JP2008534009A - 大腸癌診断用の多重ｓｎｐ、それを含むマイクロアレイ及びキット、並びにそれを利用した大腸癌の診断方法 - Google Patents

Abstract

大腸癌診断用の多重ＳＮＰ、それを含むマイクロアレイ及びキット及びそれを利用した大腸癌の診断方法に関する。これにより、大腸癌の発病または発病可能性を早期に効果的に診断しうる。

Description

関連出願
本出願は、２００５年４月１日に韓国工業所有権庁に出願した韓国特許出願第１０−２００５−００２７５３号の利益を主張し、そこでの開示は、参照により本願に引用される。

本発明は、大腸癌診断用の多重一塩基多型（ＳＮＰ）、それを含むマイクロアレイ及びキット、並びにそれを利用した大腸癌の診断方法に関する。

全ての生物のゲノムは、進化の過程で子孫の核酸配列に変異体を発生させる自発的な突然変異を経る（非特許文献１）。変異体は、子孫の形態に比べて、進化学的に利益または不利益をもたらす場合もあれば、どちらともいえない場合もありうる。ある場合には、変異体が致死的な不利益をもたらし、子孫に受け継がれない場合もある。他の場合には、変異体が種に進化学的な利益をもたらし、結果として、種の大部分のＤＮＡに組み込まれて効果的に先祖の形態となる。多くの場合、先祖の形態及び変異体は、共に生き残って種集団において共存する。配列が複数形態で共存することによって、多型が発生する。

いくつかの多型のタイプが知られており、その中には、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、短塩基対反復（ＳＴＲ）、一塩基多型（ＳＮＰ）などが含まれる。このうち、ＳＮＰは、同じ種の個体間の単一ヌクレオチドの変異の形態をとる。ＳＮＰがコーディング領域内の配列に発生すると、多型の形態の中には、同義でないアミノ酸を生じ、結果として、欠陥があるかまたは変異した蛋白質が発現しうる。他方、ＳＮＰがタンパク質の非コーディング領域内の配列に発生すると、これらの多型の中には、例えば、欠陥のあるスプライシングの結果として、欠陥があるか、または変異した蛋白質の発現を招くものもある。その他のＳＮＰは、表現型に何らの影響も及ぼさない。

ＳＮＰは、人間の場合、１,０００ｂｐごとに１回の頻度で発生すると推定される。このようなＳＮＰが疾病のような表現型を誘発する場合、前記ＳＮＰを含むポリヌクレオチドは、前記疾病の診断用プライマーまたはプローブとして使われうる。前記ＳＮＰに特異的に結合するモノクローナル抗体も、疾病の診断に使われうる。現在、色々な研究機関でＳＮＰを有するヌクレオチド配列やＳＮＰの機能に関する研究を行っている。同定された人間のＳＮＰの塩基配列及びその他の実験結果はデータベース化して公開され、容易に利用可能となっている。

これまでに利用可能となった発見が、人間のゲノムまたはｃＤＮＡ上に特異的なＳＮＰが存在するということを示しているとしても、ＳＮＰが表現型に及ぼす影響は未だ明らかにされていない。大部分のＳＮＰの機能は、未だに発見されていないのである。

大腸癌のほとんどは、病理学的にいえば腺癌であり、癌が発生する部位別には、結腸癌と直腸癌とに大別される。直腸癌の発生が約５０％と最も多い。最近の研究によれば、食習慣の変化により、韓国でも大腸癌の発生率とそれによる死亡率とが顕著に上昇している。前記大腸癌の発生率は、１９９５年から２００２年までに４２０％上昇して、癌の種類のうち最も頻発するタイプとなった（非特許文献２）。

大腸癌の原因はまだ不明であるが、遺伝的な要因、高脂肪及び低繊維質の食事に関連した食習慣、並びに炎症性腸疾患が誘因となっている。大腸癌は、全ての年齢層で発生しうる。年齢が増加するにつれて発生頻度が高まり、５０〜７０代で頻繁に発生する。男女の発生比をみると、結腸癌は女子、直腸癌は男子でより高く発生する。

大腸癌の治療は、外科的な切除術を基礎として、抗癌化学療法及び放射線療法が併行してなされる。手術的な療法、抗癌化学療法及び放射線療法などの進歩にもかかわらず、一旦癌が発病してしまえば、予後診断における劇的な進展はなされていない。５年生存率の平均は、１期の場合に９０％以上、２期の場合に７０％以上、３期の場合に５０％以上、そして４期の場合には５％以下である（非特許文献３）。

