JP2011505844A - クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）の検出方法 - Google Patents

クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）の検出方法 Download PDF

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Abstract

クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）有機体全般そして特にＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）有機体の１つ以上および／または核酸配列の検出および／または同定方法、およびクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）有機体全般そして特にＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）有機体の１つ以上の存在を水、糞便、食物またはその他の試料媒質の試験試料中で判定するのに有用なハイブリダイゼーション検定プローブ、ヘルパープローブ、増幅プライマ、核酸組成物、プローブミックス、方法およびキット。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、内容が本明細書に参照により援用されている２００７年１２月１７日出願のオーストラリア仮特許出願第２００７９０６８９６号明細書による優先権を主張するものである。
本発明は、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）有機体全般そして特にＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）有機体の１つ以上および／または核酸配列の検出および／または同定方法、およびクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）有機体全般そして特にＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）有機体の１つ以上の存在を水、糞便、食物またはその他の試料媒質の試験試料中で判定するのに有用なハイブリダイゼーション検定プローブ、ヘルパープローブ、増幅プライマ、核酸組成物、プローブミックス、方法およびキットに関する。
クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種（アピコンプレクサ（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）門）は、さまざまな哺乳動物種の腸管に寄生することのできるコクシジウム原生動物である。クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種は、大部分の脊椎動物群に拡がっている。畜牛、羊などの動物は、ヒトに感染するヒトクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）の重大な保有動物である。病気はディケア・センタ、病院および都市部の家庭群において発生するが、大部分のヒト感染は、人畜共通経路または水媒介経路を介してではなくむしろヒト同士で感染する。オーシストはほぼ排せつ物中のみに発見されることから、伝染はまちがいなく糞便−経口伝染である。それでも、地表水および飲料水の両方からオーシストが時として回収されることは、水を介しての間接的な伝染の可能性も示唆している。
最初に動物の病原体として認識され、ヒト疾患の原因としてのその重要性は、後天性免疫不全症候群が蔓延するまで正しく評価されなかった。Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）は特に、現在世界中の免疫不全者および免疫健常者の両方において下痢疾患の重要な原因として認識されている。この疾病は１〜１４日間の潜伏期間を有し、疾候は７〜６０日間持続する。この腸内病原体はまた、開発途上国の幼児が罹患する下痢／栄養失調の悪循環において重要な役割を果たすことも示されてきた。塩素消毒に対する耐性および有効な臨床治療の欠如がこの有機体の健康に対する影響を助長している。
クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種は、環境耐性を有する壁の厚いオーシストの形で自然界に存在する。これらのオーシストは、水中で長期にわたり生存し続けることがわかっており、塩素などの従来の水殺菌剤の影響を受けない。摂取後、腸管内腔内の胆汁酸の作用によりオーシストから放出された運動性種虫は、腸の内側を覆う上皮細胞に浸入し、これらの宿主細胞の微絨毛膜の下側で寄生体胞を形成し、有性および無性の両方の生殖期を含む複雑な生涯過程を開始させる。
クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）種を検出するための公知の方法には、「Ｍｅｔｈｏｄ １６２２」および「Ｍｅｔｈｏｄ １６２３」と呼ばれる抗体染色法が含まれる。これらの方法には、検定の主観性、この方法ではクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種を弁別することができないこと、そして何時間もの顕微鏡分析を必要とするその労働集約的側面を含め、いくつかの欠点がある。その他の方法は、感度または特異性が欠如しているかまたは実施するのにコストの高い設備および専門的知識を必要とする。
Ｉｗａｍｏｔｏ， ２０００， Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４１：２６１６−２６２２
したがって、試験試料中のクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）有機体、そして特にＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）有機体の存在を判定するのに使用できる感度および特異性の高い検定が必要とされている。しかしながら、より詳細には、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）の公知の種のうち、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）がヒトにおける臨床的有意性を有する。したがって、ヒトの健康に関して水、糞便、食物またはその他の試料媒質の試験試料中でＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）を特異的に検出するための有効な方法が必要とされている。
本発明によると、試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在を検出する方法であって、
（ｉ） 第１および第２の外部プライマ（ここで、第１の外部プライマは標的ＤＮＡ配列の５’末端に隣接する領域と相補的であり、第２の外部プライマは、標的ＤＮＡ配列の３’末端に隣接する領域と相補的である）および；
（ｉｉ） 第１および第２の内部プライマ（ここで、内部プライマは各々、標的ＤＮＡ配列のセンスおよびアンチセンス配列に対応する２つの異なる配列を含んでいる）；
と試験試料とを接触させるステップと；自己循環型鎖置換ＤＮＡ合成を実施するステップと；増幅させた標的ＤＮＡの存在を検出するステップとを含む方法において、標的ＤＮＡ配列がＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）の実質的に保存されたＤＮＡ配列である、方法が提供されている。
検出は、例えばｄｓＤＮＡ挿入蛍光染料ＳＹＴＯ−９を用いて定性的に実施されてもよいし、あるいは、例えば濁度（Ｍｏｒｉ、２００４ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ５９：１４５−１５７）または挿入染料（Ａｏｉ、２００６ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １２５：４８４−４９１）を用いて定量的に実施されてもよい。
自己循環は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で実施されてよい。
ＤＮＡポリメラーゼは、高鎖置換活性ＤＮＡポリメラーゼであってよい。
保存標的ＤＮＡ配列はアクチンをコードしてよい。
自己循環型鎖置換ＤＮＡ合成は、ループ仲介等温増幅（「ＬＡＭＰ」）方法であってよい。
自己循環型鎖置換ＤＮＡ合成は熱変性ステップ、反応および終結ステップを含んでいてよい。熱変性ステップは、約９５℃で約５分間行なわれてよい。反応ステップは、約６０℃〜６６℃で約３５分〜１２０分間行なわれてよい。終結ステップは、約８０℃で約２分〜１０分間行なわれてよい。
この方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、増幅標的ＤＮＡまたはその補体に対し優先的にハイブリッド形成するハイブリダイゼーション検定プローブと増幅標的ＤＮＡを接触させ、それによって検出に対して安定したプローブ：増幅標的ＤＮＡ配列またはその補体のハイブリッドを形成するステップおよび、プローブ：増幅標的ＤＮＡ配列またはその補体のハイブリッドの存在を検出するステップを含んでいてよい。
本発明はまた、増幅検定においてＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在を検出するのに有用である増幅プライマも提供している。この増幅プライマは、
という配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域と少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％そしてより好ましくは１００％）の同一性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含んでいてよく、ここでｎはリンカーであるかまたは不在であってよい。リンカーはいくつかのヌクレオチド塩基、例えばｔｔｔｔであってもよい。
本発明の増幅プライマは、少なくとも２つの増幅プライマのセットで使用されてよい。本発明はさらに、増幅条件下で上述の増幅プライマと各プライマについての標的ＤＮＡ配列との間で形成される安定した核酸２重鎖を含む組成物を企図している。
本発明はまた、試験試料中にＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上が存在するか否か判定するためのハイブリダイゼーションプローブであって、好ましくは配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域と少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％そしてより好ましくは１００％）の同一性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含むプローブも提供する。これらのプローブは好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション検定条件下でＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）以外のものから誘導された核酸に対してではなくＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上と少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％そしてより好ましくは１００％）の相補性を有する標的核酸に対して優先的にハイブリッド形成してよい。
このプローブは、検出可能な標識を含んでいてよい。この標識は、放射性同位体、酵素、酵素補助因子、酵素基質、染料、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発色団、および標的核酸に対し安定した形でハイブリッド形成することができない塩基配列領域を含む（ただしこれらに限定されない）任意の適切な標識用物質であってよい。
