JP4956235B2 - 水中微生物の分離濃縮方法 - Google Patents
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Description
ろ過濃縮ステップでは、直径47mm又は90mm、ポアサイズ5μmの親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)ディスクフィルターを用い、加圧又は吸引式のフィルターホルダーに取付け試料をろ過する。
免疫蛍光染色、顕微鏡観察では、蛍光標識した抗クリプトスポリジウム抗体でクリプトスポリジウムを染色し、蛍光顕微鏡で観察する。
上記凝集剤は、鉄系凝集剤が好適であり、塩化第二鉄が特に好適である。
また、試料水の水温条件は第1工程から第3工程にわたって20℃から25℃の範囲に調節することが好適である。この範囲であれば、第3工程後の試料水から上澄み液を取り除きやすい大きさの体積でフロックを得ることができ、また、試料水中の水中微生物を効率よく回収することができる。
さらに、凝集沈殿物を溶解させる酸としては、塩酸が好適である。
また、本発明の分離濃縮方法を、上記のような微生物検出システムの分離濃縮部に適用し、濃縮試料中の検出対象微生物と特異的に結合する蛍光標識抗体と反応させ、蛍光強度を測定することで検出感度を高め、作業の自動化・省力化を図ることができ、水質の安全性を高めることができる。
分離濃縮処理手順
工程A:試料水中の100μm以上のゴミを除去する。
工程B:試料水の水温を分離濃縮処理に適した温度20〜25℃に調整する。
工程C:試料水中のクリプトスポリジウム等の水中微生物を炭酸カルシウム析出粒子中に包括固定する。
工程D:凝集剤を用いて炭酸カルシウムを核とした急速凝集沈殿を行い沈殿分離濃縮する。
工程E:上澄み液を除去し、沈殿物を酸により溶解する。
工程F:容器に回収する。
工程G:上澄み液の容器回収と中和処理を行う(廃液処理)。
工程Bにおいて、試料水の水温を20〜25℃に調整するのは、この範囲であれば、凝集沈殿後の上澄み液を取り除きやすい大きさの体積でフロックを得ることができ、また、試料水中の水中微生物を効率よく回収することができるからである。
工程Cでは、試料水に、塩化カルシウム溶液と、炭酸水素ナトリウム溶液とを添加し分散させる第1工程と、第1工程後の試料水に水酸化ナトリウム溶液を添加する第2工程とによって、析出する炭酸カルシウム粒子中にクリプトスポリジウム等の水中微生物を包括固定する。
工程Dでは、凝集剤を添加し、これによって、炭酸カルシウムの粒径を大きくし沈殿の沈降速度を上げ、短時間で上清と沈殿物を分離することできる。凝集剤としては、ポリ塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、塩化鉄、ポリ硫酸鉄等の無機系凝集剤、アルギン酸、ポリアクリル酸等の有機系凝集剤等を挙げることができるが、鉄系凝集剤が好適であり、塩化第二鉄が特に好適である。
次に、炭酸カルシウムを核とした急速凝集沈殿を行うが、凝集剤を添加した後、急速攪拌や、緩速攪拌を行うことが好ましい。
急速撹拌では凝集剤を試料中に短時間で均一に分散させ、試料中の夾雑物の表面の負電荷を中和し、表面電荷を中和された夾雑物同士が集塊を形成できるようにする必要がある。緩速撹拌では集塊を形成できるようになった夾雑物同士の接触を促し、フロックを成長させ沈降しやすくする。かつ、成長したフロックを崩壊させないような撹拌強度で撹拌する必要があるからである。
工程Eでは、水中微生物が吸着した沈殿物を酸で溶解し、担体のみを溶解する。
ここで、用いられる酸としては、スルファミン酸、塩酸等を挙げることができ、塩酸が好適である。
まず、図1に、上記微生物検出システムについて、その概要を示す。
