CN113637781A

CN113637781A - 猪易感相关致病菌检测的lamp引物组及基于此的试剂盒和lamp芯片和应用

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Publication number: CN113637781A
Application number: CN202110965791.1A
Authority: CN
Inventors: 刘雪兰; 李郁; 汤杰; 李槿年; 许发芝; 陈芳芳
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Huapai Biotechnology Group Co ltd
Priority date: 2021-08-23
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2041-08-23
Also published as: CN113637781B; US11773456B2; US20230086107A1

Abstract

本发明属于病菌检测技术领域，特别是涉及猪易感相关致病菌检测的LAMP引物组及基于此的试剂盒和LAMP芯片和应用。本发明提供了猪易感相关致病菌检测的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括猪胸膜肺炎放线杆菌引物组、副猪嗜血杆菌引物组、猪霍乱沙门氏菌引物组、猪支气管败血波氏杆菌引物组、多杀性巴氏杆菌引物组等。本发明提供的LAMP引物组特异性高，同时进行检测猪易感病菌时不会出现交叉反应，能够精准的判断患病种类，并且具有良好的灵敏性。将上述LAMP引物组利用微流控芯片技术应用于检测中，可在等温条件下快速、高效、高特异性地扩增目的基因序列，并且在1h内完成扩增；具备的简便快捷的有点更适合基层适用性。

Description

猪易感相关致病菌检测的LAMP引物组及基于此的试剂盒和 LAMP芯片和应用

技术领域

本发明属于LAMP检测试剂制备技术领域，特别是涉及猪易感相关致病菌检测的LAMP引物组及基于此的试剂盒和LAMP芯片和应用。

背景技术

规模化养殖的程度不断提高能够有效提高养殖业的效益，但是这种养殖模式会提高猪群疾病发生的概率，还会对传染类疾病的防控带来新的挑战。现阶段制约养猪业发展的第一大因素就是疾病，就现阶段猪病流行的状况而言，多种病原菌的混合感染是目前猪场疾病发展的一个趋势。其中猪支气管败血波氏杆菌、猪沙门氏菌、猪多杀性巴氏杆菌等猪呼吸及猪繁殖疾病的发病率在逐渐增加。

猪源疾病呈现多元化的发展趋势，也增加了疾病的防控难度。为了防控猪源疾病，建立对猪场发病猪的混合病原菌的快速检测机制，是对猪疾病控制的关键所在。

针对于猪易感病原菌的检测技术主要包括传统的微生物学诊断技术、血清学诊断技术和分子生物学诊断技术。目前以PCR为代表的分子生物学诊断技术及其衍生检测技术占据主体，但是上述技术都存在一定的局限性，如检测流程繁琐、工作量大、检测仪器要求高等缺陷。因此，在科学研究及生产实践中开发出一种能够同时检测多种病原菌的快速简便检测方法较为迫切。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了涉及猪易感相关致病菌检测的LAMP引物组及基于此的试剂盒和LAMP芯片。本发明提供的多组LAMP引物组具有灵敏度高、特异性强的优势，能够同时检测多种病原菌。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了猪易感相关致病菌检测的LAMP引物组，所述猪易感相关致病菌包括：猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪霍乱沙门氏菌、猪支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌和猪丹毒；所述LAMP引物组包括猪胸膜肺炎放线杆菌引物组、副猪嗜血杆菌引物组、猪霍乱沙门氏菌引物组、猪支气管败血波氏杆菌引物组、多杀性巴氏杆菌引物组、猪链球菌引物组和猪丹毒引物组；

所述猪胸膜肺炎放线杆菌引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP；

所述副猪嗜血杆菌引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的正向内引物FIP和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的反向内引物BIP；

所述猪霍乱沙门氏菌引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的正向内引物FIP和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的反向内引物BIP；

所述猪支气管败血波氏杆菌引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的正向内引物FIP和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的反向内引物BIP；

所述多杀性巴氏杆菌引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的正向内引物FIP和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的反向内引物BIP；

所述猪链球菌引物引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的正向内引物FIP和核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的反向内引物BIP；

所述猪丹毒杆菌引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的正向内引物FIP和核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的反向内引物BIP。

本发明还提供了一种猪易感相关致病菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述LAMP引物组和反应液。

优选的，所述反应液包括Bst DNA聚合酶、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、BSA-A、dNTP、MgSO₄水溶液和荧光染料。

本发明提供了一种检测猪易感相关致病菌的LAMP芯片，所述芯片包括上述LAMP引物组、反应液和芯片。

优选的，所述LAMP引物组中任一病菌对应的外引物对和内引物对的摩尔比均为1:8。

优选的，所述芯片包括恒温扩增微流控芯片。

优选的，所述LAMP芯片的扩增反应池中包括：副猪嗜血杆菌反应池、猪霍乱沙门氏菌反应池、猪支气管败血波氏杆菌反应池、多杀性巴氏杆菌反应池、猪链球菌反应池、猪丹毒反应池、猪胸膜肺炎放线杆菌反应池和阴性对照组反应池。

本发明提供了猪易感相关致病菌检测的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括猪胸膜肺炎放线杆菌引物组、副猪嗜血杆菌引物组、猪霍乱沙门氏菌引物组、猪支气管败血波氏杆菌引物组、多杀性巴氏杆菌引物组、猪链球菌引物组和猪丹毒引物。本发明选取猪胸膜肺炎放线杆菌APX Ⅳ基因、副猪嗜血杆菌OMP P2基因、猪霍乱沙门氏菌的invA基因、猪支气管败血波氏杆菌DNT基因、猪多杀性巴氏杆菌kmt1基因、猪链球菌的gdh基因和猪丹毒杆菌的spaA基因做为本申请检测的靶基因，设计出用于微流控芯片技术的具有高特异性、高灵敏度的LAMP引物组。本发明提供的LAMP引物组特异性高，同时进行检测时不会出现交叉反应，能够精准的判断患病种类，并且具有良好的灵敏性。将上述LAMP引物组利用微流控芯片技术应用于检测中，可在等温条件下快速、高效、高特异性地扩增目的基因序列，并且在1h内完成扩增；具备的简便快捷的有点更适合基层适用性。

