CN101525671B - 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用。本发明提供了检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成：一对引物是能结合于GenBank Accession Number EF075945中ORF1a区域的内侧引物对，一对引物是能结合于GenBank Accession Number EF075945中ORF1a区域的外侧引物对，一对引物是能结合于GenBank Accession NumberEF075945中ORF1a区域的环形引物对。本发明提供的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒是包括所述专用引物的试剂盒。本发明的试剂盒，检测灵敏度高，10个拷贝即可检测出目的RNA，操作简单方便，特别适于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖呼吸综合征病毒引起的，是以怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍及仔猪和育肥猪的呼吸道疾病为主要症状的传染病。该病1987年首次在美国报道，此后在加拿大、德国、西班牙、英国也相继报道了该病的发生。1995年，我国大陆发现了此病，且在多个省份开始流行。随后在1996年和1997年相继从疑似的病例中分离到了该病病源。
2006年我国东南部省区相继爆发了严重高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染，数以万计的猪迅速死亡。通过病源分离与鉴定，确定是由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染造成的。高致病性病毒感染的特点是猪只发病快、疾病传播迅速、对养猪业危害极大。经过序列比对发现，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与经典的猪繁殖与呼吸综合征病毒在基因组ORF1的Nsp2区出现了变异。
猪繁殖呼吸综合征病毒的现有检测方法很多，但是能直接检测高致病性猪繁殖呼吸综合征病毒的方法却很少。现在报道的方法主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)等和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。但是这些方法有耗时、操作复杂、所需仪器试剂较昂贵等缺点，不适合于进行田间快速诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒。
本发明提供了检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成：一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank Accession Number EF075945中ORF1a区域的内侧引物对，一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank Accession NumberEF075945中ORF1a区域的外侧引物对，一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank Accession Number EF075945中ORF1a区域的环形引物对。
具体来说，所述专用引物中，一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank Accession Number EF075945中自5′末端第2701至3150位核苷酸区域(Nsp2区部分序列)的内侧引物对，一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank Accession Number EF075945中自5′末端第2701至3150位核苷酸区域(Nsp2区部分序列)的外侧引物对，一对引物是能结合于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank Accession Number EF075945中自5′末端第2701至3150位核苷酸区域(Nsp2区部分序列)的环形引物对。
更具体来说，所述内侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。
本发明提供的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒是含有所述专用引物的试剂盒。
本发明中三对引物针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank AccessionNumber EF075945中自5′末端第2701至3150位核苷酸区域(Nsp2区部分序列)，为国内分离的高致病性猪繁殖呼吸综合征病毒的变异区域。
该高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒在使用过程中，所述的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对作为一个整体组使用，使用时应该尽量避免引物二聚体的形成。
所述内侧引物对包括上游引物(FIP)和下游引物(BIP)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物(F3)和下游引物(B3)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物(LF)和下游引物(LB)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。
所述试剂盒还可包括环介导等温扩增试剂和检样管。
所述检样管为含FTA卡片的离心管。
所述试剂盒和可包括阳性对照和阴性对照。
