KR20200116307A - Risc를 이용한 폴리뉴클레오타이드의 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오타이드의 검출 및 단일염기다형성을 단일 분자 수준에서 구분하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 핵산 분자와 아고너트(Argonaute) 단백질의 복합체를 이용해 small RNA를 검출, 정량 및 단일염기 다형성(SNP)을 단일분자 수준에서 구분할 수 있는 small RNA 검출 방법에 관한 것이다.

Description

RISC를 이용한 폴리뉴클레오타이드의 검출방법{Method for detecting polynucleotide using RISC}
본 발명은 프로브(probe)와 아고너트(Argonaute) 효소의 복합체인 RISC(RNA-induced silencing complex) 및 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy; TIRF)을 이용해 small RNA, 특히 miRNA의 검출, 정량, 및 단일염기다형성(SNP)의 단일분자 수준에서의 구분이 가능한 small RNA 검출 방법에 관한 것이다.
마이크로 RNA (miRNAs) 는 전사 후 유전자 침묵을 통해 유전자 발현을 조절하는 작은(~22nt)크기의 비-암호화 RNA이다. miRNA의 발현은 엄격히 조절되어야 하며 이의 조절 장애는 세포기능 장애 및 수많은 질병과 관련되어 있다. 이에, miRNA 발현의 정확한 프로파일링은 생물학과 의학분야 모두에서 매우 중요해지고 있다. 수많은 miRNA가 질병-특이적으로 광범위한 암의 종류에서 제대로 통제되지 않음이 밝혀졌으며, 다수의 miRNA가 암 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 현재 miRNA는 유망한 진단용 바이오 마커로 부상하고 있으며, 안정적이고 진단학적으로 유용한 miRNA가 혈액 내에서 검출되었고 이것이 암의 조기 발견을 위한 이상적인 종양 마커로 여겨지고 있다.
그러나, 현재 miRNA의 검출은 miRNA의 작은 크기(~ 22 nt) 와 단일 염기 차이정도에 불과한 miRNA의 패밀리 구성원의 높은 상동성 때문에 어려움을 겪고 있다. 이는 PCR 증폭에 근거한 표준 분석법의 취약점이기도 하다. 이에, 높은 특이성과 민감도를 갖는 miRNA 검출기술의 개발이 필요한 실정이다.
아고너트(Argonaute) 단백질 군은 RNA 침묵과정에서 핵심적인 역할을 하는 단백질이다. 아고너트 단백질은 microRNAs (miRNAs), small interfering RNAs (siRNAs) 및 Piwi-interacting RNAs (piRNAs)를 포함하여 다양한 종류의 작은 비-암호화 RNA에 결합하며, small RNA를 끌어들여, 상보적인 서열을 갖는 특정 표적으로 유도함으로써, mRNA의 절단 또는 번역의 저해를 유도한다고 알려져 있다.
전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy; TIRF)은 Evanescence Filed라 불리는 200nm 이하 영역의 형광물질을 관찰할 수 있는 장비로, 단분자 단위의 변화양상을 높은 해상도의 영상으로 구현할 수 있다. 레이저의 전반사(빛을 샘플의 경계면 부분에서 굴절)를 이용하여 형광 샘플의 전체적인 이미지가 아닌 경계면(Evanescence Field)에 대한 이미지만을 획득하기 때문에, 형광빛에 대한 간섭을 배제하고 경계면의 정확한 이미지 획득이 가능하다.
현재까지 프로브의 결합 속도 향상제로써 아고너트 단백질을 단일분자 검출 기술에 적용한 예는 없으며, 증폭없이 miRNAs를 정량할 수 있는 TRIF를 사용한 새로운 단일분자 검출 기술에 관해서는 알려진 바가 없다.
본 발명의 일 예는, 아고너트(Argonaute) 단백질 및 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 핵산 분자가 결합된, 단백질-핵산 복합체를 제공한다.
본 발명의 다른 예는, 아고너트 단백질 및 핵산 분자가 결합된 단백질-핵산 복합체를 포함하고, 상기 핵산 분자는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지며, 상기 핵산 분자는 형광물질로 표지된 것인, 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 예는, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 예는, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을 1) 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료가 고정된 기판에 접촉시키는 단계를 포함하는, 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP)의 검출 방법을 제공한다.
일 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법 또는 단일 염기 다형성의 검출 방법은, 상기 접촉시키는 단계 이후에, 2) 상기 접촉에 의해 발생하는 서로 다른 2종 이상의 형광신호를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법 또는 단일 염기 다형성의 검출 방법은, 상기 측정하는 단계 이후에, 3) 상기 측정된 서로 다른 2종 이상의 형광신호를 이용하여 각각의 결합상태 시간분율 (time fraction, duty cycle) 을 계산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법 또는 단일 염기 다형성의 검출 방법은, 상기 계산하는 단계 이후에, 4) 상기 각각 계산된 결합상태 시간분율 (time fraction)이 모두 임계값 이상일 경우, 상기 생물학적 시료는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드는 1종, 또는 서로 다른 2종 이상일 수 있다. 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드가 2종 이상인 경우, 상기 단계 1), 또는 단계 1) 및 2), 또는 단계 1, 2), 및 3), 또는 단계 1), 2) 3) 및 4)를 각각의 폴리뉴클레오타이드에 대하여 동시에 또는 연속적으로 수행할 수 있다.
본 발명은 아고너트(Argonaute)단백질 및 핵산 분자가 결합된, 단백질-핵산 복합체를 이용해 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 핵산 분자와의 결합 속도를 증가시키고, 서로 다른 형광으로 표지된 2개 이상의 상기 단백질-핵산 복합체를 이용함으로써 별다른 증폭없이 형광신호 측정만으로 단일 분자 수준으로 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 검출할 수 있음을 밝히고, SNP(single nucleotide polymorphism)를 측정가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 아고너트(Argonaute)단백질 및 핵산 분자가 결합된, 단백질-핵산 복합체와 이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물, 및 이를 이용한 폴리뉴클레오타이드 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 검출 방법은 형광영상화 기법을 이용함으로써, 검출대상 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 LNA(locked nucleic acid)를 사용하지 않고도 폴리뉴클레오타이드의 전체부위를 탐색할 수 있으며, 아고너트 단백질을 이용하기 때문에 검출속도가 기존 기술보다 최대 10배 정도 빨라지는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 검출방법은 검출대상 폴리뉴클레오타이드에 매우 특이적이고 민감한 단일-분자 검출 방법임을 입증하였으며, 검출대상 폴리뉴클레오타이내의 단일 염기 차이에도 불구하고 검출대상을 정확하게 검출할 수 있다.
본 발명의 일 예는, 아고너트(Argonaute) 단백질; 및 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 핵산 분자가 결합된, 단백질-핵산 복합체에 관한 것이다.
상기 핵산 분자는 형광물질이 결합된 (fluorescence-conjugated) 것일 수 있다.
