CN110527730A

CN110527730A - 一种基于rpa技术的石渠棘球绦虫检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110527730A
Application number: CN201810516496.6A
Authority: CN
Inventors: 贾万忠; 吴燕涛; 闫鸿斌; 李立; 朱国强; 李双男; 姚刚; 田文俊
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: CN110527730B

Abstract

本发明公开了一种基于RPA技术的石渠棘球绦虫检测试剂盒及其应用。本发明根据石渠棘球绦虫线粒体基因序列设计并筛选了一套可用于RPA检测的引物及探针组合，建立了石渠棘球绦虫特异性实时荧光RPA检测方法。该方法采用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异性结合，在DNA聚合酶的作用下延伸引物生成新的DNA链。本发明的石渠棘球绦虫特异性荧光RPA检测方法操作简便、快速、特异性强，适用于现场快速检测。

Description

一种基于RPA技术的石渠棘球绦虫检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于RPA技术的石渠棘球绦虫检测试剂盒及其应用。

背景技术

石渠棘球绦虫(Echinococcus shiquicus)是2005年在中国四川省甘孜藏族自治州的石渠县(北纬32°19’～34°20’，东经97°20’～99°15’)被首次发现和命名的，并且被鉴定为一独立种，属于棘球属(Echinococcus)绦虫成员之一。棘球属绦虫在生物分类学上属于动物界(Animalia)、扁形动物门(Platyhelminthes)、绦虫纲(Cestoda)、圆叶目(Cyclophyllidea)、带科(Taeniidae)。棘球属绦虫的分类一直备受争议，随着分子生物学技术的不断发展和深入，不同的分类方法和标准被提出，现正在趋于统一，棘球属绦虫现公认有9个种，分别是细粒棘球绦虫狭义种(E.granulosus s.s.)、多房棘球绦虫(E.multilocularis)、伏氏棘球绦虫(E.vogeli)、少节棘球绦虫(E.oligarthra)、石渠棘球绦虫、狮棘球绦虫(E.felidis)、马棘球绦虫(E.equinus)、奥氏棘球绦虫(E.ortleppi)和加拿大棘球绦虫(E.canadensis)，在中国呈流行性分布的种主要是细粒棘球绦虫狭义种、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫。棘球属绦虫的幼虫，尤其是细粒棘球蚴和多房棘球蚴分别能够引起中间宿主(包括人)的囊型棘球蚴病(cystic echinococcosis，CE)和泡型棘球蚴病(alverolar echinococcosis，AE)，不但严重阻碍全球畜牧业的发展，而且严重威胁到人类的身体健康，是一种严重的人兽共患寄生虫病，也是部分国家(包括我国)的重大公共卫生问题之一。据估计，对人类健康造成的危害：泡型棘球蚴病和囊型棘球蚴病每年分别可造成每人5.8和0.81的伤残调整生命年(DALYs)的损失，人类对棘球蚴病的经济负担每年可达1亿DALYs(约7.64亿美元)；对畜牧业造成的危害：每年全世界畜牧生产因棘球蚴病带来的损失可能高达30亿美元。石渠棘球绦虫是我国流行的一种棘球绦虫，并且与多房棘球绦虫有诸多方面的相似性，所以对石渠棘球绦虫(蚴)种鉴定的研究对控制石渠棘球蚴病有着重要的指导意义。

多年来，国内外对于石渠棘球绦虫的诊断方法主要包括剖检法和分子生物学检测方法，其中分子生物学检测方法主要包括普通PCR、多重PCR、巢式PCR、PCR-RFLP、以及环介导等温扩增(LAMP)等。尽管上述实验方法特异性和灵敏度都很高，但是它们操作复杂，需要PCR等专业仪器设备，耗时长且需要训练有素的专业人员，有些方法还特别容易出现假阳性(LAMP)，因此这些方法的使用有诸多限制。

RPA技术是由以英国剑桥Babraham研究院建立的并由Twist Dx生物技术公司发明的(http://www.twistdx.co.uk/)。该技术以T4噬菌体的核酸复制机制为原理，反应所需原料有T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32、DNA聚合酶以及寡聚核苷酸；同时还需要引物、探针、模板、ddH₂O和Mg²⁺等。该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内DNA复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，摆脱了对热循环仪器的要求，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。

