CN104805215B - 人用布氏菌弱毒疫苗株104m的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种人用布氏菌弱毒疫苗株104M的Taqman-MGB荧光定量PCR快速检测方法。本发明用于检测人用布氏菌弱毒疫苗株104M的引物组，其序列为SEQ ID NO：1-3。本发明引物组的高效灵敏：在1.5h的时间里，即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为1.0×10^-4ng/μl；特异性强：采用MGB标记的荧光探针，特异性针对104M基因组产生荧光扩增信号，而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常见非布氏菌株，不产生荧光扩增信号；操作简便：配置好的Taqman-MGB荧光定量PCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。

Description

人用布氏菌弱毒疫苗株104M的快速检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种人用布氏菌弱毒疫苗株104M的Taqman-MGB荧光定量PCR快速检测方法。

背景技术

布氏菌病(简称“布病”)是由布氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病。人感染布病后，急性期表现为间歇热、乏力、多汗、肌肉和骨关节疼痛及神经痛等；部分患者会转化为慢性布病，症状为惯性疲劳、抑郁，体重减轻和反应性关节炎，反复发作，且可终身带病。近年我国人间和畜间布病发病率都有不同程度回升，严重威胁人类健康和畜牧业发展。

弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段，我国人用疫苗为布氏菌弱毒疫苗株104M。该疫苗于1965年开始应用，是目前我国唯一的人用布病疫苗，其使用对象主要是屠宰、放牧、皮毛加工等重点职业人群，研究显示通过免疫可有效降低布病发病率。但弱毒疫苗的使用可对布病的诊断和监测造成干扰。因此，实现弱毒疫苗与野生菌株的鉴别，对于布病防控工作具有重要现实意义。

弱毒疫苗株的鉴别包括血清抗体和病原检测两个方面。104M为光滑型菌株，其LPS含有O-侧链，能刺激机体产生抗体，但也使常规血清学检测方法难以区分疫苗免疫与自然感染。病原分离鉴定，所需营养条件复杂，分离培养需在P2级以上生物安全实验室进行，且难以区分104M与同生物型的其它菌株，限制其广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种人用布氏菌弱毒疫苗株104M的Taqman-MGB荧光定量PCR快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于检测人用布氏菌弱毒疫苗株104M的引物组，引物信息如下：

Dsba-F:GGACATAACGAACATTCGGATCT(SEQIDNO:1)

Dsba-R:TCGATTACAATTGCGGCTATTG(SEQIDNO:2)

Dsba-P:ATCGCTTCCATGTCG(SEQIDNO:3)

其中Dsba-P的5′端用FAM进行标记；3′端用MGB进行标记。

本发明还提供一种利用上述的Taqman-MGB荧光定量PCR引物组检测104M株的方法，包括有如下的步骤：

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA；

2)Taqman-MGB荧光定量PCR步骤：根据本发明设计104M株的Taqman-MGB荧光定量PCR引物组，加入反应体系中各组分。反应程序：95℃3min；95℃5s，56℃10s，72℃10s，在72℃进行FAM荧光信号采集，进行40个循环。

3)结果检测：根据荧光扩增曲线情况，判定检测结果。

另一方面，本发明的Taqman-MGB荧光定量PCR引物组可用于制备检测试剂盒。

本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：在1.5h的时间里，即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为1.0×10^-4ng/μl；2)特异性强：采用MGB标记的荧光探针，特异性针对104M基因组产生荧光扩增信号，而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常见非布氏菌株，不产生荧光扩增信号；3)操作简便：配置好的Taqman-MGB荧光定量PCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定；4)高通量：根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现48～384个样品的检测。

附图说明

图1：阳性结果荧光扩增曲线图，其中：曲线1.阳性对照，即104M基因组的荧光扩增曲线；曲线2.阴性对照，即水的荧光扩增曲线。

图2：Taqman-MGB荧光定量PCR方法检测104M基因组DNA的灵敏度检测荧光扩增曲线图，其中：曲线1-8.104M基因组DNA的质量浓度分别为1ng/μl，1.0×10^-1ng/μl，1.0×10^-2ng/μl，1.0×10^-3ng/μl，1.0×10^-4ng/μl，1.0×10^-5ng/μl，1.0×10^-6ng/μl；曲线8.阴性对照。

