CN101993949B

CN101993949B - 检测胰腺癌的基因芯片及其应用

Info

Publication number: CN101993949B
Application number: CN200910057745A
Authority: CN
Inventors: 江华
Original assignee: Shanghai East Hospital
Current assignee: Shanghai East Hospital
Priority date: 2009-08-12
Filing date: 2009-08-12
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2029-08-12
Also published as: CN101993949A

Abstract

本发明公开了一种检测胰腺癌的基因芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测胰腺癌相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交，所述待测胰腺癌相关基因包括P21，smad4，P16，c-Myc，bc1-2，Fas，CA19-9，SERPINB9，RHOT1和P53基因。本发明还公开了应用所述基因芯片对胰腺癌进行检测的方法。本发明的基因芯片能够在胰腺癌发生发展早期即进行有效检测，以提高治愈率降低死亡率。

Description

检测胰腺癌的基因芯片及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因芯片，尤其涉及一种检测胰腺癌的基因芯片及其应用。

背景技术

胰腺癌是常见恶性肿瘤之一，近年来发病率呈升高趋势，且缺乏有效的诊断方法和治疗措施，因此造成胰腺癌病人发现晚、预后差、死亡率高。对普通和高危人群进行定期筛查，是提高早期诊断率并及时发现疾病的有效措施之一。

事实上，胰腺癌的发生发展涉及多个基因表达改变。如果在胰腺癌发生早期就从基因水平对癌症进行诊断，检测重要相关基因的表达变化，将有利于癌症的早期发现和早期治疗，提高病人的生存率。

基因芯片是人类基因组计划带来的最具应用价值的科研成果，它融合了生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生命信息学等多种学科的最新技术。随着微加工技术的发展，高密度寡核苷酸芯片最高密度可达上百万个探针，因此基因芯片通量水平并不受芯片技术本身制约，而是受样本的处理和基因芯片设计方法的限制。基因芯片作为一种高通量的、先进的分子生物学技术，可应用于疾病基因表达变化的检测，其具有高度的灵敏性和准确性、快速便捷、并可同时检测多个基因表达变化等优点。

目前有关胰腺癌的免疫学诊断产品及PCR产品单一标志物检测灵敏度和特异性存在不能兼顾的缺点，鉴于目前检测胰腺癌的传统方法效果不佳，有必要利用基因芯片技术开发一种检测胰腺癌的基因芯片，从而能够在胰腺癌发生发展早期即进行有效诊断，以提高治愈率降低死亡率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测胰腺癌的基因芯片，能够在胰腺癌发生发展早期即进行有效检测，以提高治愈率降低死亡率。为此，本发明还要提供应用该基因芯片检测胰腺癌的方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种检测胰腺癌的基因芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测胰腺癌相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交，所述待测胰腺癌相关基因包括P21，smad4，P16，c-Myc，bcl-2，Fas，CA19-9，SERPINB9，RHOT1和P53基因。

本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果就可以。优选的，本发明所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。

所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其衍生物。所述探针的长度没有限制，只要能完成与目的核苷酸序列特异性结合。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对之间的为最佳。所述探针的自身互补序列最好少于6个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明基因芯片的探针为DNA，包括：

(1)与待测P21基因杂交的(a)SEQ ID NO：1所示序列，(b)SEQ ID NO：1所示序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：1所示序列有至少70％同源性的序列；

(2)与待测smad4基因杂交的(a)SEQ ID NO：2所示序列，(b)SEQ ID NO：2所示序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：2所示序列有至少70％同源性的序列；

(3)与待测P16基因杂交的(a)SEQ ID NO：3所示序列，(b)SEQ ID NO：3所示序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：3所示序列有至少70％同源性的序列；

(4)与待测c-Myc基因杂交的(a)SEQ ID NO：4所示序列，(b)SEQ ID NO：4所示序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：4所示序列有至少70％同源性的序列；

(5)与待测bcl-2基因杂交的(a)SEQ ID NO：5所示序列，(b)SEQ ID NO：5所示序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：5所示序列有至少70％同源性的序列；

(6)与待测Fas基因杂交的(a)SEQ ID NO：6所示序列，(b)SEQ ID NO：6所示序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：6所示序列有至少70％同源性的序列；

(7)与待测CA19-9基因杂交的(a)SEQ ID NO：7所示序列，(b)SEQ ID NO：7所示序列7的互补链，(c)与SEQ ID NO：7所示序列有至少70％同源性的序列；

