CN100567504C - 一种猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括三对引物，即与猪胸膜肺炎放线杆菌Gen Bank Accession Number AF021919序列中3’端1000bp基因结合的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对。试剂盒还包括环介导等温扩增试剂、阳性对照、阴性对照和荧光显色剂，阳性对照为猪胸膜肺炎放线杆菌DNA。本发明还提供了一种应用本发明的试剂盒检测动物中是否携带猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。本发明的试剂盒，检测灵敏度高，6-10个拷贝即可检测出目的DNA，操作简单方便，特别适于基层现场进行的病原检测及可能污染的动物食品中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测。

Description

一种猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒及其应用。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种致死性呼吸道传染病，以急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性局灶性坏死性肺炎为特征，急性病例大多死亡，亚急性和慢性病例常能耐过，但会导致生长迟滞，是目前世界上严重危害养猪业的五大疫病之一。近20年来，猪传染性胸膜肺炎曾在欧洲、亚洲、美洲等许多区域暴发，我国台湾省及国内许多省份均有发病报道，且呈逐年增长的趋势。由于急性耐过猪常患慢性肺脏病变(包囊形成，脓肿及胸膜粘连)成为带菌猪；慢性猪的饲料转化率降低，药物费用增加，断奶仔猪生长率及市场价值降低，所以猪传染性胸膜肺炎带来巨大的经济损失。

猪胸膜肺炎放线杆菌分为生物I型和生物II型，其中生物I型包括1至12血清型，在我国血清1、2、3、4、5、7、8、9、10型均有分布。另外，在临床上猪胸膜肺炎放线杆菌也常常会与猪瘟、蓝耳病、圆环病毒、巴氏杆菌、支原体或伪狂犬等混合感染。因此，猪胸膜肺炎放线杆菌的净化及防治需要敏感、特异的检测病原的诊断技术。

猪胸膜肺炎放线杆菌的现有检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法需要细菌分离、培养和鉴定，周期较长；血清学诊断方法包括补体结合反应、荧光抗体、间接血液凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等，血清学诊断方法的缺点是只能检测动物体内胸膜肺炎放线杆菌的抗体而无法检测病原；分子生物学诊断方法主要包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)与荧光核酸探针，分子生物学方法比前两种方法快速，灵敏，但需要使用特殊的仪器，如PCR仪，而荧光探针的制备比较昂贵，不适于基层应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的快速检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)的试剂盒。

本发明提供的猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒，包括针对猪胸膜肺炎放线杆菌GenBank Accession Number AF021919序列中自5’端第5550位至6549位的核苷酸序列的三对引物，一对引物是与所述序列结合的内侧引物对，一对引物是与所述序列结合的外侧引物对，一对引物是与所述序列结合的环形引物对。

该猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒在使用过程中，所述的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对作为一个整体组使用，使用时应该尽量避免引物二聚体的形成。

所述内侧引物对包括上游引物(FIP)和下游引物(BIP)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物(F3)和下游引物(B3)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物(LF)和下游引物(LB)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。

所述试剂盒还包括环介导等温扩增试剂、阳性对照、阴性对照；所述阳性对照为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌DNA。

所述环介导等温扩增试剂具体可为含有如下溶质的水溶液：Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、Tween20、MgSO₄、甜菜碱、脱氧核苷酸和Bst DNA聚合酶。

在所述环介导等温扩增试剂中加入所述内侧引物对、所述外侧引物对及所述环形引物对，形成环介导等温扩增反应液；每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量如下：

Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH₄)₂SO₄0.25μmol、Tween200.025μL、MgSO₄ 0.2-20μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02-0.04μmol。

每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量优选如下：

Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH₄)₂SO₄ 0.25μmol、Tween200.025μL、MgSO₄ 0.2μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02μmol。

所述试剂盒还包括荧光显色剂，任何常规荧光显示剂均可，如荧光染料SYBRGREEN I。

所述环介导等温扩增反应液与所述荧光显色剂的体积比为23∶(1-3)，优选23∶1。

本发明还提供了一种检测死亡动物中是否携带猪胸膜肺炎放线杆菌的方法，是用所述的猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒对来自死亡动物的样品的总DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定死亡动物中是否携带猪胸膜肺炎放线杆菌；所述环介导等温扩增反应的条件为60-65℃、20-90分钟。