상기 핵산 분자는 링커를 포함할 수 있다. 상기 링커는 아민기를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 형광은 상기 링커의 아민기를 통해 상기 핵산 분자에 결합되는 것일 수 있다.
상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 및 miRNA로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 핵산 분자는 5 내지 50개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 것일 수 있다.
상기 핵산 분자는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예는 아고너트(Argonaute) 단백질; 및 핵산 분자가 결합된 단백질-핵산 복합체를 포함하고, 상기 핵산 분자는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지며, 상기 핵산 분자는 형광물질로 표지된 것인, 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 표적 핵산 부위는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드 내의 연속하는 5 내지 15개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 서로 다른 2종 이상의 단백질-핵산 복합체를 포함하며, 상기 서로 다른 2종 이상의 단백질-핵산 복합체는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 서로 다른 2 이상의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 서로 다른 2종 이상의 단백질-핵산 복합체는, 서로 다른 2종 이상의 신호를 발생시키는 형광물질로 표지된 것일 수 있다.
상기 핵산 분자는 링커를 포함하고, 상기 링커는 아민기를 포함하며, 상기 형광물질은 상기 링커의 아민기를 통해 상기 핵산 분자에 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법에 관한 것이다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 및 miRNA로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상 일 수 있다.
상기 생물학적 시료는, 분리된 세포, 세포 용해물, 세포 추출물, 세포 파쇄물, 또는 분리된 DNA 또는 RNA 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 상기 접촉에 의해 발생하는 형광신호를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 형광신호를 이용하여 결합상태 시간분율 (time fraction)을 계산하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법에 관한 것이다.
상기 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법은, 결합상태 시간분율 (time fraction)을 계산하는 단계 이후에, 상기 계산된 결합상태 시간분율 (time fraction)이 임계값 이상일 경우, 상기 생물학적 시료는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법은, 적어도 2회 이상 수행되되, 각각의 수행은 서로 다른 단백질-핵산 복합체를 사용하여 수행되는 것이며, 상기 서로 다른 단백질-핵산 복합체는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 서로 다른 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법은, 상기 각각의 수행에서 계산된 결합상태 시간분율이 모두 임계값 이상일 경우, 상기 생물학적 시료는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 서로 다른 단백질-핵산 복합체는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 서로 다른 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지나, 동일한 형광물질로 표지되어도 무방하다. 즉, 상기 서로 다른 단백질-핵산 복합체는, 동일한 형광물질로 표지되나, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 서로 다른 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가질 수 있다. 이 경우, 상기 서로 다른 단백질-핵산 복합체를 각각 순차적으로 교체 사용하여 상기 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법을 반복 수행하고, 각각의 결합상태 시간분율을 계산하여, 상기 계산된 결합상태 시간분율이 모두 임계값 이상일 경우, 상기 생물학적 시료는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 상기 서로 다른 단백질-핵산 복합체는, 서로 다른 형광물질로 표지될 수 있으나, 동일한 형광물질로 표지되어도 무방하며, 동일한 형광물질로 표지될 경우에는 상기 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법을 반복 수행하여, 결합상태 시간분율을 계산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 상기 접촉에 의해 발생하는 서로 다른 2종 이상의 형광신호를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 서로 다른 2종 이상의 형광신호를 이용하여 각각의 결합 상태 시간분율 (time fraction)을 계산하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법에 관한 것이다.
상기 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법은, 상기 각각 계산된 결합 상태 시간분율 (time fraction)이 모두 임계값 이상일 경우, 상기 생물학적 시료는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 생물학적 시료는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 핵산 서열 상동성이 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 (상한값은 100%임)인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 있는 것일 수 있다.
상기 형광신호를 측정하는 단계는, 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy; TIRF), 다초점 형광 현미경 (Confocal microscopy), Epi-형광 현미경 (Epi-fluorescence microscopy), HiLo 현미경 (HiLo microscopy), 및 라인 스캐닝 공초점 현미경 (Line-scanning confocal microscopy)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에 의하면, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP)의 검출 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명의 용어 "단일 분자 수준의 검출방법"이란, 앙상블(ensemble) 또는 벌크(bulk)로 모인 분자들에서 나오는 시그널을 모두 합쳐서 검출하는 것이 아닌 실제 분자 하나에서 나오는 단일분자 시그널을 검출하는 방법을 의미한다.
본 발명의 일 예는, 아고너트(Argonaute) 단백질 및 핵산 분자가 결합된, 단백질-핵산 복합체를 제공한다. 예를 들어, 상기 단백질-핵산 복합체는, RISC (RNA-induced silencing complex) 일 수 있다. 또는, 상기 단백질-핵산 복합체는, 코어-RISC (core-RISC)일 수 있다. 상기 코어-RISC (core-RISC)는, 다른 부가적인 요소 없이, 아고너트와 가이드 가닥 (guide strand)을 포함하는 복합체를 의미한다.
상기 "아고너트 단백질"은 원핵생물, 진행생물, 및 고세균 등 다양한 생물체에 존재하는 아고너트에서 유래될 수 있으며, 박테리아부터 동물, 식물, 사람 등 제한 없이 다양한 생명체에 존재하는 아고너트에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 아고너트 단백질은 hAgo2(from Human) Q9UKV8, TtAgo(from Thermus thermophilus) Q746M7, PfAgo(from Pyrococcus furiosus) Q8U3D2, 및 CbAgo(from Clostridium butyricum) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래인 것일 수 있다.
상기 "핵산 분자"는 DNA 또는 RNA 일 수 있으며, 예를 들어 DNA 일 수 있다. 상기 핵산 분자는 DNA 프로브(probe) 또는 RNA 프로브를 의미하며, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 핵산 분자는, 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 프로브 (probe) 부위의 5'말단, 3'말단, 또는 양쪽 모두에, 예컨대, 3' 말단에 링커를 추가로 포함할 수 있다.
상기 핵산 분자는 5 내지 50개, 5 내지 45개, 5 내지 40개, 5 내지 35개, 5 내지 30개, 5 내지 29개, 5 내지 28개, 5 내지 27개, 5 내지 26개, 8 내지 50개, 8 내지 45개, 8 내지 40개, 8 내지 35개, 8 내지 30개, 8 내지 29개, 8 내지 28개, 8 내지 27개, 8 내지 26개, 10 내지 50개, 10 내지 45개, 10 내지 40개, 10 내지 35개, 10 내지 30개, 10 내지 29개, 10 내지 28개, 10 내지 27개, 10 내지 26개, 12 내지 50개, 12 내지 45개, 12 내지 40개, 12 내지 35개, 12 내지 30개, 12 내지 29개, 12 내지 28개, 12 내지 27개, 12 내지 26개, 15 내지 50개, 15 내지 45개, 15 내지 40개, 15 내지 35개, 15 내지 30개, 15 내지 29개, 15 내지 28개, 15 내지 27개, 15 내지 26개, 16 내지 50개, 16 내지 45개, 16 내지 40개, 16 내지 35개, 16 내지 30개, 16 내지 29개, 16 내지 28개, 16 내지 27개, 16 내지 26개, 18 내지 50개, 18 내지 45개, 18 내지 40개, 18 내지 35개, 18 내지 30개, 18 내지 29개, 18 내지 28개, 18 내지 27개, 18 내지 26개, 5 내지 15개, 5 내지 13개, 5 내지 11개, 7 내지 15개, 7 내지 13개, 7 내지 11개, 9 내지 15개, 9 내지 13개, 또는 9 내지 11개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이루어질 수 있으며, 예를 들면 18 내지 26개의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 상기 핵산 분자는, 형광물질과 연결되기 위한 링커를 포함할 수 있다.