(8)与待测SERPINB9基因杂交的(a)SEQ ID NO：8所示序列，(b)SEQ ID NO：8所示序列8的互补链，(c)与SEQ ID NO：8所示8序列有至少70％同源性的序列；

(9)与待测RHOT1基因杂交的(a)SEQ ID NO：9所示序列，(b)SEQ ID NO：9所示序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：9所示序列有至少70％同源性的序列；

(10)与待测P53基因杂交的(a)SEQ ID NO：10所示序列，(b)SEQ ID NO：10所示序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：10所示序列有至少70％同源性的序列。

优选的，本发明基因芯片的探针选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10所示序列。

所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可以为探针形成双链的部分提供一个自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slidescoated with an agarose film.Nucleic Acids Res.2000，28：e66；USA Patent No.5556752]。连接臂越长，杂交效率越高。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T(A、C或G)的嵌合体、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其组合物。

所述探针或连接臂通过连接分子固定于固相载体上。探针固定到载体上可以通过C-C键实现，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷键(玻璃或二氧化硅作支持物时使用)。硅氧烷键键合可以通过支持物和连接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基团反应完成。氨基烷基硅烷、轻基烷基硅烷、2一轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或轻丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基团。

所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5’-NH₂修饰、5’-SH修饰、5’-Poly T(A、C或G)修饰、5’-生物素修饰、3’-NH₂修饰、3’-SH修饰、3’-Poly T(A、C或G)修饰和3’-生物素修饰等。

所述探针可以有一条或几条，甚至全部都是经过标记的，所述标记包括荧光素标记、生物素标记、放射性元素标记、酶标记和荧光共振能量转移标记。

在本发明的另一方面，提供了一种应用上述基因芯片对胰腺癌进行检测的方法，包括如下步骤：

(1)在固相载体表面点载与待测胰腺癌相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针；

(2)抽提待测样品的总RNA，纯化总RNA；

(3)反转录合成cDNA，标记cRNA合成，纯化cRNA；

(4)标记cRNA样品，纯化标记的cRNA样品；

(5)cRNA样品片段化；

(6)芯片杂交；

(7)芯片洗涤，芯片扫描，检测杂交反应的结果。

本发明步骤(3)和步骤(4)中合适的标记包括荧光标记、放射性同位素标记、发色团、发光体、FRET、酶、生物素或有特殊结合配体的配基。

本发明方法的芯片杂交可在任何适当的温度下进行，如63℃～68℃，所述杂交时间为15～20小时。可以改变杂交条件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。

本发明通过全基因表达谱实验和定量PCR实验，筛选了大量癌相关基因，最终选择了与胰腺癌发生发展重要相关的10个基因P21(K-ras)、P16、P53、smad4/DPC4、bcl-2、c-Myc、Fas/Apo-1(CD95)、SERPINB9、RHOT1、CA19-9作为诊断标志物。设计上述10个基因、阴性对照基因和阳性对照基因的探针，反复优化实验条件，使不同基因能在统一实验条件下进行检测。使用该基因芯片检测大量样本，确定判定胰腺癌的有效阈值。本发明弥补了目前免疫学诊断产品及PCR产品单一标志物检测灵敏度和特异性不能兼顾的缺点，有利于大范围的普查和筛查，从而在胰腺癌发生发展早期即进行有效诊断，以提高治愈率降低死亡率，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1是本发明的实施例3中总RNA质量检测(琼脂糖电泳)的结果示意图；

图2是本发明实施例3的基因芯片的杂交结果图；

图3是本发明实施例3的基因芯片的杂交结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1芯片设计：

芯片包括10个目的基因，定量阳性对照1个基因βactin(上海生工合成)，阴性对照为两种水稻EST序列(上海生工合成)，定量内标看家基因11种(上海生工合成)。芯片质控采用定量阳性对照和定量内标看家基因、阴性对照，对逆转录、杂交过程进行检测和结果分析。

目的基因：P21(又名K-ras)，smad4，P16，c-Myc，bcl-2，Fas，CA19-9，SERPINB9，RHOT1，P53。

实施例2芯片制备：

根据目的基因的序列设计探针，探针长度55-60bp。送上海生工合成探针，数量2OD。

将SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10所示序列探针的每条探针用TE溶液(Tiris-EDTA缓冲液，购自SIGMA公司)稀释，终浓度为50μM。

将浓度为50mM的探针与浓度为200mM的PBS溶液(购自SIGMA公司)于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，-20℃保存，以备点样使用。

将预先设计并合成好的探针通过接触式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。片基采用醛基片基(北京博奥生物有限公司，北京，中国)，GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度：60％，温度为25℃的条件下点样。点样的格式为1×3，每个矩阵为5×10。点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。