検出対象微生物を分離濃縮する方法として、中空糸膜、メンブレンフィルター等のろ過による濃縮方法、抗体を結合させた免疫磁気ビーズによる濃縮方法等を挙げることができる。本実施の形態では、酸可溶性の担体に試料水中の検出対象微生物を吸着、凝集させ沈殿させている。すなわち、本発明に係る水中微生物の分離濃縮方法を適用している。
これにより、従来のメンブレンフィルターによるろ過や免疫磁気ビーズによる濃縮方法に比べ処理時間が短縮できる。また、特別な技能を必要とせず、試験者の負荷を低減し省力化でき、試料ごとの回収率の変動が小さいと考えられ、迅速な測定ができ、大量の試料を効率よく処理することができる。
酸可溶性の担体としては、酸可溶性の無機物質の微粒子が一般的である。このような無機物質としては、炭酸塩があり、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ストロンチウム、炭酸バリウムを挙げることができる。炭酸バリウムは毒性があり、炭酸マグネシウム及び炭酸ストロンチウムはそれらを生成させるためのマグネシウム塩類及びストロンチウム塩類の価格がカルシウム塩類のそれよりも高いため、炭酸カルシウムが最も好適である。
対象となる試料水としては、河川、湖沼等の環境水も含まれる。これらの環境水は、気候の変動によりその水温も変動する。このため、このような温度変化が酸可溶性担体の生成反応、検出対象微生物と酸可溶性担体との吸着反応、沈殿の沈降速度等の変動要因となる。これによって、検出対象微生物の回収率に影響を及ぼすおそれがある。特に、冬季のように水温が低い場合、酸可溶性担体の生成反応速度が低下し、検出対象微生物の回収率が低下するおそれがある。このため、上記した加温手段を設けることが好適である。
このような加温手段としては、最も一般的にはヒーターである。
なお、水温は20〜25℃に調整することが好適である。
凝集剤としては、ポリ塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、塩化鉄、ポリ硫酸鉄等の無機系凝集剤、アルギン酸、ポリアクリル酸等の有機系凝集剤等を挙げることができ、鉄系凝集剤が好適であり、塩化第二鉄が最も好適である。
ここで、用いられる酸としては、スルファミン酸、塩酸等を挙げることができ、塩酸が好適である。
そこで、酸で溶解して得られる試料液は、濃縮試料の塩濃度を下げる脱塩、及び/又は泡を取り除く脱泡を実施することができるように構成されている試料精製部104に送られる。
抗体反応部106では、検出対象微生物に特異的に結合し、かつ蛍光物質を結合させた蛍光標識抗体108と、濃縮試料中の検出対象微生物を抗原抗体反応により結合させる。このとき、1種類の蛍光標識抗体を用いる場合、夾雑物に非特異的に結合した蛍光標識抗体を擬陽性として判定してしまうおそれがある。このため、本発明に係る微生物検出システムでは、抗原認識部位の異なる複数の抗体を用意し、そのそれぞれに蛍光波長の異なる蛍光物質を結合した蛍光標識抗体108で検出対象微生物を多重標識(染色)する。これによって、検出対象微生物の検出精度を向上させるようにしている。
なお、抗体自体は、当業者にとって公知の手法によって得ることができる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などその種類を問わず、計数目定の特定微生物に特異性を有するものであれば用いることができるが、一般にモノクローナル抗体は特異性に優れているので好ましい。
また、抗体の蛍光標識に用いられる色素としては、蛍光を示す公知のものを使用することができる。
計測部110は、蛍光散乱光強度を測定するための蛍光散乱光計測器を備えている。計測部110では、該蛍光散乱光計測器によって、蛍光標識抗体が結合した検出対象微生物の蛍光散乱光強度を測定する。測定データは、判定部112に送られる。
