CN105624150A - 以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法。该方法包括：针对miR-196a前体序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；从miR-196a前体cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。本发明得到的cRNA探针能够全部覆盖所有靶序列。本发明探针制备方法简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，探针特异性和稳定性更强，背景信号更低且灵敏度更高。在此基础上，本发明提供了一种快速检测胰腺癌相关的miR-196a表达的试剂盒。

Description

以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法
技术领域
本发明属于核酸诊断领域，具体涉及一种以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法及其应用。
背景技术
荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)是一种重要的非放射性原位杂交技术，荧光染料标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA或RNA分子杂交，如果被检测的染色体靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。通过在荧光显微镜下观察荧光信号，以确定与特异探针杂交后结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
荧光原位杂交技术(FISH)具有很多优点，无需放射性同位素标记，安全性较高；FISH的实验周期短，探针稳定性强；通过多次免疫化学反应，使其杂交信号放大，提高灵敏度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交；FISH的分辨率高达3-20Mb；FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的探针，即可以制备成多色探针。
FISH技术已经在基因定位、基因作图、基因扩增和缺失的检测、产前诊断、哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用，特别是在肿瘤诊断方面，FISH技术被广泛用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等实体瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几个方面。cRNA探针比cDNA探针有更多的优势：避免了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间易复性的可能性，提高了杂交反应的敏感性；cRNA与RNA之间形成的杂交体比cDNA-RNA杂交体更稳定；且cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响，因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针，可降低本底信号的影响。
制备特异性强、灵敏度高和稳定性强的肿瘤检测探针，生产易保存和运输相关试剂及试剂盒，对肿瘤早期诊断和治疗至关重要。研发出用于诊断和治疗多种肿瘤的高品质探针及相关试剂盒，不仅能提高人民的健康水平，而且具有很大的经济效益、社会效益及广阔的市场前景。
microRNA(简称miRNA)是内源性非编码RNA，为长约18～25核苷酸的单链RNA，呈高度保守性、时序表达特异性以及组织表达特异。miRNA对其靶基因的转录后表达调节非常重要，当miRNA和靶向mRNA完全或几乎完全互补时，可使得目的mRNA的降解，当miRNA和靶向mRNA不完全互补时，则负调控翻译过程，阻碍蛋白质翻译。miRNA在实体恶性肿瘤以及血液系统肿瘤发病过程中起着重要的作用，具有肿瘤的抑癌基因与癌基因的双重作用，参与了生物体的发育、增殖、分化和凋亡等方面的调控。
肿瘤细胞中，miRNA的表达谱与肿瘤的类型相关，不同种类肿瘤发生具有自己独特的miRNA表达谱，提示miRNA可作为肿瘤鉴别诊断的标志物。miRNA可在肿瘤发生过程中调节细胞增殖或凋亡，Bloomston等(BloomstonM,FrankelWL,PetroccaFetal,MircorRNAexpressionpatternstodifferentiatepancraticadenocarcinomafromnormalpancreasandchronicpancreatitis[J],JAMA,2007,297(17):1901-1908)应用miRNA芯片技术检测326个miRNAs的表达，研究表明在90％的胰腺癌中21个miRNAs上调和4个miRNAs下调。有研究表明，miR-196a很可能在胰腺癌细胞中特异表达，与胰腺癌的生物学特性存在密切关系，同时能积极反映胰腺癌的进展，并且是一个重要的预后诊断标志物(LiuM，DuY，GaoJ，etal.Aberrantexpressionmir-196aisassociatedwithabnormalapoptosisinvasion，andproliferationofpancreaticcancercells[J]Pancreas,2013,42(7):1169-1181.)。