所述检测死亡动物中是否携带猪胸膜肺炎放线杆菌的方法中还包括将进行完所述环介导等温扩增反应的样本80-90℃反应2-10分钟的步骤。

应用本发明提供的试剂盒检测猪胸膜肺炎放线杆菌，可以通过直接检视判断样本是否含有猪胸膜肺炎放线杆菌，也可以通过显色检测判断样本是否含有猪胸膜肺炎放线杆菌。直接检视时，LAMP反应液∶阳性对照∶阴性对照的体积配比为23∶2∶2。显色检测时，LAMP 反应液∶阳性对照∶阴性对照∶荧光显色剂的体积配比为23∶2∶2(1-3)；LAMP反应液∶阳性对照∶阴性对照∶荧光显色剂的体积配比优选为23∶2∶2∶1。

可以通过直接检视判断样本是否含有猪胸膜肺炎放线杆菌，也可以通过显色检测判断样本是否含有猪胸膜肺炎放线杆菌。

①直接检视

装有阳性对照的反应管有白色沉淀，装有阴性对照的反应管仍为澄清液体。如果装有待检测样品的反应管仍为澄清液体，则说明待检样品中猪胸膜肺炎放线杆菌检测结果为阴性。如果装有待检测样品的反应管有白色沉淀，则说明样品中猪胸膜肺炎放线杆菌检测结果为阳性。

②显色检测

在反应管中加入荧光显色剂，在紫外灯照射下观察颜色变化。装有阳性对照的反应管颜色为绿色，装有阴性对照的反应管仍为黄色。如果装有待检样品的反应管颜色为黄色，则说明猪胸膜肺炎放线杆菌检测结果为阴性。如果装有待检样品的反应管颜色为绿色，则说明样品中猪胸膜肺炎放线杆菌检测结果为阳性。

本发明提供的猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒的检测原理如下：

根据猪胸膜肺炎放线杆菌GenBank Accession Number AF021919的1000bp的保守区(GenBank Accession Number AF021919序列中自5’端第5550位至6549位的核苷酸序列，见序列表的序列1)设计了一组用于环介导等温扩增的引物，即内侧引物对(内侧上游引物FIP和内侧下游引物BIP)、外侧引物对(外侧上游引物F3和外侧下游引物B3)和环形引物对(环形上游引物LF和环形下游引物LB)。三对引物和猪胸膜肺炎放线杆菌AF021919序列中的保守区的八个特定区域的序列完全配对，确保反应的彻底进行，也保证了猪胸膜肺炎放线杆菌检测方法的特异性。

F3：GACACCTTAAAATTTACTGATGTG(序列表的序列2)；

B3：CGTTGATATTATCATCACCGTC(序列表的序列3)；

FIP：GACCGAATCCGTATCATGATAACCGTTTTCGGAAGTGAAATTCCGACG(序列表的序列4)；

BIP：GGAATTTGCTGACCGCAGTTTTTGCCAAATAATGCCATACCTTG(序列表的序列5)；

LF：GAGTAGATAATGACTTAATGTTATTCGG(序列表的序列6)；

LB：TATAACTCGTGATGAACTAGGTAAA(序列表的序列7)。

所述的引物组与所述的猪胸膜肺炎放线杆菌AF021919序列中的保守区的8个特定区域结合，见表1。

表1引物组与AF021919序列中的保守区的结合区域

上述引物组在具有高度链置换催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成对模板DNA的扩增。扩增过程分为两个阶段，具体如下：

(1)循环起始阶段

一端内侧引物先与模板结合并启动DNA合成。相同一端的外侧引物随后与模板结合启动DNA合成，并发生链置换释放出含有内侧引物序列的DNA单链。该单链DNA作为模板先后与另一端的内侧引物和外侧引物结合，启动DNA合成并发生链置换，最后形成一个初始的茎环DNA。

(2)反应循环阶段

内侧引物与初始茎环DNA结合，启动链置换DNA合成，可产生另一个初始茎环DNA和一个新的两倍长度的茎环DNA。这些茎环DNA可作为模板继续与内侧引物结合启动链置换DNA合成，并且每次合成均可使茎环DNA的茎长度成倍增长。

进入循环阶段后，会产生许多分子大小不同的茎环DNA，这些茎环DNA还可作为模版与环形引物结合，启动更多的DNA合成并发生链置换。最后经过一个小时的等温扩增，目的DNA可累积10⁹拷贝。