一方、検出対象微生物が検出された場合、計測部110から排出された試料を保存容器に受け、保存する(図中120)。保存した試料は、混入している検出対象微生物が生存しているかの判定を行う試験及び/又は感染性があるかを判定する試験に供与することができる。なお、不要な試料は、排液として廃棄される(図中122)。
図2のシステム形態その1の分離濃縮部において、本発明の分離濃縮方法を適用できる。すなわち、システム形態その1では、以下の第1工程〜第4工程を、その順に従って実施する。
第1工程:試料水に塩化カルシウム溶液と、炭酸水素ナトリウム溶液とを添加し分散させる。
第2工程:炭酸カルシウム粒子を析出させるために、第1工程後の試料水に水酸化ナトリウム溶液を添加する。
第3工程:炭酸カルシウム粒子を凝集沈殿分離させるために、さらに凝集剤を添加し攪拌する。
第4工程:第3工程後の試料水から上澄み液を取り除き、得られた凝集沈殿物を酸により溶解させ濃縮試料水として回収する。
上記凝集剤は、鉄系凝集剤が好適であり、塩化第二鉄が特に好適である。
また、試料水の水温条件は、第1工程から第3工程にわたって20℃から25℃の範囲に調節することが好適である。
さらに、凝集沈殿物を溶解させる酸としては、塩酸が好適である。
本システム形態その1では、試料水1を試料水供給ポンプ2で濃縮タンク13に供給する。試料水1は、濃縮タンクへ供給される前にヒーター39により温度調整がなされ、冬期等で試料水の水温が低い場合、加温され一定温度に保たれる。水温は20〜25℃であることが好適である。もっとも、このような構成に限らず、濃縮タンクにヒーターを設置し、濃縮タンク内を加温し、一定温度に保つような構成を採用することもできる。加温された試料水を攪拌機14で攪拌しながら、続いて塩化カルシウム溶液3を塩化カルシウム供給ポンプ4で濃縮タンク13に供給する。そして、炭酸水素ナトリウム溶液5を炭酸水素ナトリウム供給ポンプ6で濃縮タンク13に供給する。
試料液中にはカルシウムイオン等の塩類が含まれ、塩酸によりpHが低下した状態にあるため、クリプトスポリジウムとクリプトスポリジウムを標識する蛍光標識抗体との結合の妨害になる。そこで、試料液を後の抗体反応部25に供給する前に、バルブ15を経由して、脱塩脱泡槽21に供給する。
なお、濃縮タンク13内は、洗浄水11を洗浄水供給ポンプ12で供給することによって洗浄することができるように構成されている。
捕捉フィルターとしては、クリプトスポリジウムを捕捉でき、高濃度の塩類を含む溶液を透過するポアサイズ1μm程度以下のフィルターが好適である。
これらのフィルターを用い、2段階で高濃度の塩類を含む溶液を除去する方法が好適である。
本システム形態その1では脱塩脱泡槽21に捕捉されたクリプトスポリジウムを、洗浄水22をポンプ23で供給することによって洗い流し、バルブ24を経由して抗体反応部25に供給する。
抗体混合槽26ではクリプトスポリジウムを特異的に認識する蛍光標識抗体28を、バルブ30を経由して蛍光標識抗体供給ポンプ29により注入し、試料と混合する。
本システム形態その1では1番目の試料と標識抗体が混合された後、洗浄水31をポンプ32によってバルブ33を経由して供給し、混合水として押し流し、抗体反応槽27に供給する。
次いで、その測定データを判定部40に送る。複数の蛍光標識抗体を用いる多重標識(染色)を行う場合、複数の蛍光波長を同時に測定できる計測部であることが好ましい。
判定部40では、計測器38によって検出された測定データをもとに試料保存の要否を判定する。