图3：Taqman-MGB荧光定量PCR方法检测104M基因组DNA的特异性检测荧光扩增曲线图，其中：曲线1,Brucellasuisbiovar1S1330；曲线2,B.suisbiovar2Thomsen；曲线3,B.suisbiovar3686；曲线4,B.suisbiovar440；曲线5,B.abortusbiovar1A544；曲线6,B.abortusbiovar286/8/59；曲线7,B.abortusbiovar3Tulya；曲线8,B.abortusbiovar4292；曲线9,B.abortusbiovar5B3196；曲线10,B.abortusbiovar6870；曲线11,B.abortusbiovar763/75；曲线12,B.abortusbiovar9C68；曲线13,B.melitensisbiovar116M；曲线14,B.melitensisbiovar263/9；曲线15,B.melitensisbiovar3Ether；曲线16,B.ovis63/290；曲线17,B.canisRM6/66；曲线18,B.neotomae5K33；曲线19,S2；曲线20,A19；曲线21,M5-90；曲线22，EscherichiacoliK99；曲线23，PasteurellamultocidaC48-1；曲线24，StreptococcussuisST171；曲线25，PseudomonasaeruginosaDI-1；曲线26,阳性对照；曲线27，阴性对照。

具体实施方式

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)指单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形态，SNP位点广泛应用于耐药性基因、细菌及病毒种型区分等研究中。应用SNP位点的差异，布氏菌弱毒疫苗株S19、Rev1、RB51已建立相应的分子鉴别方法。但目前，尚缺乏104M株特异快速的分子鉴别方法。基于Taqman-MGB探针的荧光定量PCR方法检测特异、敏感，可区分SNP位点的差异，通过其检测104M株独特的SNP位点，可实现104M与野生菌株的快速鉴别。

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

一、用于检测104M的Taqman-MGB荧光定量PCR引物组的设计

本发明首先对ShikimatekinaseABCtransporter(Abc)、Conservedhypotheticalprotein(Chp)、BacterialregulatoryproteinLysR(Lysr)等十余个布氏菌毒力及宿主亲嗜性相关基因，以104M基因组DNA为模板进行了扩增测序，再利用生物信息学软件BLAST和DNAstar，将有关序列与Genbank中B.melitensisM28、B.suisS1330、B.pinnipedialisB2/94、B.microtiCCM4915、B.canisATCC23365、B.ovisATCC25840等16株布鲁菌基因组的相关序列进行比较，分析筛选104M特异的SNP位点。经上述筛选，本发明获得DSBAoxidoreductase(Dsba)基因上一处104M株特异的SNP位点。依据Dsba基因上104M株特异的SNP位点，在其两翼用PrimerExpress软件进行引物与探针设计。设计合适的引物是进行PCR反应的关键，通过考虑碱基组成、GC含量、二级结构的形成、Tm值等因素来设计检测104M株的Taqman-MGB荧光定量PCR反应的引物及探针。其中，引物用于扩增Dsba片段基因，探针用于检测该Dsba片段基因中SNP位点存在与否。应用上述引物及探针进行检测时，当布氏菌基因组DNA中，存在SNP位点时，扩增后出现荧光扩增曲线，可判定该模板来源于104M株；当布氏菌基因组DNA中不含SNP位点或模板本身为非布氏菌时，扩增后不出现荧光扩增曲线。引物及探针由Invitrogen公司合成。引物及探针如表1所示：

表1：104M株的Taqman-MGB荧光定量PCR引物及探针

注：下划线标记为SNP位置

二、人用布氏菌弱毒疫苗株104MTaqman-MGB荧光定量PCR的效果检测

1.1试验材料

菌株：使用的布氏菌常见种、生物型参考株及布氏菌疫苗株，见表1；四个非布氏菌参考菌株：大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌DI-1。

表2：使用的布氏菌株及登录号

1.2细菌DNA提取

将表2中的布氏菌株菌种接种胰蛋白琼脂培养基，37℃培养24—72h，根据需要不添加或添加5—10％CO₂。培养菌落用0.5％甲醛的生理盐水洗涤后，37℃灭活24h。四个非布氏菌参考菌株按常规方法培养，生长的菌落按相同方法洗涤、灭活。用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA，微量核酸蛋白测定仪测定细菌基因组DNA浓度，冻存于-20℃，备用，作为Taqman-MGB荧光定量PCR扩增模板。

1.3Taqman-MGB荧光定量PCR反应体系及条件

本发明应用宝生物工程(大连)有限公司的PremixExTaq^TM试剂盒产品，反应体系如下：

反应条件：95℃预变性3min，；95℃5s，56℃10s，72℃10s，在72℃进行FAM荧光信号采集，进行40个循环。

1.4Taqman-MGB荧光定量PCR方法的灵敏度评价

灵敏度评价：经超微量核酸蛋白测定仪测得布氏菌104M基因组DNA的浓度为1.0ng/μl。首先将质量浓度为1.0ng/μl的细菌基因组DNA进行10倍系列梯度稀释，再依次取2μl作模板，进行Taqman-MGB荧光定量PCR扩增。根据图像判定结果，扩增曲线有明显对数增长期，且Ct值≤37，为104M株检测阳性；扩增曲线无对数增长期或Ct值>37，为104M株检测阴性。以无菌水代替细菌DNA模板作为阴性对照。

1.5Taqman-MGB荧光定量PCR方法的特异性评价

特异性评价：分别提取布氏菌常见种、生物型参考株与布氏菌疫苗株(见表2，编号1-23)以及大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌DI-1的基因组DNA。用所建立的布氏菌104M株Taqman-MGB荧光定量PCR检测体系进行特异性试验。以无菌水代替细菌DNA模板作为阴性对照。

2结果与分析

2.1以104M基因组DNA为模板，Taqman-MGB荧光定量PCR后出现典型扩增曲线(含明显对数增长期)，且Ct值≤37；而以无菌水代替细菌DNA模板，Taqman-MGB荧光定量PCR后未出现扩增信号，无Ct值。

2.2Taqman-MGB荧光定量PCR灵敏度检测结果

图2的荧光曲线扩增结果显示这个方法的最低检出限为1.0×10^-4ng/μl基因组DNA模板。

2.3Taqman-MGB荧光定量PCR特异性检测结果

本试验建立的布氏菌104M株Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法，可以检测出104M株，但是检测不出其它常见种、生物型的布氏菌以及布氏菌疫苗株(S2、A19、M5-90)，也检测不出大肠杆菌、巴氏杆菌、猪链球菌、绿脓杆菌等非布氏菌株，如图3所示。说明本发明所设计的引物具有良好的特异性，可作为布氏菌104M株的鉴别检测引物。

上述结果表明，本发明建立的布氏菌104M株Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法及引物，检测特异性好、灵敏度高，通过单次检测即可快速、有效地鉴别样品是否为布氏菌104M株。操作简便，在荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时，可以实现样品的高通量检测。

Claims (4)

1.一种用于检测人用布氏菌弱毒疫苗株104M的引物组，其特征在于，所述的引物组的序列信息如下：

Dsba-F:GGACATAACGAACATTCGGATCT、

Dsba-R:TCGATTACAATTGCGGCTATTG、

Dsba-P:ATCGCTTCCATGTCG；

所述的Dsba-P的5′端用FAM进行标记；

所述的Dsba-P的3′端用MGB进行标记。

2.权利要求1所述的引物组在检测布氏菌弱毒疫苗株104M中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的引物组检测布氏菌弱毒疫苗株104M的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA；

2)CycleavePCR步骤：将权利要求1所述的引物组加入到反应体系中，反应程序为95℃30s；95℃5s，55℃10s，72℃20s，在72℃进行FAM荧光信号采集，进行40个循环；

3)结果检测：根据荧光扩增曲线情况，判定检测结果。

4.一种检测布氏菌弱毒疫苗株104M的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物组。