CN105950764A - 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌lamp诊断试剂盒 - Google Patents

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌lamp诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒。本发明构建了一套完整的LAMP体系，LAMP扩增法可使用水浴锅或保温杯进行扩增，结果肉眼可见，操作相对简单，特别适合基层现场检疫，且敏感性高。根据本发明设计的引物构建的试剂盒，可检测APP 1‑15型，敏感性达到为0.3 pg/ L，比PCR高100倍，因此建立的LAMP诊断方法可在生猪养殖场进行现场快速检测，并且结果准确，使用方便。

Description

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及家畜饲养及疾病防治领域，尤其是一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）感染引起以纤维性肺炎为主要特征的猪呼吸道疾病。急性发病时，死亡率较高，出现呼吸严重困难，体温升高，食欲减退，剖检可见肺部与胸膜粘连，慢性发病时，死亡率较低，但猪生长缓慢，饲料转化率低。该病至1987年在我国发现以来，全省各地报道较多，给养猪业造成严重的经济损失。近年来，由于抗生素的滥用，APP耐药性日益严重。
发明内容
本发明的目的是：提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒，它实现猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的现场快速诊断，以了解其耐药情况，以克服现有技术的不足。
本发明是这样实现的：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒，其特征在于：包括LAMP诊断反应混合液250µL、Bst DNA聚合酶20µL、引物4条各40µL、阴性对照20µL、阳性对照20µL及超纯水500µL；所述4条引物的序列分别为F3：5，-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3，;B3：5，-GCCCCACAATGACGTGTAC-3，；FIP：5，-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3，；BIP：5，-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，。
所述的阴性对照为超纯水，阳性对照为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA。
所述的引物F3与引物B3的浓度均为5-20µmol/L；所述的引物FIP与引物BIP的浓度为10-40µmol/L。
为了验证本发明的技术效果，进行了以下试验：
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 细菌
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1-15型、猪源大肠杆菌、猪源沙门氏菌、猪源支原体、副猪嗜血杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌由贵州畜禽重大疫病防制重点实验室保存。
主要试剂
环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒、环介导等温扩增法荧光检测试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司；猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR试剂盒由贵州省畜禽重大疫病防制重点实验室研制。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。
试验方法
1.2.1 引物设计
根据GenBank中的APP 1-15型apxIVA基因序列，应用在线PrimerExplorer 4.0软件设计4条特异性引物，包括外引物和内引物(F3、B3、FIP、BIP)。引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。
F3：5，-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3，;B3：5，-GCCCCACAATGACGTGTAC-3，；
FIP：5，-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3，；
BIP：5，-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，。
细菌核酸的提取
临床样品：取1 g病猪肺脏、淋巴结加入2 mL 0.1 mol/L PBS 研磨后，反复冻融3次，5000 r/ min离心5 min，取上清液用于细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。
细菌样品：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
扩增条件的优化
LAMP扩增条件的优化主要包括扩增温度（分别为60、65、70℃），扩增时间（分别为15、30、45 min），F3、B3引物浓度（分别为5、10、20 µmol/L），FIP、BIP引物浓度（分别为10、20、40µmol/L），Bst DNA聚合酶（分别为0.5、1、2 U）。
LAMP反应在25 µL反应体系中进行，引物F3、B3 2 µL、引物FIP、BIP 4 µL，Bst DNA聚合酶1 µL（0.5、1、2 U），LAMP反应缓冲液12.5 µL，模板1 µL，加入环介导等温扩增法荧光检测试剂盒的荧光显色液1 µL，用ddH2O补足至25 µL。扩增产物用紫外光下进行观察。
