CN101970690A - 一种检测隐孢子虫的方法 - Google Patents

Abstract

一种检测和/或鉴别一般的隐孢子虫生物体，特别是人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫生物体中的一种或多种和/或核酸序列的方法；以及用于对水、粪便、食品或其他样品介质的试样中，一般的隐孢子虫生物体、特别是人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫生物体中的一种或多种的存在进行测定的杂交分析探针、辅助探针、扩增引物、核酸组合物、探针混合物、方法和试剂盒。

Description

一种检测隐孢子虫的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年12月17日提交的澳大利亚临时申请No2007906896的优先权，将其内容引入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及一种检测和/或鉴别一般的隐孢子虫(Cryptosporidium)生物体的方法，特别是人隐孢子虫(C.hominis)、小球隐孢子虫(C.parvum)和火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)生物体中的一种或多种和/或核酸序列。本发明还涉及杂交分析探针、辅助探针、扩增引物、核酸组合物、探针混合物、方法和试剂盒，它们可用于对水、粪便、食品或其他样品介质中，一般的隐孢子虫生物体，特别是人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫生物体中的一种或多种的存在进行检测。

背景技术

隐孢子虫属(顶复门)为球虫原生动物，能够寄生于各种哺乳类物种的肠道。隐孢子虫属在多数脊椎动物群中是普遍的。例如牛、羊等动物可构成感染人类的人隐孢子虫的一个重要的储库(reservoir)。然而，在日托中心、医院和城市家庭群发生的疾病爆发表明，多数的人类感染为人对人的传播，而非通过动物传播途径或水传播途径。由于只在粪便中发现了卵囊，所述传播作用无疑为粪-口传播。尽管如此，从表面和饮用水中偶尔回收的卵囊(oocyst)表明，通过水的间接传播是可能的。

隐孢子虫属首先被确认为兽医病原体，并未认识到其作为人类疾病原因的重要性，直至获得性免疫缺陷综合征流行病的发展。在全世界的免疫抑制的人和免疫活性的人体内，尤其小球隐孢子虫和人隐孢子虫目前被确认为是腹泻疾病的重要原因。所述疾病具有1-14天的潜伏期，症状持续7-60天。这一肠病原体还显示出在发展中国家的幼童所遭受的恶性腹泻/营养不良循环中起到重要作用。对氯化消毒的抗性以及缺少有效的临床治疗手段促成了这一生物体的健康危害。

隐孢子虫属在自然界中以环境抗性的厚壁卵囊的形式存在。已知这些卵囊在水中存活相当长的时间，并且不受传统的水消毒剂(例如氯气)的影响。在摄入后，通过肠腔内胆汁酸的作用从卵囊释放出能动的子孢子，其侵入列于肠内的上皮细胞，在这些宿主细胞的微绒毛膜下形成寄生泡(parasitophorous vacuole)，并开始同时包含有性生殖期和无性生殖期的复杂生命周期。

用于检测隐孢子虫属的已知方法包括被称作“方法1622”和“方法1623”的抗体染色法。这些方法具有若干缺点，包括：分析的主观性、所述方法无法辨别隐孢子虫的物种、以及显微分析的劳动强度大且耗费时间。其他方法或是缺乏灵敏度或特异性，或是需要昂贵的设备和技术专业人员才能进行。

因此，需要有一种灵敏且具有特异性的分析可用以测定试样中的隐孢子虫生物体的存在，特别是人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫生物体。然而，更特别的是，已知物种的隐孢子虫——人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫，对于人类具有临床意义。因此，就人类健康而言，需要有效的方法用于在水、粪便、食品或其他样品介质中，对人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫进行特异性检测。

发明内容

本发明提供了一种对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行检测的方法，所述方法包括将所述试样与下列引物接触：

(i)第一外侧引物和第二外侧引物，其中第一外侧引物与邻近靶DNA序列5′端的区域互补，第二外侧引物与邻近靶DNA序列3′端的区域互补；以及

(ii)第一内侧引物和第二内侧引物，其中每条内侧引物包含两条不同的序列，所述序列对应于所述靶DNA序列的正义序列和反义序列；并且

进行自循环链置换DNA合成(auto-cycling strand displacement DNAsynthesis)，并检测所扩增后的靶DNA的存在，其中所述靶DNA序列实质上为人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的保守DNA序列。

该检测可以是定性的，例如，可用嵌入dsDNA的荧光染料SYTO-9进行检测；该检测也可以是定量的，例如使用浊度(turbidity)(Mori，2004 J Biochem Biophys Methods，59：145-157)或嵌入染料(Aoi，2006J Biotechnol，125：484-491)。

所述自循环可在DNA聚合酶的存在下进行。

所述DNA聚合酶可为链置换活性高的DNA聚合酶。

所述保守的靶DNA序列可以编码肌动蛋白。

所述自循环链置换DNA合成可为环介导等温扩增(“LAMP”)方法。

所述自循环链置换DNA合成可以包括热变性步骤、反应步骤和终止步骤。所述热变性步骤可在约95℃发生约5分钟。所述反应步骤可在约60℃-66℃发生约35分钟-120分钟。所述终止步骤可在约80℃发生约2分钟-10分钟。

所述方法可包括将扩增后的靶DNA与杂交分析探针接触，所述探针在严格杂交条件下优先与扩增后的靶DNA或其补体杂交，从而形成用于检测的稳定的探针：扩增后的靶DNA序列或其补体(probe：amplified target DNA sequence，or complement thereof)的杂交体；以及检测所述探针：扩增后的靶DNA序列或其补体的杂交体的存在。

本发明还提供了用于在扩增分析中对人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行检测的扩增引物。所述扩增引物可含有至少10个相邻碱基的区域，所述碱基区域与SEQ ID NO1-4任一序列中存在的至少10个相邻碱基的区域至少80％一致(优选至少90％一致，更优选100％一致)：

caagatgtgttttcccatcga                               SEQ ID NO：1

cctctggagcaacacgtaat                                SEQ ID NO：2

ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg         SEQ ID NO：3

cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc   SEQ ID NO：4；

其中n可为连接体或不存在。所述连接体可为若干个核苷酸碱基，例如tttt。

本发明的扩增引物可以成套使用至少两条扩增引物。本发明还另外考虑了包含稳定的核酸双螺旋的组合物，所述核酸双螺旋在上述扩增引物和每一引物的靶DNA序列之间在扩增条件下形成。

本发明还提供了用于测定试样中是否存在人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的杂交探针，所述探针优选含有至少10个相邻碱基的区域，所述区域与存在于SEQ ID NO 1-4任一序列中的至少10个相邻碱基的区域至少80％一致(优选至少90％一致，更优选100％一致)。这些探针可优先与靶核酸在严格杂交分析条件下杂交，所述靶核酸与人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种至少80％互补(优选至少90％互补，更优选100％互补)，且不与源自非人隐孢子虫、非小球隐孢子虫和非火鸡隐孢子虫的核酸互补。

所述探针可包含可检测的标记。所述标记可以是任意适合的标记物质，包括放射性同位素、酶、酶辅因子、酶底物、染料、半抗原、化学发光分子、荧光分子、燐光分子、电化学发光分子、发色团、无法与靶核酸稳定杂交的碱基序列区域，但不限于此。

扩增后的靶DNA可用电泳方法检测。电泳方法可为毛细管电泳方法和凝胶电泳方法。扩增后的靶DNA可用Southern印迹或测序检测。阳性LAMP反应的检测可通过反应终点可视化进行。由于LAMP反应产生的大量DNA，可观察到副产物白色沉淀。该沉淀为焦磷酸镁。该沉淀可与浊度增加有关，可作为检测阳性反应的另一种手段，例如使用浊度计。其可为实时测定或终点测定。可视化LAMP反应结果的进一步的手段为加入SYBR Green，其中阳性反应一经混合会变为亮绿色，而阴性反应会保持橙色(Iwamoto，2003，J Clin Microbiol，41：2616-2622)。