应用本发明提供的猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒进行检测，特异性高且灵敏度高，可检测出6-10个拷贝的目的DNA。与PCR检测方法相比，应用本发明提供的猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒检测，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属或水浴锅即可，并且检测结果使用荧光染料来观察即可，操作简单方便。本发明的试剂盒可应用于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的猪胸膜肺炎放线杆菌的检测，特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

具体实施方式

应用本发明提供的试剂盒检测猪胸膜肺炎放线杆菌可包括如下步骤：

(1)DNA的提取

本发明提供的试剂盒可用于检测鼻腔、支气管分泌物、肺部病变、扁桃体和胸水中的猪胸膜肺炎放线杆菌。不同来源的总DNA提取可参考相应资料，或使用相应DNA提取试剂盒，也可用FTA卡提取。

(2)环介导的等温扩增

①在装有23μl的LAMP反应液的反应管中加入2μl模板RNA；

②于水浴锅或金属恒温加热器上60-65℃放置20-90分钟，取出。

在步骤②完成后，取出前，还可以再调水浴锅温度到80-90℃反应2-10分钟，目的是能够终止反应，以便长期保存反应结果。

(3)结果判定

可以通过直接检视判断样本是否含有猪胸膜肺炎放线杆菌，也可以通过显色检测判断样本是否含有猪胸膜肺炎放线杆菌。

①直接检视

装有阳性对照的反应管有白色沉淀，装有阴性对照的反应管仍为澄清液体。如果装有待检测样品的反应管仍为澄清液体，则说明待检样品中猪胸膜肺炎放线杆菌检测结果为阴性。如果装有待检测样品的反应管有白色沉淀，则说明待检样品中猪胸膜肺炎放线杆菌检测结果为阳性。

②显色检测

在反应管中加入荧光显色剂，在紫外灯照射下观察颜色变化。装有阳性对照的反应管颜色为绿色，装有阴性对照的反应管仍为黄色。如果装有待检样品的反应管颜色为黄色，则说明猪胸膜肺炎放线杆菌检测结果为阴性。如果装有待检样品的反应管颜色为绿色，则说明样品中猪胸膜肺炎放线杆菌检测结果为阳性。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒的制备

一、引物的合成

人工合成以下3对引物：

F3：5′-GACACCTTAAAATTTACTGATGTG-3′；

B3：5′-CGTTGATATTATCATCACCGTC-3′；

FIP：5′-GACCGAATCCGTATCATGATAACCGTTTTCGGAAGTGAAATTCCGACG-3′；

BIP：5′-GGAATTTGCTGACCGCAGTTTTTGCCAAATAATGCCATACCTTG-3′；

LF：5′-GAGTAGATAATGACTTAATGTTATTCGG-3′；

LB：5′-TATAACTCGTGATGAACTAGGTAAA-3′。

二、配制LAMP反应液

每23μL LAMP反应液，含有以下组分：0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH₄)₂SO₄、Tween20 0.025μL、0.2μmolMgSO₄、20μmol甜菜碱(Betaine)、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.04μmol上游内侧引物(FIP)、0.04μmol下游内侧引物(BIP)、0.004μmol上游外侧引物(F3)、0.004μmol下游外侧引物(B3)、0.02μmol上游环形引物(LF)、0.02μmol下游环形引物(LB)、16U的Bst DNA聚合酶、灭菌双蒸水。

三、试剂盒的组装

该试剂盒由以下物质组成：步骤二配制的LAMP反应液、猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型菌株DNA(阳性对照)(中国兽医药品监察所菌种库)、灭菌双蒸水(阴性对照)、荧光染料SYBR GREEN I。

实施例2、猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒的制备

一、引物的合成

同实施例1的步骤一。

二、配制LAMP反应液

每23μL LAMP反应液，含有以下组分：0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH₄)₂SO₄、Tween20 0.025μL、20μmol MgSO₄、20μmol甜菜碱(Betaine)、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.06μmol上游内侧引物(FIP)、0.06μmol下游内侧引物(BIP)、0.008μmol上游外侧引物(F3)、0.008μmol下游外侧引物(B3)、0.04μmol上游环形引物(LF)、0.04μmol下游环形引物(LB)、16U的Bst DNA聚合酶、灭菌双蒸水。

