。

自1904年Rimer首次报道由RA引起鹅的“渗出性败血症”(Riemer,1904)和1933年Hendrickson和Hilbert从纽约长岛病死鸭体内成功分离和鉴定到病原菌Pfeifferellaanatipestifer(Hendrickson&Hilbert,1933)以来，英国、西班牙、泰国、日本、中国等国相继报道了该病的发生，因此本病呈世界各地分布，具有较高的发病率和死亡率，鸭场一旦感染后就很难彻底清除，并且易合并大肠杆菌和沙门氏菌感染，是引起养鸭业重大经济损失的传染病之一。

在我国鸭群中，RA广泛存在且血清型复杂，郭玉璞于1982年首次报道了RA血清1型的流行(郭玉璞等，1982)，此后，高福、程安春等鉴定的RA分离株均为血清1型(高福等，1987，程安春等，1996)。直到1997年，张大丙等分离鉴定到7个不同的血清型，包括血清2、6、10、11、13、14型。此后，程安春等(2003)又鉴定出16种血清型，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14，以及其他4个新的血清型，如22、23、24、25。疫苗免疫是现阶段较为普遍的预防措施，但是由于各型疫苗之间缺乏交叉保护，因此很多鸭场不推荐使用；另外，由于RA菌株之间的耐药性和致病力差异，抗生素治疗也不能从根本上清除RA。因此，严格的生物安全措施和鸭场定期监测能够避免RA的传播和感染。

目前为止，检测RA的方法包括：细菌分离培养、血清学抗体检测及分子基因诊断，其中分离培养是诊断RA的金标准，但需要无菌采集心、肝、脑等病料，配置TSA培养基，在含CO₂的环境中生长24-48h，只适用于实验室检测；血清学检测如平板凝集试验和琼脂扩散试验，这两种方法均涉及制备抗原的菌株来源问题，具有灵敏度低、特异性差、结果判断主观性强和不适合大批量检测等特点，限制了它们在临床中的广泛应用。ELISA诊断(刘爽等，2009；吴彩艳等，2009；季慕寅等，2015；高群，2015)用的抗原多以灭活的全菌体、超声波破碎菌体后的裂解物、脂多糖，重组的蛋白较多，但绝大多数报道仅仅初步建立了ELISA方法，并没有进一步对所建立的方法进行优化，也没有开展临床试验及验证ELISA方法的实际应用效果。分子诊断方法，如根据RA主要外膜蛋白基因设计特异性引物，用常规或多重PCR方法扩增RA的特异性目的片段，可确诊RA的存在(胡清海等，2002)；虽然该方法特异性高，敏感性强，但需要用核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性，不易基层推广。尽管环介导等温扩增方法(LAMP)具有更高的特异性和敏感性(吴彤等，2016)，并且耗时短，结果判定直观，不需特殊仪器设备，但该方法需要设计三对引物，增加了试验设计的难度，且扩增出很多条带，存在非特异性扩增，另外加样环境要求严格，模板易污染。因此，建立能够快速、特异检测RA抗原的试剂盒，实现快速诊断和基层推广，控制好RA的发生及流行，对减少养鸭业经济损失和提高经济效益具有重要的现实意义。

RPA技术是由以英国剑桥Babraham研究院建立的并由Twist Dx生物技术公司发明的(http://www.twistdx.co.uk/)。该技术以T4噬菌体的核酸复制机制为原理，反应所需原料有T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32、DNA聚合酶以及寡聚核苷酸；同时还需要引物、探针、模板、ddH₂O和Mg²⁺等。该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内DNA复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，摆脱了对热循环仪器的要求，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。目前RPA技术已经在一系列病原微生物的分子检测中得到应用，如结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、犬细小病毒、非洲猪瘟等。但据我们所知，国内外未见RPA技术在RA中的应用。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，针对鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白OMPA基因，建立并评估了基于RPA的快速诊断试剂盒，该试剂盒能够快速、特异、简单的鉴定鸭疫里默氏杆菌，实现快速诊断的目的，能够用于鸭疫里默氏杆菌的科学研究。