上記したように、大腸癌をできるだけ早期に発見及び治療するほど、生存率が顕著に上昇するということが分かる。したがって、大腸癌の早期診断方法が緊急に必要とされている。大腸癌の診断は、大腸の疾病と関連した症状を示す患者に直腸手診検査、糞便潜血検査及び大腸照影術をすることによって行われている。また、必要に応じてＳ状結腸鏡検査及び結腸鏡検査を通じた組織検査が行われる。

しかし、上記のような従来の方法では、診断の正確度が低いだけでなく、大腸癌が発病する前に早期診断をすることができず、検査を受ける被検者にとって満足なものとはいえない。

本発明者は、上記した従来技術の問題点を解決するために研究を続けた結果、大腸癌が発病する個体は全て、特定の同じＳＮＰを有しており、多重ＳＮＰを利用して大腸癌の発病の可能性及び遺伝的な感受性を予測できるということを確認し、本発明を完成した。
Ｇｕｓｅｌｌａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５，ｐｐ８３１−８５４，１９８６ ２００３健康保険統計年報，韓国国民健康保険公団発刊 ２００４癌情報，国立癌センター発刊

発明の要約
本発明の目的は、大腸癌診断用の多重一塩基多型（ＳＮＰ）を提供することである。

本発明の他の目的は、前記多重ＳＮＰのポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチド、及びそのｃＤＮＡを含む、大腸癌診断用のマイクロアレイを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記マイクロアレイを含む大腸癌診断用キットを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記多重ＳＮＰを利用して大腸癌を診断する方法を提供することである。

本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜３１のヌクレオチド配列から選択される、それぞれが１０以上のコンティグ塩基及び１０１番目の塩基を含む一以上のポリヌクレオチド、及び相補的なポリヌクレオチドを含む、大腸癌診断用の多重ＳＮＰを提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ヌクレオチド配列のポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記ヌクレオチド配列のポリヌクレオチド、その相補的なポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドのうちの一とハイブリダイズするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドのうちの一によりコードされるポリペプチド、またはそのｃＤＮＡを含む、大腸癌診断用のマイクロアレイを提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記マイクロアレイを含む大腸癌診断用キットを提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、被験者からＤＮＡを単離する段階と、前記ＤＮＡの多型部位の塩基配列を決定する段階と、前記被検者が大腸癌を発病しているか、または大腸癌の発病可能性が高いと判定する段階と、を含む大腸癌の診断方法を提供する。

本発明の上記実施形態及び有利な効果は、詳細に実施例を述べることにより、より明らかになるであろう。

本発明の一実施形態による大腸癌診断用の多重ＳＮＰは、配列番号１〜３１のヌクレオチド配列から選択される、それぞれが１０以上のコンティグ塩基及び１０１番目の塩基を含む一以上のポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む。

ＳＮＰは、個体のＤＮＡにおいて、１ｋｂごとに見られるＤＮＡ配列多型の中で、最も多く存在する一塩基対変異である。

本発明による大腸癌診断用の多重ＳＮＰは、配列番号１〜３１のヌクレオチド配列から選択される、それぞれが１０以上のコンティグ塩基及び１０１番目の塩基を含む一以上のポリヌクレオチドの組み合わせとして、表２で示される番号１〜１４のいずれかであることが好ましい。