胰腺癌是恶性程度比较高的消化系统疾病，死亡率在全球范围内占第5位，发病率在中国也呈逐年上升趋势，其起病隐匿、早期发现困难，一旦发现多属晚期，多数无法手术。然而，手术切除是胰腺癌治疗的唯一根治疗法，但因其早期即可发生浸润和转移，导致胰腺癌手术切除率低。胰腺癌肿瘤标记物包括许多方面，如血清类肿瘤标记物、癌胚肿瘤标志物、基因类肿瘤标志物和其他几十种胰腺癌相关基因及它们表达的蛋白质、生长因子、黏附分子等。但上述标记物检测时均有不足之处，故需寻找更多的生物标记和更好的检测诊断方法，近年来，miRNA在胰腺癌诊断中的运用是人们关注的热点。胰腺癌的早期诊断和治疗能提高胰腺癌患者的生存率。因此，制备胰腺癌miRNARNA早期诊断探针至关重要，并为胰腺癌治疗提供一个崭新的思路(KongX,DuY,WangG,etal.DetectionofdifferentiallyexpressedmicroRNAsinserumofpancreaticductaladenocarcinomapatients:miR-196acouldbeapotentialmarkerforpoorprognosis[J].DigDisSci,2011,56(2):602-09.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法。
本发明所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法包括以下步骤：A.针对miR-196a前体序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；B.从miR-196a前体cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；C.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。
根据本发明所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，引物的5'端加上T7启动子序列。
根据本发明所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶，引物的5'端分别加上SP6启动子序列。
根据本发明所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是T3RNA聚合酶，引物的5'端分别加上T3启动子序列。
根据本发明所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是TrcRNA聚合酶，引物的5'端分别加上Trc启动子序列。
T7启动子序列：5’-TAATACGACTCACTATAG-3′
SP6启动子序列：5’-CATACGATTTAGGTGACACTATA-3′
T3启动子序列：5’-AATTAACCCTCACTAAAG-3′
Trc启动子序列：5’-TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAAT-3′
上述四种RNA聚合酶与相应启动子的组合为同类型的设计，可以替换使用。
本发明还提供了一种快速检测胰腺癌相关的miR-196a表达的试剂盒。
本发明所述的试剂盒包括根据本发明所述的方法所制备的RNA探针。
本发明所述的方法只用一步反应即可制备200-500nt理想长度的cRNA探针，并且可直接用于下一步的杂交试验，可以提高试验效率，节约检测时间。
本发明所述的方法有利于筛选和制备高特异性探针，并可消除非编码RNA及非特异性信号的影响。
本发明所述的方法制备的探针，其用途是生产在受试者样本中区分相关疾病样本和正常样本的试剂盒。
本发明还提供了用于在受试者样本中区分相关疾病样本和正常样本的试剂盒。
本发明所述的用于在受试者样本中区分相关疾病样本和正常样本的试剂盒，包括：(a)适合于检测相关疾病的检测试剂；以及(b)适合于测定由所述检测试剂检测的相关疾病的定量的设备；其中，所述的相关疾病是用本方法制备的特异性探针检测的对应特定疾病。
本发明首次用多重DNA片段作为模板，针对miR-196a前体序列设计多对引物，并在反向引物5’端加上启动子或RNA聚合酶结合序列，以使最终得到的RNA探针能够全部覆盖所有靶序列。本发明探针制备方法简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，更重要的是，探针特异性和稳定性更强，降低背景信号，灵敏度更高。在此基础上，本发明提供了多种肿瘤初诊快速检测方面的新用途和相关的普遍适用的试剂盒。
传统的探针标记方法直接以cDNA作为标记模板。制备检测mRNA的探针时，一般是应用全长cDNA克隆质粒或PCR产物作为模板，利用RNA聚合酶或DNA聚合酶制备RNA或DNA探针。但是，大部分基因cDNA在1000bp以上，如直接进行杂交反应会因探针长度太长而不利于进入细胞和杂交，且会产生非特异性背景信号。制备的RNA或DNA探针一般需碱裂解或DNA酶处理，使探针裂解成1000bp以下的片段。然而，RNA碱裂解或DNA酶处理过程和程度不易控制，因此探针质量难以保证。
本发明所述的方法的优势在于：采用包含所述目的序列的多条DNA片段通过一步反应即可制备100-500nt理想长度的RNA探针，并且可直接用于下一步的杂交试验。探针制备过程不需要碱裂解等步骤，就可得到长度均一性好的探针，为杂交试验理想长度的片段，因此增强探针特异性，降低背景信号干扰，并节约大量实验时间，提高了试验效率。
现有的RNA探针标记的方法都很难有效地将标记好的探针长度控制在这范围内。因此，现有技术必须借助碱裂解(RNA探针)去降解标记好的探针以达到上述理想长度。
PCR反应可以精确地控制产物的长度，但用PCR直接标记探针的效率不高，而且很多用于PCR反应的酶都不能有效地将标记的dUTP掺入到产物中去。PCR反应也不能用于标记RNA探针。
本发明是利用PCR反应可以精确控制产物长度的特点，用其制备多个的理想长度的DNA片段作为模板去标记探针，这样在DNA模板水平就有效地控制了标记的探针长度，制备的RNA探针不用RNA碱裂解或DNA酶处理过程而直接用于杂交反应。此外，用多个的理想长度的DNA片段作为模板，还能根据检测目的的需要而有效地覆盖特定的目标基因序列。同时在每一个引物末端加上RNA聚合酶结合序列，使多个的理想长度的DNA片段可同时在同一标记反应中作为模板可以制备RNA探针。
下表1比较了常规制备探针的方法与本发明所述的方法的异同。
本发明所述的方法有利于筛选和制备高特异性探针，并可消除非编码序列及其它非特异性序列的影响。多重DNA片段的设计对检测序列更有针对性，不仅排除了一些非编码序列及其它非特异性序列，也能使探针的特异性大大提高。
本发明所述的方法有利于区分同源性序列及RNA的不同剪切形式。本发明多重DNA片段的设计可根据检测对象来确定加入或删除一些同源性序列，也可以只包含或不包含不同剪切形式而达检测特异性目标序列的目的。