さらに、測定データをもとに環境水中に含まれるクリプトスポリジウムの混入レベルを把握し、この環境水を原水とする浄水プロセスにフィードバック制御を行うことができる。このときのクリプトスポリジウムの混入レベルに対する制御としては、取水停止や取水先切換え、配水池洗浄があり、凝集プロセスでは凝集剤添加量の変更や凝集助剤の添加、撹拌強度の変更が挙げられ、クリプトスポリジウムに対する浄水処理を適切に運用可能となる。
試料保存部43ではクリプトスポリジウムが検出された場合、計測部37から排出された試料を、分離器45で分離して保存容器44に受け、保存する。保存した試料は、混入しているクリプトスポリジウムが生存しているかどうかの判定及び/又は感染性があるかの判定を行うために、試験に供与することができる。保存の不要な試料は、排液として排出される。
次に、本発明の水中微生物の分離濃縮方法を採用し、特にクリプトスポリジウムを検出する微生物検出システムの実施の形態について、さらに別の形態(以下、システム形態その2)を図3に示す。
このため、試料をポンプ35にて計測器38に送り、測定を行った後、試料循環流路切換えリザーバー48に試料を一時貯留する。
次に、バルブ41を切替え、ポンプ42により試料水を、試料循環流路47をバイパスにして計測器38に循環させて、繰返し蛍光測定を行う。これによって、測定データを積分し、個数濃度の低い蛍光微粒子の検出確率を向上させる。
なお、本システム形態その2は、図2のシステム形態その1と他の構成は同様のものとすることができ、図3中、図2と同一参照番号の構成要素は、図2と同様の作用・効果を持つ。
次に、本発明の水中微生物の分離濃縮方法を採用し、特にクリプトスポリジウムを検出する微生物検出システムの実施の形態について、さらに別の形態(以下、システム形態その3)を図4に示す。
本システム形態その3では、測定データに基づいた判定部40の制御のもとバルブ45が動作し、オートサンプラー49に備えられた保存容器44に試料が順次保存される。オートサンプラー49は、図中の矢印Aの方向に回転しながら、複数の保存容器44に試料を順次分取する。
純水及び河川水の水温を10〜30℃まで5℃刻みで設定し、分離濃縮工程で形成されるフロックの体積とクリプトスポリジウムの回収率を比較した。フロック体積は、分離濃縮工程で生成した沈殿をメスシリンダーに移し、沈殿の体積を測定することで求めた。クリプトスポリジウムの回収率は、試料に一定個数のクリプトスポリジウムを添加し、分離濃縮工程、試料調整工程後に試料をクリプトスポリジウム標識抗体で染色し、蛍光顕微鏡で回収されたクリプトスポリジウムを計数することにより求めた。結果を図5に示す。
クリプトスポリジウムを含む沈殿を溶解する酸の検討では、クリプトスポリジウムの回収率とクリプトスポリジウム標識抗体によるクリプトスポリジウムの標識性能を比較し、回収率と標識性の観点から評価を行った。クリプトスポリジウムの回収率は、試料に一定個数のクリプトスポリジウムを添加し、分離濃縮工程、試料調整工程後に試料をクリプトスポリジウム標識抗体で染色し、蛍光顕微鏡で回収されたクリプトスポリジウムを計数することにより求めた。また、標識性は純水中で標識したクリプトスポリジウムの蛍光強度と比較し、それに近い蛍光強度を有する条件ほど標識性が良好と判断した。酸の濃度は1モル/L(1M)、又は1価の酸では1規定(1N)とし、濃度を統一した。結果を表1に示す。
