CN102002539B - 一种猪细小病毒检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪细小病毒检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒，包括三对引物，即与猪细小病毒的基因组DNA(GenBank Accession Number NC-001718)中NS1基因结合的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对。本发明的猪细小病毒检测试剂盒，检测灵敏度高，最低可检测出10个拷贝的靶DNA，操作简单方便，特别适于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的猪细小病毒的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪细小病毒检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起猪繁殖障碍的重要病原体之一，主要表现为母猪流产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱子等特征，此外PPV还与非化脓性心肌炎、皮炎、肠炎及病毒血症等有关，PPV能加重猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。近年来，随着养猪业的发展，大型集约化猪场的相继出现，该病的发生呈上升趋势，给养猪业造成巨大的经济损失，严重影响养猪业的发展。
1966年Mary和Mahnel首次于猪瘟病毒组织中分离到该病毒并证实了其病原作用。此后在欧、美、亚、非及大洋洲很多国家均有报道。我国于1982年由中国兽药监察所分离到该病毒，此后在上海、黑龙江、吉林、四川、浙江等地均分离到该病毒，虽然各地分离的PPV来源不同，名称各异，但均为同一型，血清学上无差别。随着研究的深入，国内外众多的科研工作者已从多方面对此病毒进行了不同层次的研究。
目前，PPV的诊断方法主要有：病原学诊断方法、血清学诊断方法、分子生物学诊断方法。病原学诊断方法是PPV最确切的一种实验室诊断方法，但从流产胎儿组织接种细胞分离病原操作复杂、耗时耗力。血清学诊断方法主要包括血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)、血清中和试验(SN)、间接荧光抗体试验(IFA)和酶联免疫吸附试验作(ELLISA)。血清学试验相对简单，但是其灵敏性较低，易出现非特异反应，在感染初期，由于低水平抗体效价的影响，尤其是对隐性感染动物往往漏检，从而造成了本病的流行和蔓延。分子生物学诊断方法：主要是各种PCR技术和核酸探针杂交，这些方法具有高特异性和高灵敏度，引物与探针可以大量合成并长期保存，检测速度快、结果可靠，避免散毒等优点，在畜禽传染病的检测、鉴别诊断方面已得到了广泛应用。但PCR技术也存在其缺陷，最主要的问题是成本较高，技术性较强，操作烦琐，设备昂贵，样品检测费用较高，故不适合于基层诊断和大规模流行病学调查。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪细小病毒检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术，可以快速检测猪细小病毒。
本发明提供了检测猪细小病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成；一对引物是与猪细小病毒的基因组DNA(GenBank Accession Number NC-001718)中NS1基因结合的内侧引物对，一对引物是与猪细小病毒的基因组DNA(GenBankAccession Number NC-001718)中NS1基因结合的外侧引物对，一对引物是与猪细小病毒的基因组DNA(GenBank Accession Number NC-001718)中NS1基因结合的环形引物对。NS1基因为PPV全基因组中编码非结构蛋白1的基因，如GenBank AccessionNumber NC-001718中自5’末端第292至2280位核苷酸所示。
所述专用引物的靶序列具体可为猪细小病毒的基因组DNA(GenBank AccessionNumber NC-001718)中NS1基因的部分区域，该部分区域的核苷酸序列如序列表的序列1所示。
所述内侧引物对由上游引物FIP和下游引物BIP组成，所述上游引物FIP的核苷酸序列具体可为序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具体可为序列表中的序列5；所述外侧引物对由上游引物F3和下游引物B3组成，所述上游引物F3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3；所述环形引物对由上游引物LF和下游引物LB组成，所述上游引物LF的核苷酸序列具体可为序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列具体可为序列表中的序列7。