为实现本发明的发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明根据鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白OMPA基因设计引物和探针；通过NCBI中的Blast软件比对分析发现，该基因在GenBank中上传的不同血清型鸭疫里默氏杆菌之间具有高度的保守性；实验室通过测序发现该基因在临床不同分离株中均存在。因此本发明选取该基因全长中的一段(334bp-534bp)作为目的片段设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的鸭疫里默氏杆菌。针对RPA的检测特点，本发明分别设计合成了三对上游引物和一条下游引物，通过对引物与探针组合进行扩增效果评价，最终选出能产生强扩增信号的引物与探针组合应用到本发明中。所有的引物和探针都由金斯瑞(南京，中国)合成。

本发明提供一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒，所述试剂盒中包含：含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液、醋酸镁以及ddH₂O；还包括一对引物及一条探针，所述引物对和探针如下：

上游引物：5’-GCTAACTTTTGGCAAGCGTC-3’

下游引物：5’-GGTTTGTACTGGTCCTGCTAC-3’

探针：

5’-TGGAACACC[dT-Fam]G[dSpacer]T[dT-BHQ1]CACCATCTGTATCTG[C3-Spacer]-3’。

所述的探针序列中具有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，两个基团之间由dSpacer隔开，3’端由C3Spacer修饰。

所述RPA冻干颗粒(TwistDx exo kit,Cambridge,United Kingdom)包含噬菌体重组酶UvsX，辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白，dNTPS。

所述反应缓冲液为Rehydration Buffer。

作为优选，所述上游引物、下游引物和探针在所述RPA试剂盒中的终浓度为10μM。

作为优选，所述试剂盒的50μL反应体系如下：29.5μL的反应缓冲液，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.5μL，ddH₂O 11.5μL，鸭疫里默氏杆菌DNA模板或标准质粒2μL，以及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

本发明还提供上述RPA在检测鸭疫里默氏杆菌中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

本发明还提供上述鸭疫里默氏杆菌的检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：以待检测DNA为模板，采用上述的试剂盒进行重组酶聚合酶扩增，对扩增结果进行分析：荧光曲线明显上升的则含有鸭疫里默氏杆菌基因组DNA，反之则不含有鸭疫里默氏杆菌基因组DNA。

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增时，反应温度为20-40℃，反应时间为10min-35min。

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增时，反应温度为37℃，反应时间为15min。

相较于现有技术，本发明的方法具有以下优点：

A.节约时间：RPA整个实验过程只需要15min，该时间远远低于qPCR的1.5h。

B.降低反应温度：RPA在恒温37℃即可完成实验，该温度远远低于qPCR的60-95℃。

C.方法简单且试剂盒便于携带：扩增所需要的酶和其他一些必要的东西已经冻干保存，能常温放置，扩增时只需要加入反应缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，对操作人员专业要求低，适用于基层兽医现场诊断，也能够用于鸭疫里默氏杆菌的科学研究。

D.灵敏度高：本发明所设计的鸭疫里默氏杆菌的RPA引物和探针能够在37℃，扩增15min条件下检出最少45个拷贝的模板。

E.特异性强：本发明试剂盒中添加了探针，增加了检测的特异性，与现有的qPCR方法的符合度为100％。

F.不易于污染：本发明试剂盒中添加了核酸外切酶Ⅲ，对扩增产物进行切割，因此降低了产物污染的可能性。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为RPA实时荧光检测方法灵敏度分析。

图2为RPA实时荧光检测方法特异性分析。

具体实施方式

在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的原料、化学试剂均为常规市售商品，所用的技术手段为本领域技术人员所公知的常规手段。

实施例1一种快速诊断鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒及检测方法的建立

1.引物及探针序列的设计及制备

本发明根据鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白OMPA基因设计引物和探针；通过NCBI中的Blast软件比对分析发现，该基因在GenBank中上传的不同血清型鸭疫里默氏杆菌具有高度的保守性，因此本发明选取该基因全长中的一段(334bp-534bp)作为目的片段设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的鸭疫里默氏杆菌。所有的引物和探针都由金斯瑞(南京，中国)合成。本发明分别设计合成三对上游引物，一条下游引物以及一条探针序列，如表1所示。

