TW200946682A - A method of detecting microorganisms - Google Patents

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200946682 六、發明說明： 【發明所屬之技術々貝域】 交互參照相關申請案 5 10 15 20 本案請求澳洲臨時專利申請案第2〇〇79〇6896號，申請 日2007年12月17日之優先權，該案内容以引用方式併入此 處。 發明領域 本發明係關於一種用於通稱為隱孢子蟲 (Cryptosporidium)有機體，且特別為人隱孢子蟲（c hominis)、短小隱孢子蟲（c parvum)及火雞隱孢子蟲 mdeagddis)有機體中之一者或多者之檢測及/或識別方法 及/或核酸序列及雜錄定分析探針、助手細麟針、擴增 引子、核酸組成物、探針混合物、於水、糞便、食物或其 匕樣本介質之一試驗樣本中可用於測定通稱為隱孢子蟲有 機體，且制為人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱抱子 蟲有機體巾之-者❹者的存在之方法及套件組。

C 先前 J 發明背景 隱抱子蟲種屬（¾複分原蟲(Apic〇mplexa)亞目）為可寄 生於多種哺搞物種屬之腸道之球蟲原蟲。隱孢子蟲種屬 盛行於大部分脊椎動物鱗。動物諸如牛、料可能構成 感染人類的人隱孢子蟲的重要儲存處所。疾病於日托中 〜、醫院及都會區家庭群體中爆發，但大部分人類感染皆 係由人對人傳播，而非透過動物源途徑或水載傳播途徑感 3 200946682 染。由於卵囊幾乎絕對只出現於糞便，無疑地傳播乃糞口 傳播。雖言如此’偶爾由地表和飲水中回收卵囊，提示也 可能透過水源傳播。 隱孢子蟲種屬首先被辨識為動物病原，隱孢子蟲成為 5 人類疾病的起因—直未得知，直到後天免疫缺乏症候群流 行出現以後才為人所知。特別短小隱孢子蟲及人隱孢子蟲 今曰已經認知為全球免疫抑制者及免疫勝任者之腹瀉疾病 的顯著起因。疾病潛伏期i日至14日，症狀持續7日至6〇日。 此種腸道病原也顯示於開發中國家的幼童發生腹瀉/營養 不良惡性循環中扮演重要角色。隱抱子蟲種屬對氣化有抗 性，而又缺乏有效的臨床治療，促成該有機體造成健康的 重大威脅。 15 隱抱子蟲種屬於自然界係呈有環境抗性的厚壁印囊〒 式存在。已知此等㈣可於水中存活相當長時間，不受$ 知的水消毒劑諸如氣氣的影響。”囊攝取入體内後，^ 由腸腔内部膽酸的作用，而從㈣中釋放出的游動子抱 =侵腸道上皮細胞_’形成此等宿主細胞之 的複雜生命週期。 _&及綠生殖， 已知㈣子蟲闕讀财法包_ 及「方法1623」之抗體染色 万法1622 括檢定分析的主觀性，該方法若干缺點… 力密集，顯微鏡分析耗時數小孢子蟲，' 度或特異性且於執行切要昂貴岐倾乏敏1 20 200946682 如此需要有一種可用於測定試驗樣本中隱孢子蟲有機 體且特別為人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱抱子蟲有 機體之存在之敏感及特異性檢定分析方法。但更特定言 之，已知之各種隱孢子蟲；人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及 5火雞隱抱子蟲對人體有臨床意義。如此需要有對水、翼便、 食物或就人體健康而言有關之其它樣本介質之試驗樣本， 可更特異性檢測人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子 蟲之有效方法。