F3：5’-CAAGCAACAATGGCTAGCTATATG-3’(序列表的序列2)；
B3：5’-GTTGGTGTTGTTGGCTCGC-3’(序列表的序列3)；
FIP：5’-GTATTTATTGGGGTTTGCATTTTTTTATCATTGGGGAAATGTACCTGAT-3’(序列表的序列4)；
BIP：5’-ACATCAGTGAAAACTTCGCCAGCTTTTGCTAAATCCAGGTCCTCCTGT-3’(序列表的序列5)；
LF：5’-GCTCCTCCCATTTTTCTGAC-3’(序列表的序列6)；
LB：5’-ACAACAACTACGCAGCAACTC-3’(序列表的序列7)。
应用所述专用引物检测猪细小病毒的原理如下：
根据猪细小病毒的基因组DNA(GenBank Accession Number NC-001718)中NS1基因的部分区域(GenBank Accession Number NC-001718自5’末端第1918-2144位核苷酸；序列表的序列1)设计一组用于环介导等温扩增的引物，即内侧引物对(内侧上游引物FIP和内侧下游引物BIP)、外侧引物对(外侧上游引物F3和外侧下游引物B3)和环形引物对(环形上游引物LF和环形下游引物LB)。三对引物和所述区域变异区域的八个特定区域的序列完全配对(见表1)，可以确保反应的彻底进行，也保证了检测方法的特异性。
表1专用引物与猪细小病毒的基因组DNA的结合区域
所述专用引物在具有高度链置换催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成对模板DNA的扩增。扩增过程分为三个阶段，具体如下：
(1)循环起始阶段
一端内侧引物先与模板结合并启动DNA合成。相同一端的外侧引物随后与模板结合启动DNA合成，并发生链置换释放出含有内侧引物序列的DNA单链。该单链DNA作为模板先后与另一端的内侧引物和外侧引物结合，启动DNA合成并发生链置换，最后形成一个初始的茎环DNA。
(2)反应循环阶段
内侧引物与初始茎环DNA结合，启动链置换DNA合成，可产生另一个初始茎环DNA和一个新的两倍长度的茎环DNA。这些茎环DNA可作为模板继续与内侧引物结合启动链置换DNA合成，并且每次合成均可使茎环DNA的茎长度成倍增长。进入循环阶段后，会产生许多分子大小不同的茎环DNA，这些茎环DNA还可作为模版与环形引物结合，启动更多的DNA合成并发生链置换。最后经过一个小时的等温扩增，目的DNA可累积109拷贝。
所述专用引物可用于制备试剂盒；所述试剂盒用于检测待测样本中是否含有猪细小病毒和/或辅助鉴定猪细小病毒。
本发明还保护含有所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于检测待测样本中是否含有猪细小病毒和/或辅助鉴定猪细小病毒。该试剂盒在使用过程中，所述内侧引物对、所述外侧引物对和所述环形引物对作为一个整体组使用，使用时应该尽量避免引物二聚体的形成。
所述试剂盒可包括溶液B(B液)，由溶剂和溶质组成；溶剂为水(如双蒸水)；溶质及其浓度如下：所述上游引物F3为2.4-3.6pmol/μl，所述下游引物B3为2.4-3.6pmol/μl，所述上游引物FIP为20-28pmol/μl，所述下游引物BIP为20-28pmol/μl，所述上游引物LF为10-14pmol/μl，所述下游引物LB为10-14pmol/μl。
所述溶液B中，所述上游引物F3具体为3pmol/μl，所述下游引物B3具体为3pmol/μl，所述上游引物FIP具体为24pmol/μl，所述下游引物BIP具体为24pmol/μl，所述上游引物LF具体为12pmol/μl，所述下游引物LB具体为12pmol/μl。
所述试剂盒还可包括溶液A(A液)，由溶剂和溶质组成；溶剂为水(如双蒸水)；溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO4·7H2O为13.33nmol/μl，(NH4)2SO4为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl2·4H2O为1nmol/μl，四种脱氧核苷酸(dNTPs)各2.33nmol/μl，甜菜碱(Betaine)为0.33μmol/μl，Tris-HCl(1M，pH8.8)为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，Bst DNA聚合酶为0.8U/μl。
所述试剂盒还可包括C液，即阳性对照。所述阳性对照可为煮沸10分钟后的猪细小病毒细胞培养液(如猪细小病毒7909株的PK15细胞培养液)，病毒含量为1TCID50/μl。
