CN105567845B - 以CA19-9 cDNA片段为模板制备RNA探针的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种以CA19‑9 cDNA为模板制备RNA探针的方法。该方法包括以下步骤：针对CA19‑9 mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；从CA19‑9 cDNA质粒中，采用上述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。本发明得到的cRNA探针能够全部覆盖所有靶序列，简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，探针特异性更高，稳定性更强，背景信号更低且灵敏度更高。在此基础上，本发明提供了一种快速检测胰腺癌相关的CA19‑9表达的试剂盒。

Description

以CA19-9cDNA片段为模板制备RNA探针的方法
技术领域
本发明属于核酸诊断领域，具体涉及一种以CA19-9cDNA片段为模板制备RNA探针的方法及其应用。
背景技术
荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种重要的非放射性原位杂交技术，荧光染料标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA或RNA分子杂交，如果被检测的染色体靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。通过在荧光显微镜下观察荧光信号，以确定与特异探针杂交后结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
荧光原位杂交技术(FISH)具有很多优点，无需放射性同位素标记，安全性较高；FISH的实验周期短，探针稳定性强；通过多次免疫化学反应，使其杂交信号放大，提高灵敏度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交；FISH的分辨率高达3-20Mb；FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的探针，即可以制备成多色探针。
FISH技术已经在基因定位、基因作图、基因扩增和缺失的检测、产前诊断、哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用，特别是在肿瘤诊断方面，FISH技术被广泛用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等实体瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几个方面。cRNA探针比cDNA探针有更多的优势：避免了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间易复性的可能性，提高了杂交反应的敏感性；cRNA与RNA之间形成的杂交体比cDNA-RNA杂交体更稳定；且cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响，因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针，可降低本底信号的影响。
制备特异性强、灵敏度高和稳定性强的肿瘤检测探针，生产易保存和运输的相关试剂及试剂盒，对肿瘤早期诊断和治疗至关重要。研发出用于诊断和治疗多种肿瘤的高品质探针及相关试剂盒，不仅能提高人民的健康水平，而且具有很大的经济效益、社会效益及广阔的市场前景。
CA19-9(carbohydrate antigen 19-9)是一种粘蛋白质的糖类蛋白肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，因由鼠单克隆抗体119NS199-9识别而命名。CA19-9是一种分子量为5000KD的低聚糖类肿瘤相关抗原，由内胚层细胞分化而来的，正常人血清中含量甚微，而在多种上皮类恶性肿瘤血清中均可见增高。
在血清中CA19-9以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠和正常成年人胰腺、胆管上皮等处。正常情况下CAl9-9的合成量极微，但当上述组织出现异常时，尤其是恶性肿瘤时，其合成量可以显著增加，造成血清中的CAl9-9增加。CAl9-9是迄今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物，胰腺癌的CA19-9最高水平是正常均值的683倍，故其是胰腺癌较好的标志物。
发明内容
本发明的目的是提供一种以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针的方法。
本发明所述的以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针的方法，包括以下步骤：A.针对CA19-9mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；B.从CA19-9cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；C.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。
根据本发明所述的以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是Trc RNA聚合酶，引物的5'端分别加上Trc启动子序列。