増幅された標的ＤＮＡは、電気泳動法によって検出されてよい。電気泳動法は、キャピラリー電気泳動法、ゲル電気泳動法であってよい。増幅標的ＤＮＡは、サザンブロット法または配列決定により検出されてよい。陽性ＬＡＭＰ反応の検出は、反応終了の視覚化によるものであってよい。ＬＡＭＰ反応により生産されるＤＮＡが大量であることから、白色沈殿物が副産物として観察されるかもしれない。この沈殿物はピロリン酸マグネシウムである。この沈殿物を濁度の増大に関係づけしてもよく、これは例えば濁度計を使用して陽性反応を検出する別の手段になり得る。これは、実時間測定かまたは終点測定のいずれであってもよい。ＬＡＭＰ反応結果を視覚化するさらなる手段は、ＳＹＢＰ Ｇｒｅｅｎの添加によるものであり、ここで陽性反応は混合時点で明緑色に変化し、一方陰性反応はオレンジ色にとどまる（Ｉｗａｍｏｔｏ， ２０００， Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４１：２６１６−２６２２）。
陽性ＬＡＭＰ反応を検出する別の手段は、反応終点に対する低分子量のポリエチレンイミンの付加を使用することであってよい。これは、存在するあらゆる増幅されたＤＮＡと不溶性錯体を形成するかもしれない。標識されたプローブを標準ＬＡＭＰプライマに付加してもよい（Ｍｏｒｉ， ２００６ ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ６：３）。
本発明はまた、本発明に係る試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の保存標的ＤＮＡ配列の存在を検出する方法において有用であるＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）の少なくとも１つの保存核酸配列を同定する方法も提供している。一実施形態においては、この方法には、本発明に係る試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の保存標的ＤＮＡ配列の存在を検出する方法において有用である少なくとも２つの保存核酸配列を同定するステップが含まれる。一実施形態において、この方法には、本発明に係る試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の保存標的ＤＮＡ配列の存在を検出する方法において有用である少なくとも３つの核酸配列を同定するステップが含まれる。一実施形態において、この方法には、本発明に係る試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の保存標的ＤＮＡ配列の存在を検出する方法において有用である少なくとも４つの保存核酸配列を同定するステップが含まれる。別の実施形態において、この方法は、
から選択された配列と相補的な少なくとも１つの配列を同定するステップが含まれ、ここで配列番号１〜４から選択された配列に相補的な少なくとも１つの配列は、本発明に係る試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の保存標的ＤＮＡ配列の存在を検出する方法において有用である。１つまたは複数の保存核酸配列はアクチンまたはその１つまたは複数の部分をコードしてよい。
ｎは、リンカーであっても、または不在であってもよい。リンカーは、いくつかのヌクレオチド塩基、例えばｔｔｔｔであってよい。
本発明はまた、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上が試験試料中に存在するか否かを判定するためのキットも提供する。
キットには、本発明に係る少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブが含まれ、任意には試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在を判定するための使用説明書が含まれていてよい。
キットは、本発明に係る少なくとも１つの増幅プローブを含んでいてよい。
キットは、本発明に係る少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブおよび本発明に係る少なくとも１つの増幅プローブを含んでいてよい。本発明はまた、本発明に係る増幅プライマのうちの少なくとも１つを含み、かつ任意には核酸を増幅するための使用説明書を含む、本発明に係る標的ＤＮＡ配列を増幅するためのキットも企図している。好ましい実施形態においては、キットはさらに増幅に必要とされるヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの酵素を含む。
当業者であれば、必要とされる特異度に応じて本発明のハイブリダイゼーション検定プローブを増幅プライマまたは捕捉プローブとして使用してもよいこと、そして本発明の増幅プライマをハイブリダイゼーション検定プローブまたは捕捉プローブとして使用し得るということを認識する。
本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語またはその活用形例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、規定の要素、整数またはステップまたは一群の要素、整数またはステップの包含を意味し、任意のその他の要素、整数またはステップ、または一群の要素、整数またはステップの排除は意味しないものと理解される。
本明細書中で言及されている全ての参考文献は、その全体が本明細書に参照により援用されている。これらの参考文献が単独で援用される場合、これらの参考文献の全てまたは任意の特定の参考文献の任意の部分が特許出願のための任意の法定開示要件を満たすために不可欠な事項であると発明人らがみなしていることの表明または了解と判断してはならない。
本明細書に援用された文献、作業、材料、装置、物品などについての論述は全て、本発明のための背景を提供する目的のみを有するものである。それを、これらの事項のいずれかまたは全てが先行技術の根拠の一部を成すかまたは本出願の各請求項の優先日以前に存在していたために本発明に関連する分野における共通の一般的知識であったことの了解としてとらえてはならない。
本発明のその他の特徴および利点は、本発明の限定的でない実施形態の記述を通して明らかとなり、これらは添付図面を用いて例示される。
（末端塩基に矢印がある状態で破線で表わされた）ＬＡＭＰプライマと整列されたＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のヌクレオチド配列。 ＳＹＴＯ−９ｄｓ−ＤＮＡ総合染料を用いたＬＡＭＰ反応の実時間増幅プロフィール。 １．５％のアガロースゲル電気泳動によるＬＡＭＰ反応。１． Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ） ６１４９；２． Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ） ＩＯＷＡ；３． Ｃ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ） ＣＺ−Ｂ１−３２；４． Ｃ．バイレイ（Ｃ． ｂａｉｌｅｙｉ）ＣＺ−Ｂ１−１５；５． Ｃ．アンデルソニ（Ｃ． ａｎｄｅｒｓｏｎｉ） ＣＺ−Ｂ１−５２；６． ＤＮＡ無し； Ｍ．１００ｂｐラダー。
本発明は、ヒトの健康に関して水、糞便、食物またはその他の試料媒質の試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）を特異的に検出するための有効な方法を提供する。
定義
以下の用語は、異なる意味を有することが明示されているのでない限り、指示された意味を有する。：
「存在または不在を検出する」という文言は、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種の存在または不在についての臨床的に許容できる規格が有する意味合いで用いられている。
「核酸増幅」または「標的増幅」という用語は、少なくとも１つの標的核酸配列を有する核酸分子の数を増大させることを意味する。本発明に係る標的増幅は、線形増幅または指数増幅のいずれかであってよいが、指数増幅が好ましい。
「監視」は、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種の存在または不在について系統的に照査または検査するという意味で使用される。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション検定条件」、「ハイブリダイゼーション検定条件」、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェント条件」というのはハイブリダイゼーション検定プローブから標的核酸（クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種有機体に特異的な核酸）に優先的にハイブリッド形成でき、密接に関連する非標的微生物に由来する核酸にはハイブリッド形成できないようにする条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション検定条件は、プローブのＧＣ含有量および長さ、試験試料中に存在し得る非標的配列の１つまたは複数のプローブ配列と標的配列との間の類似度を含めた因子に応じて変動してよい。
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」または「標的領域」は、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列のすべてまたは一部分を含む特異的デオキンリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味している。
「標的核酸」または「標的」とは、標的核酸配列を含有する核酸を意味する。
本発明は、クリプトスポリジウム種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）の属に帰属する有機体が、水、糞便、食物またはその他の試料媒質などの試験試料中に存在するのか否か、具体的には、ヒトの健康に関して水、糞便、食物またはその他の試料媒質の試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のうちのいずれか１つ以上の存在を判定するために有用である単離核酸分子を特徴としている。
試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のうちいずれか１つ以上の存在を検出する方法
本発明によると、試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在を検出する方法であって、
（ｉ） 第１および第２の外部プライマ（ここで、第１の外部プライマは標的ＤＮＡ配列の５’末端に隣接する領域と相補的であり、第２の外部プライマは、標的ＤＮＡ配列の３’末端に隣接する領域と相補的である）および；
（ｉｉ） 第１および第２の内部プライマ（ここで、内部プライマは各々、標的ＤＮＡ配列のセンスおよびアンチセンス配列に対応する２つの異なる配列を含んでいる）；
と試験試料とを接触させるステップと；自己循環型鎖置換ＤＮＡ合成を実施するステップと；増幅させた標的ＤＮＡの存在を検出するステップとを含む方法において、標的ＤＮＡ配列がＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）の実質的に保存されたＤＮＡ配列である、方法が提供されている。
検出は例えばｄｓＤＮＡ挿入蛍光染料ＳＹＴＯ−９を用いて定性的に実施されてもよいし、あるいは、例えば濁度（Ｍｏｒｉ， ２００４ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ５９：１４５−１５７）または挿入染料（Ａｏｉ， ２００６ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １２５：４８４−４９１）を用いて定量的に実施されてもよい。