附图说明

图1为实施例提供的圆盘式微流控芯片及引物点样池示意图；

图2为猪胸膜肺炎放线杆菌圆盘式微流控芯片特异性结果图；

图3为副猪嗜血杆菌圆盘式微流控芯片特异性结果图；

图4为猪霍乱沙门氏菌圆盘式微流控芯片特异性结果图

图5为猪支气管败血波氏杆菌圆盘式微流控芯片特异性结果图；

图6为猪多杀性巴氏杆菌圆盘式微流控芯片特异性结果图；

图7为猪链球菌圆盘式微流控芯片特异性结果图；

图8为猪丹毒杆菌圆盘式微流控芯片特异性结果图；

图9为猪胸膜肺炎放线杆菌圆盘式微流控芯片灵敏度结果图；

图10为副猪嗜血杆菌圆盘式微流控芯片灵敏度结果图；

图11为猪霍乱沙门氏菌圆盘式微流控芯片灵敏度结果图；

图12为猪支气管败血波氏杆菌圆盘式微流控芯片灵敏度结果图；

图13为猪多杀性巴氏杆菌圆盘式微流控芯片灵敏度结果图；

图14为猪链球菌圆盘式微流控芯片灵敏度结果图；

图15为猪丹毒杆菌圆盘式微流控芯片灵敏度结果图。

具体实施方式

所述猪丹毒杆菌引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的正向外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的反向外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的正向内引物FIP和核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的反向内引物BIP。本发明提供的LAMP引物组具有高特异性、高灵敏度。

本发明还提供了一种猪易感相关致病菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述LAMP引物组和反应液。在本发明中，所述反应液优选包括10×Isothermal Amplification反应缓冲液、BSA-A、dNTP、MgSO₄水溶液、荧光染料和Bst DNA聚合酶；所述荧光染料进一步优选为SYTO^TM9。

本发明还提供了一种检测猪易感相关致病菌的LAMP芯片，所述芯片包括上述LAMP引物组、反应液和芯片。本发明所用的芯片优选包括恒温扩增微流控芯片，进一步优选为32孔反应池圆盘式微流控芯片，最优选为图1所示的微流控芯片。在本发明的实验中所用的微流控芯片由上海速创诊断产品有限公司生产，型号为4×8的微流控芯片；所述微流控芯片中优选包括4个反应检测区；所述反应检测区中优选包括加样孔、反应池；所述反应检测区优选包括8个反应池；所述反应池优选包括：副猪嗜血杆菌反应池、猪霍乱沙门氏菌反应池、猪支气管败血波氏杆菌反应池、多杀性巴氏杆菌反应池、猪链球菌反应池、猪丹毒反应池、猪胸膜肺炎放线杆菌反应池和阴性对照组反应池。本发明提供了一种结合微流控芯片与LAMP扩增技术的即时检测技术，能够建立高效、快速、灵敏、特异的即时检测技术，在猪易感病菌的检测方面提供更具意义的检测价值，为推进病原菌快速检测提供基础。

在本发明中，所述LAMP引物组中任一病菌对应的外引物对和内引物对的摩尔比优选均为1:8；所述反应液优选包括恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液；所述恒温扩增缓冲液优选包括10×Isothermal Amplification反应缓冲液、BSA-A、dNTP、MgSO₄水溶液和荧光染料，所述恒温扩增酶溶液优选包括Bst DNA聚合酶；所述荧光染料进一步优选为SYTO^TM9。本发明提供的LAMP芯片选用特定的反应液能够有效提高LAMP芯片的检测效率。

本发明获得不同病菌的LAMP引物组后，优选将对应的病菌的LAMP引物组包被至微流控芯片对应的反应池中，得到包被有LAMP引物组的微流控芯片。在本发明中，将病菌对应的外引物对和内引物对优选以1:8的摩尔比混合后再添加至微流控芯片的反应池中；所述每个反应池中优选添加一个病菌对应的LAMP引物组；待本发明设计的所有病菌的LAMP引物组添加至反应池后，优选进行真空加热干燥、压片封膜和压模处理，使LAMP引物组包被至反应池中。

得到包被有LAMP引物组的微流控芯片后，优选将待测样品封口至微流控芯片的进样区中进行扩增检测。在本发明中，所述封口待测样品前优选将待测样品、恒温扩增缓冲液(10×Isothermal Amplification反应缓冲液、BSA-A、dNTP、MgSO₄水溶液和荧光染料)和恒温扩增酶溶液(Bst DNA聚合酶)混合得到反应混合溶液；将反应混合溶液加样至包被有LAMP引物组的微流控芯片的进样区中，贴上封口膜进行封口后将微流控芯片放置于检测装置中进行即时扩增检测。

扩增检测结束后，本发明优选根据各反应池中的扩增趋势，通过荧光值得变化，绘制出荧光强度-时间的曲线图，从而判断各个扩增反应孔样本阴阳性，即待检样品对线的曲线呈“S”型，且空白对照无扩增曲线，则判断出待检样品含有对应的阳性病菌的样本。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的猪易感相关致病菌检测的LAMP引物组及基于此的试剂盒和LAMP芯片和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