另一种检测阳性LAMP反应的方法可使用向反应终点加入低分子量的聚乙烯亚胺进行。这会与所存在的任何扩增后的DNA产生不溶性复合物。除标准LAMP引物外，可加入已标记的探针(Mori，2006 BMCBiotechnol，6：3)。

本发明还提供了鉴别人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的至少一个保守核酸序列的方法，所述保守核酸序列可用于根据本发明对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的保守靶DNA序列的存在进行检测的方法。在一个实施方式中，所述方法包括鉴别至少两个保守核酸序列，所述保守核酸序列可用于根据本发明对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的保守靶DNA序列的存在进行检测的方法。在一个实施方式中，所述方法包括鉴别至少三个保守核酸序列，所述保守核酸序列可用于根据本发明对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的保守靶DNA序列的存在进行检测的方法。在一个实施方式中，所述方法包括鉴别至少四个保守核酸序列，所述保守核酸序列可用于根据本发明对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的保守靶DNA序列的存在进行检测的方法。在另一个实施方式中，所述方法包括鉴别至少一个与选自下述序列的序列互补的序列：

caagatgtgttttcccatcga                              SEQ ID NO：1

cctctggagcaacacgtaat                               SEQ ID NO：2

ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg        SEQ ID NO：3

cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc  SEQ ID NO：4

其中所述至少一个与选自SEQ ID NO：1-4的序列互补的序列可用于根据本发明对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的保守靶DNA序列的存在进行检测的方法。所述保守核酸序列可编码肌动蛋白或部分肌动蛋白。

n可为连接体或不存在。所述连接体可为若干个核苷酸碱基，例如tttt。

本发明还提供了用于测定试样中是否存在人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的试剂盒。

所述试剂盒可包含至少一个本发明所述的杂交探针，并任选包含用于对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行检测的书面说明。

所述试剂盒可包含至少一个本发明所述的扩增探针。

所述试剂盒可包含至少一个本发明所述的杂交探针以及至少一个本发明所述的扩增探针。本发明还考虑了用于扩增本发明所述靶DNA序列的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个本发明所述的扩增引物，并任选包含用于扩增核酸的书面说明。在一个优选的实施方式中，所述试剂盒将会进一步包含核苷酸和/或至少一种扩增所需的酶。

本领域技术人员将会明了的是，根据所需的特异性程度，本发明所述的杂交分析探针可用作扩增引物或捕获探针，本发明所述的扩增引物可用作杂交分析探针或捕获探针。

在整个申请文件中，单词“包括”或其变体例如“包含”或“含有”将被理解为下述含义：内含所述元素、整体或步骤、或是元素、整体或步骤的组，但不排除任何其他元素、整体或步骤、或是元素、整体或步骤的组。

本文所引用的全部参考文献都全文引入本文作为参考。独立地看，这些参考文献的引入不应被解释为：本发明人断言或承认全部这些参考文献的内容的任何部分或任何特定的参考文献被认为是满足专利申请任何法定公开要求的必要材料。

对于本申请文件中包括的文件、法令、材料、装置或制品等的任何讨论其目的仅在于为本发明提供上下文背景。其不应被视为承认：任何或全部这些事项由于其先于本申请优先权日存在，所以构成现有技术基础的一部分或是成为本发明相关领域的公知常识。

在下述附图的辅助下，通过对将要阐释的本发明非限制性实施方式的描述，将会展现本发明的其他特征和优点。

附图说明

图1：人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的核苷酸序列，与LAMP引物(终止碱基处用带有箭头的虚线表示)进行序列比对。

图2：使用ds-DNA结合染料SYTO-9的LAMP反应的实时扩增曲线。

图3：通过1.5％琼脂糖凝胶电泳的LAMP反应。1.人隐孢子虫6149；2.小球隐孢子虫IOWA；3.火鸡隐孢子虫CZ-B1-32；4.贝氏隐孢子虫CZ-B1-15；5.安氏隐孢子虫CZ-B1-52；6.无DNA；M.100bp梯。

具体实施方式

本发明提供了用于特异性检测水、粪便、食品或其他关于人类健康的样品介质的试样中小球隐孢子虫、人隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的有效方法。

定义

除非明确指定具有不同含义，下述术语具有所指定的含义：

“检测存在或不存在”用于表示存在或不存在隐孢子虫属的临床上可接受标准的意思。

“核酸扩增”或“靶向扩增”是指增加具有至少一个靶核酸序列的核酸分子的数目。本发明所述的靶向扩增可为线性的或指数性的，但优选指数性扩增。

“监测”用于表示系统性地检查或检验存在或不存在隐孢子虫属的意思。

“严格杂交分析条件”、“杂交分析条件”、“严格杂交条件”或“严格条件”是指下述条件：允许杂交分析探针优先与靶核酸(隐孢子虫属生物体所特有的核酸)而非源自密切相关的非靶微生物核酸杂交。严格杂交分析条件可根据包括探针的GC含量和长度、探针序列与可存在于试样中的非靶序列的序列之间的相似程度、以及靶序列在内的参数进行变化。杂交条件包括杂交试剂或溶液的温度和组成。

“靶核酸序列”、“靶核苷酸序列”、“靶序列”或“靶区域”是指特异性的脱氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，其包含单链核酸分子的全部或部分核苷酸序列。

“靶核酸”或“靶”是指包含靶核酸序列的核酸。

本发明的特点是分离后的核酸分子，所述核酸分子可用于测定属于隐孢子虫属的生物体是否存在于例如水、粪便、食品或其他样品介质的试样中，特别是对水、粪便、食品或与人类健康有关的其他样品介质的试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行测定。

对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多 种的存在进行检测的方法

本发明提供了一种对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行检测的方法，所述方法包括将所述试样与下列引物接触：

(i)第一外侧引物和第二外侧引物，其中第一外侧引物与邻近靶DNA序列5′端的区域互补，第二外侧引物与邻近靶DNA序列3′端的区域互补；以及

(ii)第一内侧引物和第二内侧引物，其中每条内侧引物包含两条不同的序列，所述序列对应于所述靶DNA序列的正义序列和反义序列；并且

进行自循环链置换DNA合成，并检测所扩增后的靶DNA的存在，其中所述靶DNA序列实质上为人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的保守DNA序列。

该检测可以是定性的，例如，可用嵌入dsDNA的荧光染料SYTO-9进行检测；该检测也可以是定量的，例如使用浊度(turbidity)(Mori，2004 J Biochem Biophys Methods，59：145-157)或嵌入染料(Aoi，2006J Biotechnol，125：484-491)。

所述自循环可在DNA聚合酶的存在下进行。

所述DNA聚合酶可为链置换活性高的DNA聚合酶。

所述保守的靶DNA序列可以编码肌动蛋白或部分肌动蛋白。

所述自循环链置换DNA合成可为环介导等温扩增(“LAMP”)方法。

所述自循环链置换DNA合成可以包括热变性步骤、反应步骤和终止步骤。所述热变性步骤可在约95℃发生约5分钟。所述反应步骤可在约60℃-66℃发生约35分钟-120分钟。所述终止步骤可在约80℃发生约2分钟-10分钟。

所述方法可包括在严格杂交条件下将扩增后的靶DNA与杂交分析探针接触，所述探针优先与扩增后的靶DNA或其补体杂交，从而形成用于检测的稳定的探针：扩增后的靶DNA序列或其补体的杂交体；以及检测所述探针：扩增后的靶DNA序列或其补体的杂交体的存在。

