CN1908621A - 水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种检测技术领域的水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，通过采用微孔滤膜过滤，经乙酸乙酯和福尔马林为10∶1梯度分离，铁苏木和改良抗酸联合染色法检测水环境中隐孢子虫和贾第氏虫，通过膜滤前筛网水样预处理减轻后续镜检背景复杂性，通过铁苏木和改良抗酸染色法分别实现对贾第虫和隐孢子虫的染色。本发明可减轻贾第虫和隐孢子虫传统检测方法中背景较多杂质的干扰，提高形态结构特征的镜检确认准确度。

Description

水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法

技术领域

本发明涉及的是一种检测技术领域的方法，特别是一种水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法。

背景技术

贾第鞭毛虫和隐孢子虫是一类寄生于人和动物体内的肠道原虫。发达国家人类介水肠传播疾病的病因中，原虫是介水传播的主要原因之一。污染饮用水的主要原虫为肠贾第鞭毛虫和隐孢子虫。当前关于两虫最权威的美国EPA1623检测方法成本昂贵，实验条件要求高。如1623方法中涉及大量昂贵消耗品，如专用滤囊、免疫磁珠分离试剂盒、荧光染色试剂盒、DAPI等，这些都属于一次性消费品，且不可回收再利用。考虑到目前中国的具体国情，即：资金方面、实验室条件以及实验人员的技术水平都有限等，此方法在国内普通自来水厂无法得以推广实施。

经对现有技术文献检索发现，余贵英等(水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫检测方法的探讨.中国卫生检验杂志，Vol.14，No.5，2004)采用膜过滤一梯度分离-GiemSa染色、膜过滤一IMS一GiemSa染色对EPA1623《免疫磁分离荧光抗体法》的3个关键步骤一原虫滤囊过滤浓缩一磁抗体分离(IMS)一荧光抗体染色鉴定(IFA)做了适当的改进，并对原虫的染色特征，形态结构和回收率的检测进行了方法学的探讨和比较分析。其结果中：对于膜-IMS-GiemSa染色，由于滤囊改成了滤膜，荧光染色改成了Giemsa染色，成本比囊-IMS-IFA约降低了60％，同时实验条件要求也较低，不需要贵重仪器设备如荧光显微镜等，但必须由有工作经验的实验员观察结果，以减少误差，而且成本实际仍然较高；而膜-梯度分离-Giemsa染色是传统的检测方法，操作简便，成本很低，仅相当于囊-IMS-IFA的10％，但由于未经IMS的特异性分离，染片背景较复杂，有较多藻类及杂质干扰，形态结构特征的镜检确认有一定的难度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法。使其可减轻贾第虫和隐孢子虫传统检测方法中背景较多杂质的干扰，提高形态结构特征的镜检确认准确度。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明通过采用微孔滤膜过滤，经乙酸乙酯福尔马林(10∶1)梯度分离，铁苏木和改良抗酸联合染色法检测水环境中隐孢子虫和贾第氏虫，通过膜滤前筛网水样预处理减轻后续镜检背景复杂性，通过铁苏木和改良抗酸染色法分别实现对贾第虫和隐孢子虫的最佳染色。