상기 핵산 분자 중 표적 부위 핵산 부위와 상보적 서열을 갖는 프로브 부위는 5 내지 13개, 5 내지 11개, 7 내지 15개, 7 내지 13개, 7 내지 11개, 9 내지 15개, 9 내지 13개, 9 내지 11개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드 길이 및/또는 표적 핵산 부위의 길이를 고려하여, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 전체 부위, 또는 목적하는 특정 부위를 커버할 수 있도록 적절히 조절될 수 있다.
상기 "링커"는, 상기 단백질-핵산 복합체에서 상기 핵산이 상기 단백질에 결합(loading)되기 용이한 적절한 길이의 뉴클레오타이드를 가지도록, 상기 핵산의 말단에 형성될 수 있다. 또는, 상기 "링커"는, 상기 핵산과 형광물질의 연결을 위해, 상기 핵산의 말단에 형성될 수 있다. 또는, 상기 "링커"는, 상기 핵산의 단백질과의 결합 용이성 및 상기 핵산과 형광물질의 연결의 목적을 모두 달성하기 위해, 상기 핵산의 말단에 형성될 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 분자는 3’말단에 4 내지 15개의 뉴클레오타이드로 이루어지거나 포함하는 링커를 포함할 수 있으며, 예를 들어 4 내지 14개, 4 내지 13개, 4 내지 12개, 4 내지 9개, 4 내지 8개, 5 내지 8개, 5 내지 7개, 6 내지 15개, 6 내지 14개, 6 내지 13개, 6 내지 12개, 8 내지 15개, 8 내지 14개, 8 내지 13개, 8 내지 12개, 9 내지 15개, 9 내지 14개, 9 내지 13개, 9 내지 12개, 10 내지 15개, 10 내지 14개, 10 내지 13개, 또는 10 내지 12개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 링커를 포함할 수 있다. 그러나, 상기 링커의 길이는 상기 핵산 분자의 전체 뉴클레오타이드 길이가 5 내지 30개, 바람직하게는 18 내지 26개가 되도록 적절하게 설정될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 링커를 이루는 뉴클레오타이드는 임의의 뉴클레오타이드로 이루어져도 무방하며, 예를 들어 표 1의 서열번호 3 내지 6에서 밑줄로 표시된 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 링커는, 상기 핵산 분자를 표지하기 위한 형광물질과 연결될 수 있는 부분을 포함하며, 예를 들어 아민(NH2)기를 가지는 탄소사슬이 부착된 뉴클레오타이드, 예를 들어 iAmMC6T(Int Amino Modifier C6 dT)를 포함할 수 있다. 상기 형광물질은, 상기 링커의 아민기와 연결되어, 상기 핵산 분자를 표지할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 핵산 분자는 2종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 2 내지 10종, 2 내지 9종, 2 내지 8종, 2 내지 7종, 2 내지 6종, 2 내지 4종, 2 내지 3종, 3 내지 10종, 3 내지 9종, 3 내지 9종, 3 내지 7종, 3 내지 6종, 3 내지 5종, 또는 3 내지 4종일 수 있으며, 바람직하게는 3종 이상일 수 있다. 상기 2종 이상의 핵산 분자는 일부 (예컨대, 1 내지 5 뉴클레오타이드)가 서로 중복되거나, 또는 중복되지 않고 검출대상 폴리뉴클레오타이드의 전체 또는 일부를 커버하는 것일 수 있다.
상기 핵산 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 일 예로 DNA일 수 있다.
상기 핵산 분자는, 형광물질과 결합되어 표지된 것일 수 있으며, 2종 이상의 핵산 분자는 상이한 신호를 발생시키는 물질로 표지된 것일 수 있다.
상기 표적 핵산 부위는 5 내지 15개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 5 내지 13개, 5 내지 11개, 7 내지 15개, 7 내지 13개, 7 내지 11개, 9 내지 15개, 9 내지 13개, 9 내지 11개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물에 포함된 핵산 분자는, 형광물질 또는 퀀텀닷 (Quantum dot) 등과 결합되어 표지된 것일 수 있으며, 2종 이상의 핵산 분자는 상이한 신호를 발생시키는 물질로 표지된 것일 수 있다.
상기 핵산 분자의 표지에 사용 가능한 형광물질은, 단일 분자 형광 검출이 가능한 양자 수율 (Quantum yield)이 높은 형광단 (fluorophore)이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 488, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5-Allophycocyanin, Cy7, 및 Alexa Fluor 790 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 예는, 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법을 제공한다.
상기 검출방법은, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계 전 단계로, 검체에서 생물학적 시료를 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 생물학적 시료는, 분리된 세포, 세포 용해물, 세포 추출물, 세포 파쇄물, 또는 분리된 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드는 RNA라면 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어 miRNA일 수 있다.
상기 생물학적 시료는, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 있을 수 있다. 상기 검출대상 폴리뉴클레오타이드는 10 내지 500개, 10 내지 400개, 10 내지 300개, 10 내지 200개, 10 내지 150개, 10 내지 100개, 10 내지 90개, 10 내지 80개, 10 내지 70개, 10 내지 60개, 또는 10 내지 50개의 뉴클레오타이드로 이루어지거나 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 목적하는 부위만 검출하는 것 또한 가능하기 때문에, 이보다 많은 수의 뉴클레오타이드로 이루어지는 폴리뉴클레오티드도 무방하다. 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드는 서로 다른 2종 이상, 예컨대, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종 또는 10종일 수 있다. 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드는 반응 챔버(기판) 표면에 결합 등의 목적으로 5'말단 및/또는 3'말단이 폴리 G tailing, 폴리 A tailing, 폴리 U/T tailing, 또는 폴리 C tailing 등으로 변형된 것일 수 있으며, 상기 변형 종류에 따라서 biotin poly C 대신 biotin poly U, biotin poly A, biotin poly G 등을 적절히 사용할 수 있다.
상기 생물학적 시료는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 염기 상동성이 유사한 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 있을 수 있으며, 본 발명의 일예에 따르면, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않으나, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 염기 1개 차이가 있는 폴리뉴클레오타이드만을 포함할 경우에도, 상기 생물학적 시료는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는 것으로 정확히 판정할 수 있다.
