CN105734150A - 一种奶牛隐孢子虫的快速检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种奶牛隐孢子虫的快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：月桂酰肌氨酸钠水溶液，吐温?20水溶液，引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液。本发明还提供奶牛隐孢子虫的快速检测方法。本发明的试剂盒具有敏感性高、特异性强、反应迅速、操作简单等特点。且无须利用DNA提取试剂盒提取样品DNA，同时利用RPA?测流层析的优点，可以完全脱离实验室环境，从而实现奶牛养殖场实地快速检测奶牛是否感染隐孢子虫，进而采取相应措施减少损失，遏制传播。

Description

一种奶牛隐孢子虫的快速检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种奶牛隐孢子虫的快速检测方法及检测试剂盒。
背景技术
隐孢子虫卵广泛的存在于环境当中，可以感染多种脊椎动物，造成不同程度的腹泻甚至死亡。对于奶牛养殖业，隐孢子虫病是一种重要的寄生虫病，可引起犊牛腹泻，抑制幼畜的生长发育, 降低畜产品的产量和数量，造成饲料的大量浪费。同时奶牛粪便是重要的传染源，威胁人类的健康。一旦感染隐孢子虫，没有有效的治疗方法。所以建立一种快速简便的奶牛隐孢子虫诊断方法显得尤为重要。
发明内容
本发明目的是针对现有技术的不足，提出一种快速简便检测奶牛粪便中隐孢子虫的方法，可以实现临床现场检测；本发明还提供奶牛隐孢子虫的快速检测试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一种奶牛隐孢子虫的快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：月桂酰肌氨酸钠水溶液，吐温-20水溶液，引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液；
所述引物探针混合液中引物序列为：
上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；
下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；
探针序列为：5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-Spacer C3-3'；
所述PBST溶液的制备方法为：将1ml的吐温-20溶于1000mlPBS溶液中，混匀即可。
作为优选，每16μl所述引物探针混合液的制备方法为：将上游引物21pmol，下游引物21pmol，探针6pmol混合于16μl纯水中。
本发明的第二个目的是提供奶牛隐孢子虫的快速检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，步骤如下：
（1）将奶牛粪便溶解于装有月桂酰肌氨酸钠水溶液的容器中，将容器放入盛有沸水的锅中，盖上锅盖，利用沸水的余温孵育10-20分钟，之后在容器内加入吐温-20，使溶液中吐温-20的浓度约为5%-10%，得到含有隐孢子虫DNA的样品处理液；
（2）对样品处理液进行重组酶聚合酶扩增；扩增时所使用的引物和探针为：
上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；
下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；
探针为：5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-Spacer C3-3'；
（3）将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验，如果试纸条为两条杠，则为隐孢子虫阳性，如果为一条杠，则为阴性。
作为优选，步骤（1）中所述月桂酰肌氨酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.1%-0.2%。
作为优选，步骤（2）中所述重组酶聚合酶扩增的反应体系为：样品处理液2μl，引物探针混合液16μl，RPA反应预混液32μl，RPA反应冻干酶一份；反应条件为：在30℃-45℃条件下反应20-30分钟。
作为优选，步骤（3）中将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验的具体方法为：用无菌牙签沾取少许扩增产物与200μl PBST溶液混合，然后沾取一滴混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直浸入装有200μl PBST 溶液的离心管中，数分钟后观察结果；
所述PBST溶液的制备方法为：将1ml的吐温-20溶于1000mlPBS溶液中，混匀即可。
本发明的第三个目的是提供上述试剂盒在检测奶牛隐孢子虫中的应用，所述检测不以疾病的诊断和治疗为目的。
作为优选，所述奶牛隐孢子虫为感染奶牛的微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫和瑞氏隐孢子虫。
本发明的第四个目的是提供一种从奶牛粪便中提取隐孢子虫DNA的方法，步骤如下：将奶牛粪便溶解于装有0.1%-0.2%月桂酰肌氨酸钠水溶液的容器中，将容器放入盛有沸水的锅中，盖上锅盖，利用沸水的余温孵育10-20分钟，之后在容器内加入吐温-20，使溶液中吐温-20的浓度为5%-10%，完成奶牛粪便中隐孢子虫DNA的提取。