目前RPA技术已经在多种病原生物的分子检测中得到应用，如结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、犬细小病毒、非洲猪瘟、牛环型泰勒虫、隐孢子虫、弓形虫、血吸虫等。但是未见RPA技术在棘球绦虫检测中的应用。因此，建立一种简便、快速、有效的棘球绦虫RPA检测方法，对于棘球蚴病的防控具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种检测或辅助检测石渠棘球绦虫的成套试剂。

本发明提供的检测或辅助检测石渠棘球绦虫的成套试剂由引物对和探针组成；

所述引物对由引物甲和引物乙组成；所述引物对的靶序列含有特异DNA片段；所述特异DNA片段为如下1)或2)：

1)序列表中序列1或序列1第44-360位所示的DNA分子；

2)将序列1或序列1第44-360位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1或序列1第44-360位具有相同功能的DNA分子；

所述探针依次由DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙组成；

所述DNA片段甲与所述特异DNA片段上的区段甲部分相同；

所述DNA片段乙与所述特异DNA片段上的区段乙部分相同；

所述区段甲和所述区段乙在所述特异DNA片段上无重叠。

上述成套试剂中，所述引物甲为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

a2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物乙为如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；

b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；

所述DNA片段甲为如下c1)或c2)：

c1)序列4所示的单链DNA分子；

c2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；

所述DNA片段乙为如下d1)或d2)：

d1)序列5所示的单链DNA分子；

d2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子。

上述成套试剂中，所述引物甲、所述引物乙和所述探针的摩尔量比为7:7:2。

上述成套试剂中，所述DNA片段甲自5’端起最后一位碱基被荧光基团修饰；所述DNA片段乙自5’端起第一位碱基被淬灭基团修饰。

进一步的，所述荧光基团可为FAM；所述淬灭基团可为BHQ1。

更进一步的，所述DNA片段乙的3’末端由C3Spacer修饰，以阻断所述探针延伸。

本发明的第二个目的是提供一种检测或辅助检测石渠棘球绦虫的RPA试剂盒。

本发明提供的RPA试剂盒包括上述引物对或上述成套试剂。

本发明的第三个目的是提供上述特异DNA片段。

本发明的第四个目的是提供上述成套试剂或上述试剂盒或上述特异DNA片段的新用途。

本发明提供了上述成套试剂或上述试剂盒或上述特异DNA片段在如下A1)-A6)中任一种中的应用：

A1)检测或辅助检测石渠棘球绦虫；

A2)制备检测或辅助检测石渠棘球绦虫的产品；

A3)检测或辅助检测待测样品是否感染石渠棘球绦虫；

A4)制备检测或辅助检测待测样品是否感染石渠棘球绦虫的产品；

A5)检测或辅助检测待测病原体是否为石渠棘球绦虫；

A6)制备检测或辅助检测待测病原体是否为石渠棘球绦虫的产品。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否感染石渠棘球绦虫的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否感染石渠棘球绦虫的方法为如下B1)或B2)或B3)：

B1)以待测样品的基因组DNA为模板，采用上述成套试剂进行RPA扩增，根据RPA扩增结果判断待测样品是否感染石渠棘球绦虫：

若在RPA扩增的10min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则待测样品感染或候选感染石渠棘球绦虫；

若RPA扩增不满足上述条件，则待测样品未感染或候选未感染石渠棘球绦虫；

B2)以待测样品的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断待测样品是否感染石渠棘球绦虫：

若PCR扩增得到大小为317bp的条带，则待测样品感染或候选感染石渠棘球绦虫；

若PCR扩增未得到大小为317bp的条带，则待测样品未感染或候选未感染石渠棘球绦虫；

B3)检测待测样品的基因组DNA是否含有上述特异DNA片段：

若待测样品的基因组DNA含有上述特异DNA片段，则待测样品感染或候选感染石渠棘球绦虫；

若待测样品的基因组DNA不含有上述特异DNA片段，则待测样品未感染或候选未感染石渠棘球绦虫。

本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测病原体是否为石渠棘球绦虫的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测病原体是否为石渠棘球绦虫的方法为如下C1)或C2)或C3)：