C 明内J 10 發明概要 根據本發明提供一種檢測於一試驗樣本中人隱孢子蟲 (C. homims)、短小隱孢子蟲(c parvum)及火雞隱孢子蟲(c meleagridis)中之任何一者或多者之存在之方法，該方法包 含該試驗樣本接觸： 15 (i) 一第一外引子及一第二外引子，其中該第一外引子 係與一標把DNA序列之5’端相鄰之一區互補及該第 二外引子係與該標靶DNA序列之3,端相鄰之一區互 補，及 (ii)一第一内引子及一第二内引子，其中該等内引子各 2〇 自含有與該標靶DNA序列之一訊息序列及一反訊息 序列相對應之兩個分開序列；及 執行自動循環股置換DNA合成，及檢測已擴增的標把 DNA之存在’其中該標靶DNA序列為人隱孢子蟲、短小隱 孢子蟲及火雞隱孢子蟲之實質上保留性DNA序列。 5 200946682 該檢測可為定性檢測例如檢測可使用dsDNA嵌入螢光 染料SYTO-9進行；或檢測可為定量例如使用濁度(M〇ri， 2004生物化學生物物理方法期刊，59: 145 157)或嵌入染料 (Aoi，2006 J Biotechnol，125 : 484-491)進行檢測。 5 自動循環可於DNA聚合酶存在下進行。 DNA聚合酶可為高股置換活性dNa聚合酶。 保留性標乾DNA序列可編碼肌動蛋白。 自動循環股置換DNA合成可為迴圈媒介恆溫擴增 (「LAMP」）方法。 10 自動循環股置換DNA合成包含熱變性步驟、反應步驟 及結束步驟。熱變性步驟可於約95〇c進行約5分鐘。反應步 驟可於約6(TC-66t：進行約35分鐘-12〇分鐘。結束步驟可於 約80°C進行約2分鐘-10分鐘。 該方法包含於嚴格雜交條件下，該已擴增的躲職 15接觸偏好雜交至該6擴增的躲DNA之—雜交檢定分析探 針或其麵，因而形成可穩定用於檢測之一探針：已擴增 的標紗NA序列或其麵之雜交體，以及檢測該探針：^ 擴增的標靶DNA序列或其補體之雜交體之存在。 本發明也提供-種可用於一擴增檢定分析中檢測人隱 2〇抱子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任何—者或多 者之存在之擴增引子。該擴增引子含有一個至少ι〇連續驗 基區’該區係與存在於SEQIDN〇1_4中之任一者之—個至 少1 〇連續驗基區至少有齡相同性(較佳至少9〇%相同性及 更佳100%相同性）。 25 200946682 caagatgtgttttcccatcga SEQ ID NO: 1 cctctggagcaacacgtaat SEQ ID NO: 2 ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg SEQ ID NO: 3 cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc SEQ ID NO: 4， 其中n可為連接子或不存在。連接子可為多個核苷酸鹼 基例如tttt。 本發明之擴增引子可以至少兩個擴增引子之集合使 5 用。本發明額外涵蓋包含於擴增條件下於前述擴增引子與 各個擴增引子之標靶DNA序列間所形成之穩定的核酸二倍 Φ 體之組成物。 本發明也提供一種用於測定一試驗樣本中是否存在有 人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者或 10 多者之雜交探針，該等探針較佳含有一個至少1〇連續鹼基 • 區，該區係與存在於SEQ ID NO 1-4中之任一者之_個至少 1〇連續鹼基區至少有80%相同性(較佳至少9〇%相同性及更 • 佳1〇〇%相同性）。此等探針於嚴格檢定分析條件下偏好雜交 至一標靶核酸而非雜交至衍生自非人隱孢子蟲、短小隱孢 ^ 15子蟲及火雞隱孢子蟲之核酸，該標靶核酸係與人隱 蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者或多者至少 80%互補（較佳至少90%互補及更佳1〇〇%互補）。 該探針可包括一可檢測標記。該標記可為任—種適去 標記物質，包括但非限於放射性同位素、梅、崎輔因子、 2〇酶基質、染料、半抗原、化學冷光分子、登光分子、碟光 分子 '電化學冷光分子、產色基團、無法穩定雜交至該桿 靶核酸之鹼基序列區。 μ不 已擴增的標靶DNA可藉電泳方法檢測。電泳法可為毛 7 200946682 細電泳法、凝膠電泳法。已擴增的標靶DNA可藉南方墨點 分析或藉定序檢測。陽性LAMP反應之檢測可由反應終點目 測檢測。由於LAMP反應產生大量DNA，故可觀察得白色 沉澱為副產物。此種沉澱為焦磷酸鎂。此種沉澱係與濁度 5 的增加有關，濁度的增加例如可使用濁度計變成檢測陽性 反應之另一項手段。可為即時測量或終點測量。進一步目 測LAMP反應結果的手段係藉添加SYBR綠，陽性反應於混 合時將轉成亮綠，而陰性反應將維持橙色(Iwamoto, 2003, J Clin Microbiol，41 : 2616-2622)。 10 另一種檢測陽性LAMP反應之手段係使用添加低分子 量聚伸乙基亞胺至反應終點。如此可與所存在之另一種已 擴增的DNA形成不溶性複體。除了標準LAMP引子之外， 可添加已加標記的探針(Mori，2006 BMC Biotechnol，6 : 3)。 本發明也提供一種識別人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及 15 火雞隱孢子蟲之至少一個保留性核酸序列之方法，該序列 係可用於根據本發明之於一試驗樣本中檢測人隱孢子蟲、 短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者或多者之一保留 性標靶DNA序列的存在之方法。於一個實施例中，該方法 包含識別至少兩個可用於根據本發明之於一試驗樣本中檢 2〇測人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者 或多者之—保留性標靶D N A序列的存在之方法之保留性核 酸序列。於-個實施例中，該方法包含識別至少三個可用 ;根據本發明之於一試驗樣本中檢測人隱孢子蟲、短小隱 抱子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者或多者之一保留性標靶 200946682 DNA序列的存在之方法之保留性核酸序列。於一個實施例 中’該方法包含識別至少四個可用於根據本發明之於一試 驗樣本中檢測人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲 中之任一者或多者之一保留性標靶DNA序列的存在之方法 5 之保留性核酸序列。於另一個實施例中，該方法包含識別 - 與選自於下列之一序列互補之至少一個序列： - caagatgtgttttcccatcga SEQ ID NO: 1 cctctggagcaacacgtaat SEQ ID NO: 2 ® ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg SEQ ID NO: 3 cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc SEQ ID NO: 4， 其中該與選自於SEQ ID NO: 1-4之一序列互補之至少 1〇 個序列係可用於根據本發明之於一試驗樣本中檢測人隱 — 孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者或多者 之一保留性標靶DNA序列的存在之方法。該保留性核酸序 列編碼肌動蛋白或其部分。 η為連接子或不存在。連接子可為多個核苗酸鹼基例如 ® 15 tttt。 本發明也提供一種用於測定一試驗樣本中是否存在有 人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者或 多者之套件組。 該套件組包含根據本發明之至少一個雜交探針及視需 20要可包括用於測定一試驗樣本中人隱孢子蟲、短小隱抱子 蟲及f雞隱孢子蟲中之任一者或多者之存在之書面指示。 套件《a包含根據本發明之至少一個擴增探針。 "亥套件組包含根據本發明之至少一個雜交探針及根據 9 200946682 本發月之至個擴增探針。本發明也涵蓋用於擴增根據 本發明之躲DNA相之套件組，包含㈣本發明之至少 一個擴則子及視需要可包括用於擴增核酸之書面指示。 於:較佳實施例中，該套件組進_步包含㈣酸及以擴增 所需之至少 '一種酶。 熟印技藝人士瞭解本發明之雜交檢定分析探 為擴增引子或捕捉探針，及本發明之擴增引子可用作 交檢定分析探針或捕捉探針，依據所要求之特作為雜 定。 、生韃度決 10 15 全文說明書中’「包含」—詞或其變化詞例如「勺 須瞭解暗示包括-所述元件、整數或步驟或元件、4者」 步驟組群’但未排除任何其它元件、整數❹ #或 整數或步驟組群。 2元件、 此處參考之全部參考文獻全文皆以引用方式併 處。合併此等參考文獻不可解譯為本發明發明人主入此 認全部此等參考文獻或任何特定參考文獻之内容<彳或承 分被視為滿足專利申請案之任何法定揭示要求 何姅 料。 、必要持 已經含括於本說明書中之任何文件、動作 、枒料、 1 J 、 置、物件等之討論僅供提供本發明之内文之目的。、數 為呈任何此等主題中之任一者或全部構成先前抆術之可現 分’或由於其存在於本案申請專利範圍各項之镘先日部 前而呈本發明相關業界之普通常識。 期支 本發明之其它特性及優點由本發明之非限制性實 20 200946682 之詳細說明將顯然易明，該等實施例將藉所揭示之圖式之 助舉例說明，附圖中： 圖式簡單說明 5 鲁 10 15 Ο 20 第1圖：與LAMP引子(於結束鹼基以帶有箭頭之虛線指 示）校準之人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲之核 苷酸序列。 第2圖：使用SYTO-9ds-DNA結合染料之LAMP反應之 即時擴增輪廓資料。 第3圖：藉1.5%瓊脂糖凝膠電泳之LAMP反應。1.人隱 孢子蟲6149 ; 2.短小隱孢子蟲IOWA ; 3.火雞隱孢子蟲 CZ-B1-32 ; 4·貝利隱孢子蟲(c.baileyi)CZ-Bl-15;5.安德森隱 抱子蟲(C.andersoni)CZ-Bl-52;6.無DNA;M.100bp階梯。 【實施方式】 較佳實施例之詳細說明 本發明提供一種用於水、糞便、食物或其它人體健康 相關樣本介質中特異性檢測人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及 火雞隱孢子蟲之有效方法。 定義 除非明白指示有不同定義，否則下列術語具有所指示 之定義： 檢測疋否存在」係以臨床上可接受之隱孢子蟲種屬 是否存在之標準定義使用。 — 核酸擴增」或「標靶擴增」係指增加具有至少一個 核酸相之核酸分子數目。根據本發明之標把擴增可 11 200946682 為線性擴增或指數擴增，但以指數擴增為佳。 「監測」係以系統性檢查或檢驗隱孢子蟲種屬是否存 在之一定義使用。 嚴袼雜交檢定分析條件」、「雜交檢定分析條件」、「嚴 格雜交條件」《「嚴格條件」係指允許-雜交檢定分析探 針優先雜交至一標靶核酸（隱孢子蟲種屬有機體之特異性 核酸）而非雜交至衍生自密切相關的非標靶微生物之核酸 之該等條件。嚴格雜交檢定分析條件可依據下列因素而改 變，包括探針之GC含量及長度、探針序列與可能存在於試 〇 1〇驗樣本之非標靶序列之序列間之相似性程度、及標靶序 列雜父條件包括雜交試劑或溶液之溫度及組成。 「標靶核酸序列」、「標靶核苷酸序列」、「標靶序列」 或「標靶區」係指組成一單股核苷酸分子之核苷酸序列之全 · 邛或部分之一特定去氧核糖核苷酸序列或核糖核誓酸序列。 15 「標靶核酸」或「標靶」係指含有一標靶核酸序列之 一核酸。 本發明又有特徵在於已分離的核酸分子，其可用於測 0 定屬於隱抱子蟲種屬之有機體是否存在於試驗樣本諸如 水糞便、食物或其它樣本介質；特別測定於水、糞便、 食物或人體健康相關之其它樣本介質之試驗樣本中人隱孢 子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者或多者之 存在。 子蟲、柄小隱孢子蟲及火雞& 之存在之方法 12 200946682 根據本發明提供一種檢測於一試驗樣本中人隱孢子蟲 (C. hominis)、短小隱孢子蟲(c. parvum)及火雞隱孢子蟲(C. meleagridis)中之任何一者或多者之存在之方法’該方法包 含該試驗樣本接觸： 5 10 15 e 20 ⑴一第一外引子及一第二外引子，其中該第一外引子 係與一標|£DNA序列之5’端相鄰之一區互補及該 第二外引子係與該標靶DNA序列之3’端相鄰之一 區互補，及 (ii)一第一内引子及一第二内引子，其中該等内引子各 自含有與該標靶DNA序列之一訊息序列及一反訊 息序列相對應之兩個分開序列；及 執行自動循環股置換DNA合成，及檢測已擴增的標靶 DNA之存在，其中該標靶DNA序列為人隱孢子蟲、短小隱 孢子蟲及火雞隱孢子蟲之實質上保留性DNA序列。 該檢測可為定性檢測例如檢測可使用dsDNA嵌入螢光 染料SYT0-9進行；或檢測可為定量例如使用濁度(Mori， 2004生物化學生物物理方法期刊，59: 145-157)或嵌入染料 (Aoi，2006 J Biotechnol, 125 : 484-491)進行檢測。 自動循環可於DNA聚合酶存在下進行。 DNA聚合酶可為高股置換活性DNA聚合酶。 保留性標靶DNA序列可編碼肌動蛋白。 自動循環股置換DNA合成可為迴圈媒介恆溫擴增 LAMP」）方法。 自動循環股置換DNA合成包含熱變性步驟、反應步驟 13 200946682 及結束步驟。熱變性步驟可於約95°C進行約5分鐘。反應步 驟可於約60。(：-66。(：進行約35分鐘_12〇分鐘。結束步驟可於 約80°C進行約2分鐘_10分鐘。 該方法包含於嚴格雜交條件下，該已擴增的躲DNA 5接觸偏雜交至該㈣增的標灿NA之—雜交檢定分析探 針或其補體’因而形成可穩定用於檢測之一探針：已擴增 的標把DNA序列或其補體之雜交體，以及檢測該探針：已 擴增的標無DNA序列或其補體之雜交體之存在。 擴增引子 ίο 纟發明也提供種可用於—擴增檢定分析中檢測人隱 抱子蟲、短小隱抱子蟲及火雞隱抱子蟲中之任何一者或多 者之存在之擴增引子。該擴增引子含有一個至少1〇連續鹼 基區，該區係與存在於SEQ ID NO 1-4中之任一者之一個至 少10連續驗基區至少有80%相同性（較佳至少9〇%相同性及 15 更佳100%相同性）。