月桂酰肌氨酸钠在高温下能够溶解隐孢子虫卵囊壁，使其释放DNA，但是月桂酰肌氨酸钠会抑制DNA聚合酶的活性，吐温-20溶液能够消除月桂酰肌氨酸钠对DNA聚合酶活性的抑制作用，这样无需DNA提取试剂盒就可以获得奶牛粪便中的隐孢子虫DNA。相比以前在90℃恒温条件下进行孵育，在这里我们只需在沸水中利用沸水的余温进行孵育，这样就无需恒温水浴锅，利用生活中常用热水方法就可以达到相同的效果。RPA-测流层析技术以其特异性强、灵敏度高、反应迅速、设备简单等优点，结合上述DNA获取方法，就可以实现奶牛养殖场实地快速检测隐孢子虫，进而采取相应措施减少损失，遏制传播。
本发明是建立在分子生物学基础上，基于感染奶牛的微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫高度保守的小核糖体18S基因设计了特定引物和探针，应用重组酶聚合酶扩增（RPA）-测流层析的方法制备了快速检测奶牛隐孢子虫的试剂盒。该试剂盒具有敏感性高、特异性强、反应迅速、操作简单等特点。且无须利用DNA提取试剂盒提取样品DNA，同时利用RPA-测流层析的优点，可以完全脱离实验室环境，从而实现奶牛养殖场实地快速检测隐孢子虫，进而采取相应措施减少损失，遏制传播。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的试剂盒的敏感性实验结果；
图2为本发明的试剂盒的特异性实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
本发明的奶牛隐孢子虫快速检测试剂盒包括：
月桂酰肌氨酸钠水溶液，吐温-20水溶液，引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条（Milenia Hybridtech 1 strips,胜创生物），RPA试剂盒（TwistAmp nfo kit，胜创生物）提供的冻干酶和RPA反应预混液（29.5μl Rehydration Buffer和2.5μl 280mM Magnesium Acetate混合液）。
具体制备方法为：
（1）粪便样品处理液：①质量百分比为的0.1%的月桂酰肌氨酸钠水溶液按400μl/管分装于2ml的离心管中，备用；②质量百分比为的10%的吐温-20水溶液按500μl/管分装于2ml离心管中，备用。
（2）引物探针混合液：本申请针对微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫的小核糖体18S基因的一段保守序列，设计这四个种的保守引物和探针；其中，下游引物在5’端有生物素标记。具体核苷酸序列如下：
上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；
下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；
探针：5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-Spacer C3-3'。
将上游引物21 poml、下游引物21 pmol、探针6 pmol混合于16μl纯水中，得到引物探针混合液。
（3）PBST 溶液：将1ml的吐温-20溶于1000mlPBS溶液当中，备用。
本发明的试剂盒的使用方法为：
RPA反应体系为：2μl的样品处理液，16μl的引物探针混合液，RPA反应预混液32μl，RPA反应冻干酶一份。反应条件为：反应温度为30℃-45℃之间，反应时间为20到30分钟。
反应后用无菌牙签沾取少许RPA产物与200μl PBST溶液混合，沾取一滴混合液，滴加到测流层析试纸条的加样端，最后将试纸条竖着插入的装有200μl PBST溶液的离心管中，5分钟后观察结果，如果试纸条为两条杠，则奶牛粪便为隐孢子虫阳性，如果为一条杠则为阴性。
实施例2 具体应用实施例
应用本发明的试剂盒快速检测奶牛隐孢子虫的方法如下：
（1）奶牛粪便样品中隐孢子虫DNA的获得：
取黄豆状大小的奶牛粪便溶解于装有400μl浓度为0.1%的月桂酰肌氨酸钠水溶液的2ml离心管中，将离心管放入盛有沸水的非保温锅中，盖上锅盖，利用沸水的余温孵育15分钟（注：不是在沸水中煮15分钟，否则会破坏隐孢子虫DNA的结构）。孵育后取出离心管加入500μl浓度为10%的吐温-20水溶液并混匀，获得含有隐孢子虫DNA的样品处理液。
（2）RPA反应
用类似牙签的无菌棒沾取少许（1）中得到的样品处理液（约2μl），与准备好的16μl的引物探针混合液、32μl的RPA反应预混液一同加入到装有RPA反应冻干酶的离心管中，混匀。在30℃-45℃条件下（可以捂在手中或腋窝下）反应20-30分钟。
（3）反应产物的检测：
用类似牙签的无菌棒沾取少许（2）中反应产物（2-4μl）与准备好的200μl的PBST溶液混合，沾取一滴混合液（约10μl）滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直浸入装有200μl PBST 溶液的1.5ml离心管中。5分钟后观察结果，如果试纸条为两条杠，则奶牛粪便为隐孢子虫阳性，如果为一条杠则为阴性。
实施例3 本发明的试剂盒的敏感性实验