自己循環は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で実施されてよい。
ＤＮＡポリメラーゼは、高鎖置換活性ＤＮＡポリメラーゼであってよい。
１つまたは複数の保存標的ＤＮＡ配列はアクチンまたはその１つまたは複数の部分をコードしてよい。
自己循環型鎖置換ＤＮＡ合成は、ループ仲介等温増幅（「ＬＡＭＰ」）方法であってよい。
自己循環型鎖置換ＤＮＡ合成は熱変性ステップ、反応および終結ステップを含んでいてよい。熱変性ステップは、約９５℃で約５分間行なわれてよい。反応ステップは、約６０℃〜６６℃で約３５分〜１２０分間行なわれてよい。終結ステップは、約８０℃で約２分〜１０分間行なわれてよい。
この方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、増幅標的ＤＮＡまたはその補体に対し優先的にハイブリッド形成するハイブリダイゼーション検定プローブと増幅標的ＤＮＡを接触させ、それによって検出に対して安定したプローブ：増幅標的ＤＮＡ配列またはその補体のハイブリッドを形成するステップおよび、プローブ：増幅標的ＤＮＡ配列またはその補体のハイブリッドの存在を検出するステップを含んでいてよい。
増幅プライマ
本発明はまた、増幅検定においてＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在を検出するのに有用である増幅プライマも提供している。この増幅プライマは、
という配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域と少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％そしてより好ましくは１００％）の同一性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含んでいてよい。
ｎはリンカーであるかまたは不在であってよい。リンカーはいくつかのヌクレオチド塩基、例えばｔｔｔｔであってもよい。
本発明の増幅プライマは、少なくとも２つの増幅プライマのセットで使用されてよい。本発明はさらに、増幅条件下で上述の増幅プライマと各プライマについての標的ＤＮＡ配列との間で形成される安定した核酸２重鎖を含む組成物を企図している。
増幅プライマは、配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域に対して少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％そしてより好ましくは１００％）の相同性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含んでいてよい。本発明の増幅プライマは、少なくとも２つの増幅プライマのセットの形で使用されてよい。本発明はさらに、増幅条件下で上述の増幅プライマと各プライマについての標的核酸との間に形成される安定した核酸２重鎖を含む組成物を企図している。増幅プライマがＲＮＡ合成を開始するように設計されている場合、このプライマは、標的配列に相補的ではないもののＴ７、Ｔ３またはＳＰ６ＲＮＡポリメラ―ゼなどのＲＮＡポリメラーゼによって認識される塩基配列を含んでいてよい。本発明の増幅プライマは、プライマ拡張の速度または量を抑えるか削減するように修飾される３’末端を含んでいてよい。（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」米国特許第５，７６６，８４９号明細書は、修飾または遮断された３’末端を有するプロモータープライマを開示している）。本発明の増幅プライマは、化学的に合成されてもよいし、ベクターから誘導されてもよいが、これらは天然に発生する核酸分子ではない。
本発明の増幅プライマは、ＬＡＭＰ反応試薬とともに、オーシスト、糞便または水の試料の粗製調製物に対し適用してよく、反応の性能はこれらの条件下で査定される。オーシストは、当業者にとっては周知の単離方法にしたがってＤＮＡを解放するため水からの濃縮により単離されてよい。次にＬＡＭＰを用いた増幅を利用してＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のうちのいずれか１つ以上の存在を検出することができる。ループ仲介等温増幅（「ＬＡＭＰ」）は、熱循環を必要としないＤＮＡ増幅方法である（Ｎｏｔｏｍｉら、２０００）。それは、鎖置換活性をもつＤＮＡポリメラーゼならびに標的ＤＮＡ上の６つの領域に特異的な少なくとも４つのプライマのセットを使用する。きわめて選択性および特異性の高いＬＡＭＰ反応は通常１時間未満で等温条件（例えば６０℃〜６５℃）で実施されてよい。
検出可能なプローブ
本発明はまた、試験試料中にＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上が存在するか否か判定するための検出可能なプローブであって、好ましくは配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域と少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％そしてより好ましくは１００％）の同一性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含むプローブも提供する。これらのプローブは好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション検定条件下でＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）以外のものから誘導された核酸に対してではなくＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上と少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％そしてより好ましくは１００％）の相補性を有する標的核酸に対して優先的にハイブリッド形成してよい。
このプローブは、検出可能な標識を含んでいてよい。この標識は、放射性同位体、酵素、酵素補助因子、酵素基質、染料、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発色団、および標的核酸に対し安定した形でハイブリッド形成することができない塩基配列領域を含む（ただしこれらに限定されない）任意の適切な標識用物質であってよい。
本発明の検出可能なプローブは、ストリンジェント条件下でＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上に由来する核酸に対し安定した形で結合しない標的結合領域の塩基配列に加えて１つ以上の塩基配列を含んでいてよい。付加的な塩基配列はストリンジェント条件下で標的有機体由来の核酸に対し安定した形で結合しないかまたは標的核酸に対する安定したハイブリダイゼーションを妨げないかぎり、任意の所望の塩基配列で構成されていてよい。一例を挙げると、付加的な塩基配列は、捕捉プローブの固定化プローブ結合領域を構成してよく、ここでこの固定化プローブ結合領域は、例えば、固定支持体に対し直接または間接的に結合したポリヌクレオチドの５’ｐｏｌｙ ｄＴ（チミン）領域に対しストリンジェント条件下でハイブリッド形成する３’ｐｏｌｙ ｄＡ（アデニン）領域で構成されている。付加的な塩基配列はまた、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるかまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を増強する（例えばＴ７プロモータ）５’配列でもあると考えられる。最初の配列が例えば「分子指標」プローブ内に取り込まれる場合、２つ以上の付加的な塩基配列が含まれてよい。分子指標については、Ｔｙａｇｉら、「Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｄｕａｌ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ， Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ」米国特許第５，９２５，５１７号明細書により開示されており、これには、互いに少なくとも部分的にのみ相補的である領域を有する２つの塩基配列によって結合されている標的結合領域が含まれる。付加的な塩基配列を標的結合領域に対して直接、または例えば非ヌクレオチドリンカーを用いて接合させてよい。
本発明の検出可能なプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション検定条件下での検出のために安定したプローブ：標的ハイブリッドを形成するのに充分な相補性をその標的核酸配列に対して有する塩基配列を含んでいてよい。当業者であれば分かるように、ハイブリダイゼーションプローブは、人間の介入なく自然界には見出されることのない形態の（例えば外来性核酸で組み換えられるか、単離されるかまたは或る程度まで精製されている）単離核酸分子またはその類似体である。
本発明に係る検出可能なプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションを妨げずかつハイブリダイゼーション検定プローブの場合、標的核酸に対する優先的ハイブリダイゼーションを妨げないかぎりにおいて、付加的なヌクレオシドまたは核酸塩基を標的領域の外部に含んでいてよい。非相補的配列、例えば標的捕捉配列（一般にはホモポリマー経路、例えばｐｏｌｙ−Ａ、ｐｏｌｙ−Ｔまたはｐｏｌｙ−Ｕテール）、プロモータ配列、ＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、あるいは検出および／または増幅を容易にするために使用可能である触媒活性部位またはヘヤピン構造などの所望の二次または三次構造を付与する配列なども含み入れてよい。本発明に係る検出可能なプローブは、当業者にとって公知の技術、例えば化学合成および試験管内または生体内発現により、組み換え型核酸分子から生産してもよい。
当業者であれば、ハイブリダイゼーションが、２本鎖領域を有する安定した構造を形成するべく、平行なまたは好ましくは逆平行の配向で、特定のハイブリダイゼーション検定条件下において２つの完全にまたは部分的に相補的な核酸ストランドが集合できる能力を意味するということを認識する。時としてハイブリッドと呼ばれるこの２本鎖構造の２つの構成ストランドは、水素結合によって共に保持される。これらの水素結合は最も一般的には塩基アデニンおよびチミンまたはウラシル（ＡおよびＴまたはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を単一の核酸ストランド上に含むヌクレオチドの間に形成されるが、塩基対はまた、これらの「標準的」対のメンバーでない塩基の間で形成され得る。非標準的塩基対は、当該技術分野において周知である（例えばＲｏｇｅｒ Ｌ． Ｐ． Ａｄａｍｓら、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ （１１ｔｈ ｅｄ １９９２）を参照のこと）。
必要条件ではないものの、プローブは好ましくは、検出可能な標識または一群の相互作用する標識を含む。標識は、放射性同位体、酵素、酵素補助因子、酵素基質、染料、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発色団、および所定の条件下で標的核酸に対し安定した形でハイブリッド形成することができない塩基配列領域、ならびにこれらの混合物を含む（ただしこれらに限定されない）任意の適切な標識用物質であってよい。１つの特に好ましい実施形態においては、標識はアクリジニウムエステル（ＡＥ）、好ましくは４−（２−スクシニミジルオキシカルボニルエチル）−フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネート（以下「標準ＡＥ」と呼ぶ）である。相互作用する標識の群には、酵素／基質、酵素／補因子、発光／クエンチャ、発光／付加物、染料ダイマーおよびフォレスタエネルギー伝達対が含まれているが、これらに限定されない。