扩增引物

本发明还提供了用于在扩增分析中对人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行检测的扩增引物。所述扩增引物可含有至少10个相邻碱基的区域，所述碱基区域与SEQ ID NO1-4任一序列中存在的至少10个相邻碱基的区域至少80％一致(优选至少90％一致，更优选100％一致)：

caagatgtgttttcccatcga                              SEQ ID NO：1

cctctggagcaacacgtaat                               SEQ ID NO：2

ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg        SEQ ID NO：3

cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc  SEQ ID NO：4.

n可为连接体或不存在。连接体可为若干个核苷酸碱基，例如tttt。

本发明的扩增引物可以成套使用至少两条扩增引物。本发明还另外考虑了包含稳定的核酸双螺旋的组合物，所述核酸双螺旋在上述扩增引物和每一引物的靶DNA序列之间在扩增条件下形成。

所述扩增引物可包含至少10个相邻碱基的区域，所述区域与存在于SEQ ID NO 1-4任一序列中的10个相邻碱基的区域至少80％同源(优选至少90％同源，更优选100％同源)。本发明的扩增引物可以成套使用至少两条扩增引物。本发明还另外考虑了包含稳定核酸双螺旋的组合物，所述核酸双螺旋在上述扩增引物和每一引物靶核酸的之间在扩增条件下形成。如果将所述扩增引物设计用以开始RNA合成，所述引物可包含与所述靶序列不互补但被RNA聚合酶(例如T7、T3或SP6RNA聚合酶)识别的碱基序列。本发明的扩增引物可包含被修饰以防止或减少引物延伸速率或延伸量的3′端。(McDonough等人，“Methods of Amplifying Nucleic Acids Using Promoter-Containing Primer Sequence，”美国专利No.5,766,849，公开了具有经修饰或封闭的3′端的引物和启动子-引物)。当本发明的扩增引物可由化学合成或由载体衍生时，其并非天然存在的核酸分子。

同LAMP反应试剂一起，本发明所述的扩增引物可应用于卵囊、粪便或水样品的粗品制备物，并且在这些条件下评价所述反应的进行。根据本领域普通技术人员已知的分离方法，可通过浓缩将卵囊从水中分离出来用于释放DNA。然后，使用LAMP的扩增可用于对人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行检测。环介导等温扩增(“LAMP”)为不需要热循环的DNA扩增方法(Notomi等人，2000)。其利用具有链置换活性的DNA聚合酶以及至少四个引物的引物组，所述引物对于靶DNA上的六个区域具有特异性。可在等温条件(例如60℃-65℃)下进行高度灵敏且高度特异性的LAMP反应，通常少于一小时。

可检测的探针

本发明还提供了可检测的探针，用于测定试样中是否存在人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种，所述探针优选含有至少10个相邻碱基的区域，所述区域与存在于SEQ ID NO 1-4任一序列中的至少10个相邻碱基的区域至少80％一致(优选至少90％一致，更优选100％一致)。这些探针可优先与靶核酸在严格杂交分析条件下杂交，所述靶核酸与人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种至少80％互补(优选至少90％互补，更优选100％互补)，且不与源自非人隐孢子虫、非小球隐孢子虫和非火鸡隐孢子虫的核酸互补。

所述探针可包含可检测的标记。所述标记可以是任意适合的标记物质，包括放射性同位素、酶、酶辅因子、酶底物、染料、半抗原、化学发光分子、荧光分子、燐光分子、电化学发光分子、发色团、无法与靶核酸稳定杂交的碱基序列区域，但不限于此。

本发明所述可检测的探针除所述靶结合区的碱基序列外，还可包含一个或多个碱基序列，所述一个或多个碱基序列在严格条件下不与源自人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的核酸稳定结合。额外的碱基序列可由任意所希望的碱基序列组成，只要其不与源自靶生物体的核酸在严格条件下稳定结合或是不阻止所述探针与所述靶核酸稳定杂交即可。举例来说，额外的碱基序列可构成捕获探针的固定化的探针结合区，其中所述固定化的探针结合区由例如3′聚dA(腺嘌呤)区域组成，所述3′聚dA(腺嘌呤)区域与聚核苷酸的5′聚dT(胸腺嘧啶)区域在严格条件下杂交，所述聚核苷酸直接或间接地结合至固体支持物。额外的碱基序列也可为被RNA聚合酶识别的5′序列，或由RNA聚合酶(例如T7启动子)增强起始作用或延伸作用。如果第一序列被引入到例如“分子信标(Molecular Beacon)”探针，可包含多于一个额外的碱基序列。分子信标公开于Tyagi等人的“Detectably Labeled Dual Conformation Oligonucleotide Probes，Assays and Kits，”美国专利No.5,925,517中，并且包含被两个碱基序列结合的靶结合区，所述碱基序列具有至少部分彼此互补的区域。额外的碱基序列可直接连接至所述靶结合区，或是例如通过非核苷酸连接体的手段。

本发明所述可检测的探针可包含与其靶核酸序列完全互补的碱基序列，从而形成探针：靶的杂交体，所述杂交体对于在严格杂交分析条件下的检测是稳定的。本领域普通技术人员将会理解的是，杂交探针为分离后的核酸分子或其类似物，处于若无人工介入则无法在自然界中发现的形式(例如与外源核酸重组，分离后的，或纯化至某一程度)。

本发明所述可检测的探针可在所靶向的区域外包含额外的核苷或核苷碱基，只要所述核苷或核苷碱基在严格杂交条件下不阻止杂交，并且对于杂交分析探针的情况，不阻止优选与靶核酸杂交。还可包含用于促进检测和/或扩增的非互补序列，例如靶捕获序列(通常为均聚物段，例如聚-A尾、聚-T尾或聚-U尾)、启动子序列、RNA转录的结合位点、限制性核酸内切酶识别位点、或带来所希望的二级结构或三级结构的序列，例如催化活性位点或发夹结构。本发明所述可检测的探针可通过本领域普通技术人员已知的技术产生，例如通过化学合成，以及通过来自重组核酸分子的体外或体内表达。

本领域技术人员将会明了的是，杂交是指两条完全或部分互补的核酸链在指定的杂交分析条件下以平行取向或优选反平行取向结合在一起以形成具有双链区域的稳定结构的能力。这一双链结构的两条组成链(有时称作杂交体)通过氢键保持在一起。尽管这些氢键通常在单一核酸链上含有碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(A和T或U)或是胞嘧啶和鸟嘌呤(C和G)的核苷酸之间形成，但在并非“规范(canonical)”碱基对成员的这些碱基之间也可形成碱基对。非规范碱基配对是本领域公知的。(请参见例如Roger L.P.Adams等人，The Biochemistry of the Nucleic Acids(第11版，1992))。

尽管不必要，所述探针优选包含可检测的标记或相互作用的标记组。所述标记可为任意适合的标记物质，包括放射性同位素、酶、酶辅因子、酶底物、染料、半抗原、化学发光分子、荧光分子、燐光分子、电化学发光分子、发色团、在上述条件下无法与靶核酸稳定杂交的碱基序列区域以及上述的混合物，但不限于此。在一个特别优选的实施方式中，所述标记为吖啶酯(AE)，优选4-(2-琥珀酰亚胺基氧羰基乙基)-苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐(以下称为“标准物AE”)。相互作用的标记组包括酶/底物、酶/辅因子、荧光剂/猝灭剂、荧光剂/加合物、染料二聚体以及Forrester传能对(energy transfer pair)，但不限于此。