所述试剂盒还可包括离心管(如0.2或0.6ml规格)，检样管(在离心管中加一片FTA卡，如直径为1.2mm的FTA卡)，螺口离心管(如2.0ml规格)、一次性自吸式微量吸管(如10±2μL规格)和滴管(如每滴20±3μL规格)等。
本发明还提供了一种检测来自死亡动物的样品中是否携带猪细小病毒的方法，是用所述专用引物或所述试剂盒对来自死亡动物的样品的总DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定来自死亡动物的样品中是否携带猪细小病毒；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、30-90min。
所述环介导等温扩增反应的温度具体可为60-63℃或63-65℃。所述环介导等温扩增反应的时间具体可为：30-50min、50-60min、60-70min或70-90min。
应用本发明提供的专用引物或试剂盒检测猪细小病毒，可以通过直接检视反应液颜色的变化来判断样本中是否含有猪细小病毒。直接检视方法为：环介导等温扩增后，阳性对照由棕黄色变为亮绿色，阴性对照保持棕黄色不变(说明实验结果可信)；此时若待检样品也保持棕黄色，则说明待检样品的检测结果为阴性(该样本不含有猪细小病毒)，此时若待检测样品由棕黄色变为亮绿色，则说明待测样本的检测结果为阳性(该样品中含有猪细小病毒)。
本发明提供的试剂盒可用于检测多种样本(如核酸、血液、尿液、唾液、心、肺、脾、肾等)中的猪细小病毒。可用商品化试剂盒提取待测样本的核酸，所得核酸溶液直接作为模板使用。若待测样本为尿液或唾液，也可将待测样本放入2.0ml螺口离心管中，于沸水浴中煮沸10min，冷却至室温后即可做模板使用。若待测样本为血液，也可取10μl血液样本滴加于检样管中的FTA卡上，孵育10min后，将液体吸出，留下卡片，加入200μl市售纯净水或双蒸水，室温下静置3分钟后将管内水全部吸出，所留FTA卡片即可作为模板使用。若待测样本为心、肺、脾、肾等组织器官，也可将采集的组织取一定量置于研钵中，加入市售纯净水或双蒸水，组织研磨成匀浆，反复冻融三次后，5000rpm离心5min，吸取上清；取10μl上清液滴加于反应管中的FTA卡上，孵育10min后将液体吸出，留下纸片，加入200μl市售纯净水或双蒸水，室温下静置3分钟后，将水全部吸出，所留FTA卡片即可作为模板使用。
用所述试剂盒进行检测时，环介导等温扩增前可将A液和B液混合均匀(体积比：9份A液，1份B液)，得到混合液，然后将模板、阳性对照和阴性对照(市售纯净水或双蒸水)分别与混合液混合，进行环介导等温扩增。
应用本发明提供的专用引物或试剂盒检测猪细小病毒，特异性高且灵敏度高，可检测出10个拷贝的目的DNA。与PCR检测方法相比，应用本发明提供的专用引物或试剂盒检测，不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属或水浴锅即可，并且检测结果通过观察可见荧光即可，操作简单方便。本发明的试剂盒可应用于基层现场进行的临床医学检测及食品中可能污染的猪细小病毒的检测，特别适于基层临床医学检测工作及现场即时检测。
附图说明
图1为实施例4的检测结果。
图2为实施例5的检测结果。
图3为实施例6的检测结果。
图4为实施例7的检测结果。
图5为实施例8的检测结果。
图6为实施例9的检测结果。
图7为实施例10的检测结果。
图8为实施例11的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。猪细小病毒(Porcine parvovirus)7909株：购自中国兽医药品监察所，产品目录CVCC AV25。
实施例1、猪细小病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
人工合成以下3对引物：
F3：5’-CAAGCAACAATGGCTAGCTATATG-3’(序列表的序列2)；
B3：5’-GTTGGTGTTGTTGGCTCGC-3’(序列表的序列3)；
FIP：5’-GTATTTATTGGGGTTTGCATTTTTTTATCATTGGGGAAATGTACCTGAT-3’(序列表的序列4)；
BIP：5’-ACATCAGTGAAAACTTCGCCAGCTTTTGCTAAATCCAGGTCCTCCTGT-3’(序列表的序列5)；
LF：5’-GCTCCTCCCATTTTTCTGAC-3’(序列表的序列6)；
LB：5’-ACAACAACTACGCAGCAACTC-3’(序列表的序列7)。
二、检样管的制备
市售0.6ml离心管(要求无核酸污染)，装入用打孔器切下的直径1.2mm的FTA卡(Whatman，Cat No.WB120205)，得到检样管。
三、阳性对照的制备
猪细小病毒(Porcine parvovirus)7909株的PK15细胞培养液，用双蒸水稀释至1TCID50/μl，水浴中煮沸10分钟，所得液体即为C液(阳性对照)，-20℃保存备用。
四、配制LAMP反应液