捕捉プローブ
当業者であれば、「捕捉プローブ」が、標的核酸および固定化プローブに対しハイブリッド形成でき、それによって試験試料中の標的核酸を固定化し単離する手段を提供するオリゴヌクレオチドまたは互いに連結された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセットであるということを認識する。標的核酸に対しハイブリッド形成する捕捉プローブの部分は、「標的結合領域」と呼ばれ、固定化プローブに対しハイブリッド形成する捕捉プローブの部分は、「固定化プローブ結合領域」と呼ばれる。好ましい捕捉プローブは検定条件下で標的核酸と固定化プローブの両方に対しハイブリッド形成するが、一方、標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、異なるハイブリダイゼーション条件下でそのそれぞれの標的配列にハイブリッド形成するように設計されていてよい。このようにして、捕捉プローブは、それが最初により有利な溶液内動態の下で標的核酸に対しハイブリッド形成してから、固定化プローブに対する固定化プローブ結合領域のハイブリダイゼーションを可能にするように条件を調整するような形で、設計されてよい。標的結合領域および固定化プローブ結合領域が同じ捕捉プローブ上に提供される場合、これらは、同じオリゴヌクレオチド上で直接連接していてよく、１つ以上の任意に修飾されたヌクレオチドにより互いに分離されていてもよく、あるいは非ヌクレオチドリンカーを用いて互いに接合されていてもよい。標的結合領域は、標的核酸中に存在する標的配列、この標的配列のＤＮＡまたはＲＮＡ等価物またはこの標的配列の補体に対して検定条件下で安定した形で結合するオリゴヌクレオチドの部分である。検定条件は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件または増幅条件であってよい。
「固定化プローブ結合領域」は本明細書において、検定条件下で固定化プローブに対しハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドの部分であるものと理解される。
「固定化プローブ」は本明細書において、固定化された支持体に捕捉プローブを接合させるためのオリゴヌクレオチドであるものと理解される。固定化プローブは、同じ条件か異なる条件かに関わらず、捕捉プローブを標的核酸および固定化プローブに対してハイブリッド形成するのに利用される条件の下で、安定したものであり続ける連結または相互作用によって固体支持体に直接的にまたは間接的に接合される。固定化プローブは、試料中の未結合材料からの結合済み標的核酸の分離を容易にする。
本発明は、固定化プローブ結合領域および標的結合領域を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む捕捉プローブを提供する。捕捉プローブの固定化プローブ結合領域は、試験試料中に存在する固定支持体に結合されたオリゴヌクレオチドに対しストリンジェント条件下で安定した形でハイブリッド形成できる任意の塩基配列で構成されていてよい。固定化プローブ結合領域は、捕捉プローブの３’末端にあるｐｏｌｙ ｄＡ、ホモポリマーテールであってよい。固定支持体に結合されたオリゴヌクレオチドは、検定条件下で捕捉プローブのｐｏｌｙ ｄＡテールに安定した形で結合するのに充分な長さの５’ｐｏｌｙ ｄＴテールを含んでいてよい。固定化プローブ結合領域は、長さが約３０アデニンのｐｏｌｙ ｄＡテールを含み、捕捉プローブは、標的結合領域と固定化プローブ結合領域とを互いに接合するための長さ約３チミンのスペーサ領域を含む。
捕捉プローブの標的結合領域は、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のうちのいずれか１つ以上に由来する核酸中に存在する標的配列に対して安定した形で結合してよい。
捕捉プローブの標的結合領域は、配列番号１〜４からなる群から選択された塩基配列に対して少なくとも約８５％（好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは１００％）の相補性を持つ塩基配列領域を含んでいてよい。
望ましくないクロスハイブリダイゼーション反応を防止するため、捕捉プローブは、検定条件下で試験試料内に存在し得るあらゆる有機体に由来する核酸に対して安定した形で結合することのできる標的結合領域のヌクレオチド塩基配列以外のヌクレオチド塩基配列を排除してよい。このアプローチと矛盾せずに、形成される捕捉プローブ：標的錯体の固定化を最大限にする目的で固定化プローブ結合領域のヌクレオチド塩基配列を、それが検定条件下で固定化プローブ中に存在するヌクレオチド塩基配列に対し安定した形で結合でき試験試料中に存在し得るＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）でない任意の有機体に由来する核酸には結合できないような形で設計してよい。
捕捉プローブの標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、捕捉プローブ：固定化プローブ錯体のＴｍよりも捕捉プローブ：標的錯体のＴｍが高くなるような形で選択されてよい。このようにして、固定化プローブよりも標的配列に対する捕捉プローブのハイブリダイゼーションに有利に作用し、それによって標的配列に対する捕捉プローブのハイブリダイゼーションの最適な液相ハイブリダイゼーション動態を提供する第１の条件セットを課してよい。捕捉プローブが標的配列に結合するのに充分な時間がひとたび経過した時に、固定化プローブに対する捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にするストリンジェンシーの比較的低い第２の条件セットを課してよい。
本発明の捕捉プローブはまた、試験試料中の標的配列の直接的検出のための標識または相互作用する一対の標識を含んでいてよい。標識、標識の組合せおよびプローブ標識手段の限定的でない例は、当業者にとっては公知である。
プローブに試料中に存在する標的核酸に対しハイブリッド形成するのに充分な時間ができた時点で、精製ステップ中に反応容器内で単離され得る磁性を帯びた粒子に対し、固定化プローブを接合してよい（Ａｃｏｓｔａら、「Ａｓｓａｙ Ｗｏｒｋ Ｓｔａｔｉｏｎ」米国特許第６，２５４，８２６号明細書はかかる精製ステップを実施するための計器を開示している）。捕捉プローブは、捕捉プローブ：標的ハイブリッドの溶融温度が、捕捉プローブ：固定化プローブハイブリッドの溶融温度よりも高くなるように設計されてよい。このようにして、固定化オリゴヌクレオチドに対する捕捉プローブのハイブリダイゼーションに先立ち標的核酸に対する捕捉プローブのハイブリダイゼーションを容易にするために、異なるハイブリダイゼーション検定条件セットを利用して、遊離プローブの濃度を最大限にして有利な液相ハイブリダイゼーション動態を提供することができる。この「２段階」標的捕捉方法は、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら、米国特許第６，１１０，６７８号明細書によって開示されている。本発明に容易に適合され得るその他の標的捕捉スキームは、当該技術分野において周知であり、限定的な意味なく、以下の文献により開示されたものを含む：Ｄｕｎｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， 「Ｍａｐｐｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｍＲＮＡｓ ｂｙ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」 ６５（１）：４６８ ４７８ （１９８０）；Ｒａｎｋｉら、米国特許第４，４８６，５３９号明細書；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７５１，１７７号明細書；およびＢｅｃｋｅｒら、米国特許第６，１３０，０３８号明細書。
検出可能な標識および検出方法
プローブ／プライマは、検出可能な標識を含んでいてよい。この標識は、放射性同位体、酵素、酵素補助因子、酵素基質、染料、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発色団、および標的核酸に対し安定した形でハイブリッド形成することができない塩基配列領域を含む（ただしこれらに限定されない）任意の適切な標識用物質であってよい。プロ―ビングは、サザンブロット法において放射性標識化プローブを用いることで実施可能であるが、例えば、ビオチンまたは蛍光剤などのマーカーで標的配列と相補的なオリゴヌクレオチドにタグ付けし、陽性結果と結合済みマーカーの存在を関連付けることによって、または公知の要領でＥＬＩＳＡにおいて活性作用物質としてビオチンタグを用いるかまたは蛍光を検出することによる、その他のプロ―ビング技術の使用も提供されている。
本発明は、増幅産物内に直接標識を取り込むことが関与する直接的技術であるその場検出方法を提供する。例えば、増幅カクテル中には、ジゴキシゲニン［ＤＩＧ］−ｄＵＴＰまたはフルオレセイン−ｄＵＴＰなどのレポータ分子が含まれ、増幅産物内に取り込まれてよい。このときアルカリホスファターゼまたはペルオキンダーゼ抱合抗−ＤＩＧを用いた単純な免疫化学ステップが次にＤＩＧ標識増幅産物を検出する。あるいは、落射蛍光顕微鏡法または免疫化学方法により、フルオレセイン標識増幅産物を検出することができる。
本発明はまた、ＰＣＲ後の増幅産物に対する特異的標識プローブのハイブリダイゼーションが関与する検出のための間接的技術も提供している。プローブ上の標識は、このとき、例えば免疫化学方法または落射顕微鏡法のいずれかにより検出されてよい。
増幅された標的ＤＮＡは、電気泳動法によって検出されてよい。電気泳動法は、キャピラリー電気泳動法、ゲル電気泳動法であってよい。増幅標的ＤＮＡはサザンブロット法または配列決定により検出されてよい。陽性ＬＡＭＰ反応の検出は、反応の終了の視覚化によるものであってよい。ＬＡＭＰ反応により生産されるＤＮＡが大量であることから、白色沈殿物が副産物として観察されるかもしれない。この沈殿物はピロリン酸マグネシウムである。この沈殿物を濁度の増大に関係づけしてもよく、これは例えば濁度計を使用して陽性反応を検出する別の手段になり得る。これは、実時間測定かまたは終点測定のいずれであってもよい。ＬＡＭＰ反応結果を視覚化するさらなる手段は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの添加によるものであり。ここで陽性反応は混合時点で明緑色に変化し、一方陰性反応はオレンジ色にとどまる（Ｉｗａｍｏｔｏ， ２００３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ４１：２６１６−２６２２）。
陽性ＬＡＭＰ反応を検出する別の手段は、反応終点に対する低分子量のポリエチレンイミンの付加を使用することであってよい。これは、存在するあらゆる増幅されたＤＮＡと不溶性錯体を形成するかもしれない。標識されたプローブを標準ＬＡＭＰプライマに付加してもよい（Ｍｏｒｉ， ２００６ ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ６：３）。
増幅されたＤＮＡは、ＤＮＡの異なる長さを区別できるあらゆる方法により直接検出されてよい。アガロースを通した電気泳動法が、ＤＮＡフラグメントを分離し、同定しかつ精製するために使用される標準的方法である。ゲル内部のＤＮＡの場所は、低濃度の蛍光挿入染料臭化エチジウムでの染色により直接判定可能である。このとき、増幅標的ＤＮＡについての予測された長さに対応するバンドを、紫外線内のゲルの直接的検査により検出することができる。
さらに、電気泳動されたゲルからのＤＮＡバンドを、毛管作用により膜支持体に転写し、その後オリゴヌクレオチドプローブを用いて間接的に検出することができる。典型的な転写プロトコルには、０．４ＭのＮａＯＨ、０．６ＭのＮａＣｌなどのアルカリ溶液を用いてゲル内部のＤＮＡを変性するステップおよびそれに続く例えば１．５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５などの緩衝液中での中和ステップが含まれる。ゲルはこのとき、１ＸＳＳＣなどの高イオン強度の転写緩衝液で平衡化され、ここで１ＸＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムである。変性されたＤＮＡはこのとき、転写緩衝液中のキャピラリーブロッティングによりゲルから膜支持体へと転写可能である。