用于检测猪易感相关致病的LAMP引物组合物的设计和制备

1、序列获得：

(1)猪胸膜肺炎放线杆菌APXⅣ基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载APXⅣ基因核酸序列(如SEQ ID NO.29所示：CCGGCAACGACAGTAAGATTGAAGGCACTAAAATCACCCGTAGGATTGCGGGTAAAGAAGTTACGCTTGATATTGCCAATCAGAAAATTGAAAAAGGCGTGTCAGAGAAATTGGGGCTGTCTGTTAGTGGTTCGGATATCATTAAATTGTTGTTTGGAGCATTGACTCCAACTTTAAATAGAATGTTGCTATCACAACTCATCCAGTCTTTTTCCGATAGCTTGGCTAAACTTGATAATCCCTTAGCCCCTTACACTAAAAATGGCGTGGTTTATGTCACCGGCAAAGGGAATGATGTGCTTAAAGGAACTGAACATGAGGATTTGTTTCTCGGTGGTGAGGGGAATGATACTTATTATGCGAGAGTAGGCGATACAATTGAAGACGCCGACGGCAAAGGTAAAGTCTATTTTGTGAGAGAAAAAGGGGTACCTAAGGCGGATCCTAAGCGGGTAGAGTTTAGCGAGTACATAACGAAAGAAGAAATAAAAGAGGTTGAAAAGGGGTTATTAACCTACGCAGTTTTAGAAAATTATAATTGGGAAGAGAAAACGGCGACTTTCGCTCATGCGACTATGCTTAATGAGCTTTTTACTGATTATACTAATTATCGTTATGAAGTTAAAGGACTAAAATTGCCCGCCGTTAAAAA)；

(2)副猪嗜血杆菌OMP P2基因序列的获取：

OMP P2基因核酸序列(如SEQ ID NO.30所示：TCTTGCGCCAGTTCTTACGAAGTCAATTTTCTCTTTAACATTACCTGTTTTTTCAACACCATGACCACCATCAACAGCTACAGTAAATGGAGCATTGACATATTTAAGACCAAAGTATACACCATCTTTGTCTTTCTTATTAACAGATCCAGATTTATAGTCATCATGAGTATAACCTGCTGCCACAGTTACAGATTGACTTTCCGCAATCTTAGCTGTGTATTTAGCACCTAAACCAAAGCCAGATTTAGCAGAACCTACTTTTACGCCTCCCTTATCATCACGCTCATTTGCAACATTATAGTTAGCACCTAACGTCAAACCTTCAATGCCTGTATAGGTATAGTTAATTGCTGAATCAGAATCTGAAGTAAGGATATCAAAACCTTTTTTGTTTGTGTTGTTTGCTGAATATTTAATTCCACCAGTACCAACACCGTATACTTTATCAAAACCAGCTTGACCAATGCTATCACCGATTACAGCTTGTTTACCAAAAGAAATTTCATGACCATAGCCACCTAAACCGACGTAAGCATATTTTGTTTTAACATCGCCCCATCCTGCAGCATTTTTAGAATTACTGTCAAGGCGAGTCTCATAAC)；

(3)猪霍乱沙门氏菌的invA基因序列的获取：

invA基因基因核酸序列(如SEQ ID NO.31所示：ATGCAACATTTGGATATCGCTGAATTAGTTCGTTCCGCACTGGAAGTAAGTGGTTGCGATCCTTCACTCATCGGAGGAATAGATAGCCATTCAACAATTGTTCTGGATTTATTTGCATTGCCAAGTATCTGTATCAGCGTCAAGGACGATGATGTATGGATCTGGGCGCAATTGGGTGCTGACAGCATGGTGGTATTACAACAGCGGGCTTATGAAATCTTAATGACCATAATGGAAGGATGCCATTTTGCCCGCGGCGGGCAATTACTACTGGGGGAGCAGAATGGGGAGCTAACGCTTAAAGCCTTAGTGCATCCGGATTTTTTATCTGACGGTGAAAAGTTCTCTACTGCCTTGAATGGGTTTTACAACTATCTGGAAGTTTTTAGTCGGTCGCTAATGAGATG)；

(4)猪支气管败血波氏杆菌DNT基因序列的获取：

DNT基因核酸序列(如SEQ ID NO.32所示：ATCGCGGGCGTGCTCTGCGATCTCGAGAGCGCGCAGCGCACGTTGCCCGTCGTATTGGCCAGGTTTCGGCCCCTTGGCGTGCTTGCGCGATTCAGAAGGCTGGAGCAGGAAACCGCGGGCATGCTGCTTGGCGACCAGGAGCCGGAGCCTCGGGGCTTCATCAGTTTTACCGATTTTCGCGATAGCGACGCGTTCGCCAGCTACGCGGAGTATGCGGCCCAGTTCAACGACTATATCGATCAATACAGCATACTCGAGGCGCAGCGGCTGGCGCGGATTCTGGCCCTGGGCTCGCGGATGACGGTCGATCAATGGTGCCTTCCCCTGCAGAAAGTACGGCACTACAAGGTGCTGACATCGCAGCCAGGGCTGATCGCGCGTGGAATCGAAAATCACAACAGGGGCATTGAATATTGCCTGGGGCGGCCGCCGCTGACCGATCTGCCGGGTCTTTTCACCATGTTCCAGCTCCATGATTCCAGCTGGCTGTTGGTATCGAACATCAACGGTGAGCTTTGGTCTGATGTCCTTGCGAACGCTGAGGTGA)；

(5)猪多杀性巴氏杆菌kmt1基因序列的获取：

kmt1基因核酸序列(如SEQ ID NO.33所示：GCTGTAAACGAACTCGCCACTTTTTGTTTCATTTGGACTGACACGATCAAACCGTTGAACACGAAGAAAAAGACCAAAATAGGTAACCAATACACGATAAATAAATTAAACCGCTCTGCCGTTAATGGCTTCAATAATGGCCATAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATATTGATAAATCAGACTGACAAGGAAATATAAACCGGCAAATAACAATAAGCTGAGTAATAAATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCAAGGAAGCAGATTGGCTCAACACACCAAACTCCGCCCAACAAAACTGTGCTTTTCTTTGCCACACGCCAAATAAAAGACTACCGACAAGCCCACTCACAACGAGCCATAAAATAATGCCATTTCCCATTTCAAGTGGCATAAAACTCAATTTCGCGGCAATCGGTTCATTCGCACCGCCCCACTGGGTAAATAGCGGAT)；