T7启动子序列：5’-TAATACGACTCACTATAG-3′
SP6启动子序列：5’-CATACGATTTAGGTGACACTATA-3′
T3启动子序列：5’-AATTAACCCTCACTAAAG-3′
Trc启动子序列：5’-TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAAT-3′
上述四种RNA聚合酶与相应启动子的组合为同类型的设计，可以替换使用。
根据本发明所述的以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述步骤A中，所述筛选包括：筛选2-50个无内含子和重复序列的特定目标序列区域，根据需要可选择同源区域序列，作为靶序列。
本发明进一步提供了一种快速检测胰腺癌相关的CA19-9表达的试剂盒
本发明所述的试剂盒包括根据本发明所述的方法所制备的RNA探针。
本发明所述的方法只用一步反应即可制备200-500nt理想长度的CA19-9cRNA探针，并且可直接用于下一步的杂交试验，可以提高试验效率，节约检测时间。探针制备过程不需要碱裂解等步骤，可得到的探针长度均一性好，从而增强了探针特异性，降低了背景信号干扰，并节约大量实验时间。
本发明所述的方法有利于筛选和制备高特异性CA19-9探针，并可消除非编码RNA等非特异性信号的影响。
本发明所述的方法制备的CA19-9探针，其用途是生产在受试者样本中区分胰腺癌样本和正常样本的试剂盒。
本发明还提供了用于在受试者样本中区分胰腺癌样本和正常样本的试剂盒。
本发明所述的用于在受试者样本中区分胰腺癌样本和正常样本的试剂盒，包括：(a)适合于检测胰腺癌的检测试剂；以及(b)适合于测定由所述检测试剂检测的胰腺癌的定量的设备。
本发明首次用多重DNA片段作为模板，针对CA19-9cDNA序列设计多对引物，并在反向引物5’端加上启动子或RNA聚合酶结合序列，以使最终得到的RNA探针能够全部覆盖所有靶序列。本发明探针制备方法简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，更重要的是，探针特异性和稳定性更强，降低背景信号，灵敏度更高。在此基础上，本发明提供了多种肿瘤初诊快速检测方面的新用途和相关的普遍适用的试剂盒。
传统的探针标记方法直接以cDNA作为标记模板。制备检测mRNA的探针时，一般是应用全长cDNA克隆质粒或PCR产物作为模板，利用RNA聚合酶或DNA聚合酶制备RNA或DNA探针。但是，大部分基因cDNA在1000bp以上，如直接进行杂交反应会因探针长度太长而不利于进入细胞和杂交，且会产生非特异性背景信号。制备的RNA或DNA探针一般需碱裂解或DNA酶处理，使探针裂解成1000bp以下的片段。然而，RNA碱裂解或DNA酶处理过程和程度不易控制，因此探针质量难以保证。
本发明所述的方法的优势在于：采用包含所述目的序列的多条DNA片段通过一步反应即可制备100-500nt理想长度的RNA探针，并且可直接用于下一步的杂交试验。探针制备过程不需要碱裂解等步骤，就可得到长度均一性好的探针，为杂交试验理想长度的片段，因此增强探针特异性，降低背景信号干扰，并节约大量实验时间，提高了试验效率。
现有的RNA探针标记的方法都很难有效地将标记好的探针长度控制在这范围内。因此，现有技术必须借助碱裂解(RNA探针)去降解标记好的探针以达到上述理想长度。
PCR反应可以精确地控制产物的长度，但用PCR直接标记探针的效率不高，而且很多用于PCR反应的酶都不能有效地将标记的dUTP掺入到产物中去。PCR反应也不能用于标记RNA探针。
本发明是利用PCR反应可以精确控制产物长度的特点，用其制备多个的理想长度的DNA片段作为模板去标记探针，这样在DNA模板水平就有效地控制了标记的探针长度，制备的RNA探针不用RNA碱裂解或DNA酶处理过程而直接用于杂交反应。此外，用多个的理想长度的DNA片段作为模板，还能根据检测目的的需要而有效地覆盖特定的目标基因序列。同时在每一个引物末端加上RNA聚合酶结合序列，使多个的理想长度的DNA片段可同时在同一标记反应中作为模板可以制备RNA探针。
下表1比较了常规制备探针的方法与本发明所述的方法的异同。
Figure BDA0000923267250000041
Figure BDA0000923267250000051
本发明所述的方法有利于筛选和制备高特异性探针，并可消除非编码序列及其它非特异性序列的影响。多重DNA片段的设计对检测序列更有针对性，不仅排除了一些非编码序列及其它非特异性序列，也能使探针的特异性大大提高。
本发明所述的方法有利于区分同源性序列及RNA的不同剪切形式。本发明多重DNA片段的设计可根据检测对象来确定加入或删除一些同源性序列，也可以只包含或不包含不同剪切形式而达检测特异性目标序列的目的。
此外，本发明中设计引物时，在反向引物5'端加上启动子序列或RNA聚合酶结合序列，可确保每个片段都能转录成探针，针对目标序列设计多对引物，能够保证探针覆盖靶基因所有特异的区域。
附图说明
图1是以CA19-9cRNA为模板设计、制备及标记RNA探针的原理示意图。首先根据目的序列CA19-9cRNA序列设计引物，引物的5'端加上T7启动子序列；再用PCR方法分别扩增出目的DNA片段并纯化；以混合的PCR产物作为标记模板，进行RNA聚合酶反应，将带有生物素标记的UTP掺入产物中，纯化后即得到RNA探针。
图2是采用本发明所述方法制备的RNA探针在FISH中的实验结果。用生物素标记的CA19-9cRNA探针检测人胰腺癌细胞SW1990的CA19-9mRNA表达水平。
具体实施方式
实施例一：以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针
以CA19-9cDNA为模板制备RNA探针的过程参见图1。
一、PCR引物的设计：