ナイロンまたはニトロセルロース膜などの固体支持体上で捕捉された増幅ＤＮＡは、標識ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出されてよい。プローブは、放射性または蛍光タグで標識されてもよく、あるいは酵素分子に直接または間接的に付着されてもよい。このとき、膜結合された増幅標的ＤＮＡは、ハイブリダイゼーション条件下でプローブと共にインキュベートされる。ハイブリダイゼーションの後、余剰のプローブは洗い流される。ハイブリダイゼーションプローブに放射性タグ付けされる場合、残りのハイブリッド形成されたプローブは、オートラジオグラフィまたはシンチレーション計数によって検出され得る。プローブが、ビオチンまたは、アビジンおよび抗体などの特異的結合分子が存在するその他のある化学基を含む場合には、固定化プローブを、ストレプトアビジンに付着されたホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの特異的な結合分子に付着した酵素で検出することができる。
検出は、非放射性５’ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識オリゴヌクレオチドプローブでのハイブリダイゼーションを介したものであってよい。ハイブリダイゼーションの後、固体支持体を約７０℃で５×ＳＳＣなどの高イオン強度緩衝液で洗浄する。洗浄後に残っている固定化ハイブリダイゼーションプローブは、アルカリホスファターゼに抱合された抗−ＤＩＧ抗体と共に固体支持体をインキュベートしその後Ｌｕｍｉｇｅｎ−ＰＰＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）などの化学発光基質を添加することにより、視覚化可能である。支持体は最終的に洗浄され、プラスチックラップの中に密閉され、Ｘ線フィルムに曝露されてあらゆる化学発光を検出する。
Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）の少なくとも１つの保存核酸配列を同定する方法
本発明はまた、本発明に係る試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の保存標的ＤＮＡ配列の存在を検出する方法において有用であるＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）の少なくとも１つの保存核酸配列を同定する方法も提供している。一実施形態においては、この方法には、本発明に係る試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の保存標的ＤＮＡ配列の存在を検出する方法において有用である少なくとも２つの保存核酸配列を同定するステップが含まれる。一実施形態において、この方法には、本発明に係る試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の保存標的ＤＮＡ配列の存在を検出する方法において有用である少なくとも３つの核酸配列を同定するステップが含まれる。一実施形態において、この方法には、本発明に係る試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の保存標的ＤＮＡ配列の存在を検出する方法において有用である少なくとも４つの保存核酸配列を同定するステップが含まれる。別の実施形態においては、この方法は、
から選択された配列と相補的な少なくとも１つの配列を同定するステップが含まれ、ここで配列番号１〜４から選択された配列に相補的な少なくとも１つの配列は、本発明に係る試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の保存標的ＤＮＡ配列の存在を検出する方法において有用であり、ここでｎはリンカーであっても、または不在であってもよい。リンカーは、いくつかのヌクレオチド塩基、例えばｔｔｔｔであってよい。１つまたは複数の保存核酸配列はアクチンまたはその１つまたは複数の部分をコードしてよい。
この方法は、所望であれば少なくとも１つのヘルパープローブと試験試料を接触させるステップを含んでいてよい。Ｈｏｇａｎら、「Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、米国特許第５，０３０，５５７号明細書を参照のこと。「ヘルパープローブ」は、本明細書において、ハイブリダイゼーション検定プローブの遺伝子座と異なる遺伝子座において標的核酸にハイブリッド形成し、それによって標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションの速度を速くするか、プローブ：標的ハイブリッドの溶融温度を上昇させるか、またはその両方を行なうように設計されたオリゴヌクレオチドであるものとして理解される。
キット
Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上を増幅し検出するために用いられる本発明のプライマおよび／またはプローブを、キットとして適切に包装することができる。キットは、本発明に係る、適切な量のプライマ、または適切な量のプローブ、または適切な量のプライマおよびプローブを含んでいてよい。さらに、キットは、公知の濃度のクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種を含む少なくとも１つの適切な量の標準試料、および問題の原生動物を実質的に含まない負の対照試料を含むことができる。
本発明の方法およびキットは、ＰＣＲなどの増幅手順に関連する速度、感度および特異性を含め、先行方法に比べて数多くの利点を有する。その上、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）を、非ヒト動物宿主のみに感染するその他のクロプトスポリジア（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ）と区別することが可能である。
キットには、本発明に係る少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブが含まれ、任意には試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在を判定するための使用説明書が含まれていてよい。
キットは、本発明に係る少なくとも１つの増幅プローブを含んでいてよい。
キットは、本発明に係る少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブおよび本発明に係る少なくとも１つの増幅プローブを含んでいてよい。本発明はまた、本発明に係る増幅プライマのうちの少なくとも１つを含み、かつ任意には核酸を増幅するための使用説明書を含む、本発明に係る標的ＤＮＡ配列を増幅するためのキットをも企図している。好ましい実施形態においては、キットはさらに増幅に必要とされるヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの酵素を含む。
本発明に係るプライマおよび／またはプローブは、オーシストその他の形態でＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上を検出するために使用されてよく、キットとして適切に包装可能である。キットは、適切な量のプライマまたは適切な量のプローブまたは適切な量のプライマおよびプローブを含んでいてよい。さらにキットは、オーシストその他の形態でＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上を公知の濃度で含む適切な量の少なくとも１つの標準試料を含むことができる。
キットには、本発明に係る少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブが含まれ、任意には試験試料中にＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在または量を判定するための使用説明書が含まれていてよい。
別の実施形態において、キットは、本発明に係る少なくとも１つの増幅プローブを含んでいてよい。
キットは、本発明に係る少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブおよび本発明に係る少なくとも１つの増幅プローブを含んでいてよい。
キットは、本発明に係る少なくとも１つの増幅プライマを、ハイブリダイゼーション検定プローブに加えて含んでいてよい。
キットはさらに、本発明に係る少なくとも１つの捕捉プローブを、ハイブリダイゼーション検定プローブに加えて含んでいてよい。
キットは、ハイブリダイゼーション検定プローブに加えて、上述の捕捉プローブの少なくとも１つ、および上述の増幅プライマの少なくとも１つを含んでいてよい。
捕捉プローブを含むキットは、試験試料中で直接的または間接的に捕捉プローブを固定化するための固体支持体材料（例えば磁気応答性粒子）をさらに含んでいてよい。
キットは、所要の酵素、ヌクレオチド三リン酸および本発明に係るプローブおよび／またはプライマを含んでいてよい。ヌクレオチド三リン酸および本発明に係るプローブおよび／またはプライマは、凍結乾燥された試薬として提供されてよい。凍結乾燥された試薬は、再構成された時点で、各構成成分を適正比率で有するいつでも検定に使用できる状態の完全な混合物を形成するように、凍結乾燥の前に予備混合されていてよい。さらに、キットは、その凍結乾燥された試薬を再構成するための再構成試薬を含んでいてよい。
典型的な包装材料は、本発明のハイブリダイゼーション検定プローブ、捕捉プローブ、ヘルパープローブおよび／または増幅プライマを定められた限度内に保つことのできる、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微小粒子などの固体基質を含むと思われる。したがって、例えば包装材料は、サブミリグラム（例えばピコグラムまたはナノグラム）量の、企図されたプローブまたはプライマを入れるために用いられるガラスバイアルを含むことができ、あるいはこれらの包装材料は、本発明のプローブまたはプライマが作動的に付加されている、すなわち本発明の増幅および／または検出方法に関与することができるように連結されたマイクロタイタープレートウェルであり得る。
使用説明書は典型的には試薬および／または試薬の濃度そして少なくとも１つの検定方法パラメータを指示し、このパラメータとしては例えば試料の量に対する使用すべき試薬の相対量が考えられる。さらに、メンテナンス、時間、温度および緩衝液条件などの細目も含み入れてよい。
キットは、個別に提供されるかまたは上述の好ましい１つの組合せの形で提供されているかに関わらず、試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在または量を増幅および／または判定する上で使用するため本明細書の中で記述されているハイブリダイゼーション検定プローブ、捕捉プローブおよび／または増幅プライマを含んでいてよい。
プローブおよびプライマの機能横断性（ｃｒｏｓｓ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）
当業者であれば、必要とされる特異度に応じて本発明のハイブリダイゼーション検定プローブを増幅プライマまたは捕捉プローブとして使用してもよいこと、そして本発明の増幅プライマをハイブリダイゼーション検定プローブまたは捕捉プローブとして使用し得るということを認識する。