此外，本发明中设计引物时，在反向引物5'端加上启动子序列或RNA聚合酶结合序列，可确保每个片段都能转录成探针，针对目标序列设计多对引物，能够保证探针覆盖靶基因所有特异的区域。
附图说明
图1是以miR-196a前体为模板的设计、制备及标记RNA探针的原理示意图。首先根据目的序列miR-196a前体序列设计引物，引物的5'端加上T7启动子序列；再用PCR方法分别扩增出目的DNA片段并纯化；以混合的PCR产物作为标记模板，进行RNA聚合酶反应，将带有生物素标记的UTP掺入产物中，纯化后即得到RNA探针。
图2是采用本发明所述方法制备的RNA探针在FISH中的实验结果。用生物素标记的miR-196a探针检测人胰腺癌细胞SW1990的miR-196a表达水平。
具体实施方式
实施例一：以miR-196a前体为模板制备RNA探针
以miR-196a前体为模板制备RNA探针的过程参见图1。
一、PCR引物的设计：
(1)在miRBase数据库中(http://www.mirbase.org/)查找其相应的pre-miRNA的名称和序列，即miR-196a前体(AccessionMI0000279)：HomosapiensmiR-196a-2stem-loop。
(2)查询相应的pre-miRNA的序列，结果显示pre-miRNA的长度在100nt左右。
(3)设计一对引物。
引物的设计：
引物编号 引物名称 引物序列
1正向 miR-196a1F TGCTCGCTCAGCTGATCTGT
1反向 miR-196a-1R taatacgactcactatagGCCCTCGACGAAAACCGACT
上表所涉及的引物仅仅是举例，本领域技术人员可以根据本发明的原理设计出更多的合适的引物。
(4)将T7启动子序列加在反向引物的5'端(见上表)，以确保PCR产物与目的片段互补并包含全部靶序列。
T7启动子序列：5’-TAATACGACTCACTATAG-3′
T7启动子序列可以用同类型的SP6启动子序列、T3启动子序列或Trc启动子序列替代。
二、标记模板的制备：Pre-miRNA表达克隆的获得并提取对应质粒(GenecopoeiamiRNA质粒库)，通过PCR扩增带有T7启动子的目的片段。
三、RNA探针的制备：
配置10×NTPs，其中，ATP、CTP和GTP的浓度均为10mM，UTP的浓度为3.5mM。在一个RNase-free(无RNA酶)的EP中，在RNase-free的环境中操作，加入以下成分：
DNA模板 xμL(总量在500ng-1000ng)
5×T7RNA聚合酶缓冲液) 10μL
T7RNA聚合酶) 3μL
RNA酶抑制剂 2μL
10x NTP 5μL
10mM Bioin-UTP(生物素标记的UTP) 3.25
RNase-free水(无RNA酶水) 补水至50μL
(1)混匀反应液，于37℃下反应2-3h。
(2)加入1μLDNaseI(DNA聚合酶I)和5μLDNaseIbuffer(DNA聚合酶I缓冲液)，混匀后于37℃下15min，以除去模板DNA。
(3)加入2μL0.5MEDTA(PH8.0)(乙二胺四乙酸)，65℃下反应10min以终止反应。
(4)取2-3μL的产物电泳检测，缓冲液用1×MOPS(3-吗啉丙磺酸)。
(5)加入100μLDEPC(焦碳酸二乙酯)水，150μL苯酚和200μL氯仿至EP管中，震荡混匀，10000rpm离心10min。
(6)上清液转移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀静置10min后，12000rpm离心10min，去上清。
(7)75％的酒精洗涤沉淀后，加DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解，测产物浓度并电泳检测，保存于-20℃。
由此，得到以miR-196a前体为模板制备的RNA探针。
将上述方法得到的用生物素标记的miR-196a探针用于检测人胰腺癌细胞SW1990的miR-196a表达水平。
在荧光显微镜下观察，实验结果如图2所示。左图：用DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)染色，蓝色荧光显示细胞核。中图：用所述探针与目的mRNA杂交，红色荧光显示人胰腺癌细胞SW1990的miR-196a分布及表达水平。右图为左图与中图的合成图像，直观地显示细胞核与miR-196a的相对位置。

Claims (6)

1.一种以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.针对miR-196a前体序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；
B.从miR-196a前体cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；
C.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。
2.根据权利要求1所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，引物的5'端加上T7启动子序列。
3.根据权利要求1所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶，引物的5'端分别加上SP6启动子序列。
4.根据权利要求1所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是T3RNA聚合酶，引物的5'端分别加上T3启动子序列。
5.根据权利要求1所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是TrcRNA聚合酶，引物的5'端分别加上Trc启动子序列。
6.一种快速检测胰腺癌相关的miR-196a表达的试剂盒，其特征在于：包括根据权利要求1所述的方法所制备的RNA探针。
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Application publication date: 20160601

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