C1)以待测病原体的基因组DNA为模板，采用上述成套试剂进行RPA扩增，根据RPA扩增结果判断待测病原体是否为石渠棘球绦虫：

若在RPA扩增的10min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则待测病原体为或候选为石渠棘球绦虫；

若RPA扩增不满足上述条件，则待测病原体不为或候选不为石渠棘球绦虫；

C2)以待测病原体的基因组为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断待测病原体是否感染石渠棘球绦虫：

若PCR扩增得到大小为317bp的条带，则待测病原体为或候选为石渠棘球绦虫；

若PCR扩增未得到大小为317bp的条带，则待测病原体不为或候选不为石渠棘球绦虫；

C3)检测待测病原体的基因组DNA是否含有上述特异DNA片段：

若待测病原体的基因组DNA含有上述特异DNA片段，则待测病原体为或候选为石渠棘球绦虫；

若待测病原体的基因组DNA不含有上述特异DNA片段，则待测病原体不为或候选不为石渠棘球绦虫。

上述方法中，所述大小为317bp的DNA片段的核苷酸序列为序列1第44-360位所示的DNA分子。

上述方法中，所述RPA扩增的反应体系如下：上游引物(10μmol/L)2.1μL、下游引物(10μmol/L)2.1μL、Es-b-probe3(10μmol/L)0.6μL、Rehydration buffer 29.5μL、模板(基因组)1μL、醋酸镁溶液(280mmol/L)2.5μL、ddH2O12.2μL。

所述RPA扩增的反应条件如下：将反应体系置于荧光定量PCR仪中进行扩增，38℃反应20min，每分钟收集一次荧光信号。

本发明根据石渠棘球绦虫线粒体基因序列设计并筛选了一套可用于RPA检测的引物及探针组合，建立了石渠棘球绦虫特异性实时荧光RPA检测方法。该方法采用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异性结合，在DNA聚合酶的作用下延伸引物生成新的DNA链。在本发明的RPA荧光检测实验中，质粒模板在10¹copies/μL及以上拷贝时有明显的扩增曲线，起飞时间随着模板拷贝数的增加而缩短，荧光强度随着模板拷贝数的增加而增强。相比于普通PCR，本发明的RPA荧光检测灵敏度更高，反应时间更短，且操作简便、特异性强，适用于现场快速检测。

附图说明

图1为特异性RPA引物的PCR验证结果。M为DL2000DNA marker；其它泳道依次为多头带绦虫(Tm)、泡状带绦虫(Th)、多房棘球绦虫(Em)、石渠棘球绦虫(Es)以及细粒棘球绦虫(Eg)基因组DNA为模板的PCR扩增结果；NC为高原鼠兔肺组织基因组为模板的PCR扩增结果。

图2为RPA荧光检测方法特异性分析。A：石渠棘球绦虫基因组检测结果；B-H：多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫的基因组检测结果；G：高原鼠兔肺组织基因组检测结果。

图3为RPA荧光检测方法灵敏度分析。重组质粒pMD19-T-EsB的标准品10倍倍比稀释为模板浓度为10⁶～10¹copies/μL的扩增曲线；NC为阴性对照的扩增曲线。

图4为PCR检测方法灵敏度分析。M为DL2000DNA marker；1～6分别为10⁶～10¹copies/μL，7为阴性对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的所使用的主要材料及来源如下：

菌株、载体与基因组：大肠杆菌感受态细胞DH5α、DNA Marker和pMD19-T simple载体均是TaKaRa Biotech公司的产品。

主要试剂与试剂盒：RNase-free水、PCR预混酶Ex Taq和pMD19-T载体连接试剂盒均是TaKaRa Biotech公司的产品；质粒提取试剂盒、PCR纯化回收试剂盒和胶回收试剂盒均是北京天根生化科技有限公司的产品。

主要仪器：移液器和PCR仪均是德国Eppendorf公司的产品；电子天平是北京赛多斯仪器系统有限公司的产品；电热恒温培养箱是上海精密实验设备公司的产品；DYY-6C电泳仪和水平摇床均是北京六一仪器厂的产品；电热恒温水槽是上海精宏实验设备有限公司产品的产品；实时荧光定量PCR仪是Bio-Rad的产品。