表1鸭疫里默氏杆菌RPA引物和探针

2.菌株基因组及临床样品

本发明中所使用的鸭疫里默氏杆菌(CVCC3966株)、沙门氏菌(CVCC541株)、大肠杆菌(CVCC1560株)、巴氏杆菌(JN株)的基因组由本实验室保存。本申请发明人分别对不同血清型的鸭疫里默氏杆菌标准株、收集广西、江苏、山东三省的60份发病鸭及10份健康鸭全血进行试验。

3.菌株基因组提取

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIAamp Bacteria DNAKit)和血液基因组提取试剂盒(TIAamp BloodDNAKit)，按照说明书来提取鸭疫里默氏杆菌DNA，并最终用50μL的无RNase水洗脱。提取的DNA存放到-20℃备用。

4.标准质粒制备

提取鸭疫里默氏杆菌DNA。设计扩增OMPA全长中的一段(174bp-1127bp)作为目的片段(SEQ No.1)，引物为：

上游F：5’-AACTTACGCGGGGTATAGCG-3’,

下游R：5’-ACTGGAAGATCAGACTTCTGAAGAG-3’

以提取到的鸭疫里默氏杆菌DNA为模板，扩增条件为94℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸80s，共35个循环；72℃再延伸10min，4℃5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，以确定扩增得到大小为954bp的目的基因片段。用胶回收试剂盒进行PCR产物回收，与pMD-19T克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12h。筛选出阳性单菌落到含有氨苄青霉素的液体培养基中，37℃培养，取菌液2mL，提取质粒，测定序列阳性的为pMG-19T-954。

SEQ No.1:

5.Real-timeRPA试验扩增条件优化

以提取纯化的鸭疫里默氏杆菌DNA或标准质粒为模板进行扩增试验，实验体系如下：在含RPA冻干颗粒的反应管中加入29.5μL反应缓冲液(rehydration buffer,TwistDxexo kit,Cambridge,United Kingdom)，上下游引物(10μM)各2μL，探针(10μM)0.5μL，去离子水11.5μL，模板2μL及2.5μL280mmol/L的醋酸镁溶液。

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5’-GCTAACTTTTGGCAAGCGTC-3’

下游引物：5’-GGTTTGTACTGGTCCTGCTAC-3’

探针：

5’-TGGAACACC[dT-Fam]G[dSpacer]T[dT-BHQ1]CACCATCTGTATCTG[C3-Spacer]-3’。

在确定RPA引物的反应温度时，按照上述体系加入反应物。我们分别试验了20℃、25℃、30℃、35℃、37℃和40℃四个不同的反应温度，反应时间为20min，结束后通过Bio-Rad的实时荧光定量PCR仪软件对结果进行分析。通过对结果分析表明，37℃扩增结果最佳。所以本发明所设计的鸭疫里默氏杆菌RPA扩增温度设定为37℃。在确定PRA反应时间时，我们同样按照上述体系加入反应物，并在37℃下设定了6个不同的时间，分别为10min、15min、20min、25min、30min和35min，结果表明，扩增15min和扩增35min的阴性及阳性结果一致，因此，本发明所设计的鸭疫里默氏杆菌RPA扩增时间设定为15min。

同时本发明用该扩增体系分别对三对引物和探针的组合进行评价，结果表明其中一对引物(表1中的OMPA RPAF1/R)和探针的组合能产生强的扩增信号，因此本发明选用该引物和探针组合。

RPA试验结果判定：含有鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的反应管荧光曲线上升，阴性对照为平滑的直线。

6.RPA试剂盒和使用方法

RPA试剂盒包括以下成分：

含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液(rehydrationbuffer,TwistDx exo kit,Cambridge,UnitedKingdom)，上下游引物，探针，去离子水，标准质粒，280mmol/L的醋酸镁溶液。

50μL反应体系如下：

在含RPA冻干颗粒的反应管中依次加入29.5μL反应缓冲液(rehydration buffer,TwistDx exo kit,Cambridge,UnitedKingdom)，上下游引物(10μM)各2μL，探针(10μM)0.5μL，去离子水11.5μL，模板2μL及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