プローブおよび／またはプライマは、ＤＮＡ、対応するＲＮＡおよび／またはその類似体であってよい。ヌクレオシドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボースおよびリボフラノシル部分に対する２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含めたその類似体であってよい。（ハイブリダイゼーション検定プローブ、ヘルパープローブおよび／または増幅プライマとして有用であり２’置換を有するヌクレオシドサブユニットを含むオリゴヌクレオチドは、Ｂｅｃｋｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍｅｒｓ」、米国特許第６，１３０，０３８号明細書により開示されている）。ヌクレオシドサブユニットは、オリゴヌクレオチドがその相補的標的核酸配列にハイブリッド形成するのを妨げない非ヌクレオチド部分によってかあるいはホスホジエステル連結、修飾された連結などの連結によって接合されてよい。修飾された連結には、ホスホロチオエート連結またはメチルホスホネート連結などの異なる連結で標準的ホスホジエステル連結が置き換えられている連結が含まれる。核酸塩基サブユニットは、例えばカルボキシメチルリンカーを用いて核酸塩基サブユニットを中央第２級アミンにカップリングする２−アミノエチルグリシン主鎖などの擬ペプチド主鎖で天然のＤＮＡのデオキシリボースリン酸主鎖を置き換えることなどによって、接合されてよい（擬ペプチド主鎖を有するＤＮＡ類似体は一般に「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」と呼ばれ、Ｎｉｅｌｓｅｎら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」、米国特許第５，５３９，０８２号明細書により開示されている）。本発明により企図されている核酸分子のその他の限定的でない例としては、「ロックされた核酸」「ロックされたヌクレオシド類似体」または「ＬＮＡ」（ロックされた核酸は、Ｗａｎｇ、「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」、米国特許第６，０８３，４８２号明細書；Ｉｍａｎｉｓｈｉら、「Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、国際公開第９８／３９３５２号パンフレット；およびＷｅｎｇｅｌら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、国際公開第９９／１４２２６号パンフレットにより開示されている）と呼ばれる二環式および三環式ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体を含む核酸類似体が含まれる。修飾オリゴヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション検定条件または増幅条件下で標的核酸にハイブリッド形成できることを条件として、あらゆる核酸類似体が本発明により企図されている。ハイブリダイゼーション検定プローブの場合、修飾オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション検定条件下で標的核酸に優先的にハイブリッド形成することもできなくてはならない。
試験試料中の核酸分子の解放
当業者であれば、以上で概説された方法のいずれかを有機体に由来する核酸ではなく全有機体に適用する場合、増幅連鎖反応条件を開始する前に前記有機体から核酸を解放するための手順を取り入れることが必要であることがわかる。本発明の好ましい形態は、テストすべき試料をまず第１に媒質、例えば緩衝液中に懸濁させ次に、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を含む緩衝液中で音波処理するかまたは凍結−解凍サイクルに付し、有機体特にそのオーシスト形態を破断し、核酸を解放させる特別な手順を提供する。
本発明の好ましい方法を用いると、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上をオーシストその他の形態で検出または同定することが可能である。
音波処理または凍結／解凍手順は、ＬＡＭＰの全てまたは一部を成すことになる媒質またはプロ―ビング用媒質の中で実施してよい。音波処理は、ピーク間約１１μｍを用いて適切に実施できる。あるいは、凍結／解凍手順のためには、液体窒素などの低温液体の中に試料コンテナを浸漬させるのが適切であり得る。ＬＡＭＰまたはプロ―ビング用媒質の中に核酸を解放するために細胞またはオーシスト構造を分断するその他の方法は、当業者にとって公知であり、ＬＡＭＰおよび／またはプロ―ビング手順を開始する前に適用可能であるものと予測してよい。
後続するハイブリダイゼーションおよび増幅手順は、シスト、オーシスト、および／または感染を受けた細胞培養からの抽出物を含む核酸を用いても実施できる。ＤＮＡを検出するために抽出物を使用しなければならない場合、ＲＮＡをＤＮａｓｅ−遊離ＲＮａｓｅＡでの処理により溶解物から取出すことができる。オーシストおよび感染した細胞培養由来のＤＮＡのさらなる精製は、追加の抽出ステップにより達成可能である。例えば、２ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫおよび０．５％のサルコシルを含有するｐＨ８の２０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ中に細胞を溶解させ、１時間、３７℃でインキュベートすることができる。その後、５ＭのＮａＣｌを添加して１Ｍの最終濃度を得、ＣＴＡＢ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）を１％の濃度になるまで添加する。３０分間６５℃でのインキュベーションの後、溶解物を少なくとも１回の凍結／解凍サイクル、およびフェノール／クロロホルム抽出に付す。０．６体積のイソプロパノールを添加することによりＤＮＡを沈殿させ、その後７０％のエタノールでＤＮＡ沈殿物を洗浄する。当業者であればまた、ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出キット、例えばＥｐｉｃｅｎｔｒｅ ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ およびＷａｔｅｒＭａｓｔｅｒＴＭ キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、増幅連鎖反応条件を開始する前に有機体由来の核酸を解放させてもよいということも認識する。
抽出物をＲＮＡの検出に使用する場合には、ＲＮａｓｅ−遊離ＤＮａｓｅでの処理により溶解物からＤＮＡを除去することができる。チオシアン酸グアニジウムなどの強い変性剤での抽出とそれに続く塩化セシウム溶液を通した遠心分離により、溶解した細胞から全ＲＮＡを単離させることもできる。その上、ｐｏｌｙ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡ転写産物を選択できるオリゴ−ｄＴに付着した固体状態の粒子を用いてｍＲＮＡを単離することができる。
オーシストの回収
クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種感染の診断は、一般に、便試料からクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストを回収することによって立証されてよい。あるいは、汚染した水を介したクリプトスポリジウム症の伝染のリスクまたはそのエビデンスの査定を、水試料からのクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストを濃縮することによって提供してもよい。
クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストは、さまざまな方法で水から濃縮してよい。例えば、１００リットルといった既定の体積の水を、濾過流量が約４リットル／分に制限された１μの公称多孔率の巻糸ポリプロピレンフィルタまたはその等価物を通して濾過してもよい。試料採取したフィルタは、典型的には２４時間以内に分析のため分析研究所まで氷に載せて発送してよい。保留された原生動物を、収集から９６時間以内に緩衝洗浄剤溶液で溶出させてよく、フィルタ繊維をカットし、裁断し、手でまたはストマッカーを用いて洗浄する。溶離剤中で回収したオーシストを遠心分離により濃縮し、比重１：１のＰｅｒｃｏｌｌ−スクロース溶液上での浮揚により部分的に精製してよい。精製された材料の一部分を膜フィルタ上に置き、間接的染色方法を用いて抗体でタグ付けし、落射蛍光顕微鏡下で検査してよい。免疫蛍光、サイズ、形状および内部形態を含めた具体的基準を用いてオーシストを同定してよい。
フラットベッド膜濾過（ｆｌａｔｂｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）方法
この方法は、Ｏｎｇｅｒｔｈ および Ｓｔｉｂｂｓ （Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５３： ６７２ − ６７６， １９８７）により当初記述された方法から導出されたものである。４Ｌ／分を超えない速度のぜん動水ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗユニット６０４Ｓ）を用いて２μｍの細孔径のトラックエッチングポリカーボネート膜（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を収納する直径２９３ｍｍのフラットベッドフィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して水試料を濃縮してよい。その後、膜を改良パースペックスシート（Ｍｉｃｒｏｎｉｘ， Ｓｙｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に移し、溶出緩衝液Ｎｏ．１を噴霧し、ゴムスクイジー（Ｍｉｃｒｏｎｉｘ）を用いて濃縮物を溶出し、これを５０ｍＬ入り遠心分離管（Ｉｗａｋｉ）内に収集してよい。この溶出手順を２〜４回反復してよく、その後膜を除去し、廃棄し、パースペックスシートおよびゴムスクイジーをさらに溶出緩衝液で洗い流してよい。その後、フィルタ洗浄液を４±２℃で１０分間１６２０ｇで遠心分離に付してよい。上清を吸引して、残留ペレットを５ｍＬの体積で放置し、このペレットを次にボルテックス混合により再懸濁させてよい。
フラットベッド装置は、まずは洗浄剤溶液（Ｔｅｒｇａｚｙｍｅ， Ａｌｃｏｎｏｘ Ｉｎｃ．， Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）その後水でバックフラッシュすることにより、各試料の間で洗浄してよい。パースペックススクリーンおよびゴムスクイジーを洗浄剤でこすり、水で洗い流してよい。
濃縮の後、オーシストの確認のための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色と共に、免疫磁気分離法（ＩＭＳ）および免疫蛍光抗体を用いて、試料を処理してよい。各試料から生成された全ペレットを処理し検査することができる。詰め込まれたペレットのサイズは、体積で０．１ｍＬ未満から１ｍＬまでの範囲内にあり、０．５ｍＬ超のペレットは２ＩＭＳ試験に分割される（メーカーの使用説明書による）。
Ｅａｓｙ ＳｐｅｅｄＴＭ（９８±１．４クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）オーシストおよび９８±１．４ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）シストを含む）をＩＭＳの直前に一部の試料内にスパイクして、ＩＭＳおよび染色手順に付随する損失を定量化してよい。Ｅａｓｙ ＳｅｅｄＴＭバイアルを３０秒間ボルテックス混合してからＩＭＳ管に添加してよい。その後、ＩＭＳキットからの１０倍のＳＬ−緩衝液Ａ１ミリリットルをバイアルに添加し、３０秒間、ボルテックス混合し、洗液をＩＭＳ管に添加してよい。その後、バイアルにＩＭＳキットからの１０倍のＳＬ−緩衝液Ｂを１ミリリットル添加し、３０秒間ボルテックス混合し、ＩＭＳ管内に傾瀉してよい。次に、試料濃縮物をＩＭＳ管に添加してよい。