实施例1、用于检测石渠棘球绦虫的RPA引物和探针及其检测方法

一、用于检测石渠棘球绦虫的RPA引物和探针

1、获取目的基因的序列信息

以石渠棘球绦虫线粒体全基因组中的部分序列为检测目的基因，根据GenBank数据库中石渠棘球绦虫(NC_009460)和其它常见以犬科动物作为终末宿主的绦虫的线粒体全基因组序列[GenBank accession no.NC_014768(带状带绦虫，Taenia taeniaeformis)、GU569096(豆状带绦虫)、NC_021145(犬复孔绦虫)、GQ228818(多头带绦虫)、GQ228819(泡状带绦虫)、NC_009460(石渠棘球绦虫)、AB786664(细粒棘球绦虫)、KU601616(细粒棘球绦虫)、NC_000928(多房棘球绦虫)、AB208063(加拿大棘球绦虫G6)、AB235848(加拿大棘球绦虫G8)、AB745463(加拿大棘球绦虫G10)和AB235847(加拿大棘球绦虫G7)]，利用在线软件Clustal Omega进行序列比对，最终确定检测目的基因片段为SEQ ID No.1所示的DNA片段。

2、石渠棘球绦虫的RPA引物和探针的设计与合成

参考TwistDx(剑桥，英国)的RPA引物和探针设计指南结合生物信息学软件DNASTAR，根据步骤1确定的SEQ ID No.1所示的目的片段，设计用于检测石渠棘球绦虫的RPA引物和探针及普通PCR扩增引物，并送上海生工进行序列合成。

用于检测石渠棘球绦虫的RPA引物和探针的序列如下：

Es-b-Fnew1：5’-TAGTGGTTACTTTTGATTGTGGCAGTGGTA-3’(SEQ ID No.2)；

Es-b-Rnew3：5’-CAACAAACACAACAACAAAATCACACCAAC-3’(SEQ ID No.3)；

Es-b-probe3：5’-TTGTTTAGTTCTGTAATTATGTTTAGTTATT(FAM-dT)(SEQ ID No.4)-THF-T(BHQ1-dT)GACTGTTGGTCGTTT-SpacerC3-3’(SEQ ID No.5)。

上述探针Es-b-probe3依次由SEQ ID No.4所示的单链DNA分子、四氢呋喃和SEQID No.5所示的单链DNA分子连接而成。其中，SEQ ID No.4自5’端起最后一位胸腺嘧啶核苷酸被荧光基团FAM修饰(FAM-dT)；THF为四氢呋喃连接子，连接SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的单链DNA分子；SEQ ID No.5自5’端起第一位胸腺嘧啶核苷酸被淬灭基团BHQ1修饰(BHQ1-dT)，SEQ ID No.5的3’端由C3Spacer修饰(SpacerC3)，以阻断延伸。

二、RPA引物的特异性检测

1、普通PCR扩增验证

以多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫以及石渠棘球绦虫的基因组DNA为模板，对设计的3对RPA引物进行普通PCR扩增，3对RPA引物序列分别如下：

Es-b-Fnew1：5’-TAGTGGTTACTTTTGATTGTGGCAGTGGTA-3’(SEQ ID No.2)；

Es-b-Rnew3：5’-CAACAAACACAACAACAAAATCACACCAAC-3’(SEQ ID No.3)；

Es-b-Fnew：5’-AGATTGATGATGGTTAGTGGTTACTTTTGATTG-3’(SEQ ID No.6)；

Es-b-Rnew：5’-AATAATATGACTATCAAACGAAGAAAACAG-3’(SEQ ID No.7)；

Es-b-Fnew2：5’-GTGTGATGATGGTTTTGATGATGTTTATTT-3’(SEQ ID No.8)；

Es-b-Rnew2：5’-TTCTCACACCCGAGTCAACACAACCAATCT-3’(SEQ ID No.9)。

PCR扩增反应体系(50μL)如下：上游引物1μL、下游引物1μL、Ex Taq预混酶25μL、模板(基因组)2μL、ddH₂O 21μL。

PCR扩增反应程序如下：首先98℃充分预变性5min；然后35个循环，分别为：94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。

结果表明：经过多次重复得出SEQ ID No.2和SEQ ID No.3组成的引物对特异性最好，仅石渠棘球绦虫的基因组DNA扩增得到大小为317bp的条带(图1)。