(6)猪链球菌的gdh基因序列的获取：

gdh基因核酸序列(如SEQ ID NO.34所示：GCAGCGTATTCTGTCAAACGAGCGCGGCGTTTTTCTTTGATGTCCACCAAGAGGTCGAAGTCGATACCAGTTTCGTCAATGATGTAACCATTTGAGTCTGAAACAGAAATAACTTTTGCACCAAGTTCAGTCGCTTTTTGAACAGCATATTGGGCAACGTTACCAGAACCTGAGATAAGGACAGTTTGGTCTTTGAAGGATTTACCGTTTGCTGCCAACATGTTATCAGTGAAGTAAACCAAACCGTAACCAGTTGCTTCTGGGCGGATCAATGAACCACCGAAGCCAAGAGGTTTACCAGTCAAGACACCTGCATCAAACTGGCGGAGGCGTTTGTATTGACCGTACATGTAACCGATCTCACGACCACCGACACCGATGTCACCAGCAGGGACGTCAAGTGAAGGTCCGATGTGTTTTTGCAATTCAGTCATGAAGCTTTGGCAGAAGCGCATGATTTCAGCATCAGTTTTTCCTTTAGGATCAAAGTCTGAACCACCTTTACCACCGCCGATTGGAAGACCAGTCAAGACGTTTTTGAAGATTTGCTCAAAACCGAGGAACTTCAAGATGGATTGGTTTACAGTTGGGTGGAAGCGAAGACCGCCTTTATAAGGACCTACAGCTGAGTTGAACTGAACACGGTAGCCACGGTTGACTTGAACATTTCCATCTTTATCTGTCCATGG)；

(7)猪丹毒杆菌的spaA基因序列的获取：

spaA基因核酸序列(如SEQ ID NO.35所示：ATGAAAAAGAAAAAACACCTATTTCCGAAAGTAAGTCTTATGTCGTGCTTACTTTTAACAGCAATGCCACTACAAACAGCTTTTGCTGATTCGACAGATATTTCTGTGATTCCACTAATCGGTGAACAAGTTGGATTGCTCCCAGTTTTACCTGGGACAGGGGTACATGCTCAGGAATACAACAAAATGACTGATGCTTATATTGAAAAATTGGTATCTCTAATTAATCAAAAAGTGAAGCCGTTTCTTATAAATGAACCAAAGGGGTACCAAAGTTTCGAAGCAGTGAATGAAGAGATTAACTCGATTGTAAGTGAACTTAAAAATGAAGGAATGAGTCTTCAAAACATTCACCATATGTTTAAACAAAGCATCCAAAACCTAGCAACTAGAATCGGCTACAGAAGTTTTATGCAGGATGCTATGTATCTTGAAAATTTTGAAAGATTAACGATTCCTGAACTTGATGAAGCATACGTTGATTTACTCGTGAATTACGAGGTGAAACACCGTATTTTAGTAAAATATGAAGGTAAAGTTAAAGGTAGAGCTCCCTTAGAAGCATTTATAGTTCCTCTAAGAGATAGAATTCGTAGTATGAATGAAATTGCTGCAGAAGTAAATTATTTACCTGAAGCGCATGAGGATTTCTTAGTTTCAGATTCAAGCGAGTATAATGACAAACTAAATAATATCAACTTTGCTTTGGGTCTAGGGGTCAGCGAGTTTATTGACTATAACCGGCTCGAAAATATGATGGAAAAAGAACTTCATCCACTGTATCTTGAACTTTATGCTATGCGGAGAAATCGCCAAATTCAAGTTGTAAGAGATGTATATCCAAACTTGGAACGTGCGAACGCGGTTGTTGAATCCTTAAAGACAATTAAAGATATAAAACAAAGAGGGAAGAAACTACAGGAACTTCTTGAAATTTATATCCAAAGAAGTGGAGATGTTCGAAAACCAGATGTACTCCAACGATTTATTGGAAAATATCAATCAGTAGTTGATGAAGAAAAAAATAAACTTCAAGATTATTTAGAATCAGATATTTTTGATTCATATAGTGTGGATGGCGAGAAAATAAGAAATAAAGAAATTACACTCATCAATAGAGATGCATACTTATCTATGATTTACAGAGCTCAATCGATTTCGGAAATTAAGACGATTCGTGCAGATTTAGAATCACTTGTCAAATCATTCCAAAATGAAGAAAGTGACTCTAAAGTAGAGCCTGAAAGTCCCGTTAAAGTAGAAAAACCAGTTGATGAAGAAAAACCTAAAGATCAAAAGAAGCTAGTTGATCAATCAAAACCCGAATCGAATTCAAAAGAAGGGTGGATTAAGAAAGATAATAAGTGGTTCTATATTGAGAAATCAGGTGGAATGGCAACAGGTTGGAAGAAGGTAGCAGACAAATGGTACTACCTCGATAATACGGGTGCTATAGTTACGGGTTGGAAGAAGGTAGCAAACAAATGGTACTATCTTGAAAAATCAGGTGCGATGGCAACAGGATGGAAGAAAGTATCAAACAAGTGGTACTACCTTGAAAACTCAGGTGCAATGGCAACAGGATGGAAGAAAGTATCAAACAAGTGGTACTACCTTGAAAATTCAGGCGCAATGGCTACAGGATGGAAAAAGGTAGCAAACAAATGGTACTACCTTGAAAACTCAGGTGCGATGGCAACAGGATGGAAGAAAGTATCGAACAAGTGGTACTACCTTGAAAACTCAGGCGCAATGGCTACAGGATGGAAAAAGGTAGCAAACAAATGGTACTACCTTGATAAATCAGGAATGATGGTTACAGGTTCAAAATCTATTGATGGTAAAAAGTATGCATTTAAGAACGATGGAAGTTTAAAATAG)。

