CN108048581A - 一种检测细粒棘球绦虫dna的引物探针组合物和试剂盒 - Google Patents

一种检测细粒棘球绦虫dna的引物探针组合物和试剂盒 Download PDF

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茅范贞
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刘燕红
王智宏
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Abstract

本发明提供了一种检测细粒棘球绦虫DNA的引物探针组合物，属于分子生物学检测技术领域，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为在SEQ ID No.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第33位碱基修饰淬灭基团和第32位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。本发明提供的引物探针组合物能够快速检测细粒棘球绦虫，操作简便，在20min内能够得到检测结果。

Description

一种检测细粒棘球绦虫DNA的引物探针组合物和试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测细粒棘球绦虫DNA的引物探针组合物和试剂盒。
背景技术
棘球蚴病又称包虫病，是由棘球属绦虫的幼虫—棘球蚴寄生于人及牛羊猪等多种哺乳动物的肝、肺等内脏器官，成虫寄生于犬、狼、狐等食肉动物肠道所致的人畜共患寄生虫病。该病在中东、南欧、拉丁美洲、中亚、澳大利亚和非洲部分国家流行，呈世界性分布，尤其以放牧或半农半牧为主要畜牧业生产方式的国家为主。细粒棘球绦虫的蚴体生长力强，体积大，不仅压迫周围组织使之萎缩和功能障碍，还易造成继发感染，如果蚴体包囊破裂，可以引起过敏反应，甚至导致死亡，严重威胁公共安全和畜牧业生产，影响社会经济发展。在我国，有23个省、市、自治区有本病报道，尤以西部的新疆、甘肃、青海、宁夏、西藏和内蒙古等省、自治区流行最为严重，其中在各省(区)血清学阳性率方面，以新疆最高(21.89％)，其次是内蒙古(20.92％)。
目前，包虫病的检测方法主要有分子生物学检测，分子生物学检测技术主要是实时荧光定量PCR技术，其原理是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。这种方法灵敏、特异、检出率高，但对人员要求及设备要求高，检测时间为1.5～2小时。
发明内容
本发明的目的是采用RAA技术提供一种检测细粒棘球绦虫DNA的引物探针及试剂盒，能够快速灵敏的检测出细粒棘球绦虫DNA。
本发明提供了一种检测细粒棘球绦虫DNA的引物探针组合物，包括引物和探针，所述引物包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；
所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；
所述探针为在SEQ ID No.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第33位碱基修饰淬灭基团和第32位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。
优选的，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。
优选的，所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品。
优选的，所述试剂盒中包括：引物探针组合物40～80μl，所述上游引物和下游引物的浓度独立的为0.03～0.07mM，所述探针的浓度为0.01～0.03mM；RAA基础荧光通用反应试剂24管冻干粉；反应缓冲液1000～1800μl；阴性质控品25～35μl；浓度为1.0×104～8IU/mL的阳性质控品；浓度为1.0×102～5IU/mL的临界阳性质控品。
优选的，所述阴性对照品为ddH2O。
优选的，所述阳性对照品为含有细粒棘球绦虫DNA片段的质粒，所述细粒棘球绦虫DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，所述临界阳性质控品为含有细粒棘球绦虫DNA片段的质粒，所述细粒棘球绦虫DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，所述反应缓冲液包括：450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc和质量体积百分含量为5～15％的PEG10000。
优选的，所述试剂盒在使用时，实时RAA荧光反应体系每50μl包括：47μl反应缓冲液，2μl引物探针组合物，1μl样品、阴性质控品、阳性质控品或临界阳性质控品；
所述实时RAA荧光反应的条件包括：所述实时RAA荧光反应的温度为30～45℃，所述实时RAA荧光反应的时间为15～25min。
本发明提供了一种检测细粒棘球绦虫DNA的引物探针组合物，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述探针的序列如SEQ ID No.3所示，所述探针的荧光报告基团修饰在离5’端碱基数31bp位置上，所述探针的淬灭基团修饰在离3’端碱基数17bp位置上；所述荧光报告基团与淬灭基团之间空1个碱基位置，由四氢呋喃残基修饰。
本发明采用重组酶介导等温核酸扩增技术(简称RAA技术)，是一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温条件(25-42℃)下进行核酸扩增。扩增过程为：重组酶与引物形成聚合体扫描双链DNA，在与引物同源的序列处使双链DNA解旋。在单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，使引物和模板之间发生链替换，新的DNA片段可以在体外快速地扩增出来；不断重复这一过程而最终实现核酸的高效扩增，5～20分钟之内就可以将目的基因扩增放大到可以用仪器检测。
本发明实施例的结果显示：发明提供的引物探针组合物能够快速检测细粒棘球绦虫，操作简便，在20min内能够得到检测结果。
附图说明
图1为实施例1的检测扩增图；
图2为实施例2的检测扩增图；
图3为实施例3的检测扩增图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测细粒棘球绦虫DNA的引物探针组合物，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为在SEQ ID No.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第33位碱基修饰淬灭基团和第32位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。
在本发明中，所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，具体序列如下所示：
5’-TGTTGATTTTGCCTGGATTTGGTATAATTAGTCAT-3’。
在本发明中，所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，具体序列如下所示：
5’-GAAACAACCCATCACAAAACCGGATCACTAACA-3’。
在本发明中，所述探针为在SEQ ID No.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第33位碱基修饰淬灭基团和第32位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。在本发明中，所述SEQ ID No.3所示序列具体如下所示：