상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 핵산 서열 상동성이 유사한 폴리뉴클레오타이드는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와의 핵산 서열 상동성이, 10% 이상 100% 미만, 15% 이상 100% 미만, 20% 이상 100% 미만, 25% 이상 100% 미만, 30% 이상 100% 미만, 35% 이상 100% 미만, 40% 이상 100% 미만, 45% 이상 100% 미만, 50% 이상 100% 미만, 55% 이상 100% 미만, 60% 이상 100% 미만, 65% 이상 100% 미만, 70% 이상 100% 미만, 75% 이상 100% 미만, 80% 이상 100% 미만, 85% 이상 100% 미만, 90% 이상 100% 미만, 91% 이상 100% 미만, 92% 이상 100% 미만, 93% 이상 100% 미만, 94% 이상 100% 미만, 95% 이상 100% 미만, 96% 이상 100% 미만, 97% 이상 100% 미만, 98% 이상 100% 미만, 또는 99% 이상 100% 미만일 수 있다.
또는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 핵산 서열 상동성이 유사한 폴리뉴클레오타이드는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 상이한 뉴클레오타이드가, 1개 이상 30개 이하, 1개 이상 29개 이하, 1개 이상 28개 이하, 1개 이상 27개 이하, 1개 이상 26개 이하, 1개 이상 25개 이하, 1개 이상 24개 이하, 1개 이상 23개 이하, 1개 이상 22개 이하, 1개 이상 21개 이하, 1개 이상 20개 이하, 1개 이상 19개 이하, 1개 이상 18개 이하, 1개 이상 17개 이하, 1개 이상 16개 이하, 1개 이상 15개 이하, 1개 이상 14개 이하, 1개 이상 13개 이하, 1개 이상 12개 이하, 1개 이상 11개 이하, 1개 이상 10개 이하, 1개 이상 9개 이하, 1개 이상 8개 이하, 1개 이상 7개 이하, 1개 이상 6개 이하, 1개 이상 5개 이하, 1개 이상 4개 이하, 1개 이상 3개 이하, 1개 이상 2개 이하, 또는 1개일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일예에 의하면, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 상이한 염기가 1개인 폴리뉴클레오타이드의 경우에도, 정확하게 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 구별할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계는, 바이오틴(biotin)이 부착된 폴리머(polymer)로 코팅된 석영 슬라이드, 스트렙타비딘(Streptavidin), 및 바이오틴이 부착된 뉴클레오타이드를 포함하는 고정용 폴리뉴클레오타이드, 및 시료에서 추출한 전체 폴리뉴클레오타이드가 포함된 검출 칩(chip)에서 수행되는 것일 수 있다. 또한, 상기 시료에서 추출한 전체 폴리뉴클레오타이드는 3' 말단에 수십 개 이상의 폴리뉴클레오타이드가 부착된 것일 수 있으며, 고정용 폴리뉴클레오타이드와 서로 상보적이다. 시료에서 추출한 뉴클레오타이드는 상보적인 고정 폴리뉴클레오타이드 간의 결합력에 인해, 검출 칩에 고정되어 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물은 2종 이상의 아고너트(Argonaute) 단백질 및 핵산 분자가 결합된, 단백질-핵산 복합체를 포함할 수 있으며, 예를 들어 3종의 아고너트 단백질-핵산 복합체를 포함할 수 있으며, 각각의 단백질-핵산 복합체는 서로 다른 신호를 발생시키는 형광물질로 표시된 것일 수 있다.
일 예에 따르면, 3종의 단백질-핵산 복합체의 경우, 각각 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 seed, mid, tail 표적 핵산 부위에 상보적인 핵산 서열을 포함한 것일 수 있다. 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 seed 부분은 5' 말단의 약 7~11개 nt 염기로 이루어진 표적 핵산 부위를 의미하며, mid 부분은 5' 말단과 3' 말단 중간 부분의 7~11개 nt 염기로 이루어진 표적 핵산 부위를 의미하고, tail 부분은 3'말단의 약 7~11개 nt 염기로 이루어진 표적 핵산 부위를 의미한다. 각각의 표적 핵산 부위는 약 2~10개 정도의 연속되는 염기가 겹칠 수도 있다.
3개의 단백질-핵산 복합체는 각각 서로 다른 색의 형광으로 표시되어 있으며, 이로 인해, 형광신호의 측정과 단일분자 다색 이미지화를 통해 검출대상 폴리뉴클레오타이드를 정확히 검출해낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형광 신호 측정방법은 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy; TIRF), 다초점 형광 현미경 (Confocal microscopy), Epi-형광 현미경 (Epi-fluorescence microscopy), HiLo 현미경 (HiLo microscopy), 라인 스캐닝 공초점 현미경 (Line-scanning confocal microscopy) 등 단일분자 형광신호를 검출할 수 있는 모든 현미경을 이용해 수행될 수 있으며, 일예로 전반사 형광 현미경 (TIRF)를 이용해 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 형광 신호 측정은, 형광신호를 측정한 후 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 핵산 분자 (imager)의 결합상태 시간분율 (time fraction) 을 계산하고, 그 결과 모든 imager의 결합상태 시간분율 (time fraction)이 임계값 이상으로 측정되면 검출 대상 폴리뉴클레오타이드로 판단하며, 하나의 imager라도 time fraction이 임계값 미만으로 측정되면, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드가 아닌 것으로 판단할 수 있다.
상기 결합상태 시간분율 (time fraction)은, 하기 수학식 1로 계산되는 것일 수 있다.
[수학식 1]
결합상태 시간분율 (time fraction) = T / P
T: 형광 신호가 감지되는 총 시간
P: 검출 시간
상기 수학식 1에서, 형광 신호가 감지되는 총 시간인 T 값은, 형광 신호가 감지되는 총 시간의 합계를 의미하며, 예를 들면 카메라 등의 형광 감지 수단에 의해 형광신호가 감지되는 총 시간의 합계를 의미한다.
상기 형광 신호가 감지되는 총 시간 (T)은, 잡음 (noise)을 제외한 형광 신호가 감지되는 시간의 총 합계로, 통상의 기술자라면 잡음 (noise)과 형광 신호를 구별할 수 있을 것이다. 일예로, 상기 잡음과 구별되는 형광 신호는 S/N (signal to noise ratio)가 3 이상인 것일 수 있다.
상기 형광 신호가 감지되는 총 시간 (T)은, 잡음 (noise)의 세기를 초과하는 강도 (세기)를 가지는 형광 신호가 감지되는 총 시간일 수 있다. 상기 잡음 (noise)의 세기를 초과하는 강도 (세기)를 가지는 형광 신호는, 형광 신호를 나타내는 것으로 판단하기 위한 최소한의 신호 세기를 가지는 형광 신호를 의미하며, 통상의 기술자라면 잡음 (noise)와 구별되는 형광 신호를 구별할 수 있을 것이다. 일예로, 상기 잡음의 세기는, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드가 아닌 것으로 배제하고자 하는 폴리뉴클레오타이드에 대해, 검출하고자 하는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 임의의 핵산 분자 (imager)에 의해 발생하는 잡음 신호의 세기일 수 있다. 예를 들어, 상기 잡음의 세기는, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드가 아닌 것으로 배제하고자 하는 폴리뉴클레오타이드에 대해, 검출하고자 하는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 임의의 핵산 분자 (imager)에 의해 발생하는 잡음 신호의 세기 중 최대값일 수 있으나, 통상의 기술자라면 잡음과 구별되는 형광 신호를 구별할 수 있을 것이다.