2、引物设计

(1)特异性基因引物：确定上述特异基因的保守区段，针对保守区段设计LAMP引物组。

(2)引物合成：将下表1中的引物序列委托擎科生物公司合成，备用。

在本实施例中，设计得到的28条引物如表1所示。

表1引物组合物中的引物序列

实施例2

检测猪易感相关致病的LAMP芯片的制备及其使用

1、用于检测猪易感相关致病的LAMP芯片的制备

本发明提供的用于检测猪易感相关致病的微流控芯片组成如下：

(1)恒温扩增缓冲液

恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：1.4mM dNTPs，10×IsothermalAmplification反应缓冲液，100mM MgSO₄的水溶液，质量百分含量为10％的BSA-A和SYTO^TM9。微流控LAMP反应体系详见表2。

表2微流控LAMP反应体系

(2)恒温扩增酶溶液

恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：Bst DNA Polymerase LargeFragment 320U/mL。

(3)装载有引物对的32孔反应池圆盘式微流控芯片

所述32孔反应池圆盘式微流控芯片为上海速创诊断产品有限公司生产的，其型号为4×8，微流控芯片的示意图如图1所示，

图1中，外圈标记的7、15、23、31均固定有实施例1提供的猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增引物(SEQ ID NO.1～4)；

1、9、17、25均固定有实施例1提供的副猪嗜血杆菌环介导等温扩增引物(SEQ IDNO.5～8)；

2、10、18、26均固定有实施例1提供的猪霍乱沙门氏菌环介导等温扩增引物(SEQID NO.9～12)；

3、11、19、27均固定有实施例1提供的猪支气管败血波氏杆菌环介导等温扩增引物(SEQ ID NO.13～16)；

5、13、21、29均固定有实施例1提供的猪多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增引物(SEQID NO.17～20)；

6、14、22、30均固定有实施例1提供的猪链球菌导等温扩增引物(SEQ ID NO.21～24)；

7、15、23、31均固定有实施例1提供的猪丹毒杆菌环介导等温扩增引物(SEQ IDNO.25～28)；

8、16、24、32为空白对照，不包埋任何扩增引物。

将引物包埋入圆盘式微流控芯片的方法为：将病菌对应的外引物和内引物按照1:8的摩尔比进行混样，再与海藻糖进行混匀，配制成相应的混合液。混合液中内引物终浓度为1.6μM，外引物终浓度为0.2μM，海藻糖的质量百分含量为0.5％。

将混合液加样至芯片对应的反应池中，经真空加热、压片封膜和冲压后LAMP引物物被包被至反应池中，待所有病菌的LAMP引物都包被至芯片的反应池中，得到LAMP芯片备用。

2、检测多种猪易感病原菌LAMP芯片的使用方法

(1)提取基因组

按照TIANGEN公司提供的提取试剂盒进行细菌基因组及非目的菌基因组的提取，得到猪病原菌目的菌基因组和非目的菌基因组。

按照煮沸法提取临床样本的基因组DNA。

(2)反应体系配制

分别取上述的包括恒温扩增酶溶液3μL以及猪病原菌目的菌基因组和非目的菌基因组6μL组成的75μL恒温扩增反应混合溶液，旋涡震荡均匀后注入LAMP芯片的加样孔中，贴封口膜。

(3)恒温扩增反应与检测

将LAMP芯片置于微流控芯片检测仪器中，迅速离心1500rpm/min 15s，3500rpm/min 30s，63℃反应1h。

(4)结果判断

检测结果如图2～图8所示，反应池中所对应的“S”型为阳性；反应池中所对应的平直的曲线，即为阴性。

由图2可知，固定有猪胸膜肺炎放线杆菌引物组的反应池7、15、23、31的检测结果呈“S”型，为阳性，说明该待测样本为猪胸膜肺炎放线杆菌阳性临床样本。

由图3可知，固定有副猪嗜血杆菌引物组的反应池1、9、17、25的检测结果呈“S”型，为阳性，说明该待测样本为副猪嗜血杆菌阳性临床样本。

由图4可知，固定有猪霍乱沙门氏菌的反应池2、10、18、26的检测结果呈“S”型，为阳性，说明样本为猪霍乱沙门氏菌阳性临床样本。

由图5可知，固定有猪支气管败血波氏杆菌的反应池3、11、19、27的检测结果呈“S”型，为阳性，说明该待测样本为猪支气管败血波氏杆菌阳性临床样本。

由图6可知，固定有猪多杀性巴氏杆菌的反应池5、13、21、29的检测结果呈“S”型，为阳性，说明该待测样本为猪多杀性巴氏杆菌阳性临床样本。

由图7可知，固定有猪链球菌的反应池6、14、22、30的检测结果呈“S”型，为阳性，说明该待测样本为猪链球菌阳性临床样本。

由图8可知，固定有猪丹毒杆菌的反应池7、15、23、31的检测结果呈“S”型，为阳性，说明该待测样本为猪丹毒杆菌阳性临床样本。

结果表明，本发明提供的检测猪易感相关病原体的环介导等温扩增的成套引物及基于此的LAMP芯片能够准确的检测出猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪霍乱沙门氏菌、猪支气管败血波氏杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌和猪丹毒杆菌。

与常规PCR检测对比的结果见表2。

表2临床样品检测结果

由表2可知，本发明提供的LAMP芯片的检测结果与常规PCR检测结果相同，表明本发明提供的检测方法的检出率高达100％。还表明本发明能特异性地检测猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪霍乱沙门氏菌、猪支气管败血波氏杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪丹毒杆菌，且与其他病原体无交叉反应，具有极高的特异性。