本発明による大腸癌診断用の多重ＳＮＰにおいて、選択されたポリヌクレオチドの前記１０１番目の塩基の対立因子は、表３の遺伝子型を有することが好ましい。

Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベースにおけるＳＮＰのジーンバンク登録番号は、ＳＮＰの配列及び位置を示す。当業者ならば、前記ジーンバンク登録番号を利用してＳＮＰの位置及び配列を容易に確認可能である。ＮＣＢＩに登録されているＳＮＰのｒｓ番号に対応する特異的な配列は、経時的に若干変更されうる。対応するｒｓ番号が変更になったとしても、本発明の範囲が前記変更された配列も含むのは、当業者にとって自明なことである。前記配列番号１〜３１のヌクレオチド配列は、前記ｒｓ１４０２０２６、ｒｓ１４８５２１７、ｒｓ１１７７６１９、ｒｓ１９９６４８９、ｒｓ１３３４８５６、ｒｓ２２９５７０６、ｒｓ１５８２４０、ｒｓ１１９１３５４、ｒｓ１０２８５８６、ｒｓ３１７９１３、ｒｓ１４８６９４５、ｒｓ１０２５８８２、ｒｓ１５１１０４５、ｒｓ９５４８８１、ｒｓ７３１１３２、ｒｓ１９０１２２３、ｒｓ１１８２４７７、ｒｓ１０４１３１６、ｒｓ１４１６０９５、ｒｓ１０２０９２２、ｒｓ１５８３６９７、ｒｓ９９２９２２、ｒｓ５６６４１９、ｒｓ１８７７２９０、ｒｓ９８７５６２７、ｒｓ１７４１６２１、ｒｓ３１０６０６、ｒｓ１５０４２９９、ｒｓ１２６３２３９０、ｒｓ１４０８８８９及びｒｓ２２５４０３のＳＮＰ（各１０１番目の位置）の塩基配列を含むポリヌクレオチドでもある。前記ポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドに存在するＳＮＰの特性に関しては、下記表４に記載されている。

前記配列番号１〜３１のヌクレオチド配列は多型配列である。多型配列とは、ＳＮＰを表す多型部位を含むポリヌクレオチド配列をいう。前記ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡがありうる。

本実施形態の多重ＳＮＰは、配列番号１〜３１のポリヌクレオチド配列から選択される、表１に記載されている単一のＳＮＰ、すなわち、それぞれが１０以上のコンティグ塩基及び１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチドである。

表４における‘多重ＳＮＰの組み合わせ中の関与数’欄は、単一のＳＮＰが本発明による１４の多重ＳＮＰの組み合わせに関与した回数を表す（表１参照）。

‘遺伝子’欄は、前記ＳＮＰを含む遺伝子を意味する。

‘ＳＮＰの機能’欄は、前記遺伝子内で単一のＳＮＰが果たす役割を意味する。

‘染色体番号’欄は、単一のＳＮＰが位置する染色体の番号を意味する。

本発明による多重ＳＮＰは、単一のＳＮＰを組み合わせた１４の多重ＳＮＰのうちの１つでありうる。前記組み合わせ及びそれらの遺伝子型は、表２及び表３に開示されている。表３における‘多重ＳＮＰ’欄は、４つの選択された単一のＳＮＰの組み合わせを表す。‘対立因子’欄は、多重ＳＮＰの配列番号の順序での単一のＳＮＰの位置における対立因子の塩基を表す。例えば、表３の番号１において、ｒｓ１４０２０２６の対立因子型はＡ１Ａ２またはＡ２Ａ２であり、ｒｓ１１７７６１９の対立因子型はＡ１Ａ１であり、ｒｓ１１９１３５４の対立因子型はＡ１Ａ１またはＡ１Ａ２であり、ｒｓ７３１１３２の対立因子型はＡ１Ａ１またはＡ１Ａ２である。

本発明の一実施形態では、大腸癌の高い発生率と関連する単一のＳＮＰ群、すなわち多重ＳＮＰを発見するために、一連の選別が行われた。前記多重ＳＮＰの選別は、男性の被験者で行われた。大腸癌患者及び正常人の血液からＤＮＡを単離及び増幅した後、大腸癌患者で特に現れたが正常人では現れなかった、特異的なＳＮＰの組み合わせ及びそれらの遺伝子型が同定された。この同定されたＳＮＰの組み合わせ及びそれらの遺伝子型を、表２及び表３に表した。前記多重ＳＮＰの特性に関しては、下記表５に記載されている。

表５における‘番号’欄は、表２に記載されている番号に対応する。

‘患者群の出現頻度’欄は、２４７人の検査された患者のうち、前記多重ＳＮＰを有する患者の数を表す。‘正常群の出現頻度’欄は、２９５人の検査された正常人のうち、前記多重ＳＮＰを有する正常人の数を表す。

‘患者群の累積的出現頻度’欄は、２４７人の検査された患者のうち、該当する多重ＳＮＰまたは先行番号（ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ Ｎｏ．）の多重ＳＮＰを有する患者の数を表す。‘正常群の累積的出現頻度’欄は、２９５人の検査された正常人のうち、該当する多重ＳＮＰまたは先行番号（ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ Ｎｏ．）の多重ＳＮＰを有する正常人の数を表す。２以上の多重ＳＮＰを有している患者が多いため、前記累積的出現頻度は線形ではない。表５に表したように、１４の多重ＳＮＰのうち一つ以上を有している患者は、２４７人のうち１７７人であるということが分かる。