상기 잡음의 세기를 초과하는 세기를 가지는 형광 신호는, 잡음 대비 신호의 비율 (signal to ratio, S/N)이 1 초과, 1.1 이상, 1.2 이상, 1.3 이상, 1.4 이상, 1.5 이상, 1.6 이상, 1.7 이상, 1.8 이상, 1.9 이상, 2 이상, 2.1 이상, 2.2 이상, 2.3 이상, 2.4 이상, 2.5 이상, 2.6 이상, 2.7 이상, 2.8 이상, 2.9 이상, 3 이상, 3.1 이상, 3.2 이상, 3.3 이상, 3.4 이상, 3.5 이상, 3.6 이상, 3.7 이상, 3.8 이상, 3.9 이상, 또는 4 이상일 수 있으며, 일예로 3 이상일 수 있다.
상기 수학식 1로 계산되는 결합상태 시간분율이, 모든 imager에서 임계값 이상으로 측정되면 검출 대상 폴리뉴클레오타이드로 판단하는 것일 수 있다. 또는, 상기 수학식 1로 계산되는 결합상태 시간분율이, 하나의 imager에서라도 임계값 미만으로 측정되면, 검출대상 폴리뉴클레오타이드가 아닌 것으로 판단할 수 있다. 상기 임계값은, 검출 목적에 따라 적절하게 설정될 수 있으며, 검출하고자 하는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 임의의 핵산 분자 (imager)에 의한 결합상태 시간분율 (time fraction) 중 최소값을 상한으로, 상기 상한값 이하로 설정될 수 있다. 또는, 상기 임계값은, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드가 아닌 것으로 배제하고자 하는 폴리뉴클레오타이드에 대해, 상기 핵산 분자 (imager)에 의한 결합상태 시간분율 (time fraction) 중 최소값을 하한으로, 상기 하한값 이상으로 설정될 수 있다. 또는, 상기 임계값은, 상기 상한값 및 상기 하한값으로 설정되는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 임계값은, 상기 검출하고자 하는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 임의의 핵산 분자에 의한 결합상태 시간분율 (time fraction) 중 최소값 이하인 것일 수 있다. 일예로, 상기 임계값은, 상기 하한값 초과 내지 상기 상한값 이하로 설정될 수 있다. 일 구체예로, 상기 임계값은 0.03 내지 0.12, 0.03 내지 0.1, 0.03 내지 0.07, 0.03 내지 0.05, 0.05 내지 0.12, 0.05 내지 0.1, 0.05 내지 0.07, 0.07 내지 0.12, 0.07 내지 0.1, 또는 0.1 내지 0.12의 범위 내에서 설정될 수 있으며, 예를 들어 0.12, 0.1, 0.07, 0.05, 및 0.03으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 임계값은, 검출 목적에 따라 적절하게 설정될 수 있다. 예를 들어, 상기 임계값은 민감도 (sensitivity) 및 특이도 (specificity)에 따라 설정될 수 있으며, 민감도 (sensitivity)를 높이고자 할 경우에는 상기 임계값이 상기 하한값 근처로 설정될 수 있으며, 특이도 (specificity)를 높이고자 할 경우에는 상기 임계값이 상기 상한값 근처로 설정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계, 및 상기 단계 (1)에서 발생하는 형광신호를 측정하는 단계를 포함하는, 단일염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 검출 방법을 제공할 수 있다.
예를 들어, 상기 표적 핵산 부위는 2 이상이고, 상기 표적 핵산 부위의 3' 및/또는 5' 말단쪽에 이웃하는 표적 핵산 부위와 연속하는 2 내지 7개 뉴클레오타이드가 중복되고 동시에 적어도 1개 이상의 뉴클레오타이드는 3' 및/또는 5' 말단쪽에 이웃하는 부위와 중복되지 않으며, 상기 핵산 분자는 상기 2 이상의 표적 핵산 부위와 상보적인 서열을 갖는 2 이상의 핵산 분자이고, 상기 2 이상의 핵산 분자 중에서 형광신호가 측정되지 않는 핵산 분자에 해당하는 표적 핵산 부위 중 이웃하는 표적 핵산 부위와 중복되지 않는 뉴클레오타이드에 단일염기다형성이 존재하는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일예에 의하면, 생물학적 시료 내에 검출 대상 폴리뉴클레오타이드가 2종 이상 혼재되어 있을 경우, 해당 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 검출하기 위한 단백질-핵산 복합체를 순차적으로 사용하여, 상기 혼재된 2종 이상의 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 순차적으로 검출할 수 있다. 구체적으로, 생물학적 시료 내의 여러 종류의 폴리뉴클레오타이드는 하나의 검출 칩 (chip)에 고정될 수 있으며, 검출 챔버 하나 당 1종의 폴리뉴클레오타이드가 아닌, 검출 챔버 하나에서 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 검출할 수 있으며, 본 발명의 일예에 따른 단백질-핵산 복합체와 타겟 폴리뉴클레오타이드 간의 상호작용이 매우 동적이기 때문에, 단순히 흐름(flow)를 통해 프로브 (검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 핵산 분자)를 교체해주는 작업만으로도 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드를 순차적으로 검출할 수 있다. 일예로, 도 2d에 의하면, molecule 1 및 molecule 2는 하나의 검출 챔버에 고정되어 있는 상황이며, 1200초를 기점으로 프로브 세트 1에서 프로브 세트 2로 단백질-핵산 복합체를 교체하였는데, molecule 1 및 molecule 2의 시그널이 1200초를 기준으로 바뀌는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 일예에 의하면, 2종 이상의 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 하나의 검출챔버에서 순차적 검출이 가능한 것이다.
본 발명의 RISC와 형광영상화 기법을 이용해 miRNA를 탐지하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 아고너트(Argonaute) 단백질과 프로브 복합체를 이용함으로써, miRNA 검출속도가 본래의 기술보다 최대 10배 정도 빨라지며, miRNA의 단일-뉴클레오타이드 수준의 돌연변이까지 검출가능하고 우수한 민감성을 가진다. 또한, 2 이상의 폴리뉴클레오타이드를 동시에 또는 짧은 시간 내에 순차적으로 검출 가능하다는 이점도 갖는다.
도 1a는 실시예 4-1에 따라, 세포에서 추출하고 분리한 RNA를 검출 칩의 glass 표면에 고정하기 위한 miRNA tailing 과정의 모식도를 나타낸다.