三、试剂盒的组装

同实施例1的步骤三。

实施例3、猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒的制备

一、引物的合成

同实施例1的步骤一。

二、配制LAMP反应液

每23μL LAMP反应液，含有以下组分：0.5μmol Tris-HCl、0.25μmol KCl、0.25μmol(NH₄)₂SO₄、Tween20 0.025μL、10μmol MgSO₄、20μmol甜菜碱(Betaine)、四种脱氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.05μmol上游内侧引物(FIP)、0.05μmol下游内侧引物(BIP)、0.006μmol上游外侧引物(F3)、0.006μmol下游外侧引物(B3)、0.03μmol上游环形引物(LF)、0.03μmol下游环形引物(LB)、16U的Bst DNA聚合酶、灭菌双蒸水。

三、试剂盒的组装

同实施例1的步骤三。

实施例4、猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒的应用

取两头猪，1只确诊为血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌感染的猪，1只健康猪。分别对两只猪采鼻拭子，采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。

一、提取总DNA

将采鼻拭子其放入1.5ml离心管中，加1ml生理盐水，涡旋30s，取出鼻拭子，将余下液体12000rpm/min离心30s；弃上清液，沉淀添加100μl的GTE溶液(500mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mol/L Tris-HCl，pH 8.0)，振荡混匀；再加650μl的GTE溶液，混匀；向悬浮液中加入7.5μl 100mg/ml的溶菌酶，混匀，37℃水浴30min；再向悬浮液中加入7.5μl 10mg/ml的蛋白酶K，混匀，于55℃温浴1小时；结束后向溶液中加入等体积的氯仿，上下颠倒充分混匀；12000rpm/min离心10分钟；将上清移至新的离心管中，再用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次；取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，混匀，加入两倍体积的无水乙醇，混匀，室温静置2min沉淀出DNA；12000rpm/min离心10分钟；小心弃去上清液，用1ml 70％酒精洗涤沉淀，4℃、12000rpm离心5min，弃去上清，55℃烘干；加入60μl TE溶解，37℃水浴30min；

所制备DNA应立即进行检测或贮存于-80℃备检。

二、猪胸膜肺炎放线杆菌的检测

分别对上述2只猪的DNA样本的进行检测，检测步骤如下：

(1)环介导等温扩增

在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到病猪的DNA样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到健康猪的DNA样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪胸膜肺炎放线杆菌DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。

上述反应管同时在水浴锅上60℃放置90分钟，取出。

(2)直接检视

结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。健康猪检测组的三个反应管均为澄清液体，病猪检测组的三个反应管均有白色沉淀。

(3)显色检测：

在每个反应管中加入1μL荧光显色剂。

结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。健康猪检测组的三个反应管均为黄色，病猪检测组的三个反应管均变为绿色。

实施例5、猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒的应用

取两头猪，1只确诊为血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌感染的猪，1只健康猪。分别对两只猪采血，采用实施例2制备的试剂盒对样本进行检测。

一、提取总DNA

同实施例4的步骤一。

二、猪胸膜肺炎放线杆菌的检测

分别对上述2只猪的DNA样本的进行检测，每个样本的检测步骤如下：

(1)环介导等温扩增

在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到病猪的DNA样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到健康猪的DNA样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪胸膜肺炎放线杆菌DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。

上述反应管同时在金属浴锅上65℃放置70分钟，取出。

(2)直接检视

结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。健康猪检测组的三个反应管均为澄清液体，病猪检测组的三个反应管均有白色沉淀。

(3)显色检测：

在每个反应管中加入2μL荧光显色剂。

结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。健康猪检测组的三个反应管均为黄色，病猪检测组的三个反应管均变为绿色。

实施例6、猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒的应用

取两头猪，1只确诊为血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌感染的猪，1只健康猪。分别对两只猪采鼻拭子，采用实施例3制备的试剂盒对样本进行检测。

一、提取DNA

同实施例4的步骤一。

二、猪胸膜肺炎放线杆菌的检测

分别对上述2只猪的DNA样本的进行检测，每个样本的检测步骤如下：

(1)环介导等温扩增

在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到病猪的DNA样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到健康猪的DNA样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪胸膜肺炎放线杆菌DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。

上述反应管同时在水浴锅上60℃放置50分钟，取出。

(2)直接检视

结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。健康猪检测组的三个反应管均为澄清液体，病猪检测组的三个反应管均有白色沉淀。