caagatgtgttttcccatcga SEQ ID NO: 1 cctctggagcaacacgtaat SEQ ID NO: 2 ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg SEQ ID NO: 3 cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc SEQ ID NO: 4, 其中n可為連接子或不存在。連接子可為多個核苷酸鹼 基例如tttt。 20 本發明之擴增引子可以至少兩個擴增引子之集合使 用。本發明額外涵蓋包含於擴增條件下於前述擴增引子與 各個擴增引子之標靶DNA序列間所形成之穩定的核酸二倍 體之組成物。 14 200946682 該擴增引子含有一個至少10連續鹼基區，該區係與存 在於SEQ ID NO 1·4中之任-者之—個至少1G連續驗基區 至少有80%相同性（較佳至少90%相同性及更佳1〇〇%相同 性）。本發明之擴增引子可以至少兩個擴增引子之集合使 5用。本發明額外涵蓋包含於擴增條件下於前述擴增引子與 - 各個擴增引子之標靶DNA序列間所形成之穩定的核酸二倍 體之組成物。若該擴增引子係設計成起始RNA的合成，則 ^ 該引子可含有與標靶序列非互補之一鹼基序列，但該序列 可藉RNA聚合酶諸如T7、T3或SP6 RNA聚合酶辨識。本發 1〇明之擴增引子含有3,端經修飾而防止或減低引子延長速率 - 或延長量。（McDonough等人，「使用含啟動基因之引子序 , 列擴增核酸之方法」，美國專利案第5,766,849號揭示具有經 - 修飾或經封阻之3’-端之引子及啟動基因-引子）。雖然本發 明之擴增引子可以化學方式合成或由載體而衍生，但非天 15 然核酸分子。 φ 本發明之擴增引子可應用至卵囊之製備粗產物、糞便 樣本或水樣連同lamp反應試劑且該反應之效能係於此等 條件下評估。根據熟諳技藝人士眾所周知之分離方法，卵 囊可藉由水中濃縮分離用來釋放DNA。然後使用匕八河卩擴 20增來檢測人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲有機 體中之任一者或多者之存在。迴圈媒介之恆溫擴增 (「LAMP」）為無需熱循環之dNA擴增方法(N〇t〇mi等人， 2000)。LAMP方法利用具有股置換活性之DNA聚合酶及對 標把DNA上六個區具有特異性之一組至少四個引子。高度 15 200946682 敏感性且特異性之LAMP反應通常可於少於1小時於恆溫條 件（例如60°C -65。(：）下進行。 可檢測摆# 本發明也提供一種用於測定一試驗樣本中是否存在有 5 人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲令之任一者或 多者之可檢測探針，該等探針較佳含有一個至少1〇連續鹼 基區，該區係與存在於SEQ ID NO 1-4中之任一者之一個至 少10連續鹼基區至少有80%相同性（較佳至少9〇%相同性及 - 更佳_%相隨）。此等探針於嚴格檢定分析條件下偏雜 β 10 交至一標靶核酸而非雜交至衍生自非人隱孢子蟲、短小隱 孢子蟲及火雞隱孢子蟲之核酸，該標靶核酸係與人隱孢子 蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任—者或多者至少 — 80%互補（較佳至少90%互補及更佳100%互補）。 t 該探針可包括一可檢測標記。該標記可為任一種適當 - 15 標記物質，包括但非限於放射性同位素、晦、酶輔因子、 酶基質、染料、半抗原、化學冷光分子、螢光分子、磷光

分子、電化學冷光分子、產色基|5、無法穩定雜交至雜 Q 靶核酸之鹼基序列區。 本發明之可檢測探針除了標靶結合區之鹼基序列之 20外，可包括於嚴格條件下無法穩定結合至衍生自人隱孢子 蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲有機體中之任一者或多 者之核酸之一個或多個鹼基序列。額外鹼基序列可包含任 何期望的驗基序列，只要其於嚴格條件下不會穩定結合至 衍生自標靶有機體之核醆或避免探針穩定雜交至該標靶核 16 200946682 ^了 °舉例言之，額外驗基相可組成—捕捉探針之制 動^針結合區，此處該制動探針結合區例如包含3，p〇iy奵 (^^1，該區於嚴格條件下雜交至直接或間接結合至固 5 ⑩ 10 15 20 =_之多核㈣之，ly dT (胸腺射）區。額外驗基 序列也可為由舰聚合_識之5，序列或藉麵聚合酶加 強起始或延長之序列(例如取動基因）。若該第—序列係 =入例如「分子信標」探針，則可包括多於一個額外驗 土列。分子信標揭示於Tyagi等人，「加可檢測標記的雙 隨形寡㈣酸探針、檢定分析及套件組」，美國專利第 5,925,517號，包括一躲結合區，該區係由具有彼此至少 部分互觀之兩鑛基序職合。額外驗基序列可直接結 合至標把結合區，或例如利用非核»連接子而結合至該 標把結合區。 本發明之可檢測探針可包含一驗基序列，該驗基序列 係與其㈣減序列充分互補而形成於嚴格雜交檢定分析 條件下可穩定供檢測之探針：錄雜交體。如熟諸技藝人 士瞭解，雜交探針為呈未經人類介人(例如與外來核酸重 組、分離或純魅某種程度)無法出現於天狀形式之已分 離的核酸分子或其類似物。

根據本發明之可檢測探針包含標乾區外侧之額外核誓 或核鹼基’只要此等核R核驗基不會妨礙於嚴格雜交條 件下之雜交且於雜交檢定分析探針之情況下，不會妨礙優 先雜交至該標托核酸即可。也包括非互補序列，諸如標無 捕捉序列（通常為均聚物束，諸如pQly_A、pQly_T或p〇ly U 17 200946682 尾部）、=動基因序列、臟轉錄之結合位置、限剪核酸内 切酶辨識位置、或开4日 —棱供可用於協助檢測及/或擴增的期望 I 第三結構諸如催化活性位置或髮炎結構之序 歹艮發明之可檢測探針可藉熟諸技藝人士已知之技 術製造，諸如II化學合成製造，及藉由重組職分子之試 管内表現或活體内表現而製造。 10 15 20 …曰技""人士瞭解雜交表示兩個完全互補或部分互補 的核酸版於特定雜交檢定分析條件下於平行方向或較佳為 反平行方向共同結合而形成有雙股區之财結構。此種雙 股結構偶_作為雜交體之兩個組成股藉氫鍵結合在一 起。雖然此等氫鍵最常見形成於單—核酸股上含有驗基腺 嗓呤與胸㈣錢尿射(Α與τ_或胞料與鳥嗓吟^ 與G)間’驗基對也可形成於判此等「標準」驗基對成員 之驗基間。非標準驗基對為技藝界眾所周知（例如參考 Roger L· R Ad_等人，核酸生物化學，（第imi992年》。 雖然並非必要，探針較佳包括可檢測標記或交互作用 標記群、组。標記可為任一種適當標記物質，包括但非限於 放射性同位素、酶、酶_子、酶基f、染料、半抗原、' 化學冷光分子、螢光分子、嶙光分子、電化學冷光分子、 產色基團、於所述條件下無法穩定結合至標靶核酸之鹼基 序列區及其混合物。於-個特佳實施例中，標記為〇丫咬鏘 酯（AE)較佳為氟磺酸4-(2-丁二醯亞胺氧基羰基乙基)_苯基 -10-甲基吖啶鑕-9-羧酸酯（後文稱作為「標準AE」）。交互 作用標記組群包括但非限於梅/酶基質、酶/輔因子 '發光劑

18 200946682 /淬熄劑、發光劑/加合物、染料二元體與福瑞斯特$〇rrester) 能轉移對。 捕捉探針 熟諳技藝人士瞭解「捕捉探針」為一募核每酸或一組 5至少兩個共同鏈接的寡核苷酸其可雜交至標靶核酸及/或 ' 制動的探針，藉此提供於試樣中制動與分離標靶核酸之手 - 段。雜交至標靶核酸之捕捉探針該部分稱作為「標靶結合 藝區」，雜交至制動探針之捕捉探針該部分稱作為「制動探針 結合區」。雖然於檢定分析條件下較佳捕捉探針雜交至標靶 W核酸及制動探針二者’但標減合區及制動探針結合區設 - 収可於列雜交條件下雜交至其個別的錄序列。藉此 , 方式，捕捉探針可設計成於較為有利之流體動力學之下， - 歡探針首先雜交至脉㈣，親調整條件來允許制動 ㈣結合區㈣至韻探針。當標㈣合區及觸探針結 Μ合區設置於同一個捕捉探針上時，可於同—個寡核㈣上 〇 彼此直接接合，彼此分開一個或多個視需要可修改之核苷 酸，或可利用非核苷酸連接子而彼此接合。「標人 為於檢定分析條件下，穩定結合至存在於_標乾核酸之標 無序列、該躲序列之DNA或RNA相當物、或該躲序列 之補體之該寡核替酸部分。檢定分析條件可為嚴格雜交條 件或擴增條件。 此處須瞭解「制動探針結合區」為於檢定分析條件下 雜交至制動探針之該募核誓酸部分。 此處須瞭解「制動探針」為將捕捉探針結合至制動撐 19 200946682 未結合的材料分離。 體之-券核f酸。制動探針藉鍵聯或交互作心直接或間 接接合至固趙擇體，於用來將該捕捉探針雜交至獅酸 及雜父至制動探針之條件下維持穩定，而與該等條件為相 同或相異無關。制動探針協助已結合的標_與樣本中