所述阳性对照可为FTA卡片上黏附了如下核酸序列或粘附了含有如下核酸序列的质粒的检样管：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank Accession Number EF075945中自5′末端第2701至3150位核苷酸(Nsp2区部分序列)。
所述环介导等温扩增试剂具体可为含有如下溶质的水溶液：Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween20、MgSO4、甜菜碱、钙黄绿素、MnCl2、脱氧核苷酸、Bst DNA聚合酶和AMV反转录酶。
在所述环介导等温扩增试剂中加入所述内侧引物对、所述外侧引物对及所述环形引物对，形成环介导等温扩增反应液；每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量如下：
Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH4)2SO4 0.25μmol、Tween20 0.025μL、MgSO4 0.2-20μmol、甜菜碱20μmol、钙黄绿素0.00125μmol、MnCl2 0.015μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02-0.04μmol；
每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量优选如下：
Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH4)2SO4 0.25μmol、Tween20 0.025μL、MgSO4 0.2μmol、甜菜碱20μmol、钙黄绿素0.00125μmol、MnCl2 0.015μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02μmol。
本发明还提供了一种检测死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括如下步骤：用所述的专用引物或所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒对来自死亡动物的样品的总RNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、20-90分钟。
所述检测死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法中还包括将进行完所述环介导等温扩增反应的样本80-90℃反应2-10分钟的步骤。
应用本发明提供的试剂盒检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，可以通过直接检视判断样本是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒。直接检视方法为：
装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。如果装有待检测样品的检样管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。如果装有待检测样品的检样管有亮绿色可见荧光，则说明样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阳性。
所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒具体可为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HUB1株。
所述专用引物在制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的应用与属于本发明的保护范围。
本发明提供的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的检测原理如下：
根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank Accession Number EF075945中自5′末端第2701至3150位核苷酸(Nsp2区部分序列)(序列表的序列1)设计了一组用于环介导等温扩增的引物，即内侧引物对(内侧上游引物FIP和内侧下游引物BIP)、外侧引物对(外侧上游引物F3和外侧下游引物B3)和环形引物对(环形上游引物LF和环形下游引物LB)。三对引物和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(2701-3150)部分序列变异区域的八个特定区域的序列完全配对，确保反应的彻底进行，也保证了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法的特异性。
F3：SEQ ID NO 2：CCTTTGAGTGGGTCAGCAC(序列表的序列2)；
B3：SEQ ID NO 3：GTGCAGGGTTGGTGTCATT(序列表的序列3)；
FIP：SEQ ID NO 4：GCAGACAAATCCAGAGGCTCTTTTAGTTCCTGCACCGCGTAGA(序列表的序列4)；
BIP：SEQ ID NO 5：CCTAGCACCGTCGCAGAACATTTTTCACTCAGGACTTCCTCAGC(序列表的序列5)；
LF：SEQ ID NO6：CTGGTGCGTCAGCGTTG(序列表的序列6)；
LB：SEQ ID NO7：ATGGGCATCCTGGAGGCG(序列表的序列7)。
所述的引物组与所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GenBank AccessionNumber EF075945中自5′末端第2701至3150位核苷酸(Nsp2区部分序列)上8个特定区域结合，见表1
表1引物组与Nsp2区部分序列的结合区域
上述引物组在AMV反转录酶和具有高度链置换催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成对模板RNA的扩增。扩增过程分为三个阶段，具体如下：
(1)反转录阶段