5’-GTGTTTGGGTAGCAGGGTTTGGGGTCATCATATGTTTACTGTTGGGTTG-3’。
在本发明中，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
在本发明中，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)，获得细粒棘球绦虫cox1基因序列，并进行多序列比对，从中选出一段保守序列，该序列如序列表中SEQ ID NO.5所示，具体序列如下所示：
TGTGTTGATTTTGCCTGGATTTGGTATAATTAGTCATATTTGTTTGAGTATTAGTGCTAATTTTGATGCGTTTGGGTTCTATGGGTTGTTGTTTGCTATGTTTTCTATAGTGTGTTTGGGTAGCAGGGTTTGGGGTCATCATATGTTTACTGTTGGGTTGGATGTGAAGACGGCTGTTTTTTTTAGCTCTGTTACTATGATTATAGGGGTTCCTACTGGTATAAAGGTGTTTACTTGGTTATATATGTTGTTGAATTCGAGTGTTAATGTTAGTGATCCGGTTTTGTGATGGGTTGTTTCTTTTATAGTGTTGTTTACGTTTGGGGGAGTTACGGGTATAGTTTTGTCTGCTTGTGTGTTAGATAATATTTTGCATGATACTTGGTTTGTG
根据SEQ ID No.5所示的序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成DNA质粒，质粒大小336bp；根据RAA技术引物及探针设计原则进行设计，得到上游引物、下游引物和探针。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品。
本发明提供的试剂盒优选包括40～80μl的引物探针组合物，更优选为50～70μl，最优选为60μl。在本发明中，所述上游引物和下游引物的浓度独立的优选为0.03～0.07mM，更优选为0.04～0.06mM，最优选为0.05mM；所述探针的浓度优选为0.01～0.03mM，更优选为0.02mM。在本发明中，所述引物和探针的溶剂优选为ddH2O。
本发明提供的试剂盒优选包括RAA基础荧光通用反应试剂，所述RAA基础荧光通用反应试剂的管数优选为24管，所述RAA基础荧光通用反应试剂优选以冻干粉的形态提供。本发明对所述RAA基础荧光通用反应试剂的来源没有特殊限定，在本发明实施例中RAA基础荧光通用反应试剂采购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为F00001。本发明提供的试剂盒优选包括1000～1800μl的反应缓冲液，更优选为1200～1600μl，最优选为1400μl，所述反应缓冲液的pH值优选为7.0～8.4，更优选为7.4～8.0，最优选为7.6。在本发明中，所述反应缓冲液优选包括：450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc和质量体积百分含量为10％的PEG10000；更优选包括：480～520mM的Tris-HCl、220～280mM的MgAc和质量体积百分含量为8～12％的PEG10000；最优选包括：500mM的Tris-HCl、250mM的MgAc和质量体积百分含量为10％的PEG10000。
本发明提供的试剂盒优选包括阴性质控品25～35μl，所述阴性质控品优选为ddH2O；所述阴性质控品的体积更优选为28～32μl，最优选为30μl。
本发明提供的试剂盒优选包括浓度为1.0×104～8IU/mL的阳性质控品，更优选为1.0×104～6IU/mL，最优选为1.0×105IU/mL。在本发明中，所述阳性对照品为含有细粒棘球绦虫DNA片段的质粒，所述细粒棘球绦虫DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示，具体序列如下所示：
TGTGTTGATTTTGCCTGGATTTGGTATAATTAGTCATATTTGTTTGAGTATTAGTGCTAATTTTGATGCGTTTGGGTTCTATGGGTTGTTGTTTGCTATGTTTTCTATAGTGTGTTTGGGTAGCAGGGTTTGGGGTCATCATATGTTTACTGTTGGGTTGGATGTGAAGACGGCTGTTTTTTTTAGCTCTGTTACTATGATTATAGGGGTTCCTACTGGTATAAAGGTGTTTACTTGGTTATATATGTTGTTGAATTCGAGTGTTAATGTTAGTGATCCGGTTTTGTGATGGGTTGTTTCTTTTATAGTGTTGTTTACGTTTGGGGGAGTTACGGGTATAGTTTTGTCTGCTTGTGTGTTAGATAATATTTTGCATGATACTTGGTTTGTG
根据SEQ IDNo.4所示的序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成DNA质粒，质粒大小336bp。
本发明提供的试剂盒优选包括浓度为1.0×102～5IU/mL的临界阳性质控品，更优选为1.0×102～4IU/mL，最优选为1.0×103IU/mL。在本发明中，所述临界阳性质控品为含有细粒棘球绦虫DNA片段的质粒，所述细粒棘球绦虫DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示，在此不再赘述。
在本发明中，所述试剂盒在使用时，实时RAA荧光反应体系每50μl包括：47μl反应缓冲液，2μl引物探针组合物，1μl样品或阴性质控品或阳性质控品或临界阳性质控品。
在本发明中，所述实时RAA荧光反应的条件包括：所述实时RAA荧光反应的温度优选为30～45℃，更优选为35～40℃，最优选为37℃；所述实时RAA荧光反应的时间优选为15～25min，更优选为18～22min，最优选为20min。
在本发明中，所述检测细粒棘球绦虫DNA的结果分析条件优选设定为：在20min内FAM荧光检测仪器检测到信号明显增强，增加的荧光值达到本底值的30％以上为阳性；在20min内FAM荧光仪器信号无增加，显示扩增结果为阴性。
在本发明中，待测样品为细粒棘球绦虫的包囊的DNA；所述待测样品的的制备方法优选包括：用组织样本DNA提取试剂盒提取细粒棘球绦虫的包囊的DNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行，得到样品。在试剂盒使用时，样品的量优选为1μl。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种检测细粒棘球绦虫DNA的引物探针组合物和试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
试剂盒的组成：
引物和探针的设计与具体实施方式中的引物和探针的设计相同，在此不再赘述，引物和探针的序列与具体实施方式中的引物和探针的序列相同，在此不再赘述，探针的荧光报告基团、淬灭基团和四氢呋喃残基的修饰与具体实施方式中的修饰相同，在此不再赘述。
试剂盒的组成见表1。
表1试剂盒的组成
将5ul重组质粒转接大肠杆菌培养并提取出来的浓度为1010IU/mL DNA质粒制成不同梯度的的工作标准品，分别为：
工作标准品1，含有1.0×107IU/mL细粒棘球绦虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品2，含有1.0×106IU/mL细粒棘球绦虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品3，含有1.0×105IU/mL细粒棘球绦虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品4，含有1.0×104IU/mL细粒棘球绦虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品5，含有1.0×103IU/mL细粒棘球绦虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