本發明提供包含至少—個核苔酸含有-制動探針結合 區及一標乾結合區之捕捉探針。捕捉探針之制動探針結合 區包絲嚴格條件下可穩定雜交至試驗樣本中結合至固體 撑體之寡核聽的任何驗基相。制動探針結合區可為 10 P〇lydA，P〇lydA為位於捕捉探針之3,端的均聚物尾部。结 合至固體撐體之募核㈣包括於檢定分析條件下穩定結合 至捕捉探針之poly dA尾部之夠長的5>%盯尾冑。制動探 針結合區包含-P〇lydA尾部其長約3〇腺嗓吟，捕捉探針包 括長約3胸腺嘧啶之一間隔區用來將標靶結合區與制動探 15 針結合區彼此結合。

捕捉探針之標靶結合區可穩定結合至存在於衍生自人 隱抱子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱抱子蟲有機體中之任一 者或多者之核酸中之標把序列。 捕捉探針之標靶結合區可包含一鹼基序列區，該區係 20 與選自於由SEQ ID NO 1-4所組成之組群之一鹼基序列至 少約85%互補（較佳至少約90%互補，更佳至少約95%互補及 最佳100%互補）。 為了防止非期望的交又雜交反應，捕捉探針排除標把 結合區之核苷酸鹼基序列以外之核苷酸鹼基序列，該等核 20 200946682 5 ❹ 10 15 ❹ 20 苔酸驗基序列可歧結合至於較分析條件下存在於試驗 樣本中衍生自任何有機體之核酸。與此等辦法符合一致且 為了最大化形成之捕捉探針：標把複體之_，^動探針 結合區之《舰基㈣可設計成讓該等相於檢定分析 條件下穩定結合至存在於㈣探針之核料絲序列，而 不會結合至衍生自存在於試驗樣本中之任何非人隱抱子 蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲有機體之核酸。 捕捉探針之標把結合區及制動探針結合區可選擇為該 她探針：標純雜有比捕姉針：觸料複體之^ 更高的Tm。藉此方式，可加諸第—組條件，其比較制動^ 針更有利於捕捉探舰交至躲糊，藉此提供用於捕捉 探針雜交至料序狀最紐_找力學。—旦有足夠 時間讓捕捉探針結合至躲相，可加諸第二組較不嚴格 的條件，該條件允許捕捉探針結合至制動探針。 本發明之捕捉探針也包括用於直接檢測試驗樣本中之 4序狀-標記或-對交互作_標記。標記、禪記之 =合及探針加標記手段之非限制性實例為熟諳技藝人士已 =的探針可接合至磁性帶電粒子，—旦探針有㈣ 域針樣本中之脉核_交時，於純化步驟期間 m反應咖分離(A⑽轉人，「檢 驟i儀=案第6,254— 一 _。捕捉探針可設計朗捉探針：絲雜交體之炼 點係高於捕捉探針：制動探針 雜交體之熔點。藉此方式， 21 200946682 可採用雜交檢定分析條件之不同集合來於捕捉探針雜交至 制動寡核苗酸之前協助捕捉探針雜交至標靶核酸，藉此最 大化自由探針濃度且提供有利的液相雜交動力學。此種「二 步驟式」標靶捕捉方法揭示於Weisburg等人之美國專利案 5 第6，11〇,678號。其它容易適用於本發明之標乾捕捉方案為 技藝界眾所周知且包括但非限於下列揭示之標靶捕捉方 案：Dunn等人，酶學方法，「藉夾置雜交映射的病毒 mRNA」’ 65(1) : 468 478 (1980);Ranki等人，美國專利案第 4,486,539號;Stabinsky，美國專利案第 4,751,177號;及Becker 10 等人，美國專利案第6，130,038號。 可檢測標記及檢调丨方法 探針/引子包括一可檢測標記。該標記可為任一種適當 標記物質，包括但非限於放射性同位素、酶、酶輔因子、 酶基質、染料、半抗原、化學冷光分子、螢光分子、磷光 15 分子、電化學冷光分子、產色基團、無法穩定雜交至該標 靶核酸之鹼基序列區。探測可於南方墨點法中使用放射性 標記的探針進行，但也提供其它探測技術的使用，例如以 標諸諸如生物素或螢光劑將與該標把序列互補之募核苷酸 加才承臧，且已結合的標Ί志的存在與陽性結果相關聯；或經 20 由以已知方式使用生物素標籤用於ELISA中作為活性劑或 檢測螢光。 本發明提供屬於直接技術之原位檢測法，涉及將一標 記直接結合入放大產物。例如通報子分子諸如長葉毛地黃 配體（dig〇xigenin)[DIG]-dUTP或螢光素_dljTP可含括於擴 200946682 增混合液内且摻混入擴增產物。然後使用鹼性磷酸酶-輛合 抗-DIG或過氧化酶_輛合抗_DIG之單純免疫化學步驟，檢測 DIG加標記之擴增產物。另外，藉周圍螢光顯微術或免疫化 學方法可檢測螢光素加標記之擴增產物。 5 本發明也提供一種間接檢測技術，涉及於聚合酶連鎖 反應(PCR)後特定加標記之探針雜交至該擴增產物。然後探 針上之標記例如可藉免疫化學法或周圍螢光顯微術檢測。 已擴增的標靶DNA可藉電泳方法檢測。電泳法可為毛 細電泳法、凝膠電泳法。已擴增的標靶DNA可藉南方墨點 10 分析或藉定序檢測。陽性LAMP反應之檢測可由反應終點目 測檢測。由於LAMP反應產生大量DNA，故可觀察得白色 沉澱為副產物。此種沉澱為焦磷酸鎂。此種沉澱係與濁度 的增加有關，濁度的增加例如可使用濁度計變成檢測陽性 反應之另一項手段。可為即時測量或終點測量。進一步目 15 測LAMP反應結果的手段係藉添加SYBR綠，此處陽性反應 於混合時將轉成亮綠’而陰性反應將維持撥色（Iwamoto, 2003, J Clin Microbiol, 41 ： 2616-2622) ° 另一種檢測陽性LAMP反應之手段係使用添加低分子 量聚伸乙基亞胺至反應終點。如此可與所存在之另一種已 20 擴增的DNA形成不溶性複體。除了標準LAMP引子之外， 可添加已加標記的探針(Mori，2006 BMC Biotechnol, 6 : 3)。 已擴增的DNA可藉區別不同DNA長度之任一種方法直 接檢測。通過瓊脂糖之電泳為用於分離、辨識及純化DNA 片段之標準方法。於凝膠内部之DNA位置可使用低濃度螢 23 200946682 光嵌入染料漠化乙鐵(ethidium bromide)染色而直接測定。 然後藉於紫外光下直接檢查凝膠可檢測於已放大的標把 DNA之預測長度相對應之帶。 此外’得自電泳凝膠之DNA帶可藉毛細作用移轉至膜 5 撐體，接著使用寡核苷酸探針間接檢測。典型移轉方案包 括使用驗性溶液諸如0.4M NaOH、0.6M NaCl變性凝膠内部 之DNA ’接著為於緩衝溶液例如1 NaCl、0.5M 丁]^-11(：1、？117.5中之中和步驟。然後凝膠與高離子強度移 轉緩衝液諸如lx ssc平衡，其中lx ssc為015M NaCn、 10 0.015M檸檬酸鈉。然後已變性的DNA藉毛細打點於移轉緩 衝液而由凝膠移轉至膜撐體。 已經捕捉於固體撐體諸如尼龍膜或硝基纖維素膜上之 已擴增的DNA可使用加標記的雜交探針檢測。探針可以放 射性標籤或螢光標籤加標記，或直接或間接附接至酶分 15 子。然後，與膜結合的已擴增的標靶DNA與探針於雜交條 件下培養。於雜交後洗掉過量探針。若雜交探針有加放射 性標籤’則其餘已雜交的探針可藉自動放射性攝影術或閃 爍計數檢測。若探針含有生物素或其它屬於特異性結合分 子之化學基例如抗生物素及抗生素’則使用酶附接至該特 20異性結合分子諸如辣根過氧化崎或鹼性磷酸酶附接至鏈絲 菌抗生物素可檢測制動的探針。 檢測可透過與非放射性5’長葉毛地黃配體(DIG)加標 記之寡核苔酸探針進行。於雜交後，固體撐體以高離子強 度緩衝液諸如5XSSC於約7(TC洗滌。洗滌後剩餘之制動雜 24 200946682 父探針可經由將該固體撐體與軛合至鹼性磷酸酶之抗-DIG 抗體共同培養，接著添加化學冷光酶基質諸如魯明金 (Lumigen) PPD (百靈嘉英格漢(B〇ehringer Mannheim))而變 成目測可見。撐體最後經洗滌，封在塑膠包裹内，曝光於χ 5 光膜來檢測任何化學冷光。 塑別人抱子蟲及火雜隱孢子蟲之至少一 個保留性核酸序歹I丨之方法 本發明也提供一種識別人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及 火雞隱孢子蟲之至少一個保留性核酸序列之方法，該序列 ίο係可用於根據本發明之於一試驗樣本中檢測人隱孢子蟲、 紐小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者或多者之一保留 性標乾DNA序列的存在之方法。於一個實施例中，該方法 包含識別至少兩個可用於根據本發明之於—試驗樣本中檢 測人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者 15或多者之-保留性標把DNA序列的存在之方法之保留性核 酸序列。於-個f施例中，豸方法包含識別至少三個可用 於根據本發明之於-試驗樣本中檢測人隱孢子蟲、短小隱 抱子蟲及火雞隱抱子蟲中之任一者或多者之一保留性標歡 DNA序》|的存在之方法之保留性核酸序列。於—個實施例 2〇中，該方法包含識別至少四個可用於根據本發明之於一試 驗樣本中檢測人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱抱子蟲 中之任-者或多者之―保留性標紗财序列的存在之方法 之保留性核酸序列。於另一個實施例中，該方法包含識別 與選自於下列之一序列互補之至少一個序列： 25 200946682 caagatgtgttttcccatcga SEQ ID NO: 1 cctctggagcaacacgtaat SEQ ID NO: 2 ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg SEQ ID NO· 3 cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc SEQ ID NO: 4