도 1b는 실시예 4-2에 따라, 타겟 miRNA의 seed, mid, 및 tail 부분에 결합하는 서로 다른 세 개의 DNA 프로브를 사용한 miRNA 탐지 방법의 모식도를 나타낸다. DNA 프로브와 타겟 RNA와의 결합을 촉진하기 위해, 각각의 miRNA는 아르고너트(Argonaute) 단백질과 RISC(RNA-induced silencing complex)를 형성한다.
도 2a는 실시예 4-3에 따라, 타겟 miRNAs(let-7a 및 let-7c)와 이들을 표적으로 결합하는 DNA 프로브 세트(let-7a는 프로브 세트 1, let-7c는 프로브 세트 2)를 나타낸다.
도 2b는 실시예 4-3에 따라, let-7a 및 let-7c miRNAs에 대한 프로브 세트 1과 프로브 세트 2의 결합상태에서의 Time fraction 측정 결과를 보여준다.
도 2c는 실시예 5에 따라, Argonaute-loaded 프로브 세트 1을 검출 칩에 주입하고 3개의 형광체(표적 RNA의 Seed부분을 탐지하는 Cy7, Mid 부분을 탐지하는 Cy3, tail 부분을 탐지하는 Cy5)의 형광신호를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2d는 실시예 5에 따라, Molecule 1과 Molecule 2에 대한 프로브 세트 1과 프로브 세트 2의 대표적인 형광 강도 시간 트레이스 결과를 나타낸다.
도 3a는 실시예 4-3에 따라, let-7a와 let7c에 대한 프로브 세트 1의 대표적인 형광 강도 시간 트레이스 결과를 보여준다.
도 3b는 실시예 4-3에 따라, let-7a와 let7c에 대한 프로브 세트 2의 대표적인 형광 강도 시간 트레이스 결과를 보여준다.
도 4a는 실시예 6-1에 따라, let-7a의 단일 뉴클레오타이드가 돌연변이된 mismatch 표적 서열로서, 대응하는 프로브 DNA가 single nucleotide mismatch를 갖는, mismatch target 서열의 설계도를 나타낸다.
도 4b는 실시예 6-2에 따라, mismatch target 1, 2, 3 각각의 Cy3 (green), Cy5 (red), 및 Cy7 (black) 의 대표적인 형광 강도 시간 트레이스 결과를 보여준다.
도 4c는 target let-7a, mismatch target1, mismatch target2, mismatch target3 상의 Imager1, Imager2, Imager3의 결합상태의 Time fraction 측정 결과를 보여준다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 단, 이는 본 발명의 일 예를 나타낼 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 테르무스 테르모필루스 Ago ( Thermus thermophilus Ago, Tt Ago) 단백질의 정제
N-말단에 His-tagged 형태를 갖는 TtAgo 단백질을 제조하기 위해, 테르무스 테르모필루스 Ago (Thermus thermophilus Ago, TtAgo) 유전자 (TT_P0026)를 TEV protease cleavage site를 포함하도록 변형된 pET28a 벡터 (Addgene)에 클로닝하였다. 이어서, Escherichia coli BL21(DE3) 세포에 상기 재조합 벡터를 삽입한 후, 18℃에서 0.5mM의 IPTG(isoproply-1-thio-β-D-galactopyranoside)와 함께 배양하여 TtAgo 유전자를 발현시켰다. 다음으로 TtAgo 단백질을 발현하는 세포들을 1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 및 2 mM MgCl2를 함유하는 용해 버퍼(buffer) 내에서 초음파를 처리하여 용해시켰으며, 용해된 세포를 18,000rpm에서 1시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 4℃에서 3시간 동안 Ni-NTA agarose resin (Qiagen) 에서 배양하였다. 배양을 완료한 후 Ni-NTA 레진을 20mM 이미다졸을 포함하는 용해 버퍼에서 세척하였으며, 다음으로, TtAgo 단백질을 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2 및 100 mM 이미다졸(imidazole)을 함유하는 버퍼에서 용출시키고, N-말단 His-태그는 TEV 프로테아제를 처리해 제거하였다.
이후, 열적으로 안정한 TtAgo 단백질을 55℃에서 15분동안 열을 처리해 추가로 정제하였다. 열-처리를 수행한 이후에 가용성 분획에 포함되어 있는 TtAgo 단백질을 수집하였으며 Superdex 200 (GE Healthcare) size exclusion column을 사용해 추가 정제하였다.
실시예 2. DNA 프로브 준비, RNA 분리, Poly(G)tailing
2-1. DNA 프로브 준비
6개의 탄소사슬을 이용하여 부착된 아민그룹을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 4종을 Integrated DNA technology (IDT, Coralville, IA)로부터 구입하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드 4종의 서열을 표 1에 서열번호 3 내지 6으로 나타내었으며, 서열번호 3 내지 6의 올리고뉴클레오타이드를 각각 Imager 1 내지 4로 명명하였다. 서열번호 3 내지 6에서 링커를 밑줄을 그어 표시하였으며, T*는 6개의 탄소사슬을 이용하여 아민기가 부착된 티민을 의미한다.
구분 염기서열(5' > 3') 서열번호
let-7a miRNA UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU 1
let-7c miRNA UGA GGU AGU AGG UUG UAU GGU 2
Imager1 Phos-ACT ACC TCA TTT TTT TTT* TTT 3
Imager2 Phos-TAC AAC CTA CTC ATT TTT* TTT 4
Imager3 Phos-ACT ATA CAA CCA TTA TTT* ATT 5
Imager4 Phos-ACC ATA CAA CTT TTA TTT* ATT 6
다음으로, 링커의 아민 그룹과 반응하는 Cy3, Cy5, 또는 Cy7 mono NHS-ester로 Imager1, Imager2, Imager3, Imager4의 각각의 프로브를 표지하였다. Imager1 (서열번호 3) 프로브는 Cy7로 표지하였으며, Imager2 (서열번호 4) 프로브는 Cy3으로 표지하였고, Imager3 (서열번호 5) 프로브는 Cy5로 표지하였다 (도 2a 참고).
다음으로, 형광표지된 프로브를 50mM NaCl과 함께, 10mM Tris-HCl (pH 8.0)을 포함하는 T50 buffer에 저장하였다.
이 후 실험에서 사용한 Probe set 1은 Imager1, Imager2, 및 Imager3을 포함하며, Probe set 2는 Imager1, Imager2, 및 Imager4을 포함한다.
2-2. RNA 분리 및 Poly(G)tailing
HeLa 세포 (한국세포주은행)로부터 TRIzol (Invitrogen) 또는 mirVana 키트 (Ambion)를 사용하여 miRNA를 분리하였다.
분리한 miRNA의 3'말단을 Poly G tailing 하기 위해, Poly(A) Polymerase Reaction Buffer (100mM Tris-HCl, pH 7.0, 3.0mM MnCl2, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 500μg/ml acetylated BSA, 50% glycerol) 4μl, RNA 0.2μM, 5mM GTP 1μl, 5mM ITP 1μl, 효모 Poly(A) polymerase(Thermo Fisher) 600 units와 Rnase-free 물을 혼합하여 20μl 부피의 혼합물을 제조하였다. 분리한 RNA와 상기 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하고 65℃에서 15분동안 가열하여 반응을 종결시켰다.