工作标准品6，含有1.0×102IU/mL细粒棘球绦虫的5.8S rRNA基因的非传染性DNA片段。
反应体系配制：按吸取376μL反应缓冲液，加入16μL引物探针组合物，充分混均；吸取混均后的缓冲液49μL试剂分别加入到8个装有RAA基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在8个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、标准工作品6、标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。
将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。
检测结果如附图1所示。结果显示最快3分钟明显有扩增，10分钟内所有标准工作品均有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。能检测到工作标准品6含有1.0×102IU/mL的荧光信号。
实施例2
试剂盒的组成与实施例1相同。
样本来源及DNA提取
样本由江苏省血吸虫病防治研究所提供，为细粒棘球绦虫的包囊，DNA提取采用商品化的组织样本DNA提取试剂盒，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取好的DNA-80℃保存备用。
反应体系配制：取两个反应管，分别按如下操作，吸取47μL反应缓冲液，加入2μL引物探针组合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到装有RAA基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在2个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL提取好的样本DNA为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。
将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟，检测结果如附图2所示。结果显示6分钟明显有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。
实施例3
试剂盒的组成同实施例1。
样本来源及DNA提取
所有样本均由江苏省血吸虫病防治研究所提供，细粒棘球绦虫的包囊，血吸虫样本为血吸虫虫卵，十二指肠钩蚴培养物，肝吸虫样本为感染肝吸虫的鱼样本，DNA提取采用QIAGEN试剂盒分别提取组织试剂盒和专用DNA提取试剂盒，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取好的DNA-80℃保存备用。
反应体系配制：取5个反应管，分别按如下操作，吸取47μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到装有RAA基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在5个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL提取好细粒棘球绦虫样本DNA、1μL血吸虫虫卵DNA、1μL包虫样本DNA、1μL肝吸虫样本DNA为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。
将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。
检测结果如图3所示，结果显示只有细粒棘球绦虫的包囊样本DNA明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性，表明本发明的试剂盒特异性好。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。
由以上实施例可以得出，本发明提供的引物探针组合物能够快速检测细粒棘球绦虫，操作简便，在20min内能够得到检测结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省血吸虫病防治研究所
江苏奇天基因生物科技有限公司
<120> 一种检测细粒棘球绦虫DNA的引物探针组合物和试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgttgatttt gcctggattt ggtataatta gtcat 35
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaacaaccc atcacaaaac cggatcacta aca 33
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgtttgggt agcagggttt ggggtcatca tatgtttact gttgggttg 49
<210> 4
<211> 391
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtgttgatt ttgcctggat ttggtataat tagtcatatt tgtttgagta ttagtgctaa 60
ttttgatgcg tttgggttct atgggttgtt gtttgctatg ttttctatag tgtgtttggg 120
tagcagggtt tggggtcatc atatgtttac tgttgggttg gatgtgaaga cggctgtttt 180
ttttagctct gttactatga ttataggggt tcctactggt ataaaggtgt ttacttggtt 240
atatatgttg ttgaattcga gtgttaatgt tagtgatccg gttttgtgat gggttgtttc 300
ttttatagtg ttgtttacgt ttgggggagt tacgggtata gttttgtctg cttgtgtgtt 360
agataatatt ttgcatgata cttggtttgt g 391
<210> 5
<211> 391
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtgttgatt ttgcctggat ttggtataat tagtcatatt tgtttgagta ttagtgctaa 60
ttttgatgcg tttgggttct atgggttgtt gtttgctatg ttttctatag tgtgtttggg 120
tagcagggtt tggggtcatc atatgtttac tgttgggttg gatgtgaaga cggctgtttt 180
ttttagctct gttactatga ttataggggt tcctactggt ataaaggtgt ttacttggtt 240
atatatgttg ttgaattcga gtgttaatgt tagtgatccg gttttgtgat gggttgtttc 300
ttttatagtg ttgtttacgt ttgggggagt tacgggtata gttttgtctg cttgtgtgtt 360
agataatatt ttgcatgata cttggtttgt g 391