其中該與選自於SEQ ID NO : 1-4之一序列互補之至少 一個序列係可用於根據本發明之於一試驗樣本中檢測人隱 5 抱子蟲、短小隱抱子蟲及火難隱抱子蟲中之任一者戍多者 之一保留性標靶DNA序列的存在之方法，及其中n可為連接 子或不存在。連接子可為多個核苷酸鹼基例如tttt。該保留 性核酸序列可編碼肌動蛋白或其部分。 視需要該方法包括試驗樣本接觸至少一個助手探針之 1〇 步驟。參考H〇gan等人，「促進核酸雜交之手段及方法」，美 國專利案第5’030,557號。此處須瞭解「助手探針」為設計 用來於與雜交檢定分析探針之位置不同的位置雜交至一標 靶核酸，藉此提高該探針雜交至標靶核酸之雜交速率，提 高探針：標靶雜交體之熔點或二者之寡核答酸。 15

用來擴增與檢測人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱 抱子蟲有機體巾之任-者或多者之本發明之引子及/或探 針可方便地包裝成套件組。套件组可包含根據本發明之適 量弓1子或適量探針或適量引子及探針。此外，套件組可含 =至少-種標準樣本其含有已知衫之隱孢子蟲種屬及 實質上不含感興趣之原蟲之一陰性對照樣本。 本發明之方法及套件組具有多項優於先前方法之優 •，’包括與擴增程序諸如PCR相關之速度、敏感度及特異 26 200946682 e 10 15 鲁 20 卜人義子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲可 與只感染非人浦宿主的其它隱好蟲區別。 =套件組包含根據本發明之至少—個雜交探針及視需 ^翻於敎-試驗樣切人隱孢子蟲、短小隱抱子 蟲及，雞隱孢子蟲巾之任—者❹者之存在之書面指示。 该套件組可包含根據本發明之至少一個擴增探針。 ^套件組包含根據本發明之至少—個雜交探針及根據 本發明之至個擴增探針。本發明也涵蓋用於擴增根據 树明之_囊序狀㈣組，包含根據本發明之至少 個擴增引子及視需要可包括用於擴增核酸之書面指示。 2較佳實施射，該套件组進—步包含㈣酸及/或擴增 所需之至少一種酶。 、 根據本發明之引子及/或探針可用於檢測呈印囊形式 形式之人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱抱子蟲 ^體中之任—_者，否則可方便地包裝成套件組。 ^牛組可包含適量引子或適量探針或適量引子及探針。此 丄套件组可含有適量之至少—種標準樣本其含有呈印囊 2或其它形式之人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱抱 于蟲有機體中之任一者或多者。 套件組可包含至少-種根據本發明之雜交探針，及視 需要可包括用於判定試驗樣本中是否存在有人隱抱子蟲、 短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之—者或多者或 書面指示。 於另-個實施例中，套件組包含至少一種根據本發明 27 200946682 10 15 20 之擴增探針。 套件組可包含至少— -種根據本發明之擴増探針。據本發明之雜交探針及至少 除了雜交檢定分析探針外 據本發明之擴增引子。 除了雜交檢定分析探針外 種根據本發明之捕捉探針。 除了雜交檢定分析探針外，安件組可包含肩 針中之至少-者及前物則子巾之至少一者。 包括捕捉探針之套件址進—步包括用於將捕捉探針直 =接制動於試驗樣本之—固體撐體材料(例如磁性響 應粒子）。 套件組包含所要求之_、_ ⑽ :探針™子m魏及根縣發明讀針及/ 1子Γ呈'東乾摘提供。；東乾觸可於;東乾前預先混 重新調製時形成完全混合物，具有準制於檢定分 t各^之適當混合比。此外，套件组可含有用於重新 調製該套件組之綠_之重新調製試劑。 :型包裝材料包括可於固定限度範圍内盛裝本發明之 定分㈣針、捕捉探針、科探針及大引子之 =體諸如破璃、塑膠、紙張、金屬羯、微粒等。如此， 之所2材料包括用於盛裝次毫克(例如皮克或奈克)數量 Z涵麵探針或引子之《小瓶，或包裝材料可為微力價 各孔其上已經操作式固定本發明之探針或引子， 套件組可包含至少 種根 套件組進一步包含至少一 套件組可包含前述捕捉探 ❹ 28 200946682 亦即鏈接因而可參與本翻之擴增方法及/錄測方法。 時間、溫度及緩衝 …書面和U係指示試劑及/或試劑濃度及至少一項 刀析方法參數’例如相對於每個樣本數量所使用之試 劑之相對量。此外，也包括諸如維持、 液條件等規定。

10 套件、、且可^ 3雜交檢定分析探針、捕捉騎及/或此處 所述擴增引子，絲係個欺供或於前狀較佳組合之一 提供來驗㈣L牧試驗縣巾之人㈣子蟲、短小 隱孢子蟲及火雜解騎機财之任—者❹者之存在 探針及弓丨子之交叉试t 二叫技藝人士瞭解本發明之雜交檢定分析探針可用作 為擴增引子或捕捉探針，及本發明之擴增引子可用作為雜 父檢定分析探針或捕捉探針，依據所要求之特異性程度決 15 定。 探針及/或引子可為崎、相對狀舰及/或其類似 物核苗亞單位之糖基可為核糖、去氧核糖及其類似物， 例如包括有2 -Ο-甲基取代於核糖㈣糖基部分之核糖核 苔。（募核«包括具有2,取代之核普亞單位且可用作為雜 2〇交檢定分析探針、助手探針及/或擴增引子者係由Becker等 人，「使用經修改之引子擴增標乾核酸之方法」，美國專利 案第6，13〇，()38號所揭示）。„亞單位可藉連接子諸如碌酸 二醋連接子、改性連接子接合，不㈣礙寡核微雜交至 其互補標把核酸序列之非核普酸部分接合。改性連接子包 29 200946682 5 括其中標準磷酸二酯連接子由不同連接子諸如硫代鱗酸連 接子或曱基膦酸連接子所置換之該等連接子。核驗基亞單 位可經由以假胜肽主鏈置換天然去氧核糖磷酸主鍵而接 合，假胜肽主鏈諸如利用羧基曱基連接子將核驗基亞單位 偶合至中央第二胺之2-胺基乙基甘胺酸主鏈。（具有假胜狀 10 15 20 主鏈之DNA類似物俗稱為「胜肽核酸」或「PNA」且係相 示於Nielsen等人，「胜肽核酸」，美國專利案第5,539 〇8, 號）。本發明涵蓋之核酸分子之其它非限制性實例包括含病 二環及三環核嘗及核誓酸類似物之核酸類似物，稱作為「深 鎖核酸」、「閉鎖核咖物」或「LNA」(閉鎖核酸係揭开 於Wang ’「隨形閉鎖核答及募核誓酸」，美國專利案第 6,〇83,482號；Manishi等人，「新賴二環料及寡核苔咖 似物」，國際專利公告案第w〇 98/39352號；及偏㈣等人 「寡核«類似物」，國際專利公告案第w〇 99/i422_ 本發明涵蓋之任何核_似物，關條件為誠性寡核苗 酸於嚴格雜交蚊分㈣件或«條件下可雜交至標把核 酸。於雜交檢定分析探針之情況下，該改性寡«酸必須 於嚴格雜錄定分析條件下也可優絲交至織減酸。 猃試驗樣本中釋放枋 體有機I*技藝人士瞭解⑼文摘述之任—種方法應用至整 體有機體，而非應用至折 連鎖反應條件之前，須2自有機體之核酸，於開始擴增 链良 、、° Q由該有機體中釋放核酸之處理本首先料二提供特定程序，藉此欲測試之樣 …/ 後經超音波㈣處理或