A液由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO4·7H2O为13.33nmol/μl，(NH4)2SO4为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl2·4H2O为1nmol/μl，四种脱氧核苷酸(dNTPs)各2.33nmol/μl，甜菜碱(Betaine)为0.33μmol/μl，Tris-HCl(1M，pH8.8)为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，Bst DNA聚合酶为0.8U/μl。
B液由由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：F3为3pmol/μl，B3为3pmol/μl，FIP为24pmol/μl，BIP为24pmol/μl，LF为12pmol/μl，LB为12pmol/μl。
五、试剂盒的组装
试剂盒由以下物质组成：A液、B液、C液和检样管。
实施例2、猪细小病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
同实施例1的步骤一。
二、反应管的制备
同实施例1的步骤二。
三、阳性对照的制备
同实施例1的步骤三。
四、配制LAMP反应液
A液同实施例1的A液。
B液由由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：F3为3.6pmol/μl，B3为3.6pmol/μl，FIP为28pmol/μl，BIP为28pmol/μl，LF为14pmol/μl，LB为14pmol/μl。
五、试剂盒的组装
同实施例1的步骤五。
实施例3、猪细小病毒检测试剂盒的制备
一、引物的合成
同实施例1的步骤一。
二、反应管的制备
同实施例1的步骤二。
三、阳性对照的制备
同实施例1的步骤三。
四、配制LAMP反应液
A液同实施例1的A液。
B液由由溶质和溶剂组成；溶剂为双蒸水；溶质及其浓度如下：F3为2.4pmol/μl，B3为2.4pmol/μl，FIP为20pmol/μl，BIP为20pmol/μl，LF为10pmol/μl，LB为10pmol/μl。
五、试剂盒的组装
同实施例1的步骤三。
实施例4、猪细小病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1头确诊为猪细小病毒猪细小病毒感染的猪(病猪)，1头健康猪。对两头猪采血，分别采用实施例1制备的试剂盒对血液样本进行检测。
一、样本的处理
取10μl血液滴加于检样管中的FTA卡上，孵育10min后，吸除液体，留下FTA卡，加入200μl双蒸水，室温下静置3分钟(如需要，可在管内进行适当的人工混合)，将水全部吸出。
采用病猪血液进行上述处理，得到3支反应管，作为I组反应管。
采用健康猪血液进行上述处理，得到3支反应管，作为II组反应管。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(体积比：9份A液，1份B液)，得到混合液。
向I组反应管和II组反应管中每管加入20μl混合液，进行环介导等温扩增。另外，在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl双蒸水(阴性对照)，进行环介导等温扩增；在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl C液(阳性对照)，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于60℃恒温水浴反应90min。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有猪细小病毒。结果见图1。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，病猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例5、猪细小病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1头确诊为猪细小病毒感染的猪(病猪)，1头健康猪。对两头猪采血，分别采用实施例3制备的试剂盒对血液样本进行检测。
一、样本的处理
同实施例4的步骤一。
二、环介导等温扩增
环介导等温扩增的反应条件为：置于65℃恒温水浴反应70min。其它均同实施例4的步骤二。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有猪细小病毒。结果见图2。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，病猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例6、猪细小病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1头确诊为猪细小病毒感染的猪(病猪)，1头健康猪。对两头猪采血，分别采用实施例2制备的试剂盒对血液样本进行检测。