在AMV反转录酶的作用下，样本RNA被反转录为cDNA。
(2)循环起始阶段
一端内侧引物先与模板结合并启动DNA合成。相同一端的外侧引物随后与模板结合启动DNA合成，并发生链置换释放出含有内侧引物序列的DNA单链。该单链DNA作为模板先后与另一端的内侧引物和外侧引物结合，启动DNA合成并发生链置换，最后形成一个初始的茎环DNA。
(3)反应循环阶段
内侧引物与初始茎环DNA结合，启动链置换DNA合成，可产生另一个初始茎环DNA和一个新的两倍长度的茎环DNA。这些茎环DNA可作为模板继续与内侧引物结合启动链置换DNA合成，并且每次合成均可使茎环DNA的茎长度成倍增长。
进入循环阶段后，会产生许多分子大小不同的茎环DNA，这些茎环DNA还可作为模版与环形引物结合，启动更多的DNA合成并发生链置换。最后经过一个小时的等温扩增，目的DNA可累积109拷贝。
应用本发明提供的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒进行检测，特异性高且灵敏度高，可检测出10个拷贝的目的RNA。与PCR检测方法相比，应用本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒检测，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属或水浴锅即可，并且检测结果通过观察可见荧光即可，操作简单方便。本发明的试剂盒可应用于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
本发明提供的试剂盒检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒可包括如下步骤：
(1)样本的处理
①待测样本
取待测血液样本10μl滴加于检样管内的FTA卡(Whatman，Cat No.WB120205)上，室温放置10min后，用移液管将血液吸出，留下纸片。加入200μl ddH2O，在室温下放置5分钟(如需要，可在管内进行适当的人工混合)。用移液管将管内用过的ddH2O全部吸出，即得。
②阴性对照
用10μl双蒸水代替待测血液样本，滴加于检样管内FTA卡上，室温放置10min后，用移液管将液体吸出，留下纸片。加入200μl ddH2O，在室温下放置5分钟。用移液管将管内用过的ddH2O全部吸出，即得。
(2)环介导的等温扩增
①向检样管中加入23μl的LAMP反应液(2mm的FTA卡在反应体系中视为2μl)；
②于水浴锅或金属恒温加热器上60-65℃放置20-90分钟，取出。
在步骤②完成后，取出前，还可以再调水浴锅温度到80-90℃反应2-10分钟，目的是能够终止反应，以便长期保存反应结果。
(3)结果判定
可以通过直接检视判断样本是杏含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。
装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。如果装有待检测样品的检样管仍为棕黄色无荧光液体，则说明待检样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性；如果装有待检测样品的检样管有亮绿色可见荧光，则说明样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阳性。
实施例1、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
人工合成以下3对引物：
F3：CCTTTGAGTGGGTCAGCAC；
B3：GTGCAGGGTTGGTGTCATT；
FIP：GCAGACAAATCCAGAGGCTCTTTTAGTTCCTGCACCGCGTAGA；
BIP：CCTAGCACCGTCGCAGAACATTTTTCACTCAGGACTTCCTCAGC；
LF：CTGGTGCGTCAGCGTTG；
LB：ATGGGCATCCTGGAGGCG。
二、检样管的制备
用2.0mm打孔取样器从空白的FTA卡(Whatman，Cat No.WB120205)上取下直径2.0mm的小圆片，置一0.25ml离心管底部。
三、阳性对照的制备
生长良好的Marc-145细胞(中国兽医药品监察所)长成单层后，用Hank’s液(pH7.4)洗涤2次，接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HUB1株(农业部兽医诊断中心)，37℃吸附1h，加含1％犊牛血清的MEM营养液继续培养，待CPE达70％左右时收获病毒液，取10微升病毒液，参照Invitrogen公司TRIZOL试剂盒提取RNA，加至检样管内的FTA卡上。室温放置10min后，用移液管将血液吸出，留下纸片。加入200μl ddH2O，在室温下放置5分钟(如需要，可在管内进行适当的人工混合)。用移液管将管内用过的ddH2O全部吸出。病毒RNA即黏附在处理过的FTA圆片上。得到阳性对照，-20～-4℃保存备用。
四、配制LAMP反应液
每23μL LAMP反应液，含有以下组分：0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、0.025μL Tween20、0.2μmolMgSO4、20μmol甜菜碱(Betaine)、0.00125μmol钙黄绿素、0.015μmol MnCl2、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.04μmol上游内侧引物(FIP)、0.04μmol下游内侧引物(BIP)、0.004μmol上游外侧引物(F3)、0.004μmol下游外侧引物(B3)、0.02μmol上游环形引物(LF)、0.02μmol下游环形引物(LB)、16U的Bst DNA聚合酶、0.2U的AMV反转录酶、灭菌双蒸水。
五、试剂盒的组装
该试剂盒由以下物质组成：步骤四配制的LAMP反应液、步骤三制备的阳性对照和步骤二制备的检样管若干支。
实施例2、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
同实施例1的步骤一。
二、检样管的制备
同实施例1的步骤二。
三、阳性对照的制备
同实施例1的步骤三。