30 200946682 於含有還原劑例如二硫赤絲醇(D Τ Τ)之緩衝液内接受冷凍/ 解凍循環來讓有機體破裂，特別為卵囊形式破裂而釋放出 核酸。 5 ❹ 10 15 Ο 20 使用此等本發明之較佳方法，可達成呈卵囊形式或其 匕形式之人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲有機 體中之任一者或多者之檢測或識別。 超音波振盪處理或冷凍/解凍程序可於形成LAMp介質 或探測介質之全部或部分介質内進行。超音波振盪處理方 便使用峰至峰約11微米進行。另外，用於冷康/解凍程序， 樣本容器方便浸泡於低溫液體諸如液態氮中進行。其它讓 細胞或卵囊結構破裂而釋放核酸入LAMP或探測介質之方 法為熟諳技藝人士眾所周知，預期可於LAMP及/或探測程 序開始前施加。 隨後之雜交及擴增程序也可使用自孢子囊、卵囊及/或 感染細胞培養之含核酸萃取物進行。若該等萃取物欲用於 檢測DNA，則可以不含DNase之RNase處理而從溶解產物中 移除RNA。由卵囊及感染細胞培養中進一步純化dna可藉 額外萃取步驟完成。例如細胞可於含2毫克/毫升蛋白酶K及

0.5%薩可席（sarkosyl)之50 mM Tris-HC卜 20 mM EDTA' pH 8内溶解且於37°C培養1小時。然後添加5M NaCl獲得1M終 濃度’添加CTAB (十六烷基三甲基溴化銨）至1%濃度。於 65 C培養30分鐘後’溶解產物接受至少一個冷凍/解凍循環 及酚/氯仿萃取。藉添加0.6倍體積異丙醇沉澱DNA，然後 DNA沉澱以70%乙醇洗滌。熟諳技藝人士瞭解DNA/RNA萃 31 200946682 取套件組例如愛皮主（Epicentre MasterPure)及瓦特主 (WaterMaster)套件組（愛皮生技公司（EPICENTRE Biotechnologies))也可用於擴增連鎖反應條件開始前由有 機體釋放核酸。 5 若萃取物欲用於檢測RNA，則可以不含RNase之DNase 處理而由溶解產物中移除DNA。以強力變性劑諸如硫氰酸 胍鏘萃取，接著通過氣化鉋溶液離心也可由溶解細胞中分 離總RNA 〇此外，使用附接至〇iig0_dT之固態粒子其可選擇 具有poly(A)尾部之mRNA轉錄本，可分離mRNA。 © 10 卵囊之回收 隱孢子蟲種屬感染之診斷大致上係藉從糞便檢體中回 收隱孢子蟲卵囊而確定。另外，透過污染水傳播隱抱子蟲 病之風險評估或證據可由水樣中濃縮隱孢子蟲印囊提供。 隱孢子蟲卵囊可藉多種方法而由水中濃縮。例如預定 15量之水如100升可通過1微米標稱孔隙度紗捲繞聚丙烯過濾 — 器或其相當物過濾，過濾流速限於約4升/分鐘。經採樣之 過遽器典^係於冰上運送至分析實驗㈣於24小時内接受 〇 分析。於收集後之％小時以内’使用經緩衝之清潔劑溶液 可由過滤器上洗下所滞留的原蟲，過滤器纖維經切割、測 20試及以手洗蘇或借助於史托馬器（stomacher)》先務。於洗提 劑中回收的印囊藉離心濃縮，藉漂浮於比重為u之帕可 (P__糖溶液上而部分純化。部分經純化之材料可置於 薄膜過滤器上’使用間接染色法以抗體加標籤，且於周圍 螢光顯微術檢查。可使用特定標準包括免疫螢光、大、 32 200946682 形狀、及内部型態來識別卵囊。 平坦床薄膜過濾法 5 參 10 15 ❹ 20 此種方法係衍生自由Ongerth及Stibbs原先說明之方法 (Appl. Environ. Microbiol. 53 : 672-676, 1987)。使用續動水 幫浦（瓦特森馬洛(Watson Marlow)單元6〇4S)以不超過4升/ 分鐘之速率通過含有2微米孔徑經過執線蝕刻的聚碳酸醋 膜（奥斯莫尼克(Osmonics)，麻省）之直徑293毫米平坦床過 濾、單元（米里普公司（Millipore))濃縮。然後膜移轉至已改性 之帕司派（perspex)薄片（微尼司公司（Micronix)，澳洲雪 梨），以1號洗提緩衝液喷霧，濃縮物使用橡皮滾筒（微尼司 公司（Micronix))洗提且收集於50毫升離心管（伊瓦基公司 (Iwaki)) 〇此種洗提程序重複2次至4次，隨後移出薄膜拋 棄，帕司派薄片及滾筒進一步以洗提緩衝液清洗。過濾、洗 液隨後於1620g於4±2。(：離心10分鐘。上清液可經抽吸留下 體積為5毫升之丸粒，隨後藉渦旋混合再度懸浮。 平坦床裝置於不同樣本間可使用清潔劑溶液（特佳贊 (Tergazyme) ’阿可諾公司（Aic〇n〇x jnc.)，紐約白平原）回沖 洗接著以水洗滌而清潔。帕司派網及滾筒可使用清潔劑刷 洗且以水清洗。 濃縮後’樣本使用免疫磁性分離(IMS)處理及免疫螢光 抗體染色’ 4’，6-二脒基_2_苯基吲哚(dapi)染色用於證實印 囊。由各樣本製造的整個丸粒可經處理及檢查。包裝丸粒 尺寸由<0_1至1毫升體積’ >〇5毫升則分成兩次IMS試驗(根 據製造商指示）。 33 200946682 易種子(EasySeed)(含98±1.4隱孢子蟲卵囊及98土 1.4梨 形鞭毛蟲(Giardia)孢子囊）可恰在IMS之前刺激若干樣本來 定量IMS程序及染色程序相關的損耗。易種子小瓶可於添加 至IMS試管前渦旋混合30秒。然後得自IMS套件組之1毫升 5 l〇x SL緩衝液A添加至小瓶，渦旋混合30秒，洗液添加至 IMS試管。然後得自IMS套件組之1毫升1〇χ SL緩衝液B添加 至小瓶，渦旋混合30秒，及傾析入IMS試管。然後樣本濃縮 物添加至IMS試管。 使用戴那珠(Dynabeads) GC-康保(Combo)套件組(戴那 10 公司（Dynal)，奥斯陸（Oslo))根據製造商指示進行IMS，但 下述酸解離步驟除外，樣本即刻轉移至安裝於真空歧管上 方之0·8微米孔徑13毫米聚碳酸酯薄膜過濾器（核孔 (Nuclepore) ’紐澤西州克里福敦）。薄膜上之有機體可使用 甲醇處理1分鐘然後上方鋪上80微升DAPI (2微克/毫升於 15 PBS)(西革馬亞利敘公司（Sigma-Aldrich)) 2分鐘。DAPI可 藉減壓過濾移除’過濾膜使用200微升易史坦(EasyStain)洗 條緩衝液(BTF有限公司）洗滌，然後覆蓋含有加螢光素異硫 氰酸酯標記的隱孢子蟲及梨形鞭毛蟲特異性抗生素之易史 坦80微升歷15分鐘時間（Weir等人，2000 Clin. Diagn. Lab. 20 Immunol. 7(5) : 745-750)。 全部染色可於室溫進行。然後過濾膜移至載玻片上， 上方鋪設易史坦安裝介質（BTF有限公司）且以蓋玻片密 封。然後藉周圍螢光顯微術檢查安裝於玻片上的膜。 於全細胞内部之DNA或RNA之擴增 200946682 熟諳技藝人士瞭解此項技術可如例如Prescott等人， 1999, Lett· Appl. Microbiol. 29: 396-400所述應用至全細胞 内部核酸的原位檢測。 實例 5 ❹ 10 15 ❹ 20 實例1 :樣本來源及DNA純化 隱孢子蟲DNA係得自源自於培養或糞便的已純化的印 囊樣本。得自糞便的卵囊係使用奎安培(QIAamp) DNA糞便 套件組（奎金公司（Qiagen)，美國加州）純化，而得自培養之 卵囊係接受單次PBS洗滌。純化後之卵囊懸浮於ΐχ PCR緩 衝液II (10 mM Tris-Ηα、pH 8.3、50 mM KC1)(應用生物系 統公司，美國加州），藉血球計細胞室計數計算數目，及接 受5次冷凍/解凍循環。然後樣本接受於1〇,〇〇〇 xg離心5分 鐘，上清液移至新鮮微離心管。然後進行一系列稀釋（工： 2)製作具有期望濃度，於每個樣本由10,000當量至！當量卵 囊範圍之卵囊樣本。 先前藉其它分子技術識別且用於本研究之隱孢子蟲種 屬或基因型為人隱抱子蟲單離株6149、6189、H270、U271、 H273 (未公開）；短小隱孢子蟲IOWA, AZ-1 ;火雞隱抱子蟲 CZ-B1-32 (Ryan等人’ 2003);安德森隱孢子蟲 CZ-Bl-52(Ryan等人 ’ 2003);貝利隱孢子蟲CZ-B1-15 (Ryan 等人，2003);屎隱孢子蟲(C. felis) 100.22 (未公開）；膽汁 隱孢子蟲(C. galli) BE 13 (Ng等人，2006);豬隱孢子蟲(c suis)WA豬6 (Ryan等人’ 2003);有袋動物基因(未公 開）；及小鼠基因型II (未公開）。 35 200946682 用於本研究之陰性對照為純化自糞便樣本之DNA且藉 其它PCR方法識別為十二指腸梨形鞭毛蟲（Giardia duodenalis)(組合A、B及E)、俄亥俄同形孢子蟲（lsospora ohioensis)、肉孢子蟲種屬（Sarcocystis spp·)、犬鉤蟲 5 (Ancylostuma caninum)、或歐洲刺蜎螺旋條蟲（Spirometra erinaceieuropaei)(資料未公開）。 實例2 : LAMP引子 LAMP引子設計對隱孢子蟲肌動蛋白基因具有特異 性。先前公開之序列（Sulaiman等人，2002)使用BioEdit Ο 10 7.0.5.2版校準（Hall, 1999)，借助於校準及艾肯（Eiken)