(1)在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中查找CA19-9mRNA序列，用NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)排除其它非特异性RNA序列。
(2)筛选2个无内含子和重复序列特定序列区域，排除同源区域序列。
(3)所选的每个区域各设计至少一对引物，使扩增产物长度为200-500bp，并覆盖CA19-9全长。
引物的设计：
Figure BDA0000923267250000061
上表所涉及的引物仅仅是举例，本领域技术人员可以根据本发明的原理设计出更多的合适的引物。
(4)将T7启动子序列加在反向引物的5'端，以确保PCR产物与目的片段互补并包含全部靶序列。
T7启动子序列：5’-TAATACGACTCACTATAG-3′
T7启动子序列可以用同类型的SP6启动子序列、T3启动子序列或Trc启动子序列替代。
二、标记模板的制备：通过PCR从cDNA质粒模板(GeneCopoeia cDNA质粒库)，扩增带有T7启动子的目的片段。
三、RNA探针的制备：
配置10×NTPs，其中，ATP、CTP和GTP的浓度均为10mM，UTP的浓度为3.5mM。在一个RNase-free(无RNA酶)的EP中，在RNase-free的环境中操作，加入以下成分：
Figure BDA0000923267250000062
Figure BDA0000923267250000071
(1)混匀反应液，于37℃下反应2-3h。
(2)加入1μL DNase I(DNA聚合酶I)和5μL DNase I buffer(DNA聚合酶I缓冲液)，混匀后于37℃下15min，以除去模板DNA。
(3)加入2μL 0.5M EDTA(PH 8.0)(乙二胺四乙酸)，65℃下反应10min以终止反应。
(4)取2-3μL的产物电泳检测，缓冲液用1×MOPS(3-吗啉丙磺酸)。
(5)加入100μL DEPC(焦碳酸二乙酯)水，150μL苯酚和200μL氯仿至EP管中，震荡混匀，10000rpm离心10min。
(6)上清液转移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀静置10min后，12000rpm离心10min，去上清。
(7)75％的酒精洗涤沉淀后，加DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解，测产物浓度并电泳检测，保存于-20℃。
由此，得到以CA19-9cDNA片段为模板制备的RNA探针。
将上述方法得到的生物素标记的RNA探针用于检测人胰腺癌细胞SW1990(购自ATCC)的CA19-9mRNA表达水平。
在荧光显微镜下观察，实验结果如图2所示。左图：用DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)染色，蓝色荧光显示细胞核。中图：用所述探针与目的mRNA杂交，红色荧光显示人胰腺癌细胞SW1990的CA19-9mRNA分布及表达水平。右图为左图与中图的合成图像，直观地显示细胞核与CA19-9mRNA的相对位置。

Claims (6)

1.一种以CA19-9 cDNA为模板一步反应制备RNA探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.针对CA19-9 mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列，每个引物末端添加RNA聚合酶结合序列；
B.从CA19-9 cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；
C.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到100-500nt理想长度的RNA探针，
所述步骤A中，所述筛选包括：筛选2-50个无内含子和重复序列的特定目标序列区域，根据需要可选择同源区域序列，作为靶序列，
所述靶序列为2个，所述引物如下：
CA19-9-1F：TCACAGCCTCACTTCTAACCTTCT
CA19-9-1R：ccgGAATTCTAATACGACTCACTATAGACGGTTGCCATCCACTCTTTCAC
CA19-9-2F：GCTCCTGCTCACAGCCTCACTTC
CA19-9-2R：ccgGAATTCTAATACGACTCACTATAGTTTGACGGTTGCCATCCACTCTT。
2.根据权利要求1所述的以CA19-9 cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶，引物的5′端加上T7启动子序列。
3.根据权利要求1所述的以CA19-9 cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是SP6 RNA聚合酶，引物的5′端分别加上SP6启动子序列。
4.根据权利要求1所述的以CA19-9 cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是T3 RNA聚合酶，引物的5′端分别加上T3启动子序列。
5.根据权利要求1所述的以CA19-9 cDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是Trc RNA聚合酶，引物的5′端分别加上Trc启动子序列。
6.一种快速检测胰腺癌相关的CA19-9表达的试剂盒，其特征在于：包括根据权利要求1所述的方法所制备的RNA探针。
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