Claims (10)

1.一种检测细粒棘球绦虫DNA的引物探针组合物，包括引物和探针，所述引物包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；
所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；
所述探针为在SEQ ID No.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第33位碱基修饰淬灭基团和第32位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
4.一种试剂盒，包括权利要求1～3任意一项所述的引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：引物探针组合物40～80μl，所述上游引物和下游引物的浓度独立的为0.03～0.07mM，所述探针的浓度为0.01～0.03mM；RAA基础荧光通用反应试剂24管冻干粉；反应缓冲液1000～1800μl；阴性质控品25～35μl；浓度为1.0×104～8IU/mL的阳性质控品；浓度为1.0×102～5IU/mL的临界阳性质控品。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为ddH2O。
7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有细粒棘球绦虫DNA片段的质粒，所述细粒棘球绦虫DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示。
8.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述临界阳性质控品为含有细粒棘球绦虫DNA片段的质粒，所述细粒棘球绦虫DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示。
9.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括：450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc和质量体积百分含量为5～15％的PEG10000。
10.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在使用时，实时RAA荧光反应体系每50μl包括：47μl反应缓冲液，2μl引物探针组合物，1μl样品、阴性质控品、阳性质控品或临界阳性质控品；
所述实时RAA荧光反应的条件包括：所述实时RAA荧光反应的温度为25～42℃，所述实时RAA荧光反应的时间为15～20min。
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