捕获探针

本领域技术人员将会意识到，“捕获探针”为寡核苷酸或一组连接在一起的至少两个寡核苷酸，所述寡核苷酸能够与靶核酸以及与固定化的探针杂交，从而提供将试样中的靶核酸固定并分离的手段。与靶核酸杂交那部分捕获探针被称为“靶结合区”，与固定化的探针杂交的那部分捕获探针被称为“固定化的探针结合区”。尽管优选的捕获探针在分析条件下同时与靶核酸和固定化的探针均杂交，但所述靶结合区和固定化的探针结合区可被设计在不同的杂交条件下与其各自的靶序列杂交。这样，所述捕获探针可被设计以使其首先在更有利的溶液动力学下与靶核酸杂交，然后将条件调节至允许固定化的探针结合区与固定化的探针杂交。当靶结合区和固定化的探针结合区被设置于同一捕获探针上时，它们可在同一寡核苷酸上直接互相邻接，也可被一个或多个任选经修饰的核苷酸彼此分开，或者可通过非核苷酸连接体的手段彼此连接。所述“靶结合区”为在分析条件下，与存在于靶核酸中的靶序列、所述靶序列的DNA或RNA等价物、或所述靶序列的补体稳定结合的那部分寡核苷酸。所述分析条件可为严格杂交条件或扩增条件。

“固定化的探针结合区”在本文中理解为在分析条件下与固定化的探针杂交的那部分寡核苷酸。

“固定化的探针”在本文中理解为用于将捕获探针连接至固定化的支持物上的寡核苷酸。通过在将捕获探针与靶核酸和固定化的探针杂交的所用条件下保持稳定的键或相互作用，将所述固定化的探针直接或间接地连接至固体支持物，无论那些条件相同还是不同。所述固定化的探针促进了将已结合的靶核酸从样品中未结合的材料中分离。

本发明提供了包含至少一个寡核苷酸的捕获探针，所述寡核苷酸含有固定化的探针结合区和靶结合区。所述捕获探针的固定化的探针结合区可由在严格条件下能够与寡核苷酸稳定杂交的任何碱基序列组成，所述寡核苷酸与存在于试样中的固体支持物结合。所述固定化的探针结合区可为聚dA，位于捕获探针3′端的均聚物尾。结合至固体支持物的寡核苷酸可包含5′聚dT尾，所述5′聚dT尾具有在分析条件下稳定结合至捕获探针聚dA尾的足够长度。所述固定化的探针结合区可包含长度约30个腺嘌呤的聚dA尾，所述捕获探针包含长度约3个胸腺嘧啶的间隔区，用于使靶结合区和固定化的探针结合区彼此连接。

捕获探针的靶结合区可稳定结合至存在于核酸中的靶序列，所述核酸源自人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种。

捕获探针的靶结合区可包含与选自SEQ ID NO 1-4所组成的组中的碱基序列至少约85％互补(优选至少约90％互补，更优选至少约95％互补，最优选100％互补)的碱基序列区域。

为避免不希望的交叉杂交反应，所述捕获探针可不包含靶结合区的核苷酸碱基序列以外的核苷酸碱基序列，所述核苷酸碱基序列在分析条件下可与可存在于试样中的、源自任何生物体的核酸稳定结合。与这一方法相一致，并且为了将所形成的捕获探针：靶复合物的固定化作用最大化，固定化的探针结合区的核苷酸碱基序列可被设计使其在分析条件下与存在于固定化的探针中的核苷酸碱基序列稳定结合，并且不与可存在于试样中的、源自任何非人隐孢子虫、非小球隐孢子虫和非火鸡隐孢子虫生物体的核酸稳定结合。

可选择捕获探针的靶结合区和固定化的探针结合区，从而使捕获探针：靶复合物的T_m高于捕获探针：固定化的探针复合物的T_m。这样，可施加第一组条件促进捕获探针与靶序列而非固定化的探针杂交，从而捕获探针与靶序列的杂交为提供最佳的液相杂交动力学。一旦经过了足够的时间使得捕获探针与靶序列杂交，再施加第二组相对不严格的条件，使得捕获探针与固定化的探针杂交。

本发明所述的捕获探针还可包含标记或一对相互作用的标记用于直接检测试样中的靶序列。标记、标记组合以及对探针进行标记的手段的非限制性实例是本领域技术人员公知的。

所述固定化的探针可连接至带磁颗粒，一旦所述探针经过足以与样品中存在的靶核酸杂交的时间，所述带磁颗粒可在纯化步骤期间在反应器皿中分离(Acosta等人，“Assay Work Station，”美国专利No.6,254,826，公开了进行这一纯化步骤的仪器)。所述捕获探针可被设计使得捕获探针：靶的杂交体的熔解温度高于捕获探针：固定化的探针的杂交体的熔解温度。这样，可使用不同组的杂交分析条件促进捕获探针与靶核酸的杂交先于捕获探针与固定化的寡核苷酸的杂交，从而将游离探针的浓度最大化，并提供有利的液相杂交动力学。这一“两步骤”的靶捕获方法公开于Weisburg等人的美国专利No.6,110,678。其他可容易地适应于本发明的靶捕获方案是本领域公知的，包括但不限于下列内容中公开的方案：Dunn等人，Methods in Enzymology，“Mapping viral mRNAs by sandwich hybridization，”65(1)：468 478(1980)；Ranki等人，美国专利No.4,486,539；Stabinsky，美国专利No.4,751,177；以及Becker等人，美国专利No.6,130,038。

可检测的标记以及检测方法

探针/引物可包含可检测的标记。所述标记可以是任意适合的标记物质，包括放射性同位素、酶、酶辅因子、酶底物、染料、半抗原、化学发光分子、荧光分子、燐光分子、电化学发光分子、发色团、无法与靶核酸稳定杂交的碱基序列区域，但不限于此。可通过使用放射性标记的探针在Southern印迹法中进行探针作用。但也提供了其他探针技术的使用，例如通过用标记物将与靶序列互补的寡核苷酸进行标记，所述标记物例如生物素或荧光剂，具有阳性结果的结合标记物的存在；或通过在ELISA中用已知方式使用生物素标签作为活性剂或是通过荧光检测。

本发明提供了作为直接技术的原位检测方法，所述方法包括直接向扩增产物中并入标记。举例来说，报告分子例如地高辛[DIG]-dUTP或荧光素-dUTP可包含于扩增混合物中，并被并入扩增产物。然后，使用结合有碱性磷酸酶或过氧化物酶的抗-DIG的简易免疫化学步骤检测DIG标记的扩增产物。或者，荧光素标记的扩增产物可通过落射荧光显微术(epifluorescence microscopy)或免疫化学方法进行检测。

本发明还提供了用于检测的间接技术，其包括在PCR后将特异性标记的探针与扩增产物杂交。然后，所述探针上的标记可通过例如免疫化学方法或落射荧光显微术进行检测。

扩增后的靶DNA可通过电泳方法检测。所述电泳方法可为毛细管电泳方法、凝胶电泳法。扩增后的靶DNA可用Southern印迹或测序进行检测。阳性LAMP反应的检测可通过反应终点可视化进行。由于LAMP反应产生的大量DNA，可观察到作为副产物的白色沉淀。该沉淀为焦磷酸镁。该沉淀可与浊度增加有关，可作为检测阳性反应的另一种手段，例如使用浊度计。其可为实时测定或终点测定。可视化LAMP反应结果的进一步的手段为加入SYBR Green，其中阳性反应会在混合后变为亮绿色，而阴性反应会保持橙色(Iwamoto，2003，J Clin Microbiol，41：2616-2622)。

另一种检测阳性LAMP反应的方法可使用向反应终点加入低分子量的聚乙烯亚胺进行。这会与所存在的任何扩增后的DNA产生不溶性复合物。除标准LAMP引物外，可加入已标记的探针(Mori，2006 BMCBiotechnol，6：3)。