敏感性试验
将提取的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型核酸用核酸蛋白仪测定浓度后，经10倍系列稀释用于LAMP、PCR反应，以确定建立的LAMP诊断方法的敏感性。PCR试剂盒敏感性试验参照文献[8]进行。
特异性试验
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1-15型、猪源大肠杆菌、猪源沙门氏菌、猪源支原体、副猪嗜血杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌DNA为模板分别进行LAMP反应，以确定建立的LAMP诊断方法的特异性。
重复性试验
应用建立LAMP诊断方法，重复检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1-15型3次以检验结果的可靠性。
建立的LAMP对临床样品的检测
对2014年3月至2016年3月在贵州省贵阳市、安顺市、遵义市、凯里市、兴义市、铜仁市、瓮安县在15个规模场和48家养殖户236份疑似病猪样品采用建立的LAMP诊断方法进行检测，同时应用研制的PCR诊断试剂盒进行检测。
结果
2.1 LAMP诊断方法的建立
LAMP诊断方法最优25 µL扩增体系为引物F3、B3 浓度5 µmol/L各1 µL，引物FIP、BIP浓度40 µmol/L各2 µL，BstDNA聚合酶1 U 1 µL，LAMP扩增缓冲液12.5 µL，模板1 µL，加入环介导等温扩增法荧光检测试剂盒的荧光显色液1 µL，用ddH2O补足至25 µL。最佳扩增条件为，反应温度65℃，反应30 min，94℃灭活2 min。扩增完后，在紫外灯光下观察，阳性反应管颜色为绿色，阴性反应管为无色，见图1。
敏感性试验
经10倍系列稀释的APP 1型DNA用于LAMP、PCR反应，结果，建立的LAMP诊断方法最低核酸检测量为2 pg/µL，见图2，而PCR诊断方法最低核酸检测量为200 pg/µL，见图3。
特异性试验
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1-15型、猪源大肠杆菌、猪源沙门氏菌、猪源支原体、副猪嗜血杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌 DNA为模板，结果，紫外光下猪源大肠杆菌、猪源沙门氏菌、猪源支原体、副猪嗜血杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌DNA均为阴性，而猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1-15型 DNA显示为阳性，见图4。
重复性试验
应用建立的LAMP方法，重复检测APP DNA样品3次，结果均一致。
建立的LAMP对临床样品的检测
对2014年3月至2016年3月在贵州省贵阳市、安顺市、遵义市、凯里市、兴义市、铜仁市、瓮安县15个规模化猪场236份疑似病猪样品采用建立的LAMP诊断方法进行检测，同时应用研制的PCR诊断试剂盒进行检测。236份疑似病猪样品阳性率为37.7%（89/236），而PCR阳性率为34.3.0%（81/236）。建立的LAMP诊断方法与PCR诊断方法符合率为91.0%。
结论
近年来，随着生猪养殖规模化不断发展，生猪养殖病害不断增多，呼吸道疾病尤为严重。APP是近几年较为常见的呼吸道病病原。目前APP检测方法很多，传统的病原分离鉴定，费时较长，且APP病原分离对培养条件要求较高，病原检测多使用PCR检测技术，但PCR技术需要专业设备和专业人员操作。LAMP扩增法可使用水浴锅或保温杯进行扩增，结果肉眼可见，操作相对简单，特别适合基层现场检疫，且敏感型较PCR高。刘亚娟等建立的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP方法，最低检测限为0.307ng/L。本研究建立的LAMP诊断方法利用APP1-15型共有的apxIVA基因设计引物，检测方法可检测APP 1-15型，敏感性达到为0.3 pg/L，比PCR高100倍，因此建立的LAMP诊断方法可在生猪养殖场进行现场快速检测。
由于采用了上述技术方案，本发明构建了一套完整的LAMP体系，LAMP扩增法可使用水浴锅或保温杯进行扩增，结果肉眼可见，操作相对简单，特别适合基层现场检疫，且敏感性高。根据本发明设计的引物构建的试剂盒，可检测APP 1-15型，敏感性达到为0.3 pg/L，比PCR高100倍，因此建立的LAMP诊断方法可在生猪养殖场进行现场快速检测，并且结果准确，使用方便。
附图说明
图1为LAMP检测方法的建立；
图1中，1-15：APP 1-15型LAMP产物；16：阴性对照；
图2为APP LAMP敏感试验；
图2中，1～8：2.0×106～2.0×10-1pg/µL稀释的APP DNA LAMP结果；
图3为APP PCR敏感试验
图3中，M:DL200；1～6：2.0×106～2.0×101pg/µL稀释的APP DNA PCR结果；
图4为APP LAMP特异性试验；
图4中，1-15：APP1-15型 LAMP产物；16：E.coli LAMP产物；17：Salmonella LAMP产物；18: Mycoplasma LAMP产物；19: Haemophilus suis LAMP产物；20:Pasteurellamultocida LAMP产物; 21: 阴性对照.。
具体实施方式