酸解離ステップの後、試料を直ちに、真空マニホルド上に取付けた細孔径０．８μｍの１３ｍｍのポリカーボネート膜フィルタ（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ， Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）に移してよいという点を除いて、メーカーの使用説明書にしたがってＤｙｎａｂｅａｄｓ ＧＣ−Ｃｏｍｂｏキット（Ｄｙｎａｌ， Ｏｓｌｏ）を用いてＩＭＳを実施してよい。膜上の有機体を、１分間メタノールで処理し、次に８０μＬのＤＡＰＩ（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２分間上に載せてよい。ＤＡＰＩを真空濾過により除去し、２００μＬのＥａｓｙ ＳｔａｉｎＴＭ洗浄緩衝液（ＢＴＦ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）２００μＬで膜を洗浄し、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）およびジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）に特異的なフルオレセインイソシアネート標識抗体を含む８０μＬのＥａｓｙ ＳｔａｉｎＴＭを１５分間この上に載せてよい（Ｗｅｉｒら、 ２０００ Ｃｌｉｎ． Ｄｉａｇｎ． Ｌａｂ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７（５）：７４５ − ７５０）。
全ての染色は、室温で行なってよい。その後膜をスライドに移し、Ｅａｓｙ ＳｔａｉｎＴＭ封入剤（ＢＴＦ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）を上に載せ、カバースリップで密閉してよい。その後、スライドに取付けた膜を落射蛍光顕微鏡法により検査してよい。
全細胞内のＤＮＡまたはＲＮＡの増幅
当業者であれば、例えばＰｒｅｓｃｏｔｔら、１９９９， Ｌｅｔｔ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２９： ３９６ − ４００中に記述されているように全細胞内の核酸のその場検出にこの技術を使用してよいということを認識する。
実施例１：試料供給源およびＤＮＡ精製
培養または糞便に由来する精製済みオーシスト試料からクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）ＤＮＡを入手した。糞便由来のオーシストはＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌキット（Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて精製し、一方培養由来のオーシストは単一ＰＢＳ洗浄に付した。精製したオーシストを１倍のＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）中に懸濁させ、血球計細胞チャンバ計数により計数し、５サイクルの凍結／解凍に付した。試料を次に５分間、１０，０００×ｇで遠心分離に付し、上清を新しい微小遠心管に移した。その後、１試料あたり１０００〜１当量のオーシスト／ｓの範囲内の所望の濃度までオーシスト試料の連続希釈（１：２）を行なった。
その他の分子技術により先に同定されこの研究において使用されたクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種または遺伝子型はＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）分離株 ６１４９， ６１８９， Ｈ２７０， Ｈ２７１， Ｈ２７３ （未公開）；Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ） ＩＯＷＡ， ＡＺ−１；Ｃ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ） ＣＺ−Ｂ１−３２ （Ｒｙａｎら、２００３）；Ｃ．アンデルソニ（Ｃ． ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）ＣＺ−Ｂ１−５２ （Ｒｙａｎら、 ２００３）；Ｃ．バイレイ（Ｃ． ｂａｉｌｅｙｉ）ＣＺ−Ｂ１−１５ （Ｒｙａｎら、 ２００３）；Ｃ．フェリス（Ｃ． ｆｅｌｉｓ） １００．２２ （未公開）；Ｃ．ガリ（Ｃ． ｇａｌｌｉ）ＢＥ １３ （Ｎｇら、 ２００６）；Ｃ．スイス（Ｃ． ｓｕｉｓ）ＷＡ Ｐｉｇ ６ （Ｒｙａｎら、２００３）；Ｍａｒｓｕｐｉａｌ 遺伝子型 ＩＩ （未公開）； およびＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＩＩ （未公開）であった。
この研究で利用される負の対照は、糞便試料から精製され、ジアルジア・デュオデナリス（Ｇｉａｒｄｉａ ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ）（集団Ａ、ＢおよびＥ）、イソスポラ・オハイオイエンシス（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｏｈｉｏｅｎｓｉｓ）、サルコシスティス種（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）、アンシロストマ・カニヌム（Ａｎｃｙｌｏｓｔｕｍａ ｃａｎｉｎｕｍ）またはマンソン裂頭条虫（Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ ｅｒｉｎａｃｅｉｅｕｒｏｐａｅｉ）（未公開データ）としてその他のＰＣＲ方法により同定されたＤＮＡであった。
実施例２：ＬＡＭＰプライマ
クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）アクチン遺伝子に対する特異性のために、ＬＡＭＰプライマを設計した。以前に公開された配列（Ｓｕｌａｉｍａｎら、２００２をＢｉｏＥｄｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０．５．２ （Ｈａｌｌ， １９９９）を用いて整列させ、アラインメントおよびＥｉｋｅｎ ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３ （ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｅ／）を用いて手作業で１組のＬＡＭＰプライマを設計した。プライマはＳｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏ （ＮＳＷ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により商業的に合成された。
ヌクレオチド位置の付番は、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）ＴＵ５０２アクチン配列ＧｅｎＢａｎｋ ＸＭ＿６６１０９５ （Ｘｕら、２００４）に基づくものである。ＦＩＰおよびＢＩＰは、各々１つのプライマしか構成しないものの、２つの別々のヌクレオチド領域Ｆ１ｃおよびＦ２そしてＢ１ｃおよびＢ２でそれぞれ構成されているという点に留意されたい。
実施例３：ＬＡＭＰ反応
２５μｌのＬＡＭＰ反応混合物は、各々１．６μＭのＦＩＰおよびＢＩＰ内部プライマ、各々０．８μＭのＦ３およびＢ３外部プライマ、８ＵのＢｓｔ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ＭＡ ＵＳＡ）、１倍のＴｈｅｒｍｏ Ｐｏｌ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、２００μＭのｄＮＴＰｍｉｘ（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、０．８Ｍのベタイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， ＣＡ， ＵＳＡ）、３．３４μＭのＳＹＴ０９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， ＯＲ ＵＳＡ）および１μｌの熱変性ＤＮＡ鋳型（５分間９５℃）で構成されていた。反応混合物をＲｏｔｏｒＧｅｎｅ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＮＳＷ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）内に投入し、ＦＡＭチャンネル上で毎分３０秒間蛍光データを収集しながら６０分間６０℃で走行させた（４７０ｎｍでの励起、５１０ｎｍでの検出）。蛍光データ収集のためには３つの利得設定値（１、２および４または５）を含み入れた。その後、５分間８０℃でインキュベートすることによって反応を終結させた。
実施例４：単位複製配列の検出および分析
ＬＡＭＰ反応により増殖されたＤＮＡを、２つの異なる方法により検出した。これらの方法とはすなわち、実時間蛍光データ収集と、電気泳動法の後の臭化エチジウムで染色された１．５％のアガロースゲルの紫外線下での検査である。
同様に、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）ＬＡＭＰプライマが意図された標的を増幅したことを確認する目的で、単位複製配列の配列を決定した。簡単に言うと、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）６１４９鋳型から得られた１０μｌのＬＡＭＰ反応後ＤＮＡをゲル電気泳動に付した。その後、切除され精製されたおよそ１８０ｂｐのフラグメント（図３）を、ＬＡＭＰ単位複製配列のＦ２およびＢ２配列と重複する領域と同一の配列を含む
というプライマを用いてＰＣＲに付した。増幅産物をＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）中にクローニングし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）へと形質転換させ、スクリーニングの後クローンから配列を得た。
実施例５：ＬＡＭＰ陽性の検出
ＢＩＰプライマの５’末端に１つの塩基対ミスマッチを伴うＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）に対する特異性を伴って、ＬＡＭＰプライマを設計した。しかしながら、実際には、プライマは、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）の標的アクチン遺伝子を増幅したが、一方適用されたその他のあらゆるＤＮＡを増幅することはできなかった。記述された方法によるＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）およびＣ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）の検出をおよそ３０分〜３５分以内で行ない、一方Ｃ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）の検出はおよそ４５分以内で発生した（図２）。ＬＡＭＰ反応は、その他のクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）種を含めたその他全ての試験対象種から抽出されたＤＮＡを増幅できなかった。クローニングされたＬＡＭＰ産物の配列決定は、Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）６１４９と同一の配列を生成した。
実時間結果と一致して、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル中にも、陽性ＬＡＭＰ反応が検出された。陽性ＬＡＭＰ反応は、特徴的なラダー様の外観を生み出し（図３）、最小バンドのサイズはおよそ１８０ｂｐであった。
当業者であれば、広範に記述した本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、具体的実施形態の中で示された通りの本発明に対し数多くの変更および／または修正を加えてよい、ということを認識する。したがって、これらの実施形態は、限定的なものではなく、全ての点で例示的なものとみなされるべきである。