2、RPA验证

以多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫以及石渠棘球绦虫的基因组DNA为模板，采用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物，运用RPA试剂盒Basic kit进行扩增验证。详细操作步骤如下所示：

①将如下试剂：上游引物(10μmol/L)2.4μL、下游引物(10μmol/L)2.4μL、Rehydration buffer 29.5μL、模板(基因组)1μL、ddH₂O 12.2μL加入到1.5mL离心管中，漩涡震荡混匀；

②将步骤①制备的47.5μL反应体系加入到试剂盒中的freeze-dried reaction反应管中，用移液管上下吹打混匀，至反应管中的颗粒全部重悬起来；

③将2.5μL 280mmol/L醋酸镁溶液加在反应管管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋混匀；

④将反应管置于38℃孵育4min；

⑤从38℃反应器中拿出反应管，上下颠倒混匀，涡旋后重新置于38℃反应器孵育20min；

⑥使用DNA纯化试剂盒对扩增结果进行回收；

⑦取5μL回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增结果进行分析。

结果与上述普通PCR扩增结果相同，仅石渠棘球绦虫的基因组DNA扩增得到大小为317bp的条带。

实施例2、石渠棘球绦虫的特异性荧光RPA检测方法

以多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫及石渠棘球绦虫的基因组DNA为模板，采用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3引物，以Es-b-probe3为探针，按照RPA试剂盒Basic exo说明书进行特异性荧光RPA检测，并采用荧光定量PCR仪进行信号检测。详细的操作步骤如下：

①将如下试剂：上游引物(10μmol/L)2.1μL、下游引物(10μmol/L)2.1μL、Es-b-probe(10μmol/L)0.6μL、Rehydration buffer 29.5μL、模板(基因组)1μL、ddH₂O 12.2μL加入到1.5mL离心管中，漩涡震荡混匀；

②将47.5μL反应体系加入到试剂盒中的freeze-dried reaction反应管中，用移液管上下吹打混匀，至反应管中的颗粒全部重悬起来；

③将2.5μL 280mmol/L醋酸镁溶液加在反应管管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋混匀。

上下游引物在RPA反应体系的终浓度均为0.42μmol/L；探针在RPA反应体系的终浓度为0.12μmol/L；

④将反应管置于荧光定量PCR仪中，38℃反应20min，每分钟收集一次荧光信号，采集扩增曲线。

结果如图2所示。A：石渠棘球绦虫基因组DNA的检测结果；B-H：多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫的基因组DNA的检测结果；G：高原鼠兔肺组织基因组DNA的检测结果。从图中可以看出：只有石渠棘球绦虫出现了特异性扩增。上述结果表明：本发明的石渠棘球绦虫特异性荧光RPA检测方法的特异性较高。

因此，在实际应用中，可以按照如下方法判断待测样品是否感染石渠棘球绦虫病原体：

采用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3引物，以Es-b-probe3为探针对待测样品进行RPA扩增，根据RPA扩增扩增结果判断待测样品是否感染石渠棘球绦虫：

若RPA扩增不满足上述条件，则待测样品未感染或候选未感染石渠棘球绦虫。

实施例3、石渠棘球绦虫特异性荧光RPA检测的灵敏度分析

一、质粒标准品的构建

①以石渠棘球绦虫的基因组DNA为模板，采用Es-T-F和Es-T-R引物进行普通PCR扩增，得到SEQ ID No.1所示的目的片段。引物序列如下：

Es-T-F：5’-TAGTGTGATGATGGTTTTGA-3’(SEQ ID No.10)；

Es-T-R：5’-CACACACCCAAAATCAGTAC-3’(SEQ ID No.11)。

PCR扩增反应体系(总体积50μL)如下：上游引物1μL、下游引物1μL、Ex Taq预混酶25μL、模板(基因组)2μL、ddH₂O 21μL。

PCR扩增反应程序如下：首先98℃充分预变性5min；然后35个循环，分别为：95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸50s，最后72℃延伸10min。

②采用TaKaRa Biotech公司PCR产物纯化试剂盒纯化回收步骤①获得的PCR产物，并将其克隆至pMD19-T simple载体(TaKaRa Biotech)中，得到重组质粒pMD19-T-EsB，即为质粒标准品。