‘オッズ比’欄は、正常群のうち前記多重ＳＮＰを有する確率に対する、患者群のうち前記多重ＳＮＰを有する確率の比を表す。すなわち、オッズ比は、ａｄ／ｂｃであって、前記式で、ａは、患者群での多重ＳＮＰの出現頻度を表し、ｃは、正常群での多重ＳＮＰの出現頻度を表し、ｂ＝［（検査された患者の総数）−ａ］であり、ｄ＝［（正常で羅患していない人の総数）−ｃ］である。検査された患者及び正常な人がそれぞれ２４７人及び２９５人であるので、結局、ｂ＝［２４７−ａ］であり、ｄ＝［２９５−ｃ］である。

前記オッズ比が１を超える場合、前記多重ＳＮＰと前記患者群との間には相関性がある。オッズ比が大きいほど前記相関性も増加する。表５に表したように、本発明の実施形態による多重ＳＮＰの番号１〜１４は、３.３２〜３６.０８のオッズ比を有する。この数値は、１よりはるかに大きい数値であるので、本発明の実施形態による多重ＳＮＰの番号１〜１４と大腸癌の発病とは緊密な相関性があるということが分かる。

‘９５％信頼区間’欄または‘９９％信頼区間’欄は、その区間が実際のオッズ比を含む確率がそれぞれ９５％及び９９％であることを表すものであって、下記の式で計算される。１が前記信頼区間を含む場合、すなわち、前記信頼区間の下限が１未満であり、上限が１を超える場合には、前記多重ＳＮＰと大腸癌との相関性はないということが分かる。

前記式で、Ｖ＝１／ａ＋１／ｂ＋１／ｃ＋１／ｄである。

前記式で、Ｖ＝１／ａ＋１／ｂ＋１／ｃ＋１／ｄである。

前記‘並べかえテスト’欄は、既に求めた前記多重ＳＮＰのオッズ比が、偶然測定された値であるか、実際にそのような数値を有しているか否かを確認するために行われる。 ‘期待値（Ｅ）’欄は、オッズ比が該当値より高い遺伝子型の期待される数を表す。前記‘観測値（Ｏ）’欄は、オッズ比が該当値より高い遺伝子型の実際に観測された数を表す。また、‘比率（Ｏ／Ｅ）’欄は、前記期待値に対する前記観測値の比を表すものである。前記比（Ｏ／Ｅ）が１以上であれば、当該分析が有意であるということを意味する。表５から分かるように、多重ＳＮＰは有意であることが証明された。

本発明の実施形態による大腸癌診断用の多重ＳＮＰは、前記多重ＳＮＰのうちの一を含み、さらに好ましくは２以上の多重ＳＮＰを含み、例えば、番号１〜１４の多重ＳＮＰ全てを含む。

大腸癌診断用の多重ＳＮＰに含まれる単一のＳＮＰを有するポリヌクレオチドは、１０以上のコンティグ塩基を含むことができ、例えば１０〜１００のコンティグ塩基を含む。

本発明の他の実施形態による大腸癌診断用のポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチドまたはその相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズしうる。

本発明の他の実施形態による大腸癌診断用のマイクロアレイは、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチド若しくはその相補的なポリヌクレオチド、それらのうちの１つとハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらのうちの１つによりコードされるポリペプチド、またはそのｃＤＮＡを含む。

本発明の一実施形態によれば、前記マイクロアレイは、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチドまたはその相補的なポリヌクレオチド、プローブとハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらによりコードされるポリペプチド、またはそのｃＤＮＡを利用して、当業者に知られている従来の方法を用いて製造されうる。

すなわち、前記ポリヌクレオチドは、アミノ−シラン、ポリ−Ｌ−リシン及びアルデヒドの中から選択される活性基でコーティングされた基板上に固定されうる。また、前記基板は、シリコンウエハー、ガラス、石英、金属またはプラスチックから形成されうる。前記ポリヌクレオチドを前記基板上に固定化させる方法としては、圧電方式を利用したマイクロピペッティング法、またはピン状のスポッターを利用した方法のいずれかが使用可能である。