凝集剤の塩化第二鉄がクリプトスポリジウムの回収において残留し、回収の妨害になっていると考え、無機の強酸及び有機酸による沈殿溶解の検討を行った。実施例4では塩酸を用い、添加量は30mLとしさらに沈殿を完全に溶解させるため10分間の溶解時間を設けた。その結果、クリプトスポリジウムの回収率は90%となり、また標識抗体の標識性も良好であることがわかった。実施例5では硝酸を用いたところ、標識性は良好であったがクリプトスポリジウムの回収率は41%となり、実施例4よりも低くなった。実施例6では硫酸を用いたが沈殿溶解時にカルシウムと結合し、不溶性の硫酸カルシウムが生成したため、回収率及び標識性ともに測定できず、沈殿溶解に適しないことがわかった。実施例7では有機酸で一般的に使用されているクエン酸を用いた。クリプトスポリジウムの回収率は77%と比較的高い値となったが、標識抗体で標識したクリプトスポリジウムの蛍光強度が低下することがわかり、沈殿溶解に適しないと判断した。以上の結果より、沈殿溶解用酸として塩酸が好適であることがわかった。
急速撹拌では凝集剤を試料中に短時間で均一に分散させ、試料中の夾雑物の表面の負電荷を中和し、表面電荷を中和された夾雑物同士が集塊を形成できるようにする必要がある。そのため、凝集沈殿において撹拌強度は重要な因子であるため、本発明において適している撹拌強度の検討を行った。純水1Lに塩化カルシウムと炭酸水素ナトリウムを所定量添加し、撹拌後、水酸化ナトリウムを添加し炭酸カルシウムを生成させた。ここに凝集剤の塩化第二鉄を所定量添加し、200rpm(撹拌強度310/秒)から400rpm(撹拌強度700/秒)まで変化させ、1分間撹拌した。緩速撹拌の条件は、集塊を形成できるようになった夾雑物同士の接触を促し、フロックを成長させ沈降しやすくし、かつ、成長したフロックを崩壊させないようにするため、水処理の凝集沈殿プロセスで一般的に適用されている条件を採用し、68rpm(撹拌強度70/秒)で10分間とした。
凝集沈殿後の上清の濁度を測定し、沈殿の沈降性を比較した結果、急速撹拌は300rpm(撹拌強度430/秒)以上で良好であり、400rpm(撹拌強度700/秒)の条件が適していることがわかった。
2 試料水供給ポンプ
3 塩化カルシウム溶液
4 塩化カルシウム供給ポンプ
5 炭酸水素ナトリウム溶液
6 炭酸水素ナトリウム供給ポンプ
7 水酸化ナトリウム溶液
8 水酸化ナトリウム供給ポンプ
9 凝集剤
10 凝集剤供給ポンプ
11 洗浄水
12 洗浄水供給ポンプ
13 濃縮タンク
14 攪拌機
15 バルブ
16 試料精製部
17 塩酸溶液
18 塩酸供給ポンプ
19 バルブ
20 バルブ
21 脱塩脱泡槽
22 洗浄水
23 洗浄水供給ポンプ
24 バルブ
25 抗体反応部
26 抗体混合槽
27 抗体反応槽
28 蛍光標識抗体
29 蛍光標識抗体供給ポンプ
31 洗浄水
32 洗浄水供給ポンプ
37 計測部
38 計測器
39 ヒーター
40 判定部
41 バルブ
42 ポンプ
43 試料保存部
44 試料保存容器
45 流路切換えバルブ
46 試料循環流路切換えバルブ
47 試料循環流路
48 リザーバー
49 オートサンプラー
50 保存試料供給ポンプ
Claims (3)
- 試料水に、塩化カルシウム溶液と、炭酸水素ナトリウム溶液とを添加し分散させる第1工程と、
炭酸カルシウム粒子を析出させるために、上記第1工程を経た試料水に水酸化ナトリウム溶液を添加する第2工程と、
炭酸カルシウム粒子を凝集沈殿分離させるために、さらに凝集剤を添加し攪拌する第3工程と、
第3工程後の試料水から上澄み液を取り除き、得られた凝集沈殿物を塩酸により溶解させ濃縮試料水として回収する第4工程と
を含み、炭酸カルシウム粒子に試料水中の微生物を吸着させることを特徴とする水中微生物の分離濃縮方法。 - 上記凝集剤が塩化第二鉄であることを特徴とする請求項1に記載の水中微生物の分離濃縮方法。
- 上記試料水の水温条件が20℃から25℃の範囲であることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の水中微生物の分離濃縮方法。
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