③质粒标准品浓度测定

用蛋白核酸测定仪对pMD19-T-EsB的浓度进行测定，经测定质粒浓度为67.9ng/μL。

④质粒标准品拷贝数计算

pMD19-T simple载体大小为2692bp，SEQ ID No.1所示的目的片段大小为476bp，因此，pMD19-T-EsB重组质粒大小为3168bp。根据如下公式计算质粒标准品拷贝数：拷贝数(copies/μL)＝6.02×10²³×质粒浓度(ng/μL)×10^-9/(质粒碱基数×660)。

计算结果表明：本发明构建的质粒标准品拷贝数约为2.0×10¹⁰copies/μL。

⑤质粒标准品的倍比稀释

将重组质粒pMD19-T-EsB进行10倍倍比稀释，使其浓度分别为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL，并将其作为RPA反应的模板。

二、灵敏度分析

1、基于RPA扩增的灵敏度分析

分别以浓度为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL的重组质粒pMD19-T-EsB作为荧光RPA反应的模板，以Es-b-probe3为探针，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3为引物进行RPA扩增，按照RPA试剂盒Basic exo说明书进行特异性荧光RPA检测，并采用荧光定量PCR仪进行信号检测。同时以健康的鼠兔肺组织DNA作为阴性对照模板(NC)。详细的操作步骤同实施例2中的特异性荧光RPA检测的步骤。

结果如图3所示。从图中可以看出：随着模板拷贝数的降低，曲线起飞时间和荧光信号值逐渐的下降，在拷贝数为10¹时仍有扩增曲线，而阴性对照模板(NC)没有明显的扩增曲线。

2、普通PCR扩增的灵敏度分析

分别以浓度为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL的重组质粒pMD19-T-EsB作为荧光RPA反应的模板，采用引物对(SEQ ID No.10和SEQ ID No.11)进行普通PCR扩增。

PCR扩增反应程序如下：首先98℃充分预变性5min；然后35个循环，分别为：94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

结果如图4所示。从图中可以看出：采用SEQ ID No.10和SEQ ID No.11引物进行的普通PCR：质粒浓度从10⁶～10¹copies/μL依次稀释时，质粒浓度在10¹copies/μL时没有出现扩增。

上述结果表明：本发明的石渠棘球绦虫特异性荧光RPA检测方法的灵敏度更高。

实施例4、临床样品检测

1、临床样品

以39份采集自不同地区的高原鼠兔棘球蚴包囊组织的基因组DNA以及9份采集自久治县的田鼠棘球蚴包囊组织的基因组DNA作为待检临床样品，同时以健康的高原鼠兔肺脏组织基因组DNA作为阴性对照样品(NC)，分别采用本发明的石渠棘球绦虫特异性荧光RPA检测方法和普通PCR检测方法进行敏感性和特异性检测。特异性荧光RPA检测方法同实施例2中的特异性荧光RPA检测的步骤。普通PCR检测方法同实施例3步骤二的2中的步骤。

检测结果如表1所示。结果表明：阴性对照样品和田鼠棘球蚴包囊组织基因组DNA的荧光RPA和普通PCR检测结果均呈阴性，而高原鼠兔棘球蚴基因组DNA检测结果均为阳性。虫种鉴定结果说明高原鼠兔感染的棘球蚴为石渠棘球蚴。此外，从表中还可以看出：荧光RPA和普通PCR两种方法的检测结果相同。