Claims (47)

  1. 試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在を検出する方法であって、
    （ｉ） 第１および第２の外部プライマ（ここで、第１の外部プライマは標的ＤＮＡ配列の５’末端に隣接する領域と相補的であり、第２の外部プライマは、標的ＤＮＡ配列の３’末端に隣接する領域と相補的である）および；
    （ｉｉ） 第１および第２の内部プライマ（ここで、内部プライマは各々、標的ＤＮＡ配列のセンスおよびアンチセンス配列に対応する２つの異なる配列を含んでいる）；
    と試験試料とを接触させるステップと；自己循環型鎖置換ＤＮＡ合成を実施するステップと；増幅させた標的ＤＮＡの存在を検出するステップとを含む方法において、標的ＤＮＡ配列がＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）の実質的に保存されたＤＮＡ配列である、方法。
  2. 定性的検出方法である、請求項１に記載の方法。
  3. 検出がｄｓＤＮＡ挿入蛍光染料を用いて実施される、請求項１または２に記載の方法。
  4. ｄｓＤＮＡ挿入蛍光染料がＳＹＴＯ−９である、請求項３に記載の方法。
  5. 定量的検出方法である、請求項１に記載の方法。
  6. 検出が濁度または挿入染料を用いて実施される、請求項５に記載の方法。
  7. 自己循環が高鎖置換活性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. １つまたは複数の保存標的ＤＮＡ配列がアクチンまたはその１つまたは複数の部分をコードする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 自己循環型鎖置換ＤＮＡ合成がループ仲介等温増幅（「ＬＡＭＰ」）方法である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 自己循環型鎖置換ＤＮＡ合成が熱変性ステップ、反応ステップおよび終結ステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 熱変性ステップが約９５℃で約５分間行なわれ、反応ステップが約６０℃〜６６℃で約３５分〜１２０分間行なわれ、終結ステップが約８０℃で約２分〜１０分間行なわれる、請求項１０に記載の方法。
  12. ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、増幅標的ＤＮＡまたはその補体に対し優先的にハイブリッド形成するハイブリダイゼーション検定プローブと増幅標的ＤＮＡを接触させ、それによって検出に対して安定したプローブ：増幅標的ＤＮＡ配列またはその補体のハイブリッドを形成するステップおよび、プローブ：増幅標的ＤＮＡ配列またはその補体のハイブリッドの存在を検出するステップを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 増幅標的ＤＮＡが電気泳動法により検出される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 電気泳動法が、キャピラリー電気泳動法またはゲル電気泳動法である、請求項１３に記載の方法。
  15. 増幅標的ＤＮＡがサザンブロット法または配列決定により検出される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  16. 陽性ＬＡＭＰ反応の検出が、沈殿物の視覚化によるものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  17. 沈殿物が濁度の増大によって検出される、請求項１６に記載の方法。
  18. 沈殿物がピロリン酸マグネシウムである、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 検出が実時間測定または終点測定のいずれかである、請求項１８に記載の方法。
  20. 検出がＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの添加によりＬＡＭＰ反応結果を視覚化するステップをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 検出には、反応終点に対する低分子量ポリエチレンイミンの付加が含まれる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  22. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法において有用であるＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）の少なくとも１つの保存核酸配列を同定する方法。
  23. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法において有用である少なくとも２つの保存核酸配列を同定するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法において有用である少なくとも３つの保存核酸配列を同定するステップを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法において有用である少なくとも４つの保存核酸配列を同定するステップを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 以下の配列
    から選択された配列と相補的な少なくとも１つの配列を同定するステップを含み、ここでｎはリンカーであるかまたは不在である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. リンカーが１つ以上のヌクレオチド塩基である、請求項２６に記載の方法。
  28. ｎがｇである、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. １つまたは複数の保存核酸配列がアクチンまたはその１つまたは複数の部分をコードする、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  30. 増幅検定においてＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在を検出するのに有用である増幅プライマであって、
    という配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含み、ここでｎはリンカーであるかまたは不在である、増幅プライマ。
  31. リンカーが１つ以上のヌクレオチド塩基である、請求項３０に記載の増幅プライマ。
  32. ｎがｇである、請求項３０または３１に記載の増幅プライマ。
  33. 配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域と少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の増幅プライマ。
  34. 配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域と１００％の同一性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の増幅プライマ。
  35. 試験試料中にＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上が存在するか否か判定するためのハイブリダイゼーションプローブにおいて、
    という配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含み、ここでｎはリンカーであるかまたは不在である、ハイブリダイゼーションプローブ。
  36. リンカーがいくつかのヌクレオチド塩基である、請求項３５に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
  37. ｎがｃである、請求項３５または３６に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
  38. 配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域と少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
  39. 配列番号１〜４のいずれか１つの中に存在する少なくとも１０隣接塩基の領域と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも１０隣接塩基の領域を含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
  40. ストリンジェントなハイブリダイゼーション検定条件下でＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）以外のものから誘導された核酸に対してではなくＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上と少なくとも８０％の相補性を有する標的核酸に対して優先的にハイブリッド形成する、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
  41. ハイブリダイゼーションプローブが検出可能な標識を含む、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
  42. 検出可能な標識が、放射性同位体、酵素、酵素補助因子、酵素基質、染料、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発色団、および標的核酸に対し安定した形でハイブリッド形成することができない塩基配列領域からなる群から選択される、請求項４１に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
  43. Ｃ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上が試験試料中に存在するか否かを判定するためのキットであって、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの増幅プローブを含むキット。
  44. 請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項４３に記載のキット。
  45. 請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの増幅プローブおよび請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項４３または４４に記載のキット。
  46. 増幅のために必要とされるヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの酵素を含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載のキット。
  47. 試験試料中のＣ．ホミニス（Ｃ． ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｃ．パルバム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）およびＣ．メレアグリジス（Ｃ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）のいずれか１つ以上の存在を判定するための使用説明書を含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のキット。
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