本発明の一実施形態による大腸癌診断用のキットは、前記マイクロアレイを含む。

前記キットは、被検者から前記ＳＮＰを含むＤＮＡを単離及び増幅するのに使われるプライマーセットをさらに含む。適当なプライマーセットは、本発明の実施形態の配列を参照して、当業者が容易に設計しうる。例えば、前記プライマーセットとして、表６に示されたものを利用しうる。

本発明の他の実施形態による大腸癌を診断する方法は、本発明による多重ＳＮＰを用いる。

診断する方法は、被験者からＤＮＡを単離する段階と、前記ＤＮＡの多型部位の塩基配列を決定する段階と、前記塩基配列が前記表３における一以上の多重ＳＮＰを含む場合、前記被検者が大腸癌を発病しているか、または大腸癌の発病可能性が高いと判定する段階と、を含む。

ＤＮＡの単離は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、組織または細胞からＤＮＡを直接的に精製するか、ＰＣＲのような増幅方法を用いて特定の領域を特異的に増幅し、これを単離することがありうる。本明細書において、「ＤＮＡ」とは、ＤＮＡだけでなく、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡも含む意味である。被検者から核酸を得る段階は、例えば、ＰＣＲ増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１、１０７７（１９８８））、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、１１７３（１９８９））、自家維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７、１８７４（１９９０））、及び核酸配列に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）のいずれかが用いられうる。

単離されたＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の多様な方法によってなされうる。例えば、核酸のヌクレオチドの場合、ジデオキシ法を用いたダイレクトシークエンシングが利用できる。また、ＳＮＰ部位の配列を含むプローブまたはその相補的なプローブと前記ＤＮＡとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションの程度を測定することによって、多型部位のヌクレオチド配列を決定することができる。ハイブリダイゼーションの程度は、例えば、検出可能な標識で標的ＤＮＡを標識し、ハイブリダイズされた標的のみを特異的に検出する方法によって測定されてもよいし、電気的信号の検出方法によって測定されてもよい。前記塩基配列を決定する段階は、前記被検者から単離されたＤＮＡを本発明の一実施形態によるマイクロアレイにハイブリダイズさせる段階と、非特異的な反応を除去するために洗浄する段階と、前記ハイブリダイゼーションの程度を決定する段階とを含みうる。

被験者から単離された核酸中に、表３に表した一以上の多重ＳＮＰが含まれる場合、前記被験者は大腸癌患者であるか、または大腸癌を発病する確率が高いと判定される。

以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１
多重ＳＮＰの選別
大腸癌患者と診断されて治療中の患者群、及び大腸癌症状のない正常群のそれぞれの血液中の白血球からＤＮＡを単離し、その後、特定のＳＮＰの出現頻度を分析した。前記患者群及び正常群は共に韓国人からなる。本実施例のＳＮＰは、公開データベース（ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ＳＮＰ／）またはシーケノム社のウェブサイト（ｈｔｔｐ：：／／ｗｗｗ.ｒｅａｌｓｎｐ.ｃｏｍ／）のいずれかから選択された。前記ＳＮＰから近接した位置に設計したプライマーを利用して試料中のＳＮＰを分析した。

１−１．ＤＮＡ試料の調製
大腸癌患者と診断されて治療中の２４７人からなる韓国人の患者群、及び大腸癌症状のない２９５人からなる韓国人の正常群のそれぞれの血液からＤＮＡを抽出した（患者群の血液：ＭｙＤＮＡ（ｗｗｗ.ｂｉｏｂａｎｋ.ｃｏ.ｋｒ／ｋｏｒｅａ／ｍａ／ｍｙｄｎａ.ｓｈｔｍｌ）、正常群の血液：三星医療センター（ｗｗｗ.ｓｍｃ.ｏｒ.ｋｒ））。染色体ＤＮＡの抽出は、公知の分子クローニング抽出方法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ｐ３９２、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）及び商業上利用可能なキット（Ｇｅｎｔｒａ ｓｙｓｔｅｍ、Ｄ−５０Ｋ）の説明書を用いてなされた。ＵＶ（２６０／２８０ｎｍ）を用いて測定された、１.７以上の純度を有するＤＮＡのみが、前記抽出したＤＮＡから選択され、使用された。