包括如下具体步骤：

1)采集至少10L水样，24小时内运回实验室，4℃避光保存或立即过滤；

2)水样先用500目筛网过滤水样，然后用孔径3μm的滤膜进行抽滤；

3)抽滤结束后，将滤膜连同滤膜上的附着物放入三角瓶中并加入50mL清洗缓冲液；

4)用约5-10mL清洗缓冲液手洗滤膜，将滤膜上的附着物充分洗净，洗液全部收集到三角瓶中；

5)将装有滤膜及缓冲液的三角瓶置于振荡器上振荡15min，并重复三次。以使滤膜上的隐孢子虫卵囊与贾第鞭毛虫孢囊被释放出来；

6)振荡完成后，将三角瓶中的液体全部转入50mL离心管中，8000r/min离心15min；

7)离心结束后，取出离心管并小心吸去上层清液，吸去上清液时需非常小心，以免振荡到下层沉淀，若下层沉淀被振荡到，可考虑再次离心，但离心次数越少越好；

8)在离心管中加入1mL 10％福尔马林溶液，振荡，使沉淀和福尔马林溶液充分混匀；

9)再加入10mL乙酸乙酯至50mL离心管中，振荡离心管，使管内物质充分混匀；

10)将50mL离心管置于离心机中，3500r/min离心15min；

11)离心结束后取出离心管，离心管内液体此时分为2层，小心弃去上层；

12)吸取适量混和后的悬浮液涂于两片载波片上，晾干；

13)晾干后，滴加50μL无水乙醇固定涂片，室温干燥；

14)干燥后，一片用铁苏木素液染5-10min。然后加0.5％盐酸酒精脱色，水洗，晾干，最后用中性树胶封片，并用油镜观察并计数；

15)另一片先用染色液5-10min，接着水洗，然后滴加硫酸，1-10min，水洗，最后滴加溶液，1min后水洗，晾干，中性树胶封片，油镜观察并计数。

所述的染色液，是指：酸性复红4g，95％酒精20mL，石炭酸8mL，蒸馏水100ml；

所述的硫酸，是指：浓硫酸10mL，缓缓加入90mL蒸馏水中，边加边搅拌；

所述的溶液，是指：孔雀绿0.2g，溶于100mL蒸馏水。

采用本发明提供的检测方法可以有效减轻镜检背景杂质干扰，采用Giemsa染色虽对隐孢子虫和贾第氏虫染色效果均比较好，但铁苏木素染色对贾第氏虫的效果更好，并且操作比较简单，实验时间也比较短；而改良抗酸染色方法是对隐孢子虫效果更好的方法，采用改良抗酸染色隐孢子虫卵囊被染成红色，而其他的杂质为蓝绿色，很强的颜色对比，对最终隐孢子虫的确认有很大帮助。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。

实施例采用上海某污水厂出水水样。整个发明实现过程如下：

取污水厂出水10L水样，按具体实施步骤1-11操作后，将剩余的水层和沉淀充分混匀。分别吸取150μL混合后的液体涂于4片载波片上，晾干后滴加50μL无水乙醇固定涂片，室温干燥。干燥后分别进行Giemsa染色、抗酸染色、铁苏木染色和改良抗酸染色。不同染色方法比选实验结果如下表所示：

样次		1	2	3	4	5
							涂片1		3μm滤膜抽滤→福尔马林-乙酸乙酯1∶10梯度分离→Giemsa染色
结果	GC	+-	-+	+-	--	-+
							涂片2		3μm滤膜抽滤→福尔马林-乙酸乙酯1∶10梯度分离→抗酸染色
结果	GC	--	-+	+-	--	-+
							涂片3		3μm滤膜抽滤→福尔马林-乙酸乙酯1∶10梯度分离→铁苏木素染色
结果	GC	+-	-+	+-	--	+-
							涂片4		3μm滤膜抽滤→福尔马林-乙酸乙酯1∶10梯度分离→改良抗酸染色
结果	GC	-+	-+	+-	--	-+

注：“+”表示镜检观察到两虫，“-”表示没有观察到。G表示贾第鞭毛虫，C表示隐孢子虫。

实验结果显示：采用500目筛网预先将水样过滤后，镜检时视野杂质影响明显减轻。对于染色效果，5次实验中Giemsa染色效果较平均，对贾第鞭毛虫有2次检出，隐孢子虫也有2次；抗酸染色有对贾第鞭毛虫染色很差，只有1次检出，而对隐孢子虫染色效果较好，有2次检出；铁苏木染色对贾第鞭毛虫的检出率最高，有3次，但对隐孢子虫的检出率较差，只有1次；改良抗酸染色对贾第鞭毛虫染色较差，只有1次，但是对隐孢子虫的染色效果最好，有3次。