实施例3芯片杂交实验：

1.总RNA抽提(TRIzol法)：

每100mg组织加入1ml Trizol(购自SIGMA公司)，用匀浆器充分打碎。加入约1/5体积的氯仿，充分混匀室温下静置5分钟。4℃，12,000rpm离心15分钟后将上清夜转入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5分钟。4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀15分钟。去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，测定OD260和OD280值。

2.总RNA质量检测(琼脂糖电泳)

通过目测28S和18S的亮度比例可以初步评价总RNA的质量。一般认为28S∶18S≥2可以初步判定总RNA质量较好，如图1所示。

3.总RNA的纯化(QIAGEN

mini Kit试剂盒纯化总RNA)

如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGEN

Kit(购自QIAGEN公司)纯化总RNA，详细操作原理和方法见下：

(1)取总RNA≤100μg溶解于100μl RNase free(无RNA酶)水中，加入350μl Buffer RLT(缓冲液RLT)并充分混匀。

(2)加入250μl无水乙醇，Tip头充分混匀。

(3)将共计700μl含总RNA的溶液转入套在2ml离心管内的RNeasy柱子内，≥8000g离心30秒，弃去滤过液。

(4)吸取500μl Buffer RPE(缓冲液RPE)到RNeasy mini柱子内，≥8000g离心洗涤30秒，弃去滤过液，再用500μl Buffer RPE在≥8000g离心洗涤2min，弃去滤过液和2ml的套管，将RNeasy mini柱子转入一新的1.5ml Eppendorf管中。

(5)吸取40μl RNase free的水，≥8000g离心洗脱1min。

(6)重复步骤(5)一次。

4.cDNA第一链和第二链一步法合成

(1)取2μg RNA于1.5ml离心管中，如下配置反应溶液：

总RNA	2μg(最多6.5μl)
		T7 Promotor primer(T7启动子引物)	5μl
RNase-free Water	Xμl
		总体积	11.5μl

(2)65℃保温10分钟，冰浴5分钟；

注意：提前把5×First Strand Buffer(第一链缓冲液)在65℃预热5分钟；

(3)配置如下cDNA合成体系：

5×First Strand Buffer	4μl
		0.1M DTT(二硫苏糖醇)	2μl
10mM dNTP mix	1μl
		MMLV RT(反转录逆转录)	1μl
RNase OUT	0.5μl
		总体积	8.5μl

(4)将上述8.5μl混合物加入变性后冰浴的RNA中。

(5)用枪头混匀，之后离心。

(6)PCR：热盖65℃，40℃反应2小时；65℃灭活15分钟；4℃反应5分钟。

5.aaUTP标记cRNA合成

试剂配制：

NTP的配制：

100mM ATP 250μl

100mM GTP 250μl

100mM CTP 250μl

100mM UTP 187.5μl

RNase free H2O 62.5μl

Total 1000μl

分装成10管备用

注意：50％PEG使用之前40℃保温1分钟。

(1)如下配置Transcription mix(转录混合液)：

RNase-free Water	5.7μl
		4×Transcription Buffer(转录缓冲液)	20μl
NTP	16μl
		0.1M DTT	6μl
50％PEG	6.4μl
		aa-UTP(25mM)(型号AM8436，购自Ambion公司)	4μl
RNase OUT	0.5μl
		Inorganic Pyrophosphatase(无机磷酸酶)	0.6μl
T7RNA Polymerase(T7RNA聚合酶)	0.8μl
		总体积	60μl

(2)加入60μl Transcription mix并混匀；

(3)PCR仪(型号PTC-100，购自MJ公司)中热盖60℃，40℃反应2小时。

6.cRNA纯化(QIAGEN

Mini Kit)

QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA，具体方法可参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册。

试剂配制：

RLT的配制：14mL原始RLT可加140μl的β-ME(β-巯基乙醇)。

RPE的配制：加4倍体积的无水乙醇。

(1)加入20μl RNase free水，加入350μl Buffer RLT并充分混匀。

(2)加入250μl无水乙醇，Tip头充分混匀。

(3)将共计700μl含总RNA的溶液转入套在2ml离心管内的RNeasy柱子内，≥8000g离心15-30sec，弃去滤过液。

(4)吸取500μl Buffer RPE到RNeasy mini柱子内，≥8000g离心洗涤15-30sec，弃去滤过液，再用500μl Buffer RPE在≥8000g离心洗涤2min，弃去滤过液和2ml的套管，将RNeasy mini柱子转入一新的1.5ml Eppendorf管中。