表1高原鼠兔石渠棘球蚴RPA荧光实验和普通PCR实验结果比较

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种基于RPA技术的石渠棘球绦虫检测试剂盒及其应用

<160>11

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>476

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

tagtgtgatg atggttttga tgatgtttat ttttaagtta tattagtggt tacttttgat 60

tgtggcagtg gtaactttgt ttttattgtt tagttctgta attatgttta gttatttttt 120

gactgttggt cgttttttaa atagtttaat tattttggaa aaatttaatg tgttggttct 180

tttattttgt ttactgtttt cttcgtttga tagtcatatt atttttatag tgttgatggt 240

gatttctact gtggagatta taattagatt ggttgtgttg actcgggtgt gagaatgttc 300

gttttgtttg gaattggttg atttttaatt gttggtgtga ttttgttgtt gtgtttgttg 360

tatagatgtg gtgttggttg ttgctggcta gtgtgtgata aggtatataa tgagttcttt 420

gtttttgatt ctatatcatt ttacttgatt atattggtac tgattttggg tgtgtg 476

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

tagtggttac ttttgattgt ggcagtggta 30

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

caacaaacac aacaacaaaa tcacaccaac 30

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

ttgtttagtt ctgtaattat gtttagttat t 31

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

tgactgttgg tcgttt 16

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

agattgatga tggttagtgg ttacttttga ttgtgg 36

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

aataatatga ctatcaaacg aagaaaacag 30

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

gtgtgatgat ggttttgatg atgtttattt 30

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

ttctcacacc cgagtcaaca caaccaatct 30

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>10

tagtgtgatg atggttttga 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

cacacaccca aaatcagtac 20

Claims

1.检测或辅助检测石渠棘球绦虫的成套试剂，由引物对和探针组成；

1)序列表中序列1或序列1第44-360位所示的DNA分子；

所述探针依次由DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙组成；

所述DNA片段甲与所述特异DNA片段上的区段甲部分相同；

所述DNA片段乙与所述特异DNA片段上的区段乙部分相同；

所述区段甲和所述区段乙在所述特异DNA片段上无重叠。

2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：

所述引物甲为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；

所述引物乙为如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；

所述DNA片段甲为如下c1)或c2)：

c1)序列4所示的单链DNA分子；

所述DNA片段乙为如下d1)或d2)：

d1)序列5所示的单链DNA分子；

3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述引物甲、所述引物乙和所述探针的摩尔量比为7:7:2。

4.根据权利要求1-3任一所述的成套试剂，其特征在于：

所述DNA片段甲自5’端起最后一位碱基被荧光基团修饰；

所述DNA片段乙自5’端起第一位碱基被淬灭基团修饰。

5.一种检测或辅助检测石渠棘球绦虫的RPA试剂盒，包括权利要求1-4中任一所述的引物对或权利要求1-4任一所述的成套试剂。

6.权利要求1-4中任一所述的特异DNA片段。

7.权利要求1-4任一所述的成套试剂或权利要求5所述的试剂盒或权利要求6所述的特异DNA片段在如下A1)-A6)中任一种中的应用：

A1)检测或辅助检测石渠棘球绦虫；

A2)制备检测或辅助检测石渠棘球绦虫的产品；

A3)检测或辅助检测待测样品是否感染石渠棘球绦虫；

A5)检测或辅助检测待测病原体是否为石渠棘球绦虫；

8.一种检测或辅助检测待测样品是否感染石渠棘球绦虫的方法，为如下B1)或B2)或B3)：

B1)以待测样品的基因组DNA为模板，采用权利要求1-4任一所述成套试剂进行RPA扩增，根据RPA扩增结果判断待测样品是否感染石渠棘球绦虫：

B2)以待测样品的基因组DNA为模板，采用权利要求1-4中任一所述的引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断待测样品是否感染石渠棘球绦虫：

B3)检测待测样品的基因组DNA是否含有权利要求1中所述的特异DNA片段：

若待测样品的基因组DNA含有权利要求1中所述的特异DNA片段，则待测样品感染或候选感染石渠棘球绦虫；

若待测样品的基因组DNA不含有权利要求1中所述的特异DNA片段，则待测样品未感染或候选未感染石渠棘球绦虫。

9.一种检测或辅助检测待测病原体是否为石渠棘球绦虫的方法，为如下C1)或C2)或C3)：

C1)以待测病原体的基因组DNA为模板，采用权利要求1-4任一所述成套试剂进行RPA扩增，根据RPA扩增结果判断待测病原体是否为石渠棘球绦虫：

C2)以待测病原体的基因组为模板，采用权利要求1-4中任一所述的引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断待测病原体是否感染石渠棘球绦虫：

C3)检测待测病原体的基因组DNA是否含有权利要求1中所述的特异DNA片段：

若待测病原体的基因组DNA含有权利要求1中所述的特异DNA片段，则待测病原体为或候选为石渠棘球绦虫；

若待测病原体的基因组DNA不含有权利要求1中所述的特异DNA片段，则待测病原体不为或候选不为石渠棘球绦虫。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述大小为317bp的DNA片段的核苷酸序列为序列1第44-360位所示的DNA分子。