１−２．標的ＤＮＡの増幅
分析しようとする８５のＳＮＰを含む一定のＤＮＡ領域を有する標的ＤＮＡを、ＰＣＲを利用して増幅した。ＰＣＲは従来の方法を用いて行い、その条件は、下記の通りであった。まず、染色体ＤＮＡを２.５ｎｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。次いで、次のＰＣＲ反応液を調製した。
水（ＨＰＬＣグレード） ２.２４μｌ
１０×バッファ（１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有） ０.５μｌ
ｄＮＴＰミックス（ＧＩＢＣＯ）（２５ｍＭ／各） ０.０４μｌ
Ｔａｑ ｐｏｌ（ＨｏｔＳｔａｒｔ）（５Ｕ／μｌ） ０.０２μｌ
フォワード／リバース プライマーミックス（１μＭ／各） ０.０２μｌ
ＤＮＡ １.００μｌ
総反応体積 ５.００μｌ
ここで、前記フォワード及びリバースプライマーは、公知のデータベースにより、ＳＮＰの上流及び下流において、適当な位置にそれぞれ選択した。８５種類のプライマーセットのうち一部を表６に示す。

ＰＣＲの熱サイクルは、９５℃で１５分間維持した後、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分間を計４５回反復し、その後７２℃で３分間維持し、４℃で保管した。その結果、２００ヌクレオチド以下の長さを有する標的ＤＮＡ断片を得た。

１−３．増幅された標的ＤＮＡについてのＳＮＰ分析
標的ＤＮＡ断片についてのＳＮＰの分析は、シーケノム社の均質的ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ（ｈＭＥ）技法を利用した。前記ｈＭＥ技法の原理は、次の通りである。まず、標的ＤＮＡ断片のうち、ＳＮＰの直前までの塩基に相補的なプライマー（伸長プライマーともいう）を調製した。次いで、前記プライマーを標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、ＤＮＡ重合反応を実行した。このとき、被験者のＳＮＰ対立因子のうち第１対立因子塩基（例えば、Ａ対立因子）に相補的な塩基が添加された後に、反応を停止させる試薬（Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｘ：例えば、ｄｄＴＴＰ）を前記反応液に添加した。その結果、標的ＤＮＡ断片に前記第１対立因子（例えば、Ａ対立因子）が存在する場合には、前記第１対立因子に相補的な一塩基（例えば、Ｔ）のみが付加された産物が得られる。一方、前記標的ＤＮＡ断片に第２対立因子（例えば、Ｇ対立因子）が存在する場合には、第１対立因子塩基（例えば、Ａ）まで伸長した前記第２対立因子に相補的な塩基（例えば、Ｃ）を有する産物を得た。このように得られた、前記プライマーから伸長した産物の長さを、質量分析を通じて決定することによって、標的ＤＮＡに存在する対立因子の型を決定しうる。具体的な実験条件は、次の通りであった。

まず、前記ＰＣＲ産物から、遊離状態のｄＮＴＰを除去した。このために、純水１.５３μｌ、ｈＭＥバッファ０.１７μｌ、ＳＡＰ（Ｓｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）０.３０μｌを１．５ｍｌのチューブに入れて混合してＳＡＰ酵素溶液を調製した。前記チューブを５,０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。その後、前記ＰＣＲ産物を前記ＳＡＰ溶液チューブに入れ、密封した後に３７℃で２０分間、及び８５℃で５分間維持した後、４℃で保管した。

次いで、前記標的ＤＮＡ産物を鋳型として均質的な伸長反応を実行した。反応液は、次の通りであった。
水（ナノ級純水） １.７２８μｌ
ｈＭＥ伸長ミックス（２.２５ｍＭ ｄ／ｄｄＮＴＰｓを含む１０×バッファー） ０.２００μｌ
伸長プライマー（各１００μＭ） ０.０５４μｌ
サーモシークエナーゼ（３２Ｕ／μｌ） ０.０１８μｌ
総体積 ２.００μｌ
前記反応液をよく混合した後、スピンダウン遠心分離した。前記反応液の入ったチューブまたはプレートをよく密封し、９４℃で２分間維持した後、９４℃で５秒、５２℃で５秒、７２℃で５秒を計４０回反復し、その後４℃で保管した。このようにして得られた、均質的伸長反応産物をレジン（ＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮ，シーケノム社の＃１００５３）で洗浄し塩を除去した。均質的伸長反応に使われた８５種類の伸長プライマーのうち一部を表６に表す。