(3)显色检测：

在每个反应管中加入3μL荧光显色剂。

结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。健康猪检测组的三个反应管均为黄色，病猪检测组的三个反应管均变为绿色。

实施例7、猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒的应用

取两头猪，1只确诊为血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌感染的死猪，1只健康猪。分别对两只猪采鼻拭子，采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。

一、提取总DNA

同实施例4的步骤一。

二、猪胸膜肺炎放线杆菌的检测

分别对上述2只猪的DNA样本的进行检测，检测步骤如下：

(1)环介导等温扩增

在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到病猪的DNA样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到健康猪的DNA样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪胸膜肺炎放线杆菌DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。

上述反应管同时在水浴锅上65℃放置30分钟，调水浴锅温度到80℃反应10min，取出。

(2)直接检视

结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。健康猪检测组的三个反应管均为澄清液体，病猪检测组的三个反应管均有白色沉淀。

(3)显色检测：

在每个反应管中加入3μL荧光显色剂。

结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。健康猪检测组的三个反应管均为黄色，病猪检测组的三个反应管均变为绿色。

实施例8、猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒的应用

取两头猪，1只确诊为血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌感染的死猪，1只健康猪。分别对两只猪采鼻拭子，采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。

一、提取DNA

同实例4的步骤一。

二、猪胸膜肺炎放线杆菌的检测

分别对上述2只猪的DNA样本的进行检测，检测步骤如下：

(1)环介导等温扩增

在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到病猪的DNA样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到健康猪的DNA样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪胸膜肺炎放线杆菌DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。

上述反应管同时在水浴锅上60℃放置20分钟，调水浴锅温度到90℃反应2min，取出。

(2)直接检视

结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。健康猪检测组的三个反应管均为澄清液体，病猪检测组的三个反应管均有白色沉淀。

(3)显色检测：

在每个反应管中加入3μL荧光显色剂。

结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。健康猪检测组的三个反应管均为黄色，病猪检测组的三个反应管均变为绿色。

实施例9、猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒灵敏度的检测

制备0.5×10⁴拷贝/μL、0.5×10³拷贝/μL、0.5×10²拷贝/μL、5拷贝/μL和0.5拷贝/μL的含序列1所示DNA片段的质粒样本。采用实施例3制备的试剂盒对质粒样本进行检测。

一、质粒的制备

使用猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株DNA，根据PCR方法扩增得到血清1型菌株AF021919序列中自5’端第5550位至6549位的核苷酸序列。再与T载体连接后即形成含有AF021919序列中自5’端第5550位至6549位的核苷酸序列的质粒，一个质粒分子对应一个拷贝的AF021919序列中自5’端第5550位至6549位的核苷酸序列。将质粒转入感受态细胞，在合适的条件下培养感受态细胞，质粒可随着感受态细胞的繁殖而复制。最后从感受态细胞中提取纯AF021919序列中3’端1000bp基因质粒。得到的质粒可通过分光光度计法测定并计算拷贝数浓度。用双蒸水将质粒稀释到所需要的浓度，即0.5×10⁴拷贝/μL、0.5×10³拷贝/μL、0.5×10²拷贝/μL、5拷贝/μL和0.5拷贝/μL。检测时加入各浓度质粒2μL，每个反应中对应含有10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10拷贝/μL、1拷贝/μL的质粒样本。(可参考《分子克隆试验指南》第三版，所需要的试剂和仪器均为市面可购买的。)

二、猪胸膜肺炎放线杆菌的检测

分别对上述各浓度的质粒样本进行检测，检测步骤如下：

(1)环介导等温扩增

在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到0.5×10⁴拷贝/μL的质粒样本，做为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到0.5×10³拷贝/μL质粒样本，做为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到0.5×10²拷贝/μL质粒样本，做为检测组3；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到5拷贝/μL质粒样本，做为检测组4；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到0.5拷贝/μL质粒样本，做为检测组5；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL猪胸膜肺炎放线杆菌DNA，做为阳性对照组；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，做为阴性对照组。

上述反应管同时在水浴锅上65℃放置50分钟，调水浴锅温度到80℃反应10min，取出。

(2)直接检视

结果表明，阳性对照组的三个反应管均有白色沉淀，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。检测组1的三个反应管均有白色沉淀，检测组2的三个反应管均有白色沉淀，检测组3的三个反应管均有白色沉淀，检测组4的三个反应管均有白色沉淀，检测组5的三个反应管均为澄清液体。