扩增后的DNA可通过任何可在不同长度的DNA中进行区分的方法直接检测。通过琼脂糖的电泳为用于分离、鉴别和纯化DNA片段的标准方法。DNA在凝胶中的位置可通过用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭染色直接测定。然后，可通过在紫外光下凝胶的直接检验来检测对应于扩增后的靶DNA预计长度的条带。

此外，可通过毛细作用将来自电泳后的凝胶中的DNA条带转移至膜支持物，然后用寡核苷酸探针间接检测。典型的转移方案包括：用碱溶液将凝胶中的DNA变性，例如0.4M NaOH、0.6M NaCl；然后，在缓冲液中中和，例如1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl，pH 7.5。然后，将所述凝胶用高离子强度的转移缓冲液例如1X SSC平衡，其中1X SSC为0.15MNaCl、0.015M柠檬酸钠。然后，可在转移缓冲液中，通过毛细作用印迹将经变性的DNA由凝胶转移至膜支持物。

通过使用标记的杂交探针，可检测被捕获在固体支持物(例如尼龙或硝化纤维膜)上的扩增后的DNA。所述探针可用放射活性标签或荧光标签进行标记，或是直接或间接地附着于酶分子。然后，在杂交条件下将结合在膜上的扩增后的靶DNA用所述探针进行培养。在杂交后，洗去过量探针。如果所述杂交探针是放射活性标记的，可通过放射自显影术或闪烁计数检测剩余的杂交后的探针。如果所述探针含有生物素或一些其他存在特异性结合分子(例如亲和素和抗体)的化学基团，然后可用附着于特异性结合分子的酶检测所述固定化的探针，所述酶例如附着于链霉亲和素的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

可通过用与非放射活性的5′地高辛(DIG)标记的寡核苷酸探针杂交进行检测。在杂交后，用高离子强度的缓冲液(例如5X SSC)在约70℃洗涤所述固体支持物。通过用结合至碱性磷酸酶的抗DIG抗体培养固体支持物，然后加入化学发光底物例如Lumigen-PPD(BoehringerMannheim)，可使洗涤后仍保留的固定化的杂交探针可视化。将所述支持物最终洗涤，密封于塑料包装中，并暴露于X射线胶片以检测任何化学发光。

鉴别人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的至少一个保守核酸序 列的方法

本发明还提供了鉴别人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的至少一个保守核酸序列的方法，所述保守核酸序列可用于根据本发明对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的保守靶DNA序列的存在进行检测的方法。在一个实施方式中，所述方法包括鉴别至少两个保守核酸序列，所述保守核酸序列可用于根据本发明对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的保守靶DNA序列的存在进行检测的方法。在一个实施方式中，所述方法包括鉴别至少三个保守核酸序列，所述保守核酸序列可用于根据本发明对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的保守靶DNA序列的存在进行检测的方法。在一个实施方式中，所述方法包括鉴别至少四个保守核酸序列，所述保守核酸序列可用于根据本发明对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的保守靶DNA序列的存在进行检测的方法。在另一个实施方式中，所述方法包括鉴别至少一个与选自下述序列的序列互补的序列：

caagatgtgttttcccatcga                              SEQ ID NO：1

cctctggagcaacacgtaat                               SEQ ID NO：2

ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg        SEQ ID NO：3

cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc  SEQ ID NO：4

其中所述至少一个与选自SEQ ID NO：1-4的序列互补的序列可用于根据本发明对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的保守靶DNA序列的存在进行检测的方法。所述保守核酸序列可编码肌动蛋白或部分肌动蛋白。

如果需要，所述方法可包括将试样与至少一个辅助探针接触的步骤。参见Hogan等人，“Means and Method for Enhancing Nucleic Acid Hybridization，”美国专利No.5,030,557。“辅助探针”在本文中应理解为下述寡核苷酸：所述寡核苷酸被设计以与靶核酸在不同于杂交分析探针基因座的基因座处杂交，从而提高所述探针与靶核酸杂交的速率，或是提高探针：靶的杂交体的熔解温度，或是同时提高两者。

试剂盒

本发明所述用于扩增并检测人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫生物体中的任意一种或多种的引物和/或探针可常规地包装为试剂盒。所述试剂盒可包含适量本发明所述的引物、或适量本发明所述的探针、或适量本发明所述的引物和探针。此外，试剂盒可含有适量的至少一种标准标准样品以及实质上不含目标原生动物的阴性对照样品，所述标准样品含有已知浓度的隐孢子虫属。

相比于此前的方法，本发明所述的方法和试剂盒具有许多优点，包括速度、灵敏度以及与扩增过程(例如PCR)相联系的特异性。此外，可将人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫与其他只感染非人动物宿主的隐孢子虫区分开。

所述试剂盒可包含至少一条本发明所述的杂交探针，并任选包含用于对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行检测的书面说明。

所述试剂盒可包含至少一条本发明所述的扩增探针。

所述试剂盒可包含至少一条本发明所述的杂交探针以及至少一条本发明所述的扩增探针。本发明还考虑了用于扩增本发明所述靶DNA序列的试剂盒，所述试剂盒包含至少一条本发明所述的扩增引物，并任选包含用于扩增核酸的书面说明。在一个优选的实施方式中，所述试剂盒将会进一步包含核苷酸和/或至少一种扩增所需的酶。

本发明所述的引物和/或探针可用于检测处于卵囊形式或其他形式的人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种，并且可常规地包装为试剂盒。所述试剂盒可包含适量的所述引物、或适量的所述探针、或适量的所述引物和探针。此外，试剂盒可含有适量的至少一种标准样品，所述标准样品含有已知浓度的、处于卵囊形式或其他形式的人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种。

所述试剂盒可包含至少一条本发明所述的杂交探针，并任选包含用于对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的一种或多种的存在或量进行测定的书面说明。

在另一个实施方式中，所述试剂盒可包含至少一条本发明所述的扩增探针。

所述试剂盒可包含至少一条本发明所述的杂交探针和至少一条本发明所述的扩增探针。

除杂交分析探针之外，所述试剂盒还可包含至少一条本发明所述的扩增引物。

除杂交分析探针之外，所述试剂盒还可进一步包含至少一条本发明所述的捕获探针。

除杂交分析探针之外，所述试剂盒还可包含上述捕获探针和至少一条上述扩增引物。

包含捕获探针的所述试剂盒可进一步包含固体支持物材料(例如，磁响应颗粒)，用于在试样中对捕获探针进行直接或间接的固定。

所述试剂盒可包含所需要的酶、三磷酸核苷酸以及本发明所述的探针和/或引物。所述三磷酸核苷酸以及本发明所述的探针和/或引物可作为冻干试剂提供。所述冻干试剂可在冻干之前进行预混合，从而当其复融(reconstitute)时形成各种组分具有适当比例的、完整的混合物，所述混合物已准备好用于所述分析。此外，所述试剂盒可含有用于对试剂盒中冻干后的试剂进行复融的复融试剂。

典型的包装材料将包括固体材料，例如玻璃、塑料、纸、箔或微粒等，所述材料能够在固定的范围内保持本发明所述的杂交分析探针、捕获探针、辅助探针和/或扩增引物。因此，举例来说，所述包装材料可包括玻璃小瓶，用于含有毫克以下(例如皮克或纳克)量所考虑的探针或引物，或者所述包装材料可为微量滴定板的孔，本发明所述的探针或引物操作性地附着于所述孔，即连接至所述孔从而能够参与本发明所述的扩增和/或检测方法。

所述说明将会有代表性地表明所述试剂和/或试剂浓度以及至少一个分析方法参数，所述参数可为例如相对于每单位样品所用试剂的相对量。此外，也可包含详细情况例如维护、时间期限、温度以及缓冲液条件。

所述试剂盒可包含本文所述的杂交分析探针、捕获探针和/或扩增引物，无论是单独提供还是以上述优选组合之一提供，用于对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在或量进行扩增和/或测定。