得られた伸長反応産物について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ）を利用した質量分析を実行して、多型性部位の配列を決定した。前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでは、分析しようとする物質がレーザビームを受ければ、イオン化されたマトリックス（３−ヒドロキシピコリン酸）と共に真空状態で検出器まで飛行する。検出器まで飛行するのにかかる時間を計算して質量を決定した。質量が小さな物質は、大きな物質よりも検出器に速く到達できる。このように得られる質量と既知のＳＮＰを有するヌクレオチド配列との差に基づき、標的ＤＮＡ中のＳＮＰのヌクレオチド配列を決定しうる。

前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを利用した標的ＤＮＡのＳＮＰを有するヌクレオチド配列を決定した結果を、表１〜３に示した。このとき、各対立因子は、各個体においてホモ接合体またはヘテロ接合体の形態に存在しうる。メンデルの遺伝法則とハーディ・ワインバーグ法則とによれば、集団を構成する対立因子の遺伝子構造は、一定の頻度で維持される。前記遺伝子構造が統計的に有意な場合、生物学的に意義のあるものと考慮されうる。本発明の実施形態によるＳＮＰは、大腸癌患者から統計的に有意なレベルで出現するため、大腸癌の診断に効果的に利用可能である。

１−４．多重ＳＮＰの選別
２４７人の大腸癌患者と２９５人の正常人のうち、分析された８５のＳＮＰ配列を基礎として、大腸癌患者で頻繁に発見されるＳＮＰの組み合わせ、すなわち、多重ＳＮＰを選別した。

まず、前記８５のＳＮＰ配列のうち、１〜４個の組み合わせからなる多重ＳＮＰの数は、約１.４×１０^９個であることを確認した。

１次スクリーニング後、遺伝子型比が２以上であり、遺伝子型の差が０.１×（患者の総数）で算出される値かそれ以上の値である、約１３,３００の多重ＳＮＰを選別した。

２次スクリーニングにおいて、下記の式で計算されるオッズ比、その９５％信頼区間及び９９％信頼区間を利用した。前記オッズ比はａｄ／ｂｃで定義され、ａ、ｂ、ｃ及びｄは表７で定義されている。オッズ比が１を超える場合、前記遺伝子型と大腸癌とは相関性があるということを意味する。

前記式で、Ｖ＝１／ａ＋１／ｂ＋１／ｃ＋１／ｄである。

上記で選別された１３,３００個の多重ＳＮＰのうち、前記９５％信頼区間が１.５以上という低い範囲を有する多重ＳＮＰを選別し、前記オッズ比が３.０以上である多重ＳＮＰを選別した後、前記９９％信頼区間が１.５以上という低い範囲を有する多重ＳＮＰを選別することにより、９,８１９の多重ＳＮＰを選別した。前記オッズ比、並びに前記９５％信頼区間及び前記９９％信頼区間についての低い範囲が１.０を超えれば、結果は統計的に有意である。しかし、最も効果的なマーカーを選択するために、要求される基準値をそれぞれ１.５、３.０及び１.５と設定した。

前記９,８１９の多重ＳＮＰのうち、最適化方法のうちの一つであるグリーディー法（Ｃｏｒｍｅｎ ｅｔ ａｌ.，“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ”、ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ、２００１）を利用して１４の多重ＳＮＰを選別したが、前記１４の多重ＳＮＰは、少数の単一のＳＮＰからなり、それぞれが高いオッズ比、すなわち、患者群に対する高いカバレージ、かつ正常群に対する低いカバレージを有する。前記１４の多重ＳＮＰは、表１に示されている。

実施例２
ＳＮＰが固定されたマイクロアレイの製作
上記で選別されたＳＮＰを基板上に固定してマイクロアレイを製作した。すなわち、表２の番号１〜１４が有する多重ＳＮＰは前記基板上で固定化されるが、前記多重ＳＮＰは、表１に表した各ポリヌクレオチドから選択される、２０のコンティグ塩基及び各１０１番目の塩基を含む一以上のポリヌクレオチドの組み合わせであり、ここで、前記ＳＮＰは、１１番目のヌクレオチドに位置し、前記選択されたポリヌクレオチドのうち各１０１番目の塩基の対立因子の遺伝子型が表３に示された遺伝子型である。