实施例3

LAMP芯片的灵敏度

利用实施例2制备LAMP芯片进行灵敏度的检测。

取实施例2提取获得的猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪霍乱沙门氏菌、猪支气管败血波氏杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪丹毒杆菌的核酸，分别稀释后进行混合得到混合核酸。

猪胸膜肺炎放线杆菌样本的浓度梯度：1.17×10²ng/μL、1.17×10¹ng/μL、1.17×10⁰ng/μL、1.17×10^-1ng/μL、1.17×10^-2ng/μL、1.17×10^-3ng/μL、1.17×10^-4ng/μL、1.17×10^-5ng/μL；

副猪嗜血杆菌样本的浓度梯度：1.27ng/μL10²、1.27ng/μL10¹、1.27×10⁰ng/μL、1.27×10^-1ng/μL、1.27×10^-2ng/μL、1.27×10^-3ng/μL、1.27×10^-4ng/μL、1.27×10^-5ng/μL；

猪霍乱沙门氏菌样本的浓度梯度：1.57×10²ng/μL、1.57×10¹ng/μL、1.57×10⁰ng/μL、1.57×10^-1ng/μL、1.57×10^-2ng/μL、1.57×10^-3ng/μL、1.57×10^-4ng/μL、1.57×10^-5ng/μL；

猪支气管败血波氏杆菌样本的浓度梯度：1.20×10²ng/μL、1.20ng/μL10¹、1.20×10⁰ng/μL、1.20×10^-1ng/μL、1.20×10^-2ng/μL、1.20×10^-3ng/μL、1.20×10^-4ng/μL、1.20×10^-5ng/μL；

猪多杀性巴氏杆菌样本的浓度梯度：2.05×10¹ng/μL、2.05ng/μL10⁰、2.05×10^- ¹ng/μL、2.05×10^-2ng/μL、2.05×10^-3ng/μL、2.05×10^-4ng/μL、2.05×10^-5ng/μL、2.05×10^- ⁶ng/μL；

猪链球菌样本的浓度梯度：1.13××10¹ng/μL、1.13ng/μL10⁰、1.13×10^-1ng/μL、1.13×10^-2ng/μL、1.13×10^-3ng/μL、1.13×10^-4ng/μL、1.13×10^-5ng/μL、1.13×10^-6ng/μL；

猪丹毒杆菌样本的浓度梯度：8.3ng/μL10¹、8.3×10⁰ng/μL、8.3×10^-1ng/μL、8.3×10^-2ng/μL、8.3×10^-3ng/μL、8.3×10^-4ng/μL、8.3×10^-5ng/μL、8.3×10^-6ng/μL、。

将混合核酸与恒温扩增体系(即实施例2提供的恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液)混匀，进样至本发明提供的恒温扩增微流控芯片(即实施例2制备得到的LAMP芯片)中，按照63℃，1h的条件进行恒温扩增反应。

反应结果如图9～图15所示，本发明对猪胸膜肺炎放线杆菌的最低检测限为1.17pg/μL；副猪嗜血杆菌的最低检测限为12.7pg/μL；猪霍乱沙门氏菌的最低检测限度为15.7pg/μL；猪支气管败血波氏杆菌的最低检测限均为12.0pg/μL；猪多杀性巴氏杆菌的最低检测限为2.05pg/μL；猪链球菌最低检测限度为1.13pg/μL；猪丹毒杆菌最低检测限度为8.3pg/μL。表明本发明提供的检测方法的灵敏度极高。

本发明提供的LAMP芯片，能够快速、准确地检测猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪霍乱沙门氏菌、猪支气管败血波氏杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪丹毒杆菌病原菌，以弥补针对上述病原体检测技术存在的费时耗力的缺陷。还能够扩展病原体检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。本发明还可以肉眼可视化判定检测结果，摆脱昂贵的PCR检测仪器，使本发明在科学研究和生产实践中快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作。对于临床而言，能够在1h内获得对猪易感病原菌的检测，检测结果不仅快于目前较为普遍采用的PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。同时，多指标的分型检测也可以用于流行病学调研和疫情监控。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 猪易感相关致病菌检测的LAMP引物组及基于此的试剂盒和LAMP芯片和应用

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccttagccc cttacacta 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcttaggat ccgcctta 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccaccgag aaacaaatcc tcggcgtggt ttatgtcacc 40

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggcgataca attgaagacg ccggtacccc tttttctctc accac 45

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acctactttt acgcctcc 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcattggtca agctggtt 18

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caggcattga aggtttgacg tttatcatca cgctcatttg c 41

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accttttttg tttgtgttgt ttgctaaagt ataggtgttg gtactg 46

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cattgccaag tatctgtatc agc 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccggatgcac taaggcttta 20

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaaggatgc cattttgccc ggttagctcc ccattctgct c 41

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgagtgggct tgtcggtagt caacacacca aactctgc 38

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgacggtcga tcaatggtg 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agccagctgg aatcatgga 19

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcgattccac gcgcgatcag tcccctgcag aaagtacgg 39

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcattgaat attgcctggg gcaacatggt gaaaagaccc gg 42

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgttgtcaag gaagcaga 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tccgctattt acccagtg 18

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgagccataa aataatgcca tttccgtgcg aatgaaccga ttg 43

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgagtgggct tgtcggtagt caacacacca aactctgc 38

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acaccgatgt caccagca 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcgcttccac ccaactgta 19

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgcgcttctg ccaaagcttc agacgtcaag tgaaggtccg 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccacctttac caccgccgat agttcctcgg ttttgagcaa 40

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cggctcgaaa atatgatgg 19

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gaacatctcc acttctttgg 20

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

acgttccaag tttggatata catcttcatc cactgtatct tgaact 46

<210> 28

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gcgaacgcgg ttgttgaatc ctgtagtttc ttccctcttt gt 42