一、样本的处理
同实施例4的步骤一。
二、环介导等温扩增
环介导等温扩增的反应条件为：置于60℃恒温水浴反应50min。其它均同实施例4的步骤二。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有猪细小病毒。结果见图3。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，病猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例7、猪细小病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1头确诊为猪细小病毒感染的死猪，1头健康猪。对两头猪采血，分别采用实施例1制备的试剂盒对血液样本进行检测。
一、样本的处理
用死猪血液代替病猪血液，其它同实施例4的步骤一。
二、环介导等温扩增
环介导等温扩增的反应条件为：置于65℃恒温水浴反应30min。其它均同实施例4的步骤二。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有猪细小病毒。结果见图4。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，死猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例8、猪细小病毒检测试剂盒的应用
取两个胎儿，1个为来自确诊为猪细小病毒感染的猪，1个来自健康猪。对两个胎儿分别取肝脏，分别采用实施例1制备的试剂盒对肝脏样本进行检测。
一、样本的处理
将肝脏置于研钵中，加入双蒸水，组织研磨成匀浆，反复冻融三次后，5000rpm离心5min，吸取上清，用商品化DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技北京有限公司)提取DNA，得到DNA溶液。
采用染病猪胎儿的肝脏进行上述处理，得到染病猪胎儿肝脏模板。
采用健康猪胎儿的肝脏进行上述处理，得到健康猪胎儿肝脏模板。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(体积比：9份A液，1份B液)，得到混合液。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl染病猪胎儿的肝脏模板，进行环介导等温扩增；在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl健康猪胎儿的肝脏模板，进行环介导等温扩增。另外，在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl双蒸水(阴性对照)，进行环介导等温扩增；在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl C液(阳性对照)，进行环介导等温扩增。环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。其它均同实施例4的步骤二。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有猪细小病毒。结果见图5。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪胎儿的3支反应管均为棕黄色，染病猪胎儿的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
如果检测肺组织等其它组织，将待测组织代替肝脏进行上述操作即可。
实施例9、猪细小病毒检测试剂盒的应用
取两头猪，1头确诊为猪细小病毒感染的猪(病猪)，1头健康猪。对两头猪分别取尿液，分别采用实施例1制备的试剂盒对尿液样本进行检测。
一、样本的处理
将病猪尿液置于2.0ml螺口离心管中，于沸水浴中煮沸10min，得到病猪尿液模板。将健康猪尿液置于2.0ml螺口离心管中，于沸水浴中煮沸10min，得到健康猪尿液模板。冷却后进行环介导等温扩增。
二、环介导等温扩增
将A液和B液充分混合均匀(体积比：9份A液，1份B液)，得到混合液。在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl病猪尿液模板，进行环介导等温扩增；在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl健康猪尿液模板，进行环介导等温扩增。另外，在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl双蒸水(阴性对照)，进行环介导等温扩增；在3支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，再各加入10μl C液(阳性对照)，进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。