PrimerExplorer 第 3版（http : //primerexplorer.jp/e/)手動設計 一組LAMP引子。引子於商業上係由西革馬-普里葛公司 (Sigma-Proligo)(澳洲新南威爾斯)合成。

15 表1 :靶定於短小隱孢子蟲及人隱孢子蟲基因之四種LAMP 引子核苷酸序列 引子 序列,5’，3’ 核苷 酸位置 SEQ ID NO : F3 caagatgtgttttcccatcga 83-103 1 B3 cctctggagcaacacgtaat 282-301 2 FIP ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg 163-186(Flc), 123-140 (F2) 7 BIP cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc 201-224(Blc), 255-278 (B2) 8 核苷酸位置之編號係基於人隱孢子蟲TU502肌動蛋白 序列基因庫XM_661095 (Xu等人，2004)。注意FIP及BIP雖 20 然各自只組成一個引子，但分別包含兩個分開核誓酸區F1C 及F2及Blc及B2。 36 200946682 實例3 : LAMP反應 5 ❹ 10 15 20 25微升LAMP反應混合物包含各ΐ.6μΜ之FIP及BIP内 引子’各0.8μΜ之F3及Β3外引子，8U Bst酶(新英格蘭生物 實驗室（New England Biolabs)，美國麻省），lx熱普 (ThermoPol)反應緩衝液（新英格蘭生物實驗室），200μΜ dNTP混合物（費雪生技公司（Fisher-Biotech)，西澳洲），0.8Μ 菜鹼（西革馬亞利敘公司，美國加州），3.34μΜ SYT09 (分 子探針公司（Molecular Probes)，美國俄勒岡州）及1微升熱鈍 化DNA樣本（95 °C 5分鐘）。反應混合物載荷入羅特基因 (RotorGene) 3000 (可貝研究公司（Corbett Research)，澳洲新 南威爾斯)及於60°C操作60分鐘，於FAM頻道(於470奈米激 發，於510奈米檢測）每分鐘獲得螢光資料30秒時間。包括 三個增益設定值(1、2及4或5)用於獲得螢光資料。然後藉於 80°C培養5分鐘結束反應。 實例4 :擴增子檢測與分析 藉LAMP反應擴增之DNA藉兩種不同方法檢測，亦即 即時螢光資料獲取及電泳後於紫外光下經溴化乙鍇染色之 1.5%瓊脂糖凝膠之檢查。 擴增子也經過定序來驗證隱孢子蟲LAMP引子已經擴 增期望的標靶。簡言之得自人隱孢子蟲6149樣板之10微升 LAMP後反應DNA接受凝膠電泳。然後經過激發且經純化 之約180 bp片段（第3圖）使用引子 5’-aggtgttatggtaggtatg-3’ FseqCrAct(SEQ IN NO : 5) 及 37 200946682 5’-agaaagtatgatgccagatc-3’ BseqCrAct(SEQ IN NO : 6) 接受PCR’該等引子含有重疊LAMP擴增子之F2序列及 B2序列區之相同序列。擴增後之產物轉殖入T〇p〇 TA載體 (因維左金公司（Invitrogen)，美國加州），轉形入大腸桿菌 5 (Escherichia coli)，篩檢後由純株獲得序列。 實例5 : LAMP陽性之檢測 LAMP引子設計成對人隱孢子蟲有特異性，於Bip引子 之5’端有一個鹼基對之不匹配。但實際上引子擴增人隱孢 子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲之靶定的肌動蛋白基 0 10 因’而未能擴增任何其它施加的DNA。約30至35分鐘達成 藉前述方法檢測人隱孢子蟲及短小隱孢子蟲，而火雞隱孢 子蟲之檢測出現於約45分鐘（第2圖）。LAMP反應未能擴增 萃取自全部其它試驗種屬包括其它隱孢子蟲種屬之Dna。 轉殖後LAMP產物定序產生與人隱孢子蟲6149相同的序列。 15 於經溴化乙鑛染色之瓊脂糖膠也檢測得陽性LAMP反 應，符合即時結果。陽性LAMP反應產生特徵性梯階狀外觀 (第3圖），最小帶之大小約為180 bp。 Ο 熟諳技藝人士瞭解未悖離廣義說明之本發明之精髓或 範圍可對如特定實施例顯示之本發明做出多項變化及/或 20 修改。因此實施例就各方面而言係視為說明性而非限制性。 【圖式簡單說明】 第1圖：與LAMP引子(於結束鹼基以帶有箭頭之虛線指 示）校準之人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲之核 苷酸序列。 38 200946682 第2圖：使用SYTO-9ds-DNA結合染料之LAMP反應之 即時擴增輪廓資料。 第3圖：藉1.5%瓊脂糖凝膠電泳之LAMP反應。1.人隱 孢子蟲6149 ; 2.短小隱孢子蟲IOWA ; 3.火雞隱孢子蟲 5 CZ-B1-32 ; 4.貝利隱孢子蟲（C. baileyi) CZ-B1-15;5.安德森 隱孢子蟲(C. andersoni) CZ-B1-52; 6_無DNA; Μ. 100 bp階 梯。 【主要元件符號說明】 200946682

SEQUENCE LISTING <110> Sydney Water Corporation, incorporated under the Sydney Water Act, 1994 (NSW)

Murdoch University <120> A method of detecting microorganisms <130> FBR 507634 <150> AU 2007906896 <151> 2007-12-17 <160> 8 <170> Patentln version 3.5

<210> 1 <211> 21 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <220>

<223 > Primer <400> 1 caagatgtgt tttcccatcg a 21

<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cctctggagc aacacgtaat 20 <210> 3

<211> 43 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220> <223 > Primer <220> < 2 21 > misc_feature <222> (25)7-(25) <223> n = linker or not present, n may be a number of nucleotides, e.g. <400> 3 ctttgattga gcttcatcac caacngccag gtgttatggt agg 43

<210> 4 <211> 49 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <220>

Primer <223> 1 200946682 <220> < 2 21 > mi s c—feature <222> (25)7. (25) <223> n = linker or not present, n may be a number of TTTT <400> 4 cttgaaatac ccaattgagc atggnttata gaaagtatga tgccagatc nucleotides, e.g 49 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > Primer <400> 5 aggtgttatg gtaggtatg 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > Primer <400> 6 agaaagtatg atgccagatc 20 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ctttgattga gcttcatcac caacgccagg tgttatggta gg 42 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 cttgaaatac ccaattgagc atgggttata gaaagtatga tgccagatc 49 2

Claims (1)