四、配制LAMP反应液
每23μL LAMP反应液，含有以下组分：0.5μmol Tri s-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、0.025μL Tween20、20μmol MgSO4、20μmol甜菜碱(Betaine)、0.00125μmol钙黄绿素、0.015μmol MnCl2、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.06μmol上游内侧引物(FIP)、0.06μmol下游内侧引物(BIP)、0.008μmol上游外侧引物(F3)、0.008μmol下游外侧引物(B3)、0.04μmol上游环形引物(LF)、0.04μmol下游环形引物(LB)、16U的Bst DNA聚合酶、0.2U的AMV反转录酶、灭菌双蒸水。
五、试剂盒的组装
同实施例1的步骤五。
实施例3、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
同实施例1的步骤一。
二、检样管的制备
同实施例1的步骤二。
三、阳性对照的制备
同实施例1的步骤三。
四、配制LAMP反应液
每23μL LAMP反应液，含有以下组分：0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH4)2SO4、0.025μL Tween20、10μmol MgSO4、20μmol甜菜碱(Betaine)、0.00125μmol钙黄绿素、0.015μmol MnCl2、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.05μmol上游内侧引物(FIP)、0.05μmol下游内侧引物(BIP)、0.006μmol上游外侧引物(F3)、0.006μmol下游外侧引物(B3)、0.03μmol上游环形引物(LF)、0.03μmol下游环形引物(LB)、16U的Bst DNA聚合酶、0.2U的AMV反转录酶、灭菌双蒸水。
五、试剂盒的组装
同实施例1的步骤五。
实施例4、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1只确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。
一、样本的处理
1、待测样本
取待测血液样本10μl滴加于检样管内的FTA卡上，室温放置10min后，用移液管将血液吸出，留下纸片。加入200μl ddH2O，在室温下放置5分钟(如需要，可在管内进行适当的人工混合)。用移液管将管内用过的ddH2O全部吸出，即得。
采用病猪血样进行上述处理，得到三支含有病猪血样的检样管。
采用健康猪血样进行上述处理，得到三支含有健康猪血样的检样管。
2、阴性对照
用10μl双蒸水代替待测血液样本，滴加于检样管内FTA卡上，室温放置10min后，用移液管将液体吸出，留下纸片。加入200μl ddH2O，在室温下放置5分钟。用移液管将管内用过的ddH2O全部吸出，即得。
二、环介导等温扩增
在每支含有病猪血样的检样管中加入23μL的LAMP反应液，作为检测组1；在每支含有健康猪血样的检样管中加入23μL的LAMP反应液，作为检测组2；取阳性对照和阴性对照各3支，分别加入23μL的LAMP反应液。
上述检样管同时在水浴锅上60℃放置90分钟，取出。
三、检视
装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。健康猪检测组的三个反应管均为棕黄色，病猪检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例5、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1只确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例3制备的试剂盒对样本进行检测。
一、样本的处理
同实施例4的步骤一。
二、环介导等温扩增
在每支含有病猪血样的检样管中加入23μL的LAMP反应液，作为检测组1；在每支含有健康猪血样的检样管中加入23μL的LAMP反应液，作为检测组2；取阳性对照和阴性对照各3支，分别加入23μL的LAMP反应液。
上述检样管同时在金属浴锅上65℃放置70分钟，取出。
三、检视
装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。健康猪检测组的三个反应管均为棕黄色，病猪检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例6、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1只确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例2制备的试剂盒对样本进行检测。
一、样本的处理
同实施例4的步骤一。
二、环介导等温扩增
在每支含有病猪血样的检样管中加入23μL的LAMP反应液，作为检测组1；在每支含有健康猪血样的检样管中加入23μL的LAMP反应液，作为检测组2；取阳性对照和阴性对照各3支，分别加入23μL的LAMP反应液。
上述检样管同时在水浴锅上60℃放置50分钟，取出。
三、检视
装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。健康猪检测组的三个反应管均为棕黄色，病猪检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例7、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1只确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的死猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。
一、样本的处理
同实施例4的步骤一。
二、环介导等温扩增
在每支含有病猪血样的检样管中加入23μL的LAMP反应液，作为检测组1；在每支含有健康猪血样的检样管中加入23μL的LAMP反应液，作为检测组2；取阳性对照和阴性对照各3支，分别加入23μL的LAMP反应液。