三、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有猪细小病毒。结果见图6。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。健康猪的3支反应管均为棕黄色，病猪的3支反应管均有亮绿色可见荧光。
实施例10、猪细小病毒检测试剂盒灵敏度的检测
一、重组质粒的制备
合成序列表的序列1所示的DNA(NS1基因部分序列)，与T载体(pEASY-T1 SimpleCloning Vector，购自北京全式金生物技术有限公司)连接，然后转化Top10大肠杆菌感受态细胞(E.coli Top10菌株，购自北京全式金生物技术有限公司)，得到含有重组质粒的重组菌。一个重组质粒分子对应一个拷贝的NS1基因。
二、各浓度质粒样本的制备
提取重组菌中的重组质粒，通过分光光度计法测定并计算拷贝数浓度。用双蒸水将质粒稀释到所需要的浓度，即103拷贝/μL、102拷贝/μL、10拷贝/μL、1拷贝/μL和0.1拷贝/μL。
三、猪细小病毒的检测
分别对步骤制备的各浓度的质粒样本进行检测，检测步骤如下：
将实施例1制备的试剂盒中的A液和B液充分混合均匀(体积比：9份A液，1份B液)，得到混合液。在21支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，其中3支离心管加入10μL浓度为103拷贝/μL的质粒样本(检测组1)，3支离心管加入10μL浓度为102拷贝/μL的质粒样本(检测组2)，3支离心管加入10μL浓度为10拷贝/μL的质粒样本(检测组3)，3支离心管加入10μL浓度为1拷贝/μL的质粒样本(检测组4)，3支离心管加入10μL浓度为0.1拷贝/μL的质粒样本(检测组5)，3支离心管加入10μL双蒸水(阴性对照)，3支离心管加入10μL C液(阳性对照)；进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有猪细小病毒。结果见图7。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。检测组1的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组2的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组3的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组4的三个反应管均有亮绿色可见荧光，检测组5的三个反应管均为棕黄色无荧光液体。说明实施例1制备的试剂盒的灵敏度为10个拷贝的DNA。
实施例11、猪细小病毒检测试剂盒特异性的检测
将发病症状与猪细小病毒类似的其它病原：猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒VR-2332型毒株(美国ATCC菌种库)、猪伪狂犬病毒AV24*型毒株(中国兽医药品监察所)、猪瘟病毒AV63*型毒株(中国兽医药品监察所)、猪II型圆环病毒，分别采用实施例1制备的试剂盒进行检测。
一、猪II型圆环病毒的分离鉴定
称取可疑病例的淋巴结5～10g，加入PBS研磨组织。反复冻融3次，3000r/min离心20min，取上清，过滤除菌(0.22μm)。待PK15细胞长至80％时，弃去营养液，取上清3mL接种，放入5％CO237℃培养箱作用1h。弃去接毒液，加入DMEM营养液继续培养。6h后，弃去营养液，加入适量D-氨基葡萄糖(以能完全覆盖细胞单层为准)，于37℃作用30min。弃去D-氨基葡萄糖，用Hank’s液洗涤细胞2次，加入DMEM营养液继续培养至细胞长成单层，收获病毒液。
用商品化的病毒DNA/RNA提取试剂盒(Viral Nucleic Acid Extraction Kit II，购自北京吉普腾生物技术有限公司)提取病毒液的核酸溶液，得到的核酸溶液用作PCR鉴定的模板。
根据文献报道的引物P1：5-gaaccgcgggctggctgaacttttgaaagt-3，P2：5-gcaccgcggaaatttctgacaaacgttaca-3进行PCR鉴定(参考文献：于周1，2，李俊2，程凯慧1，2，时建立2，吴家强2，温建新1，王金宝2；猪圆环病毒2型毒株的分离鉴定；0529-6005(2009)01-0019-02)，结果显示所分离得到的病毒为猪II型圆环病毒。
二、特异性病原核酸的提取
用商品化的病毒DNA/RNA提取试剂盒(Viral Nucleic Acid Extraction Kit II，购自北京吉普腾生物技术有限公司)分别提取各个病毒的核酸溶液，得到核酸溶液作为模板。
三、环介导等温扩增