(3)显色检测：

在每个反应管中加入3μL荧光显色剂。

结果表明，阳性对照组的三个反应管的颜色均变为绿色，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。检测组1的三个反应管均变为绿色，检测组2的三个反应管均变为绿色，检测组3的三个反应管均变为绿色，检测组4的三个反应管均变为绿色，检测组5的三个反应管均为黄色。

以上结果表明，本发明的试剂盒灵敏度高，可检测出6-10个拷贝的目的DNA。

实施例10、猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒血清1至10型的检测

提取血清1型至血清10型猪胸膜肺炎放线杆菌的总DNA(中国兽医药品监察所菌种库)，采用实施例3制备的试剂盒分别对上述DNA进行检测。

各血清型在中国兽医药品监察所的菌株编号如见表2。

表2血清1型至血清10型猪胸膜肺炎放线杆菌的编号

血清型	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											菌株编号	259	260	261	262	263	264	265	266	267	268

一、各血清型总DNA的提取

分别提取10种血清型的猪胸膜肺炎放线杆菌的总DNA，方法相同，具体如下：

将1ml菌液其放入1.5ml离心管中，12000rpm/min离心30s；弃上清液，沉淀添加100μl的GTE溶液(500mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mol/LTris-HCl，pH 8.0)，振荡混匀；再加650μl的GTE溶液，混匀；向悬浮液中加入7.5μl100mg/ml的溶菌酶，混匀，37℃水浴30min；再向悬浮液中加入7.5μl 10mg/ml的蛋白酶K，混匀，于55℃温浴1小时；结束后向溶液中加入等体积的氯仿，上下颠倒充分混匀；12000rpm/min离心10分钟；将上清移至新的离心管中，再用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次；取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，混匀，加入两倍体积的无水乙醇，混匀，室温静置2min沉淀出DNA；12000rpm/min离心10分钟；小心弃去上清液，用1ml 70％酒精洗涤沉淀，4℃、12000rpm离心5min，弃去上清，55℃烘干；加入60μl TE溶解，37℃水浴30min。所制备DNA应立即进行检测或贮存于-80℃备检。

二、血清1至10型猪胸膜肺炎放线杆菌的检测

分别对上述10种血清型猪胸膜肺炎放线杆菌的DNA进行检测，检测步骤如下：

(1)环介导等温扩增

在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到血清1型的DNA作为检测组1；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到血清2型的DNA，作为检测组2；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到血清3型的DNA，作为检测组3；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到血清4型的DNA，作为检测组4；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到血清5型的DNA，作为检测组5；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到血清6型的DNA，作为检测组6；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到血清7型的DNA，作为检测组7；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到血清8型的DNA，作为检测组8；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到血清9型的DNA，作为检测组9；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL步骤一得到血清10型的DNA，作为检测组10；在3支装有23μL的LAMP反应液的反应管中各加入2μL灭菌双蒸水，作为阴性对照组。

上述反应管同时在水浴锅上65℃放置50分钟，调水浴锅温度到80℃反应10min，取出。

(2)直接检视

结果表明，阴性对照组的三个反应管均为澄清液体。检测组1的三个反应管均有白色沉淀，检测组2的三个反应管均有白色沉淀，检测组3的三个反应管均有白色沉淀，检测组4的三个反应管均有白色沉淀，检测组5的三个反应管均有白色沉淀，检测组6的三个反应管均有白色沉淀，检测组7的三个反应管均有白色沉淀，检测组8的三个反应管均有白色沉淀，检测组9的三个反应管均有白色沉淀，检测组10的三个反应管均有白色沉淀。

(3)显色检测：

在每个反应管中加入3μL荧光显色剂。

结果表明，阴性对照组的三个反应管的颜色均为黄色。检测组1的三个反应管均变为绿色，检测组2的三个反应管均变为绿色，检测组3的三个反应管均变为绿色，检测组4的三个反应管均变为绿色，检测组5的三个反应管均变为绿色，检测组6的三个反应管均变为绿色，检测组7的三个反应管均变为绿色，检测组8的三个反应管均变为绿色，检测组9的三个反应管均变为绿色，检测组10的三个反应管均变为绿色。

结果表明，本发明的试剂盒可应用于所有血清型的猪胸膜肺炎放线杆菌的检测。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒及其应用