실시예 3. 검출 칩 제조 및 단일-분자 실험(Single-molecule experiment)
3-1. 검출 칩 제조
단일-분자 실험은 전반사 형광 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)에서 수행하였다. 우선, 분자 간의 비특이적인 결합을 감소시키기 위해, Quartz slide의 유리 표면을 40:1 비율의 PEG 와 biotin-PEG 혼합물로 코팅하였으며, quartz slide 와 glass coverslip 사이에 양면 접착 테이프를 부착하여 검출 칩(detection chip)을 제조하였다.
3-2. Ago-프로브 복합체 조립
실시예 1에서 준비한 TtAgo 1uM 과, 실시예 2-1에서 준비한 각각의 dye-labeled(Cy3, Cy5, or Cy7) 프로브 DNA, 즉 Imager1, Imager2, Imager3, 또는 Imager4 프로브 0.2uM 를, 100 mM NaCl 을 포함하는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)과 5 mM MgCl2을 포함하는 Ago-DNA assembly buffer 에 넣고 55℃ 에서 30분동안 배양하여, Ago-프로브 복합체 (Ago-Imager1, Ago-Imager2, Ago-Imager3, Ago-Imager4) 를 조립하였다.
3-3. 단일 분자 실험
단일-분자 실험을 위해, 실시예 2-2에서 제조한 poly(G) tailing된 miRNAs를 biotinylated poly (C) DNA 가닥(30nt)과 함께 배양한 다음, streptavidin-biotin 상호작용을 통해 검출 칩에 고정시켰다.
다음으로, 실시예 3-2에서 제조된 분광학적/서열이 상이한 3종의 Ago-probe 복합체 (Probe set 1 또는 Probe set 2)를 이미징 버퍼 (135 mM KCl을 함유하는 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% 포름아마이드, 120mM UREA, 1mM Mg2+, 및 산소 제거 시스템 (4 mg/ml D-(+)-glucose (Sigma-Aldrich), 1mg/ml glucose oxidase (Sigma-Aldrich), 0.04mg/ml catalase (Roche), 및 saturated Trolox 25 mg/50 mL))로 100배 희석하고, 검출 칩에 동시에 주입시켰다. 실험은 30℃에서 수행하였으며, Cy3, Cy5, 및 Cy7은 532-nm 레이저 (Compass215M, Coherent, Santa Clara, CA), 640-nm 레이저 (Cube640-100C, Coherent, Santa Clara, CA), 및 730-nm 레이저 (PhoxX® 730, Omicron, Germany)에 각각 노출시켰다. 세 개의 레이져를 전환하기 위해 대체용으로 alternative laser excitation (ALEX), mechanical shutters (LS-3, Uniblitz, Rochester, NY)를 사용하였다. Cy3, Cy5, 및 Cy7의 형광 신호는 두 개의 dichroic mirrors (635dcxr and 740dcxr, Chroma) 와 하나의 mirror (BB01-E02, Thorlabs)를 사용해 분리된 water-immersion objective (UPlanSApo 60Х, Olympus) 를 통해 수집하였고, EM-CCD 카메라 (Ixon DV897, Andor)로 영상화하였다. 데이터는 Visual C++ (Microsoft)로 작성된 home-built 프로그램을 사용해 수집하였으며, MATLAB (R2010a, The MathWorks)과 Origin (8.0, OriginLab)을 사용해 분석하였다.
실시예 4. miRNA sensing 과정
4-1. 표면 고정화를 위한 miRNA tailing
첫 번째 단계로, 실시예 2-2의 방법으로 추출한 endogenous RNAs에 poly(G) tail을 추가하는 단계를 수행하였다 (도 1a). Poly (G) tail은 본 발명의 방법에서 표면 고정화를 위해 사용된다. biotinylated poly (C) DNA 가닥은 miRNA 감지 칩에 모든 miRNA를 비선택적으로 포획하기 위해 스트렙타비딘-비오틴 상호작용을 통해 부착되었고, 이러한 biotinylated poly (C) DNA 가닥은 poly (G) RNA tail과 하이브리드화 되었다. 일련의 과정을 도 1a에 나타냈다.
4-2. 세 개의 DNA 프로브를 사용한 miRNA 탐지방법
검출하고자 하는 표적 miRNA는 검체에서 추출한 모든 miRNA를 비선택적으로 표면-고정시킨 후에 검출하였다.
우선, 표적 miRNA의 seed, mid, 및 tail 부분을 타겟으로 하는 세 개의 서로 다른 DNA 프로브 (Probe set 1 또는 Probe set 2)를 사용하였다(도 2a 참조).
세 개의 DNA 프로브는 서로 다른 색의 형광으로 표지되기 때문에, 프로브의 결합은 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy; TIRF)을 통한 단일분자 다색 이미지화를 통해 구별할 수 있다. 그러나, 이러한 DNA 프로브를 사용할 경우, DNA가 상보적인 miRNA 부위를 찾아 결합하는 속도가 매우 느리므로, DNA 프로브를 사용하는 miRNA의 표적화는 실용적이지 않다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 Argonaute 단백질에 DNA 프로브를 탑재함으로써, DNA 프로브와 miRNA의 결합 속도를 증가시켰다 (도 1b 참조). 도 1b는 miRNA의 seed, mid, 및, tail 부분을 각각 타겟으로 하는 서로 다른 세개의 DNA 프로브들을 사용한 miRNA 탐지방법 과정을 도식화한 것이다. 상기 miRNA의 seed 부분은 miRNA의 5'말단 부위의 약 7-11nt 정도의 부위를 의미하며, mid 부분은 miRNA의 5'과 3'의 중간 부위의 약 7-11nt 정도의 부위를 의미하고, tail 부분은 miRNA의 3'말단 부위의 약 7-11nt 정도의 부위를 의미한다. 상기 seed 부분 말단의 연속하는 염기서열은 mid 부분과 일부 겹칠 수 있고, mid 부분 말단의 연속하는 염기서열은 tail 부분과 일부 겹칠 수 있다.
본 발명의 프로브와 상보적인 RNA 타겟 부분은 단지 9-11nt 정도의 길이로 짧기 때문에, miRNA와 Argonaute-프로브 복합체 사이의 상호작용은 매우 동적이다. 더 나아가, 프로브와 miRNA 사이의 단일-염기 불일치가 존재하는 경우, 현저하게 다른 운동 파라미터가 제공되므로 단일 뉴클레오타이드 정도의 차이에도 높은 특이성이 보장된다.
4-3. 세 개의 DNA 프로브를 사용한 miRNA 탐지방법 타당성 시험
본 발명의 miRNA 탐지방법의 타당성을 시험하기 위해, let-7a 및 let-7c 두 개의 let-7 miRNA 패밀리를 사용하였다. let-7a와 let-7c는 tail 부분에서 오직 한 개의 염기만이 상이한 패밀리 RNA이다 (도 2a). let-7a와 let-7c miRNA의 염기서열을 표 1에 서열번호 1 및 2로 나타내었다. 표 1의 서열번호 2에서 굵은 글씨로 표시한 염기는, let-7a와 비교해 차이 나는 한 개의 뉴클레오타이드를 표시한 것이다.