探针和引物的交叉功能(Cross-functionality)

本领域技术人员将会明了的是，根据所需要的特异性程度，本发明所述的杂交分析探针可用作扩增引物或捕获探针，本发明所述的扩增引物可用作杂交分析探针或捕获探针。

所述探针和/或引物可为DNA、相应的RNA和/或其类似物。核苷亚基的糖基可为核糖、脱氧核糖及其类似物，包括例如呋喃核糖基部分具有2′-O-甲基取代的核糖核苷。(用作杂交分析探针、辅助探针和/或扩增引物的、包含核苷亚基且具有2′取代的寡核苷酸公开于Becker等人，“Method for Amplifying Target Nucleic Acid Using Modified Primers，”美国专利No.6,130,038。)通过键(例如磷酸二酯键、修饰的键)或通过不阻止所述寡核苷酸与其互补靶核酸序列杂交的非核苷酸部分，可将所述核苷亚基进行连接。修饰的键包括将标准磷酸二酯键用不同的键替换的键，例如硫代磷酸酯键或甲基膦酸酯键。可通过例如用假的肽骨架替换DNA的天然磷酸脱氧核糖骨架来连接所述核苷碱基亚基，所述假的肽骨架例如2-氨基乙基甘氨酸骨架，其借助于羧甲基连接体将所述核苷碱基亚基偶联至中央的二级胺。(具有假的肽骨架的DNA类似物通常被称为“肽核酸”或“PNA”，其公开于Nielsen等人，“Peptide Nucleic Acids，”美国专利No.5,539,082。)本发明所考虑的核酸分子的其他非限制性实例包括含有双环核苷和三环核苷的核酸类似物，并且核苷酸类似物被称作“锁核酸”、“锁核苷类似物”或“LNA”。(锁核酸公开于Wang，“Conformationally Locked Nucleosides and Oligonucleotide，”美国专利No.6,083,482；Imanishi等人，“Novel Bicyclonucleoside and Oligonucleotide Analogues，”国际公开No.WO 98/39352；以及Wengel等人，“Oligonucleotide Analogues，”国际公开No.WO 99/14226。)假如修饰的寡核苷酸可在严格杂交分析条件或扩增条件下与靶核酸杂交，任何核酸类似物都在本发明考虑范围之内。对于杂交分析探针的情况，修饰的寡核苷酸必然也能够在严格杂交分析条件下优先与靶核酸杂交。

释放(liberating)试样中的核酸分子

本领域技术人员将会理解的是，当将上述任何方法应用于整个生物体而非源自所述生物体的核酸时，有必要在开始扩增链反应条件之前并入从所述生物体释放核酸的过程。本发明优选的形式提供了特定的过程，其中所测试的试样首先悬浮于培养基(例如缓冲液)中，然后在含有还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT))的缓冲液中超声处理或进行冻融循环，从而使生物体特别是其卵囊形式发生断裂，并释放出核酸。

使用这些本发明优选的方法，有可能实现检测或鉴别处于卵囊形式或其他形式的人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种。

所述超声作用或冻融过程可在培养基中进行，所述培养基将会形成全部或部分LAMP或探针培养基。可使用约11μm的峰间值方便地进行超声作用。或者，对于冻融过程，可将样品容器方便地浸入低温液体例如液氮。用于使细胞或卵囊结构破裂从而将核酸释放入LAMP或探针培养基的方法将会被本领域技术人员所知，并且可预见到在开始LAMP和/或探针过程之前应用。

也可用含有核酸的提取物进行随后的杂交和扩增过程，所述提取物来自孢囊、卵囊和/或感染后的细胞培养物。如果将所述提取物用于检测DNA，通过用无DNA酶的RNA酶A处理，可从裂解物中除去RNA。由卵囊和感染后的细胞培养物的DNA的进一步提纯可通过额外的提取步骤完成。举例来说，细胞可在下述溶液中裂解，并在37℃培养1h：所述溶液为50mM Tris-HCl、20mM EDTA，pH 8，其含有2mg/ml的蛋白酶K和0.5％肌氨酰(sarkosyl)。然后加入5M NaCl至最终浓度为1M，并加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)至浓度为1％。在65℃培养30min后，将裂解物进行至少一个冻融循环，然后进行苯酚/氯仿提取。通过加入0.6体积的异丙醇将所述DNA沉淀，然后将所述DNA沉淀用70％乙醇洗涤。本领域技术人员还将会明了的是，也可将DNA/RNA提取试剂盒用于在开始扩增链反应条件之前，从生物体释放核酸，所述试剂盒例如Epicentre MasterPure^TM和WaterMaster^TM试剂盒(EPICENTRE Biotechnologies)。

如果将所述提取物用于检测RNA，则可通过用无RNA酶的DNA酶处理将DNA从裂解物中除去。还可通过用强的变性剂(例如硫氰酸胍)进行提取，然后通过氯化铈溶液进行离心，从裂解后的细胞中分离出总RNA。此外，可用附着于寡dT的固态颗粒将mRNA分离，所述固态颗粒可选择具有聚(A)尾的mRNA转录物。

卵囊的回收

隐孢子虫属感染的诊断通常通过从粪便标本中回收隐孢子虫卵囊而确定。或者，可通过从水样品中浓缩隐孢子虫卵囊，提供对于通过污染的水传播隐孢子虫病的风险或证据所进行的评价。

可通过各种方法将隐孢子虫卵囊从水中进行浓缩。举例来说，可将预定体积的水(例如100升)通过1μ额定孔隙度的纱绕(yarn-wound)聚丙烯过滤器或其等同物进行过滤，将过滤流速限制为约4升/min。为了在24h内进行分析，装入样品的过滤器通常可装在冰上运至分析实验室。所保留的原生动物可在采集后96h内用经缓冲的洗涤剂溶液从所述过滤器上洗脱，用手或借助于拍打式匀浆器(stomacher)将过滤器纤维切开、拨动并洗涤。在洗脱液中回收的卵囊可通过离心浓缩，并通过在比重1.1的Percoll-蔗糖溶液上浮选而部分纯化。一部分经纯化的材料可置于膜过滤器上，使用间接染色的方法用抗体进行标记，然后在落射荧光显微镜下检验。可用于鉴别卵囊的具体标准包括免疫荧光、尺寸、形状和内部形态。

平板式(flatbed)膜过滤方法

这一方法源自由Ongerth和Stibbs原始记载的内容(Appl.Environ.Microbiol.53：672-676，1987)。可通过293mm直径的平板式过滤装置(Millipore)，以不超过4L/min的速率用蠕动水泵(Watson Marlow装置604S)对水样品进行浓缩，所述过滤装置含有2μm孔径的轨迹刻蚀聚碳酸酯膜(Osmonics，Massachusetts)。然后可将所述膜转移至修饰的有机玻璃片(Micronix，Sydney，Australia)上，用洗脱缓冲液No.1喷雾，然后将浓缩物用橡皮刮刀(Micronix)洗脱并收集于50mL离心管(Iwaki)中。这一洗脱过程可重复2-4次，然后可除去并弃去所述膜，并将所述有机玻璃片和刮刀用洗脱缓冲液进一步冲洗。然后，在4±2℃将过滤洗涤液以1620g离心10分钟。可吸出上清液而使小粒(pellet)保持5mL的体积，然后所述小粒可通过涡流搅拌重新悬浮。

通过先用洗涤剂溶液(Tergazyme，Alconox Inc.，White Plains，New York)、再用水进行反向冲洗，可在样品之间对所述平台式仪器进行清洗。将所述有机玻璃片和刮刀用洗涤剂清洗，然后用水冲洗。