<210> 29

<211> 652

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ccggcaacga cagtaagatt gaaggcacta aaatcacccg taggattgcg ggtaaagaag 60

ttacgcttga tattgccaat cagaaaattg aaaaaggcgt gtcagagaaa ttggggctgt 120

ctgttagtgg ttcggatatc attaaattgt tgtttggagc attgactcca actttaaata 180

gaatgttgct atcacaactc atccagtctt tttccgatag cttggctaaa cttgataatc 240

ccttagcccc ttacactaaa aatggcgtgg tttatgtcac cggcaaaggg aatgatgtgc 300

ttaaaggaac tgaacatgag gatttgtttc tcggtggtga ggggaatgat acttattatg 360

cgagagtagg cgatacaatt gaagacgccg acggcaaagg taaagtctat tttgtgagag 420

aaaaaggggt acctaaggcg gatcctaagc gggtagagtt tagcgagtac ataacgaaag 480

aagaaataaa agaggttgaa aaggggttat taacctacgc agttttagaa aattataatt 540

gggaagagaa aacggcgact ttcgctcatg cgactatgct taatgagctt tttactgatt 600

atactaatta tcgttatgaa gttaaaggac taaaattgcc cgccgttaaa aa 652

<210> 30

<211> 605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tcttgcgcca gttcttacga agtcaatttt ctctttaaca ttacctgttt tttcaacacc 60

atgaccacca tcaacagcta cagtaaatgg agcattgaca tatttaagac caaagtatac 120

accatctttg tctttcttat taacagatcc agatttatag tcatcatgag tataacctgc 180

tgccacagtt acagattgac tttccgcaat cttagctgtg tatttagcac ctaaaccaaa 240

gccagattta gcagaaccta cttttacgcc tcccttatca tcacgctcat ttgcaacatt 300

atagttagca cctaacgtca aaccttcaat gcctgtatag gtatagttaa ttgctgaatc 360

agaatctgaa gtaaggatat caaaaccttt tttgtttgtg ttgtttgctg aatatttaat 420

tccaccagta ccaacaccgt atactttatc aaaaccagct tgaccaatgc tatcaccgat 480

tacagcttgt ttaccaaaag aaatttcatg accatagcca cctaaaccga cgtaagcata 540

ttttgtttta acatcgcccc atcctgcagc atttttagaa ttactgtcaa ggcgagtctc 600

ataac 605

<210> 31

<211> 407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atgcaacatt tggatatcgc tgaattagtt cgttccgcac tggaagtaag tggttgcgat 60

ccttcactca tcggaggaat agatagccat tcaacaattg ttctggattt atttgcattg 120

ccaagtatct gtatcagcgt caaggacgat gatgtatgga tctgggcgca attgggtgct 180

gacagcatgg tggtattaca acagcgggct tatgaaatct taatgaccat aatggaagga 240

tgccattttg cccgcggcgg gcaattacta ctgggggagc agaatgggga gctaacgctt 300

aaagccttag tgcatccgga ttttttatct gacggtgaaa agttctctac tgccttgaat 360

gggttttaca actatctgga agtttttagt cggtcgctaa tgagatg 407

<210> 32

<211> 547

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

atcgcgggcg tgctctgcga tctcgagagc gcgcagcgca cgttgcccgt cgtattggcc 60

aggtttcggc cccttggcgt gcttgcgcga ttcagaaggc tggagcagga aaccgcgggc 120

atgctgcttg gcgaccagga gccggagcct cggggcttca tcagttttac cgattttcgc 180

gatagcgacg cgttcgccag ctacgcggag tatgcggccc agttcaacga ctatatcgat 240

caatacagca tactcgaggc gcagcggctg gcgcggattc tggccctggg ctcgcggatg 300

acggtcgatc aatggtgcct tcccctgcag aaagtacggc actacaaggt gctgacatcg 360

cagccagggc tgatcgcgcg tggaatcgaa aatcacaaca ggggcattga atattgcctg 420

gggcggccgc cgctgaccga tctgccgggt cttttcacca tgttccagct ccatgattcc 480

agctggctgt tggtatcgaa catcaacggt gagctttggt ctgatgtcct tgcgaacgct 540

gaggtga 547

<210> 33

<211> 457

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gctgtaaacg aactcgccac tttttgtttc atttggactg acacgatcaa accgttgaac 60

acgaagaaaa agaccaaaat aggtaaccaa tacacgataa ataaattaaa ccgctctgcc 120

gttaatggct tcaataatgg ccataagaaa cgtaactcaa catggaaata ttgataaatc 180

agactgacaa ggaaatataa accggcaaat aacaataagc tgagtaataa ataacgtcca 240

atcagttgcg ccgttgtcaa ggaagcagat tggctcaaca caccaaactc cgcccaacaa 300

aactgtgctt ttctttgcca cacgccaaat aaaagactac cgacaagccc actcacaacg 360

agccataaaa taatgccatt tcccatttca agtggcataa aactcaattt cgcggcaatc 420

ggttcattcg caccgcccca ctgggtaaat agcggat 457

<210> 34

<211> 689

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gcagcgtatt ctgtcaaacg agcgcggcgt ttttctttga tgtccaccaa gaggtcgaag 60