<130>CGGNARY81637

<160>7

<210>1

<211>1000

<212>DNA

<213>猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)

<400>1

agattatcaa tttgacaaat tggagtttgc tgaccgcagt ataactcgcg atgaactgat     60

taaagcaggg cttcatctat acggcaccga tggcaatgat gatataaagg atcatgcgga    120

ttgggacagc attttggaag gcggcaaagg caacgatatt ctaagaggtg gctacggtgc    180

ggacacctat atctttagca aaggacacgg acaggatatc gtttatgaag ataccaataa    240

tgataaccga gcaagagata tcgacacctt aaaatttact gatgtgaatt atgcggaagt    300

gaaattccga cgagtagata atgacttaat gttattcggt tatcatgata cggattcggt    360

cacgataaaa tccttctaca accatgtaga ttatcaattt gacaaattgg aatttgctga    420

ccgcagtata actcgtgatg aactaggtaa acaaggtatg gcattatttg gcactgacgg    480

tgatgataat atcaacgact ggggacgtaa ctcggtgatt gatgccggtg cgggtaatga    540

tacggttaat ggcggtaatg gcgatgacac cctcatcggc ggcaaaggta atgatattct    600

aagaggtggc tacggtgcgg acacctatat ctttagcaaa ggacacggac aggatatcgt    660

ttatgaagat accaataatg ataaccgcgc aagagatatc gacaccttaa aatttactga    720

tattaattta tccgaacttt ggtttagccg agaaaataac gatttgatta ttaaatcatt    780

attaagtgag gataaagtca cggttcaaaa ttggtattca caccaagatc ataaaataga    840

aaatattcgt ttatcgaatg agcaaacgtt ggtgagcact caggtggaga agatggttga    900

gtcgatggcc ggctttgctc agaagcacgg aggagagata tctcttgtgt cgcttgaaga    960

ggtaaaacaa tatatcaata gcttaacagc tgctttataa                            1000

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gacaccttaa aatttactga tgtg                                               24

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgttgatatt atcatcaccg tc                                                 22

<210>4

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gaccgaatcc gtatcatgat aaccgttttc ggaagtgaaa ttccgacg                     48

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggaatttgct gaccgcagtt tttgccaaat aatgccatac cttg                        44

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gagtagataa tgacttaatg ttattcgg                                          28

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tataactcgt gatgaactag gtaaa                                             25

Claims (11)

1、一种猪胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒，包括针对猪胸膜肺炎放线杆菌GenBankAccession Number AF021919序列中自5’端第5550位至6549位的核苷酸序列的三对引物，一对引物是与所述序列结合的内侧引物对，一对引物是与所述序列结合的外侧引物对，一对引物是与所述序列结合的环形引物对；所述内侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括环介导等温扩增试剂、阳性对照、阴性对照；所述阳性对照为猪胸膜肺炎放线杆菌DNA。

3、如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增试剂为含有如下溶质的水溶液：Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、Tween20、MgSO₄、甜菜碱、脱氧核苷酸和Bst DNA聚合酶。

4、如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：在所述环介导等温扩增试剂中加入所述内侧引物对、所述外侧引物对及所述环形引物对，形成环介导等温扩增反应液；每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述溶质的物质的量如下：

Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH₄)₂SO₄ 0.25μmol、Tween20 0.025μL、MgSO₄ 0.2-20μmol、甜菜碱20μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶16U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02-0.04μmol。

5、如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述MgSO₄ 0.2μmol，所述内侧引物对的上游引物和下游引物0.04μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物0.004μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物0.02μmol。

6、如权利要求1至5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光显色剂。

7、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光显色剂为荧光染料SYBRGREEN I。

8、如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增反应液与所述荧光显色剂的体积比为23∶1-23∶3。

9、如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增反应液与所述荧光显色剂的体积比为23∶1。

10、一种检测死亡动物中是否携带猪胸膜肺炎放线杆菌的方法，是用权利要求1至9中任一所述的试剂盒对来自死亡动物的样品的总DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定死亡动物中是否携带猪猪胸膜肺炎放线杆菌；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、20-90分钟。

11、如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述检测死亡动物中是否携带猪胸膜肺炎放线杆菌的方法中还包括将进行完所述环介导等温扩增反应的样本80-90℃反应2-10分钟的步骤。