在浓缩后，可用免疫磁性分离(IMS)和免疫荧光抗体染色对样品进行处理，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色来对卵囊进行证实。可对每一样品产生的整个小粒进行处理和检验。包装后的小粒的尺寸可为小于0.1mL至1mL的体积范围，大于0.5mL的小粒将被分为2次IMS测试(按照生产说明书)。

在即将进行IMS之前，可将EasySeed^TM(含有98±1.4个隐孢子虫卵囊和98±1.4个贾第虫(Giardia)孢囊)掺入一些样品，以定量与IMS和染色过程有关的损失。在加入至IMS管之前，可将EasySeed^TM小瓶涡流混合30s。然后将IMS试剂盒中的1毫升10x SL-缓冲液加入到所述小瓶中，涡流混合30s，再将洗出液加入至所述IMS管。然后将IMS试剂盒中的1毫升10x SL-缓冲液B加入到所述小瓶中，涡流混合30s，再倾倒入所述IMS管中。然后可向所述IMS管中加入样品浓缩物。

根据生产说明书，可用Dynabeads GC-Combo试剂盒(Dynal，Oslo)进行IMS，除了在酸解离步骤后，所述样品可立刻被转移至孔径0.8μm的13-mm聚碳酸酯膜过滤器(Nuclepore，Clifton，New Jersey)，所述过滤器固定在真空歧管(vacuum manifold)上。膜上的生物体可用甲醇处理1min，然后用80μL的DAPI(2μg/mL，PBS中)(Sigma-Aldrich)覆盖2min。可通过真空过滤除去DAPI，用200μL的EasyStain^TM洗涤缓冲液(BTF Pty Ltd)对膜进行洗涤，然后用80μL含有异硫氰酸荧光素标记的抗体的EasyStain^TM覆盖15min，所述抗体对于隐孢子虫和贾第虫具有特异性(Weir等人，2000 Clin.Diagn.Lab.Immunol.7(5)：745-750)。

全部染色可在室温下进行。然后可将所述膜转移至载玻片上，用EasyStain^TM固定介质(BTF Pty Ltd)，并用盖玻片密封。然后可通过落射荧光显微术对固定于载玻片上的膜进行检验。

全细胞内DNA或RNA的扩增

本领域技术人员将会明了的是，这一技术可应用于全细胞中核酸的原位检测，该技术记载于例如Prescott等人，1999，Lett.Appl.Microbiol.29：396-400。

实施例

实施例1：样品源和DNA纯化

从经纯化的卵囊样品中获得隐孢子虫DNA，所述样品源于培养物或粪便。将源自粪便的卵囊用QIAamp DNA Stool试剂盒(Qiagen，CA，USA)进行纯化，而将源自培养物的卵囊进行单独的PBS洗涤。将经纯化的卵囊悬浮于1x PCR缓冲液II(10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl)(Applied Biosystems，CA，USA)，通过血细胞计数器或细胞计数板进行计数，并进行五个冻融循环。然后将所述样品以10,000×g离心5min，将上清液转移至新的微离心管。然后将卵囊样品连续稀释(1∶2)至所希望的浓度，其范围为每份样品10,000-1当量的卵囊。

用于本研究的、此前通过其他分子技术鉴别的隐孢子虫物种或基因型为：人隐孢子虫分离物6149、6189、H270、H271、H273(未公开)；小球隐孢子虫IOWA、AZ-1；火鸡隐孢子虫CZ-B1-32(Ryan等人，2003)；安氏隐孢子虫CZ-B1-52(Ryan等人，2003)；贝氏隐孢子虫CZ-B1-15(Ryan等人，2003)；猫隐孢子虫(C.felis)100.22(未公开)；鸭隐孢子虫(C.galli)BE 13(Ng等人，2006)；猪隐孢子虫(C.suis)WA Pig6(Ryan等人，2003)；有袋类动物基因型II(未公开)；以及小鼠基因型II(未公开)。

本研究中所用的阴性对照为由粪便样品纯化并通过其他PCR方法鉴别的DNA，例如十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)(聚集体A、B和E)、俄亥俄等孢子球虫(Isospora ohioensis)、肉孢子虫属(Sarcocystis spp)、犬钩虫(Ancylostuma caninum)或刺猬绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)(数据未公开)。

实施例2：LAMP引物

为了对于隐孢子虫肌动蛋白基因具有特异性，对所述LAMP引物进行设计。将此前公开的序列(Sulaiman等人，2002)用BioEdit Version7.0.5.2(Hall，1999)进行序列比对，并且在比对和Eiken PrimerExplorer Version 3(http://primerexplorer.jp/e/)辅助下，手动设计一组LAMP引物。引物由Sigma-Proligo(NSW，Australia)商业合成。

表1：靶向小球隐孢子虫和人隐孢子虫基因的四个LAMP引物核苷酸序列

核苷酸位置编号基于人隐孢子虫TU502肌动蛋白序列，GenBankXM 661095(Xu等人，2004)。请注意每个只构成一个引物的FIP和BIP分别由两个分开的核苷酸区域组成：F1c和F2、以及B1c和B2。

实施例3：LAMP反应

25μl的LAMP反应混合物由下列组分组成：FIP和BIP内侧引物每种1.6μM、F3和B3外侧引物每种0.8μM、8U的Bst酶(New England Biolabs，MA USA)、1×ThermoPol反应缓冲液(New England Biolabs)、200μM的dNTP混合物(Fisher-Biotech，Western Australia)、0.8M的Betaine(Sigma-Aldrich，CA，USA)、3.34μM的SYTO9(Molecular Probes，OR USA)以及1μl经热变性的DNA模板(95℃，进行5分钟)。将所述反应混合物装入RotorGene 3000(Corbett Research，NSW Australia)，在FAM通道(在470nm处激发，在510nm处检测)上于60℃运行60min，每分钟进行30秒的荧光数据采集。对于荧光数据采集，包含三种增益设置(1、2以及4或5)。然后，通过在80℃培养5min将所述反应终止。

实施例4：扩增子(Amplicon)检测和分析

用两种不同的方法对通过LAMP反应扩增的DNA进行检测，所述方法为：实时荧光数据采集；以及在电泳后，于紫外光下仔细观察用溴化乙锭染色的1.5％琼脂糖凝胶。

为证实隐孢子虫LAMP引物已经扩增了所预期的靶，还对扩增子进行测序。简单来讲，将由人隐孢子虫6149模板获得的10μl LAMP反应后DNA进行凝胶电泳。然后，将经切除并纯化的约180bp的片段(图3)用下述引物进行PCR：

5′-aggtgttatggtaggtatg-3′FseqCrAct(SEQ ID NO：5)

以及

5′-agaaagtatgatgccagatc-3′BseqCrAct(SEQ ID NO：6)所述引物含有与重叠于LAMP启动子F2和B2序列的区域一致的序列。将扩增后的产物克隆入TOPO-TA载体(Invitrogen，CA，USA)，再转化为大肠杆菌(Escherichia coli)，从而在筛选后由克隆体获得序列。

实施例5：LAMP阳性的检测

为对于人隐孢子虫具有特异性，对LAMP引物进行设计，所述引物在所述BIP引物的5′端具有一个碱基对错配。然而在实践中，所述引物扩增了人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的靶向肌动蛋白基因，而未扩增所应用的任何其他DNA。通过所述的方法，对人隐孢子虫和小球隐孢子虫的检测进行大约30-35分钟，而对火鸡隐孢子虫的检测进行大约45分钟(图2)。所述LAMP反应未扩增提取自所测试的全部其他物种的DNA，包括其他隐孢子虫物种。所克隆的LAMP产物的序列产生了与人隐孢子虫6149一致的序列。

与实时的结果相一致，在用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶中也检测到了阳性LAMP反应。阳性LAMP反应产生了特征性的梯状外观(图3)，最小的条带其尺寸约为180bp。