将实施例1制备的试剂盒中的A液和B液充分混合均匀(体积比：9份A液，1份B液)，得到混合液。在18支0.6ml离心管中各加入20μl混合液，其中3支离心管加入10μL猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒核酸溶液(检测组1)，3支离心管加入10μL猪伪狂犬病毒核酸溶液(检测组2)，3支离心管加入10μL猪瘟病毒核酸溶液本(检测组3)，3支离心管加入10μL猪II型圆环病毒核酸溶液(检测组4)，3支离心管加入10μL双蒸水(阴性对照)，3支离心管加入10μL C液(阳性对照)；进行环介导等温扩增。
环介导等温扩增的反应条件为：置于63℃恒温水浴反应60min。
四、检视
环介导等温扩增后，通过直接检视判断样本是否含有猪细小病毒。结果见图8。阳性对照均由棕黄色变为亮绿色，阴性对照均保持棕黄色不变。检测组1的三个反应管均为棕黄色，检测组2的三个反应管均为棕黄色，检测组3的三个反应管均为棕黄色，检测组4的三个反应管均为棕黄色。说明实施例1制备的试剂盒检测猪细小病毒具有良好的特异性。
Claims (7)
1.一种检测猪细小病毒的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成；一对引物是与猪细小病毒的基因组DNA中NS1基因结合的内侧引物对，一对引物是与猪细小病毒的基因组DNA中NS1基因结合的外侧引物对，一对引物是与猪细小病毒的基因组DNA中NS1基因结合的环形引物对；所述NS1基因如GenBank Accession NumberNC-001718中自5’末端第292至2280位核苷酸所示；
所述内侧引物对由上游引物FIP和下游引物BIP组成，所述上游引物FIP的核苷酸序列是序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对由上游引物F3和下游引物B3组成，所述上游引物F3的核苷酸序列是序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对由上游引物LF和下游引物LB组成，所述上游引物LF的核苷酸序列是序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列是序列表中的序列7。
2.权利要求1所述的专用引物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于检测待测样本中是否含有猪细小病毒和/或辅助鉴定猪细小病毒。
3.一种含有权利要求1所述的专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于检测待测样本中是否含有猪细小病毒和/或辅助鉴定猪细小病毒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括溶液B；所述溶液B由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下：所述上游引物F3为2.4-3.6pmol/μl，所述下游引物B3为2.4-3.6pmol/μl，所述上游引物FIP为20-28pmol/μl，所述下游引物BIP为20-28pmol/μl，所述上游引物LF为10-14pmol/μl，所述下游引物LB为10-14pmol/μl。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述溶液B中，所述上游引物F3为3pmol/μl，所述下游引物B3为3pmol/μl，所述上游引物FIP为24pmol/μl，所述下游引物BIP为24pmol/μl，所述上游引物LF为12pmol/μl，所述下游引物LB为12pmol/μl。
6.如权利要求3或4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括溶液A；所述溶液A由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下：KCl为16.67nmol/μl，MgSO4·7H2O为13.33nmol/μl，(NH4)2SO4为16.67nmol/μl，钙黄绿素为0.083nmol/μl，MnCl2·4H2O为1nmol/μl，四种脱氧核苷酸各2.33nmol/μl，甜菜碱为0.33μmol/μl，1M pH8.8 Tris-HCl为33.33nmol/μl，Tween-20为0.17％(体积百分含量)，Bst DNA聚合酶为0.8U/μl 。
7.一种检测来自死亡动物的样品中是否携带猪细小病毒的方法，是用权利要求1所述专用引物对来自死亡动物的样品的总DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定来自死亡动物的样品中是否携带猪细小病毒；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、30-90min。
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