本发明的实施例1：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒，包括LAMP诊断反应混合液250µL、Bst DNA聚合酶20µL、引物4条各40µL、阴性对照20µL、阳性对照20µL及超纯水500µL；所述4条引物的序列分别为F3：5，-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3，;B3：5，-GCCCCACAATGACGTGTAC-3，；FIP：5，-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3，；BIP：5，-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，；所述的阴性对照为超纯水，阳性对照为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA；所述的引物F3与引物B3的浓度均为10µmol/L；所述的引物FIP与引物BIP的浓度为20µmol/L。
本发明的实施例2：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒，包括LAMP诊断反应混合液250µL、Bst DNA聚合酶20µL、引物4条各40µL、阴性对照20µL、阳性对照20µL及超纯水500µL；所述4条引物的序列分别为F3：5，-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3，;B3：5，-GCCCCACAATGACGTGTAC-3，；FIP：5，-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3，；BIP：5，-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，；所述的阴性对照为超纯水，阳性对照为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA；所述的引物F3与引物B3的浓度均为5µmol/L；所述的引物FIP与引物BIP的浓度为10µmol/L。
本发明的实施例3：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒，包括LAMP诊断反应混合液250µL、Bst DNA聚合酶20µL、引物4条各40µL、阴性对照20µL、阳性对照20µL及超纯水500µL；所述4条引物的序列分别为F3：5，-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3，;B3：5，-GCCCCACAATGACGTGTAC-3，；FIP：5，-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3，；BIP：5，-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，；所述的阴性对照为超纯水，阳性对照为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA；所述的引物F3与引物B3的浓度均为20µmol/L；所述的引物FIP与引物BIP的浓度为40µmol/L。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州省畜牧兽医研究所
<120> 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒
<130> nm:
<160> 4
<170> PatentIn version
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中的APP 1-15型apxIVA基因序列，应用在线PrimerExplorer 4.0软件设计，以用LAMP扩增。
<400> 1
TGGAG CTCCT CGATC TCAAG 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中的APP 1-15型apxIVA基因序列，应用在线PrimerExplorer 4.0软件设计，以用LAMP扩增。
<400> 2
GCCCC ACAAT GACGT GTAC 19
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中的APP 1-15型apxIVA基因序列，应用在线PrimerExplorer 4.0软件设计，以用LAMP扩增。
<400> 3
GCAAC GGTCA CCAGA CTCCC GACAA CGGAG TGACC TGTC 39
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中的APP 1-15型apxIVA基因序列，应用在线PrimerExplorer 4.0软件设计，以用LAMP扩增。
<400> 4
AGAGC AGCAC CCTGT AACGT TTACG CTTCT GCATT TTCCC G 41

Claims (3)

1.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒，其特征在于：包括LAMP诊断反应混合液250µL、Bst DNA聚合酶20µL、引物4条各40µL、阴性对照20µL、阳性对照20µL及超纯水500µL；所述4条引物的序列分别为F3：5，-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3，;B3：5，-GCCCCACAATGACGTGTAC-3，；FIP：5，-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3，；BIP：5，-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3，。
2.一种如权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒，其特征在于：所述的阴性对照为超纯水，阳性对照为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断试剂盒，其特征在于：所述的引物F3与引物B3的浓度均为5-20µmol/L；所述的引物FIP与引物BIP的浓度为10-40µmol/L。
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