本领域技术人员将会明了的是，如具体实施方式所示，可对本发明进行许多从广义上讲并未脱离本发明精神和范围的变型和/或修饰。因此，现有的实施方式在各个方面都应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (47)

1.一种对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行检测的方法，所述方法包括将所述试样与下列引物接触：

(i)第一外侧引物和第二外侧引物，其中所述第一外侧引物与邻近靶DNA序列5′端的区域互补，所述第二外侧引物与邻近靶DNA序列3′端的区域互补；以及

(ii)第一内侧引物和第二内侧引物，其中每条内侧引物包含两条不同的序列，所述序列对应于所述靶DNA序列的正义序列和反义序列；并且

进行自循环链置换DNA合成，并检测所扩增后的靶DNA的存在，其中所述靶DNA序列实质上为人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的保守DNA序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法为定性检测方法。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述检测用嵌入dsDNA的荧光染料进行。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述嵌入dsDNA的荧光染料为SYTO-9。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法为定量检测方法。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述检测用浊度或嵌入染料进行。

7.如权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中，所述自循环在链置换活性高的DNA聚合酶的存在下进行。

8.如权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中，所述保守的靶DNA序列编码肌动蛋白或部分肌动蛋白。

9.如权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中，所述自循环链置换DNA合成为环介导等温扩增(“LAMP”)方法。

10.如权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中，所述自循环链置换DNA合成包括热变性步骤、反应步骤和终止步骤。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述热变性步骤在约95℃进行约5分钟，所述反应步骤在约60℃-66℃进行约35分钟-120分钟，所述终止步骤在约80℃进行约2分钟-10分钟。

12.如权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中，所述方法包括将所述扩增后的靶DNA与杂交分析探针接触，所述杂交分析探针在严格杂交条件下优先与扩增后的靶DNA或其补体杂交，从而形成用于检测的稳定的探针：扩增后的靶DNA序列或其补体的杂交体；以及检测所述探针：扩增后的靶DNA序列或其补体的杂交体的存在。

13.如权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中，通过电泳方法对所述扩增后的靶DNA进行检测。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述电泳方法为毛细管电泳方法或凝胶电泳方法。

15.如权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中，通过Southern印迹或测序对所述扩增后的靶DNA进行检测。

16.如权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中，通过将沉淀的可视化对阳性LAMP反应进行检测。

17.如权利要求16所述的方法，其中，通过浊度增加对所述沉淀进行检测。

18.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述沉淀为焦磷酸镁。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述检测为实时测定或终点测定。

20.如权利要求1-19中的任一项所述的方法，其中，所述检测进一步包括通过加入SYBR Green将LAMP反应结果可视化。

21.如权利要求1-19中的任一项所述的方法，其中，所述检测包括向反应终点加入低分子量的聚乙烯亚胺。

22.一种鉴别人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的至少一个保守核酸序列的方法，所述保守核酸序列可用于权利要求1-21中的任一项所述的方法。

23.如权利要求22所述的方法，所述方法包括鉴别至少两个保守核酸序列，所述保守核酸序列可用于权利要求1-21中的任一项所述的方法。

24.如权利要求22或23所述的方法，所述方法包括鉴别至少三个保守核酸序列，所述核酸序列可用于权利要求1-21中的任一项所述的方法。

25.如权利要求22-24中的任一项所述的方法，所述方法包括鉴别至少四个保守核酸序列，所述核酸序列可用于权利要求1-21中的任一项所述的方法。

26.如权利要求22-25中的任一项所述的方法，其中，所述方法包括鉴别至少一个与选自下述序列的序列互补的序列：

caagatgtgttttcccatcga                              SEQ ID NO：1

cctctggagcaacacgtaat                               SEQ ID NO：2

ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg        SEQ ID NO：3

cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc  SEQ ID NO：4；

其中，n为连接体或不存在。

27.如权利要求26所述的方法，其中，所述连接体为一个或多个核苷酸碱基。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中，n为g。

29.如权利要求22-27中的任一项所述的方法，其中，所述保守核酸序列编码肌动蛋白或部分肌动蛋白。

30.一种在扩增分析中用于对人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行检测的扩增引物，所述扩增引物包含至少10个相邻碱基的区域，所述区域与存在于SEQ ID NO 1-4任一序列中的至少10个相邻碱基的区域至少80％一致：

caagatgtgttttcccatcga                              SEQ ID NO：1

cctctggagcaacacgtaat                               SEQ ID NO：2

ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg        SEQ ID NO：3

cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc  SEQ ID NO：4；

其中，n为连接体或不存在。

31.如权利要求30所述的扩增引物，其中，所述连接体为一个或多个核苷酸碱基。

32.如权利要求30或31所述的扩增引物，其中，n为g。

33.如权利要求30-32中的任一项所述的扩增引物，其中，所述扩增引物包含至少10个相邻碱基的区域，所述区域与存在于SEQ ID NO 1-4任一序列中的至少10个相邻碱基的区域至少90％一致。

34.如权利要求30-33中任一项所述的扩增引物，其中，所述扩增引物包含至少10个相邻碱基的区域，所述区域与存在于SEQ ID NO 1-4任一序列中的至少10个相邻碱基的区域100％一致。

35.一种用于测定试样中是否存在人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的杂交探针，其中，所述探针包含至少10个相邻碱基的区域，所述区域与存在于SEQ ID NO 1-4任一序列中的至少10个相邻碱基的区域至少80％一致：

caagatgtgttttcccatcga                              SEQ ID NO：1

cctctggagcaacacgtaat                               SEQ ID NO：2

ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg        SEQ ID NO：3

cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc  SEQ ID NO：4；

其中，n为连接体或不存在。

36.如权利要求35所述的杂交探针，其中，所述连接体为若干个核苷酸碱基。

37.如权利要求35或36所述的杂交探针，其中，n为c。

38.如权利要求35-37中任一项所述的杂交探针，其中，所述探针包含至少10个相邻碱基的区域，所述区域与存在于SEQ ID NO 1-4任一序列中的至少10个相邻碱基的区域至少90％一致。

39.如权利要求35-38中任一项所述的杂交探针，其中，所述探针包含至少10个相邻碱基的区域，所述区域与存在于SEQ ID NO 1-4任一序列中的至少10个相邻碱基的区域100％一致。

40.如权利要求35-39中任一项所述的杂交探针，其中，所述探针在严格杂交分析条件下优先与靶核酸杂交，所述靶核酸与人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种至少80％互补，且不与源自非人隐孢子虫、非小球隐孢子虫和非火鸡隐孢子虫的核酸互补。

41.如权利要求35-40中任一项所述的杂交探针，其中，所述杂交探针包含可检测的标记。

42.如权利要求41所述的杂交探针，其中，所述可检测的标记选自由下述物质所组成的组：放射性同位素、酶、酶辅因子、酶底物、染料、半抗原、化学发光分子、荧光分子、燐光分子、电化学发光分子、发色团以及无法与靶核酸稳定杂交的碱基序列区域。

43.一种用于测定试样中是否存在人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的试剂盒，所述试剂盒包含至少一条权利要求30-34所述的扩增探针。

44.如权利要求43所述的试剂盒，所述试剂盒包含至少一条权利要求35-42中任一项所述的杂交探针。

45.如权利要求43或44所述的试剂盒，所述试剂盒包含至少一条个权利要求30-34中任一项所述的扩增探针以及至少一条权利要求35-42中任一项所述的杂交探针。

46.如权利要求43-47中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含核苷酸和/或至少一种扩增所需的酶。

47.如权利要求41-43中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含书面说明，所述书面说明用于对试样中人隐孢子虫、小球隐孢子虫和火鸡隐孢子虫中的任意一种或多种的存在进行检测。

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