(5)吸取30μl RNase free的水，静置1min，≥8000g离心洗脱1min。

(6)重复步骤(5)一次。

7.cRNA浓度测定

(1)cRNA质控

用分光光度计(ND1000型号，购自Nanodrop公司)分析RNA浓度。

需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度。

A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)。

(2)按下面的计算公式确定调整cRNA的含量：

调整cRNA含量＝RNAm-(total RNAi)(y)；

RNAm＝IVT后测得cRNA量(μg)；

total RNAi＝开始总RNA的量(μg)；

y＝在IVT过程中加入的双链cDNA产物占全部cDNA产物的百分数。

8.cRNA探针后标记(所用试剂室温放置)

(1)取上述cRNA 4μg并浓缩至6.6μl。

(2)加10μl DMSO混匀。

(3)加3.4μl的0.3M碳酸氢钠(NaHCO3)(pH9.0)并混匀。

(4)将上述20μl cRNA混合物加入到荧光染料(Cy3NHS ester，型号PA13105，购自GE healthcare公司)中，并混匀，25℃保温1小时。

(5)加9μl的4M Hydroxylamine(羟胺)混匀后25℃保温15min。

9.cRNA探针纯化(QIAGEN

Mini Kit)

(1)加入70μl RNase free水，加入350μl Buffer RLT并充分混匀。

(2)加入250μl无水乙醇，Tip头充分混匀。

(5)吸取30μl RNase free的水，静置1min，≥8000g离心洗脱1min。

(6)重复步骤(5)一次。

(7)测A260、A550、A650的OD。

10.cRNA探针定量

荧光分子浓度及掺入率计算：

Cy3-浓度(pmol/μl)＝A552/0.15；

Cy3-掺入率(pmol/μg)＝Cy3-浓度/cRNA浓度(μg/μl)。

11.芯片杂交

(1)按下表配制片段化混合液，然后在60℃温浴30min进行片段化；

Cy3cRNA	875ng
		10XBlocking Agent(阻化剂)	11μl
25X Fragmentation Buffer(分裂缓冲液)	2.2μl
		Nuclease-free water(无核酸酶水)	Xμl
总体积	55μl

(2)加入55μl 2X GEx Hybri dization Buffer(杂交缓冲液)；

(3)取100μl上芯片，65℃17小时，10rpm滚动杂交(杂交炉，型号G2545A，购自Agilent公司)；

12.芯片洗涤(室温25度洗涤)

(1)取出芯片于洗液1中洗涤1分钟；

(2)再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟(37℃)。

13.芯片扫描

Agilent扫描仪(型号G2565BA)中扫描，分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描一次，两次结果Agilent软件可自动合并。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图2和图3所示。

序列表

<110>上海市东方医院

<120>检测胰腺癌的基因芯片及其应用

<130>NP-09-13348

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

catcatttgg ttgcgctgac ctaggaatgt tggtcatatc aaacattaaa aatgaccact 60

<210>2

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aggagaaaca cattcttatt aattcttcac ctgttatgta tgaaggaatc attccagtgc 60

<210>3

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gggttactgg cttctcttga gtcacactgc tagcaaatgg cagaaccaaa gctcaaataa 60

<210>4

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ttcaaatgca tgatcaaatg caacctcaca accttggctg agtcttgaga ctgaaagatt 60

<210>5

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tggctgatat tctgcaacac tgtacacata aaaaatacgg taaggatact ttacatggtt 60

<210>6

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atgtctatcc acaggctaac cccactctat gaatcaatag aagaagctat gaccttttgc 60

<210>7

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gtaccgatcg tagcccctat gagaaggttt ctgcaggtaa tggtggcagc agcctctctt 60

<210>8

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tgtctttgcc tattaaagat attatccctc tgttttatat tttctctcat tcttgtattg 60

<210>9

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cctactatgc gattaacact gtttatgtat atggacaaga gaaatacttg ttgttgcatg 60

<210>10

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ctgtgaggga tgtttgggag atgtaagaaa tgttcttgca gttaagggtt agtttacaat 60

Claims

1.一种检测胰腺癌的基因芯片，包括固相载体和探针，其特征在于，所述探针与待测胰腺癌相关基因的核苷酸序列或其互补序列进行杂交，所述待测胰腺癌相关基因包括P21，smad4，P16，c-Myc，bcl-2，Fas，CA19-9，SERPINB9，RHOT1和P53基因；所述探针由SEQID NO：1～SEQ ID NO：10所示序列组成，或者所述探针由SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10所示序列的互补链组成。