引物为表1中的OMPA RPAF1/R，探针为表1中所述探针。

将反应体系置于实时荧光定量PCR仪中进行扩增，RPA扩增条件为：37℃扩增15min，1min收集一次荧光信号，结束后通过实时荧光定量PCR仪对结果进行分析。

判断标准：含有鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的反应管荧光曲线上升，不含有鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的反应管为平滑的直线。

7.RPA试验灵敏度和特异性检测：

灵敏度检测：通过核酸测定仪测定阳性质粒pMD-19T-954的浓度为182ng/μL，pMD-19T载体的碱基数为2692bp，扩增产物大小为954bp，每个碱基的平均分子量为660道尔顿/bp，每μL样品中检测基因拷贝数按照公式计算：样本拷贝数(copies/μL)＝阿伏伽德罗常数(6.02×10²³)×质粒浓度ng/μL×10^-9/(660×重组质粒碱基数)，其中，重组质粒碱基数＝载体序列碱基数+插入序列碱基数，那么计算得出的拷贝数为4.55×10¹⁰copies/μL。对阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其浓度在10⁶～10⁰copies/μL之间，并将其作为RPA反应的模板。在温度为37℃的qPCR仪中进行扩增反应，时间设定为15min，1min收集一次荧光信号，采集扩增曲线，结果如图1所示，随着模板拷贝数的降低，扩增曲线时间和荧光信号值逐渐的下降，在拷贝数为10¹时仍有扩增曲线，当拷贝数为10⁰时没有明显的扩增曲线；表明在10⁶～10¹copies/μL范围内的样品均能被检测出来。

图1为RPA实时荧光检测方法灵敏度分析。其中，A：模板浓度为4.55×10⁶copies/μL的扩增曲线；B：模板浓度为4.55×10⁵copies/μL的扩增曲线；C：模板浓度为4.55×10⁴copies/μL的扩增曲线；D：模板浓度为4.55×10³copies/μL的扩增曲线；E：模板浓度为4.55×10²copies/μL的扩增曲线；F：模板浓度为4.55×10¹copies/μL的扩增曲线；G：模板浓度为4.55×10⁰copies/μL的扩增曲线。

特异性检测：按照上述体系添加反应物进行RPA检测，其中使用的模板分别为鸭疫里默氏杆菌(阳性对照)、沙门氏菌(CVCC541)、大肠杆菌(CVCC1560)、巴氏杆菌(JN株)。扩增反应在37℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为15min，1min收集一次荧光信号，采集扩增曲线；结果如图2所示，只有鸭疫里默氏杆菌能够进行很好的扩增，其他均未产生扩增曲线，说明该方法对检测鸭疫里默氏杆菌有较强的特异性。

图2为RPA实时荧光检测方法特异性分析。其中，A：阳性对照；B：沙门氏菌(CVCC541)；C：大肠杆菌(CVCC1560)；D：巴氏杆菌(JN株)；G：阴性对照(NC)。

8.RPA试验对样品的检测

本申请人用建立的RPA方法来检测8株不同血清型的鸭疫里默氏杆菌标准株(CVCC3967、CVCC3968、CVCC3969、CVCC3970、CVCC3971、CVCC3972、CVCC3973及CVCC3974)、采集自广西、江苏、山东三省的30份临床鸭脑组织、60份临床鸭以及10份健康鸭全血样本，并将结果与qPCR的间接结果相比较。结果如表2所示：在30份临床鸭脑组织中，RPA方法检测出25份阳性样品；60份临床鸭全血样品中，RPA方法检测出50份阳性样品，与qPCR检测结果完全一致。10份健康鸭的血清样品RPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都为阴性，符合率为100％。其中，qPCR方法参照文献(ZhangQ,Wan C,Li C,et al.Evaluation of aquantitative real-time PCR for rapid detection ofRiemerellaAnatipestiferinfection in birds.J vet Med Sci,2017,79(12):2057-2062)方法进行。