まず、前記各ポリヌクレオチドのＮ−末端をアミン基に置換した後、シリル化スライド（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社）上にスポットし、このとき、２×ＳＳＣ（ｐＨ７.０）のスポッティングバッファーを使用した。スポット後に、乾燥器中で結合を誘導し、０.２％ＳＤＳで２分間及び３回蒸溜水で２分間洗浄して、遊離のオリゴヌクレオチドを除去した。９５℃まで２分間スライドの温度を上昇させることによって誘発された変性を利用し、ブロッキング溶液（１.０ｇ ＮａＢＨ_４、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）３００ｍＬ、ＥｔＯＨ １００ｍＬ）で１５分間、０.２％ＳＤＳ溶液で１分間、及び３回蒸溜水で２分間洗浄し、その後常温で乾燥させることによってマイクロアレイを製作した。

実施例３
マイクロアレイを利用した大腸癌診断
前記実施例１−１及び１−２で説明した方法を利用して、大腸癌の発病または発病可能性を診断するための被験者の血液から標的ＤＮＡを単離し、蛍光標識した。ＵｎｉＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ社）中で、４２℃で４時間の条件下、前記実施例２で製作されたマイクロアレイと、前記蛍光標識した標的ＤＮＡとをハイブリダイズした。２×ＳＳＣを用いて室温で５分間の洗浄を２回行い、空気中で乾燥させた。乾燥したスライドをスキャンアレイ５０００（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社）を用いてスキャンした。スキャンした結果をクワントアレイ（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社）及びＩｍａＧｅｎｅソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒ社）を用いて分析した。前記被験者が本発明の一実施形態による多重ＳＮＰを全部または一部有しているか否かを確認することによって、大腸癌の発病可能性及び大腸癌に対する感受性を測定した。

本発明によるＳＮＰは、大腸癌の発病または発病可能性を効果的に診断するために利用可能である。

本発明は、望ましい実施例を参照して説明されたが、当業者ならば、これから多様な変形及び均等な他の実施例が可能であるということが分かるであろう。したがって、特許請求の範囲で規定される本発明の精神及び範囲を離れることなく決定されねばならない。

Claims (12)

1. 配列番号１〜３１のヌクレオチド配列から選択される、それぞれが１０以上のコンティグ塩基及び１０１番目の塩基を含む一以上のポリヌクレオチド、並びに前記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む、大腸癌診断用の多重ＳＮＰ。
   

   
2. 配列番号１〜３１のヌクレオチド配列から選択される、それぞれが１０以上のコンティグ塩基及び１０１番目の塩基を含む一以上のポリヌクレオチドの組み合わせ、並びに前記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの組み合わせである、表２における番号１〜１４の多重ＳＮＰからなる群から選択される、請求項１に記載の多重ＳＮＰ。
   

   
3. 前記選択されたポリヌクレオチドの１０１番目の塩基の対立因子は、表３に表された遺伝子型を有する、請求項２に記載の多重ＳＮＰ。
   

   
4. 番号１〜１４の多重ＳＮＰからなる、請求項２に記載の多重ＳＮＰ。
5. １０〜１００の前記コンティグ塩基を含む、請求項１に記載の多重ＳＮＰ。
6. 請求項１に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド。
7. 請求項１または６に記載のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、またはそのｃＤＮＡを含む、大腸癌診断用のマイクロアレイ。
8. 前記ポリヌクレオチドは、アミノ−シラン、ポリ−Ｌ−リシン及びアルデヒドからなる群から選択される活性基でコーティングされた基板上に固定される、請求項７に記載のマイクロアレイ。
9. 前記基板は、シリコンウエハー、ガラス、石英、金属及びプラスチックからなる群から選択される材料からなる、請求項８に記載のマイクロアレイ。
10. 請求項７に記載のマイクロアレイを含む、大腸癌診断用キット。
11. 被験者からＤＮＡを単離する段階と、
    前記ＤＮＡの多型部位の塩基配列を決定する段階と、
    前記塩基配列が前記表３における多重ＳＮＰの一以上を含む場合、前記被検者が大腸癌を発病しているか、または大腸癌の発病可能性が高いと判定する段階と、を含む、大腸癌の診断方法。
12. 前記塩基配列を決定する段階は、
    前記単離されたＤＮＡを請求項７に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる段階と、
    非特異的な反応を除去するために洗浄する段階と、
    ハイブリダイゼーションの程度を決定する段階と、を含む、請求項１１に記載の方法。