上述检样管同时在水浴锅上65℃放置30分钟，调水浴锅温度到80℃反应10min，取出。
三、检视
装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。健康猪检测组的三个反应管均为棕黄色，死猪检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例8、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1只确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的死猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例2制备的试剂盒对样本进行检测。
一、样本的处理
同实施例4的步骤一。
二、环介导等温扩增
在每支含有病猪血样的检样管中加入23μL的LAMP反应液，作为检测组1；在每支含有健康猪血样的检样管中加入23μL的LAMP反应液，作为检测组2；取阳性对照和阴性对照各3支，分别加入23μL的LAMP反应液。
上述检样管同时在水浴锅上60℃放置20分钟，调水浴锅温度到90℃反应2min，取出。
三、检视
装有阳性对照的检样管有亮绿色可见荧光，装有阴性对照的检样管仍为棕黄色无荧光液体。健康猪检测组的三个反应管均为棕黄色，死猪检测组的三个反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例9、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒灵敏度的检测
制备0.5×104拷贝/μL、0.5×103拷贝/μL、0.5×102拷贝/μL、5拷贝/μL和0.5拷贝/μL携带GenBank Accession Number EF075945中ORF1a区域的Nsp2区部分序列的质粒样本。采用实施例3制备的试剂盒对质粒样本进行检测。
一、质粒的制备
提取高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HUB1株(农业部兽医诊断中心)的RNA，反转录得到DNA，根据PCR方法扩增得到病毒基因组GenBank Accession NumberEF075945中ORF1a区域ORF1的Nsp2区部分序列(见序列表的序列1)。再与T载体连接后即形成所需要的质粒，一个质粒分子对应一个拷贝的Nsp2区部分序列。将质粒转入感受态细胞，在合适的条件下培养感受态细胞，质粒可随着感受态细胞的繁殖而复制。最后从感受态细胞中提取纯化质粒。得到的质粒可通过分光光度计法测定并计算拷贝数浓度。用双蒸水将质粒稀释到所需要的浓度，即0.5×104拷贝/μL、0.5×103拷贝/μL、0.5×102拷贝/μL、5拷贝/μL和0.5拷贝/μL。检测时加入各浓度质粒2μL，每个反应中对应含有104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、10拷贝/μL、1拷贝/μL的质粒样本。(可参考《分子克隆试验指南》第三版，所需要的试剂和仪器均为市面可购买的。)
二、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测
分别对上述各浓度的质粒样本进行检测，检测步骤如下：
(1)环介导等温扩增
取步骤一得到0.5×104、0.5×103、0.5×102拷贝/μL、5拷贝/μL和0.5拷贝/μL拷贝/μL的质粒样本各2μL，分别加至3支检样管中，每管再加入23μL的LAMP反应液，分别作为检测组1、2、3、4和5；用相同体积的灭菌双蒸水代替质粒样本同法制备阴性对照；另取3支阳性对照，加入23μL的LAMP反应液。
上述检样管同时在水浴锅上65℃放置50分钟，调水浴锅温度到80℃反应10min，取出。
(2)直接检视
结果表明，阳性对照组的三个检样管均有亮绿色可见荧光，阴性对照组的三个检样管均为棕黄色无荧光液体。检测组1的三个检样管均有亮绿色可见荧光，检测组2的三个检样管均有亮绿色可见荧光，检测组3的三个检样管均有亮绿色可见荧光，检测组4的三个检样管均有亮绿色可见荧光，检测组5的三个检样管均为棕黄色无荧光液体。
序列表
<110>中国农业大学
<120>高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用
<130>CGGNARY92072
<160>7
<210>1
<211>450
<212>DNA
<213>高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HUB1株
(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain HUB1)
<400>1
gctccgcgca ggaaggtcag atccgattgc ggcagcccgg ttttgatggg cgacaatgtc 60
cctaacggtt cggaagaaac tgtcggtggt cccctcaatt ttccgacacc atccgagccg 120
atgacaccta tgagtgagcc cgtacttgtg cccgcgtcgc gacgtgtccc caagctgatg 180
acacctttga gtgggtcagc accagttcct gcaccgcgta gaactgtgac aacaacgctg 240
acgcaccagg atgagcctct ggatttgtct gcgtcctcac agacggaata tgaggctttc 300
cccctagcac cgtcgcagaa catgggcatc ctggaggcgg gggggcaaga agctgaggaa 360
gtcctgagtg aaatctcgga tatactaaat gacaccaacc ctgcacctgt gtcatcaagc 420
agctccctgt caagtgttaa gatcacacgc 450
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