1. 2_46681、巾請專利範圍： 5 1. 一種檢測於一試驗樣本中人隱抱子蟲(C. hominis)、短小 隱孢子蟲(C. parvum)及火雞隱抱子蟲(c. meleagridis)中 之任何一者或多者之存在之方法，該方法包含該試驗樣 本接觸： (i) 一第一外引子及一第二外引子，其中該第一外 引子係與一標靶DNA序列之5’端相鄰之一區互 補及該第二外引子係與該標靶DNA序列之3’端 相鄰之一區互補，及 ❹1〇 (ii) 一第一内引子及一第二内引子，其中該等内引子 各自含有與該標靶DNA序列之一訊息序列及一 反訊息序列相對應之兩個分開序列；及 執行自動循環股置換DNA合成，及檢測已擴增的標 靶DNA之存在，其中該標靶DNA序列為人隱孢子蟲、短 15 小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲之實質上保留性DNA序列。 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法為定性檢測 ❹ 法。 3.如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該檢測係使用 dsDNA嵌入式螢光染料進行。 20 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該dsDNA嵌入式螢 光染料為SYTO-9。 5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法為定量檢測 法。 6.如申請專利範圍第5項之方法，其中該檢測係使用濁度 200946682 或彼入式染料進行。 7. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之方法，其中自動循 環係於高股置換活性DNA聚合酶之存在下進行。 8. 如申請專利範圍第1-7項中任一項之方法，其中該保留 5 性標靶DNA序列編碼肌動蛋白或其部分。 9. 如申請專利範圍第1-8項中任一項之方法，其中該自動 循環股置換DNA合成可為迴圈媒介恆溫擴增（「LAMP」) 方法。 10. 如申請專利範圍第1-9項中任一項之方法，其中該自動 10 循環股置換DNA合成包含一熱變性步驟、一反應步驟及 一結束步驟。 11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該熱變性步驟於約 95°C進行約5分鐘，該反應步驟於約60°C-66°C進行約35 分鐘至120分鐘及該結束步驟於約80°C進行約2分鐘至 15 10分鐘。 12. 如申請專利範圍第1-11項中任一項之方法，其中該方法 包含於嚴格雜交條件下，該已擴增的標靶DNA接觸偏好 雜交至該已擴增的標靶DNA之一雜交檢定分析探針或 其補體，因而形成可穩定用於檢測之一探針：已擴增的 20 標靶DNA序列或其補體之雜交體，以及檢測該探針··已 擴增的標靶DNA序列或其補體之雜交體之存在。 13. 如申請專利範圍第1-11項中任一項之方法，其中該已擴 增之標靶DNA係藉電泳方法檢測。 14.如申請專利範圍第13項之方法，其中該電泳方法為毛細 200946682 ⑩10 15 響 20 電泳法或凝膠電泳法。 15. 如申請專利範圍第1-11項中任一項之方法，其中該已擴 增之標靶DNA係藉南方墨點法或藉定序檢測。 16. 如申請專利範圍第1-11項中任一項之方法，其中該陽性 LAMP反應之檢測係藉目測觀察沉澱。 17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該沉澱係藉濁度的 增高而檢測。 18. 如申請專利範圍第16或17項之方法，其中該沉澱為焦磷 酸鎂。 19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該檢測為即時測量 或終點測量。 20. 如申請專利範圍第1-19項中任一項之方法，其中該檢測 進一步包含藉加入SYBR綠而目測觀察LAMP反應結果。 21. 如申請專利範圍第1-19項中任一項之方法，其中該檢測 包含添加低分子量聚伸乙基亞胺至該反應終點。 22. —種識別可用於如申請專利範圍第1-21項中任一項之 方法之人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲之至 少一個保留性核酸序列之方法。 23. 如申請專利範圍第22項之方法，包含識別可用於如申請 專利範圍第1-21項中任一項之方法之至少兩個保留性 核酸序列。 24. 如申請專利範圍第22或23項之方法，包含識別可用於如 申請專利範圍第1-21項中任一項之方法之至少三個保 留性核酸序列。 3 200946682 如申請專利範圍第22-24項中任一項之方法，包含識別 可用於如申請專利範圍第1-21項中任一項之方法之至 少四個保留性核酸序列。 26_如申請專利範圍第22-25項中任一項之方法，其中該方 5 法包含識別與選自於下列中之一序列互補的至少一個 序列： caagatgtgttttcccatcga SEQ ID NO ： 1 cctctggagcaacacgtaat SEQ ID NO : 2 ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg SEQ ID NO ·' 3 cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc SEQ ID NO : 4, 其令n為連接子或不存在。 10 27_如申請專利範圍第26項之方法，其中該連接子為一個或 多個核苷酸鹼基。 28. 如申請專利範圍第26或27項之方法，其中η為g。 29. 如申請專利範圍第22-27項中任一項之方法，其中該保 留性核酸序列編碼肌動蛋白或其部分。 15 30. —種可用於一擴增檢定分析中檢測人隱孢子蟲、短小隱 孢子蟲及火雞隱孢子蟲中之任一者或多者之存在之擴 增引子，該擴增引子包含一至少10個連續鹼基之區，其 係與存在於SEQ ID NO 1-4中之任一者之一至少1〇個連 續鹼基之區至少80%相同 20 SEQ ID NO ： 1 SEQ ID NO ： 2 SEQ ID NO : 3 SEQ ID NO : 4, caagatgtgttttcccatcga cctctggagcaacacgtaat ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc 其中n為一連接子或不存在。 4 200946682 31 ·如申請專利範圍第3G項之擴增引子，其中該連接子為-個或多個核苷酸鹼基。 32·如申請專利範圍第3G或31項之擴增引子，其中命。 33.如申請專利範圍第3〇32項中任一項之擴增引子其中 5 韻增5丨子包含—至少職連續驗基之區，其係與存在 於SEQ ID NO i_4中之任一者之一至少1〇個連續鹼基之 區至少90%相同。 ' 34·如申請專利範圍第30_33項中任一項之擴增引子，其中 © 該擴增？丨子包含—至少聰連續驗基之區，其係與存在 1〇 MSEQ ID N0 1-4中之任一者之一至少10個連續鹼基之 區至少100%相同。 " 35· 一種用於測定人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子 ' 蟲中之任一者或多者是否存在於一試驗樣本之雜交探 針’其中該探針包含一至少1〇個連續鹼基之區，其係與 15 存在於SEQ NO I-4中之任一者之一至少10個連續驗 基之區至少80%相同 caagatgtgttttcccatcga SEQ ID NO : 1 cctctggagcaacacgtaat SEQ ID NO ： 2 ctttgattgagcttcatcaccaacngccaggtgttatggtagg SEQ ID NO : 3 cttgaaatacccaattgagcatggnttatagaaagtatgatgccagatc SEQ ID NO : 4, 其中n為連接子或不存在。 20 36.如申請專利範圍第35項之雜交探針，其中該連接子為多 個核苔酸鹼基。 37.如申請專利範圍第35或36項之雜交探針，其中該n為c。 38·如申請專利範圍第35-37項中任一項之雜交探針，其中 5 200946682 至少10個連續驗基之區，其係與存在於 -4中之任一者之一至少1〇個連續鹼基之區 s亥探針包含 SEQ ID NO 至少9〇%相同 39·如申請專利蘇阁哲。 ^ 該探針包含 SEQ ID 5 10 該#…軏圍第35-兇項中任一項之雜交探針，其中 至少10個連續鹼基之區，其係與存在於 至小NO 中之任一者之一至少10個連續鹼基之區 至少100%相同。 40·女3申士太直^ ^ 月 範圍第35-39項中任一項之雜交探針，其中 隱朱針於祕雜交檢定分析條件下，係優絲交至鱼人 1¾ ^ J2L * — 小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲有機體中之任 —者或多者至少8G%互補之—躲核酸而非雜交至衍 生自非人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子蟲之核 41·如申請專利範圍第35·4()項中任—項之雜交探針，其中 15 該雜交探針包含一可檢測標記。 &如申請專利顧第例之雜交探針，其中該可檢測標記 係選自於由放射性同位素、酶、酶輔因子、酶基質染 料、半抗原、化學冷光分子、螢光分子、磷光分子、電 化學冷光分子、產色基團、無法敎雜交至該標姉酸 20 之驗基序列區所組成之組群。 43. —種用於測定人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火雞隱孢子 蟲中之任一者或多者是否存在於一試驗樣本之套件 組，該套件組包含至少一個如申請專利範圍第3〇34項 中任一項之擴增探針。 200946682 . 44. 如申請專利範圍第43項之套件組，包含至少一個如申請 專利範圍第35-42項中任一項之雜交探針。 45. 如申請專利範圍第43或44項之套件組，包含至少一個如 申請專利範圍第30-34項中任一項之擴增探針及包含至 5 少一個如申請專利範圍第35-42項中任一項之雜交探 針。 46. 如申請專利範圍第43-45項中任一項之套件組，包含擴 •增所需之核苷酸及/或至少一種酶。 g 47.如申請專利範圍第41-43項中任一項之套件組，包含用 10 於測定於一試驗樣本中人隱孢子蟲、短小隱孢子蟲及火 雞隱孢子蟲有機體中之任一者或多者之存在之書面指