从四种染色结果看：Giemsa染色是一种对隐孢子虫和贾第氏虫染色效果均比较好的染色方法。两虫检出率处于四种染色方法中上水平。抗酸染色的效果对隐孢子虫和贾第氏虫都比较差，抗酸染色主要是针对抗酸杆菌。铁苏木素染色对贾第氏虫的效果最好，是检出率最高的染色方法，并且操作比较简单，实验时间也比较短。改良抗酸染色方法是对隐孢子虫效果最好的方法，但对贾第氏虫的效果很差。采用改良抗酸染色隐孢子虫卵囊被染成红色，而其他的杂质为蓝绿色，很强的颜色对比，对最终隐孢子虫的确认有很大帮助。因此采用铁苏木和改良抗酸联合染色要比同时采用Giemsa染色效果好。

采用本发明检测方法可有效改进传统病原学检测贾第虫和隐孢子虫方法。采用500目筛网预过滤水样可明显减轻镜检视野杂质的影响，采用铁苏木素染色和改良抗酸染色联合检测两虫效果优于单独采用Giemsa染色。

Claims (10)

1、一种水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，其特征在于，通过采用微孔滤膜过滤，经乙酸乙酯和福尔马林为10∶1梯度分离，铁苏木和改良抗酸联合染色法检测水环境中隐孢子虫和贾第氏虫，通过膜滤前筛网水样预处理减轻后续镜检背景复杂性，通过铁苏木和改良抗酸染色法分别实现对贾第虫和隐孢子虫的染色。

2、根据权利要求1所述的水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，其特征是，包括如下具体步骤：

1)采集≤10L的水样运回实验室保存；

2)水样过滤，抽滤；

3)将滤膜连同滤膜上的附着物放入瓶中并加入50mL清洗缓冲液；

4)用5-10mL清洗缓冲液手洗滤膜，将滤膜上的附着物充分洗净，洗液全部收集到瓶中；

5)将装有滤膜及缓冲液的瓶置于振荡；

6)将瓶中的液体全部转入离心管离心；

7)取出离心管、吸去上层清液；

8)在离心管中加入1mL 10％福尔马林溶液，振荡，使沉淀和福尔马林溶液充分混匀；

9)再加入10mL乙酸乙酯至50mL离心管中，振荡离心管，使管内物质充分混匀；

10)将离心管离心；

11)离心管内液体此时分为2层，弃去上层；

12)吸取适量混和后的悬浮液涂于两片载波片上，晾干；

13)晾干后，滴加50μL无水乙醇固定涂片，室温干燥；

14)干燥后，一片用铁苏木素液染色，然后脱色，水洗，晾干，最后用中性树胶封片，并用油镜观察并计数；

15)另一片先用染色液5-10min，接着水洗，然后滴加硫酸，1-10min，水洗，最后滴加溶液，1min后水洗，晾干，中性树胶封片，油镜观察并计数。

3、根据权利要求2所述的水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，其特征是，步骤1)中，采集的水样，24小时内运回，并且要求4℃避光保存。

4、根据权利要求2所述的水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，其特征是，步骤2)中，过滤是指水样先用500目筛网过滤水样；抽滤是指用孔径3μm的滤膜进行抽滤。

5、根据权利要求2所述的水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，其特征是，步骤5)中，振荡是指将瓶置于振荡器上振荡15min，并重复三次。

6、根据权利要求2所述的水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，其特征是，步骤6)中，离心是指8000r/min离心15min。

7、根据权利要求2所述的水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，其特征是，步骤7)中，吸去上清液时若下层沉淀被振荡到，则再次离心。

8、根据权利要求2所述的水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，其特征是，步骤10)中，离心是指置于离心机中3500r/min离心15min。

9、根据权利要求2所述的水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，其特征是，步骤14)中，用铁苏木素液染色5-10min，然后加0.5％盐酸酒精脱色。

10、根据权利要求2所述的水中贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊的检测方法，其特征是，步骤15)中，所述的染色液，是指：酸性复红4g，95％酒精20mL，石炭酸8mL，蒸馏水100ml；所述的硫酸，是指：浓硫酸10mL，加入90mL蒸馏水搅拌；所述的溶液，是指：孔雀绿0.2g，溶于100mL蒸馏水。