cctttgagtg ggtcagcac 19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
gtgcagggtt ggtgtcatt 19
<210>4
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
gcagacaaat ccagaggctc ttttagttcc tgcaccgcgt aga 43
<210>5
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
cctagcaccg tcgcagaaca tttttcactc aggacttcct cagc 44
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
ctggtgcgtc agcgttg 17
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
atgggcatcc tggaggcg 18
Claims (9)
1.检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成：一对引物是能结合于GenBank Accession Number EF075945中自5′末端第2701至3150位核苷酸区域的内侧引物对，一对引物是能结合于GenBankAccession Number EF075945中自5′末端第2701至3150位核苷酸区域的外侧引物对，一对引物是能结合于GenBank Accession Number EF075945中自5′末端第2701至3150位核苷酸区域的环形引物对；
所述内侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。
2.含有权利要求1所述专用引物的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括环介导等温扩增试剂和检样管；所述检样管为含FTA卡片的离心管。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增试剂为含有如下溶质的水溶液：Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween20、MgSO4、甜菜碱、钙黄绿素、MnCl2、脱氧核苷酸、Bst DNA聚合酶和AMV反转录酶。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：在所述环介导等温扩增试剂中加入所述内侧引物对、所述外侧引物对及所述环形引物对，形成环介导等温扩增反应液；每23μL所述环介导等温扩增反应液中，含有如下溶质：
Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH4)2SO4 0.25μmol、Tween20 0.025μL、MgSO40.2-20μmol、甜菜碱20μmol、钙黄绿素0.00125μmol、MnCl2 0.015μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02-0.04μmol。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：每23μL所述环介导等温扩增反应液中，含有如下溶质：Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH4)2SO40.25μmol、Tween200.025μL、MgSO40.2μmol、甜菜碱20μmol、钙黄绿素0.00125μmol、MnCl20.015μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U、AMV反转录酶0.2U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02μmol。
7.一种检测死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的专用引物或权利要求2至6中任一所述的试剂盒对来自死亡动物的样品的总RNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、20-90分钟。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述检测死亡动物中是否携带高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法中还包括将进行完所述环介导等温扩增反应的样本80-90℃反应2-10分钟的步骤。
9.权利要求1所述专用引物在制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的应用。
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| 刘园园 等.<高致病性猪繁殖与呼吸系统综合症病毒荧光定量PCR检测方法的建立>.<现代食品科技>.2008,第24卷(第7期),全文. |
| 刘园园等.<高致病性猪繁殖与呼吸系统综合症病毒荧光定量PCR检测方法的建立>.<现代食品科技>.2008,第24卷(第7期),全文. * |
| 汪一帆 等.<环介导等温扩增技术及在感染病诊断中的应用>.<中国卫生检验杂志>.2008,第18卷(第9期),全文. |
| 汪一帆等.<环介导等温扩增技术及在感染病诊断中的应用>.<中国卫生检验杂志>.2008,第18卷(第9期),全文. * |
| 童光志 等.<高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析>.<中国预防兽医学报>.2007,第29卷(第5期),全文. |
| 童光志等.<高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析>.<中国预防兽医学报>.2007,第29卷(第5期),全文. * |
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