tcgataccag tttcgtcaat gatgtaacca tttgagtctg aaacagaaat aacttttgca 120

ccaagttcag tcgctttttg aacagcatat tgggcaacgt taccagaacc tgagataagg 180

acagtttggt ctttgaagga tttaccgttt gctgccaaca tgttatcagt gaagtaaacc 240

aaaccgtaac cagttgcttc tgggcggatc aatgaaccac cgaagccaag aggtttacca 300

gtcaagacac ctgcatcaaa ctggcggagg cgtttgtatt gaccgtacat gtaaccgatc 360

tcacgaccac cgacaccgat gtcaccagca gggacgtcaa gtgaaggtcc gatgtgtttt 420

tgcaattcag tcatgaagct ttggcagaag cgcatgattt cagcatcagt ttttccttta 480

ggatcaaagt ctgaaccacc tttaccaccg ccgattggaa gaccagtcaa gacgtttttg 540

aagatttgct caaaaccgag gaacttcaag atggattggt ttacagttgg gtggaagcga 600

agaccgcctt tataaggacc tacagctgag ttgaactgaa cacggtagcc acggttgact 660

tgaacatttc catctttatc tgtccatgg 689

<210> 35

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

atgaaaaaga aaaaacacct atttccgaaa gtaagtctta tgtcgtgctt acttttaaca 60

gcaatgccac tacaaacagc ttttgctgat tcgacagata tttctgtgat tccactaatc 120

ggtgaacaag ttggattgct cccagtttta cctgggacag gggtacatgc tcaggaatac 180

aacaaaatga ctgatgctta tattgaaaaa ttggtatctc taattaatca aaaagtgaag 240

ccgtttctta taaatgaacc aaaggggtac caaagtttcg aagcagtgaa tgaagagatt 300

aactcgattg taagtgaact taaaaatgaa ggaatgagtc ttcaaaacat tcaccatatg 360

tttaaacaaa gcatccaaaa cctagcaact agaatcggct acagaagttt tatgcaggat 420

gctatgtatc ttgaaaattt tgaaagatta acgattcctg aacttgatga agcatacgtt 480

gatttactcg tgaattacga ggtgaaacac cgtattttag taaaatatga aggtaaagtt 540

aaaggtagag ctcccttaga agcatttata gttcctctaa gagatagaat tcgtagtatg 600

aatgaaattg ctgcagaagt aaattattta cctgaagcgc atgaggattt cttagtttca 660

gattcaagcg agtataatga caaactaaat aatatcaact ttgctttggg tctaggggtc 720

agcgagttta ttgactataa ccggctcgaa aatatgatgg aaaaagaact tcatccactg 780

tatcttgaac tttatgctat gcggagaaat cgccaaattc aagttgtaag agatgtatat 840

ccaaacttgg aacgtgcgaa cgcggttgtt gaatccttaa agacaattaa agatataaaa 900

caaagaggga agaaactaca ggaacttctt gaaatttata tccaaagaag tggagatgtt 960

cgaaaaccag atgtactcca acgatttatt ggaaaatatc aatcagtagt tgatgaagaa 1020

aaaaataaac ttcaagatta tttagaatca gatatttttg attcatatag tgtggatggc 1080

gagaaaataa gaaataaaga aattacactc atcaatagag atgcatactt atctatgatt 1140

tacagagctc aatcgatttc ggaaattaag acgattcgtg cagatttaga atcacttgtc 1200

aaatcattcc aaaatgaaga aagtgactct aaagtagagc ctgaaagtcc cgttaaagta 1260

gaaaaaccag ttgatgaaga aaaacctaaa gatcaaaaga agctagttga tcaatcaaaa 1320

cccgaatcga attcaaaaga agggtggatt aagaaagata ataagtggtt ctatattgag 1380

aaatcaggtg gaatggcaac aggttggaag aaggtagcag acaaatggta ctacctcgat 1440

aatacgggtg ctatagttac gggttggaag aaggtagcaa acaaatggta ctatcttgaa 1500

aaatcaggtg cgatggcaac aggatggaag aaagtatcaa acaagtggta ctaccttgaa 1560

aactcaggtg caatggcaac aggatggaag aaagtatcaa acaagtggta ctaccttgaa 1620

aattcaggcg caatggctac aggatggaaa aaggtagcaa acaaatggta ctaccttgaa 1680

aactcaggtg cgatggcaac aggatggaag aaagtatcga acaagtggta ctaccttgaa 1740

aactcaggcg caatggctac aggatggaaa aaggtagcaa acaaatggta ctaccttgat 1800

aaatcaggaa tgatggttac aggttcaaaa tctattgatg gtaaaaagta tgcatttaag 1860

aacgatggaa gtttaaaata g 1881

Claims

1.猪易感相关致病菌检测的LAMP引物组，所述猪易感相关致病菌包括：猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪霍乱沙门氏菌、猪支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌和猪丹毒；所述LAMP引物组包括猪胸膜肺炎放线杆菌引物组、副猪嗜血杆菌引物组、猪霍乱沙门氏菌引物组、猪支气管败血波氏杆菌引物组、多杀性巴氏杆菌引物组、猪链球菌引物组和猪丹毒引物组；

2.一种猪易感相关致病菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的LAMP引物组和反应液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括Bst DNA聚合酶、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、BSA-A、dNTP、MgSO₄水溶液和荧光染料。

4.一种检测猪易感相关致病菌的LAMP芯片，其特征在于，所述芯片包括权利要求1所述的LAMP引物组、反应液和芯片。

5.根据权利要求4所述的LAMP芯片，其特征在于，所述LAMP引物组中任一病菌对应的外引物对和内引物对的摩尔比均为1:8。

6.根据权利要求4所述的LAMP芯片，其特征在于，所述反应液包括Bst DNA聚合酶、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、BSA-A、dNTP、MgSO₄水溶液和荧光染料。

7.根据权利要求4所述的LAMP芯片，其特征在于，所述芯片包括恒温扩增微流控芯片。

8.根据权利要求4所述的LAMP芯片，其特征在于，所述LAMP芯片的扩增反应池中包括：副猪嗜血杆菌反应池、猪霍乱沙门氏菌反应池、猪支气管败血波氏杆菌反应池、多杀性巴氏杆菌反应池、猪链球菌反应池、猪丹毒反应池、猪胸膜肺炎放线杆菌反应池和阴性对照组反应池。