表2比较RPA和qPCR方法的临床样品检测结果

9.重复性实验

按上述反应体系，以pMD-19T-954标准质粒(4.55×10⁶copies/μL～4.55×10⁰copies/μL)为模板进行稳定性检测。在同一个试验中对每个稀释度的标准质粒做3个重复孔，以分析组内差异；用上述相同条件分别进行3次独立重复实验，分析组间差异，计算其变异系数，变异系数(CV)＝标准偏差(SD)/平均数(X)。采用SPSS19.0软件进行统计学分析，方差分析用于比较不同样本之间的差异，P＜0.05有统计学意义。结果表明：组内各孔之间CV值在0.34％～0.84％之间，组间重复测定CV值在0.41％～0.93％之间，均小于1％(表3)。

表3 Real-time RPA检测鸭疫里默氏杆菌组内和组间重复性

注：表中为平均值，S为标准差，CV为变异系数。

综上所述，本发明设计的一种基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的鸭疫里默氏杆菌检测剂盒可以快速诊断鸭疫里默氏杆菌，而且检测方法简单、快速、检测结果真实可靠。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒及其用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacttacgcg gggtatagcg aaaataaacc atacactcaa ggaagagcgg atcattttgc 60

tttatcaaca ggtttaggta caaacatttg gttaactaag aactttggtc ttggtatcca 120

aggggattat gtttctactc cagtagataa gtctagattg gctaactttt ggcaagcgtc 180

agcttcattg aactttagat ttggtaacag agataaggat aaggatggag tgttagataa 240

agacgattta tgttcagaaa caccaggttt acctgaattc caaggttgtc cagatacaga 300

tggtgacggt gttccagata aagatgataa ctgtccagaa gtagcaggac cagtacaaac 360

caatggttgc ccttggccag atacagacaa agatggtgta ttggataaag accatgcttg 420

tgttgatgta gcaggaccag ctgaaaatac cggttgccct tggccagatc cagataatga 480

tggagtatta gataaagatg ataagtgtcc taatgttcca ggtcttccag aatacaaagg 540

ttgtcctaag cctcaggaag cgtatgcagt tgaagcaaca ggagcattaa agggtatatt 600

ctttaacttt aataaagcat ctatcagatc tgaatctaat actaagttag atcaagctgc 660

tgaagtgatt aagtcttcta acggaggtac tttcttagta gttggtcata cagatgttaa 720

aggtaatgct aactataact tgaaactttc tagagaaaga gctgcatctg tagtagctgc 780

tttagaagct agaggtgtta acccatctca gttaaaatct aaaggagttg gttctgctga 840

agctacagtt cctgcatctg cttctaacga agagagaatg aaagacagaa aagtggttgt 900

agaagcaatc agcggatctg cttgggaagc tcttcagaag tctgatcttc cagt 954

Claims (7)

1.一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的RPA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含：含RPA冻干颗粒的反应管，反应缓冲液、醋酸镁以及ddH₂O；还包括一对引物及一条探针，所述引物对和探针如下：

上游引物：5’-GCTAACTTTTGGCAAGCGTC-3’

下游引物：5’-GGTTTGTACTGGTCCTGCTAC-3’

探针：

5’-TGGAACACC[dT-Fam]G[dSpacer]T[dT-BHQ1]CACCATCTGTATCTG[C3-Spacer]-3’。

2.根据权利要求1所述的RPA试剂盒，其特征在于：所述上游引物、下游引物和探针在所述RPA试剂盒中的终浓度为10μM。

3.根据权利要求1所述的RPA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的50μL反应体系如下：29.5μL的反应缓冲液，10μM上下游引物各2μL，10μM探针0.5μL，ddH₂O 11.5μL，鸭疫里默氏杆菌DNA模板或标准质粒2μL，以及2.5μL 280mmol/L的醋酸镁溶液。

4.权利要求1-3任一项所述的RPA试剂盒在检测鸭疫里默氏杆菌中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

5.鸭疫里默氏杆菌的检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：包括以下步骤：以待检测DNA为模板，采用权利要求1-3任一项所述的试剂盒进行重组酶聚合酶扩增，对扩增结果进行分析：荧光曲线明显上升的则含有鸭疫里默氏杆菌DNA，反之则不含有鸭疫里默氏杆菌基因组DNA。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述重组酶聚合酶扩增时，反应温度为20-40℃，反应时间为10min-35min。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述重组酶聚合酶扩增时，反应温度为37℃，反应时间为15min。