实验过程为：将纯化的隐孢子虫卵用纯水进行梯度稀释，每个梯度稀释的隐孢子虫样品与未感染隐孢子虫的奶牛粪便混合，混匀后将它们按照上述方法提取DNA，并进行RPA扩增反应，每个扩增反应中加入的隐孢子虫卵的DNA的量分别为104，103，102，10，5，1，0.5，0.1个。反应后按照前面提到的方法进行测流层析试纸条检测，结果显示，该方法可以检测到反应体系中加入0.5个隐孢子虫卵的DNA。
实验结果参见图1（注：对照条带的显现是为了显示试纸条功能正常，检测条带的显现表示阳性；NC为空白对照）。
实施例4 本发明的试剂盒的特异性实验
实验过程为：用弓形虫，蓝氏贾第虫，艾美尔球虫，微孢子虫和未感染隐孢子虫奶牛粪便的DNA与四种隐孢子虫DNA进行特异性分析，结果发现该试剂盒只能检测到感染奶牛的微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫。
实验结果参见图2（注：对照条带的显现是为了显示试纸条功能正常，检测条带的显现表示阳性）。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种奶牛隐孢子虫的快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下成分：月桂酰肌氨酸钠水溶液，吐温-20水溶液，引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液；
所述引物探针混合液中引物序列为：
上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；
下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；
探针序列为：5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-Spacer C3-3'；
所述PBST溶液的制备方法为：将1ml的吐温-20溶于1000mlPBS溶液中，混匀即可。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：每16μl所述引物探针混合液的制备方法为：将上游引物21pmol，下游引物21pmol，探针6pmol混合于16μl纯水中。
3.奶牛隐孢子虫的快速检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：步骤如下：
（1）将奶牛粪便溶解于装有月桂酰肌氨酸钠水溶液的容器中，将容器放入盛有沸水的锅中，盖上锅盖，利用沸水的余温孵育10-20分钟，之后在容器内加入吐温-20，使溶液中吐温-20的浓度为5%-10%，得到含有隐孢子虫DNA的样品处理液；
（2）对样品处理液进行重组酶聚合酶扩增；扩增时所使用的引物和探针为：
上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；
下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；
探针为：
5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-Spacer C3-3'；
（3）将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验，如果试纸条为两条杠，则为隐孢子虫阳性，如果为一条杠，则为阴性。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述月桂酰肌氨酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.1%-0.2%。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述重组酶聚合酶扩增的反应体系为：样品处理液2μl，引物探针混合液16μl，RPA反应预混液32μl，RPA反应冻干酶一份；反应条件为：在30℃-45℃条件下反应20-30分钟。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤（3）中将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验的具体方法为：用无菌棒沾取少许扩增产物与200μl PBST溶液混匀，然后沾取一滴混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直浸入装有200μl PBST溶液的离心管中，数分钟后观察结果；
所述PBST溶液的制备方法为：将1ml的吐温-20溶于1000mlPBS溶液中，混匀即可。
7.权利要求1或2所述的试剂盒在检测奶牛隐孢子虫中的应用，所述检测不以疾病的诊断和治疗为目的。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述奶牛隐孢子虫为感染奶牛的微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫和瑞氏隐孢子虫。
9.一种从奶牛粪便中提取隐孢子虫DNA的方法，其特征在于：步骤如下：将奶牛粪便溶解于装有月桂酰肌氨酸钠水溶液的容器中，将容器放入盛有沸水的锅中，盖上锅盖，利用沸水的余温孵育10-20分钟，之后在容器内加入吐温-20，使溶液中吐温-20的浓度为5%-10%，完成奶牛粪便中隐孢子虫DNA的提取。
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