도 2a는 타겟 miRNA(let-7a 및 let-7c)와 이들을 표적으로 하는 각각의DNA 프로브 세트를 나타낸다. let-7a와 let-7c를 탐지하기 위해, 본 발명자들은 프로브 세트 1 (Imager 1, 2, 및 3)와 프로브 세트 2 (Imager 1, 2, 및 4)를 준비하였다. Cy7로 표지한 Imager 1은 표적 miRNA의 seed 부분을 탐지하고, Cy3로 표지된 Imager 2는 mid 부분을 탐지하며, Cy5로 표지된 Imager 3 및 Imager 4는 각각 let-7a 및 let-7c의 tail 부분을 탐지한다. seed는 표적 RNA의 5'말단 쪽 7~11개의 염기 부분을 의미하며, mid 는 5'말단과 3'말단 사이의 중간 위치의 7~11개의 염기 부분을 의미하고, tail은 표적 RNA의 3' 말단 쪽의 7~11개의 염기 부분을 의미한다.
단일-분자 실험을 위해, 합성된 let-7a와 let-7c를 실시예 3에서 제조한검출 칩에 고정하였으며, 미리 조립해놓은 Argonatue-프로브 복합체를 첨가하였다. 이후, 실시예 3-3의 방법을 사용해, 단일분자 검출 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타냈다.
이러한 동역학적인 특성을 정량화하기 위해, 본 발명자들은 imager의 결합상태 time fractions를 계산하였으며, 계산 결과 그래프를 도 2b에 나타냈다. 도 2b는 let-7a 및 let-7c miRNAs에 대한 프로브 세트 1과 프로브 세트 2의 결합상태 time fraction을 나타낸다. 이로부터, Time fraction을 let-7a 및 let-7c를 감지하기 위한 기준으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 상기 결과들로부터 본 발명의 검출방법이 단일 분자 수준에서 miRNAs(~22nt)를 명확하게 검출해낼 수 있으며, Argonaute-프로브 복합체의 kinetic 파라미터를 사용하여, 우수하게 단일-염기 구분이 가능함을 알 수 있었다.
실시예 5. 세포 추출물 miRNA의 단일 분자 검출실험
본 발명자들은 HeLa 세포 추출물의 miRNA에 본 발명의 검출방법을 적용해보았다. 우선, 실시예 2-2의 방법을 사용해 HeLa 세포로부터 endogenous RNA를 추출했으며, 분리한 RNAs에 poly (G) tail을 첨가하였다. Poly (G) tail이 부착된 RNA와, biotinylated poly (C) DNA 가닥을 혼성화하였으며, 스트렙타비딘-바이오틴 상호작용을 통해 miRNA 검출 칩에 고정시켰다. 다음으로, HeLa 세포로부터 나온 모든 miRNAs를 챔버 안에 비선택적으로 투입하였으며, 이어서, Argonaute와 복합체를 이룬 프로브 세트 1과 프로브 세트 2를 주입하고, 30℃ 온도에서 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy; TIRF)을 이용해 Cy7(흑색), Cy3(녹색), 및 Cy5(적색)의 단일-분자 형광 신호를 측정하고 time fraction을 계산하였으며, 그 결과를 도 2c 및 도 2d에 나타냈다.
도 2c는 Argonaute-loaded 프로브 세트 1을 검출 칩에 주입한 후, 3개의 형광체 (seed 부분을 타겟하기 위한 Cy7, mid 부분을 타겟하기 위한 Cy3, tail 부분을 탐지하기 위한 Cy5)로부터의 형광 신호를 측정한 결과를 나타낸다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, 프로브 세트 1을 주입함에 따라, Cy7, Cy3, 및 Cy5의 단일-분자 형광 신호가 성공적으로 관찰되었으며, 단일-분자 수준에서 성공적으로 검출됨을 확인하였다.
도 2d는 Molecule 1 (상단), 및 Molecule 2 (하단)에 대한 프로브 세트 1과 프로브 세트 2의 대표적인 형광 강도 시간 트레이스 결과를 나타낸다. 프로브세트 1의 모든 imager들의 결합상태 time fractions 은 0.1 이상으로 측정되었으며, 이에 Molecule 1을 let-7a로 분류하였다. 이와 대조적으로, 프로브세트 2의 모든 imager들의 결합상태 time fractions 이 0.1 이상으로 측정되었으며, 이에 Molecule 2를 let-7c로 분류하였다.
실시예 6. miRNA의 단일염기다형성(SNP) 확인
6-1. 세 개의 Mismatch target RNA 제조
본 발명의 Argonaute를 이용한 단일-분자 수준에서의 miRNA 탐지방법이 miRNA 탐지에서 더 나아가, 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 확인할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 let 7a RNA 서열(서열번호 1)에서 오직 한 개의 뉴클레오타이드만 변경한 서로 다른 세 종류의 Mismatch target RNA를 제조하였으며, 제조된 세 종류의 Mismatch target RNA 서열을 도 4a 및 표 2에 나타냈다.
구분 염기서열(5'--> 3') 서열번호
Mismatch target 1
(seed region)		 UGA G C U AGU AGG UUG UAU AGU 7
Mismatch target 2
(mid region)		 UGA GGU AGU A C G UUG UAU AGU 8
Mismatch target 3
(tail region)		 UGA GGU AGU AGG UUG U U U AGU 9
도 4a 및 표 2에 나타낸 바와 같이, Mismatch target 1은 let-7a의 seed region에서 하나의 뉴클레오타이드가 돌연변이 되었으며, Mismatch target 2는 mid region는 mid region에서, Mismatch target 3은 tail region에서 각각 한 개의 뉴클레오타이드가 돌연변이 되었다 (도 4a). 돌연변이된 뉴클레오타이드를 표 2에서 굵은 글씨 및 밑줄로 나타내었다.
6-2. Mismatch target 을 이용한 단일-분자 수준에서 표적 검출 실험
let-7a target 서열 대신에, 실시예 6-1에서 제조한 세 종류의 Mismatch target (Mismatch target 1, Mismatch target 2, Mismatch target 3)을 이용해 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 단일-분자 수준에서 표적 miRNA의 검출 실험을 수행하였다. 이어서, Mismatch target 1-3 에서의 Cy3(녹색), Cy5(적색) 및 Cy7(흑색) 각각의 실시간 형광 트레이스를 얻었으며 대표적인 트레이스를 도 4b에 나타냈다.
도 4b에 나타낸 바와 같이, Mismatch target 1-3을 사용한 경우, 각 Mismatch target에 대하여 비상보적 염기를 하나 포함하는 imager에 해당하는 형광 신호의 time fraction이 현저히 감소하였다. 이로부터, Ago-Imager DNA 복합체의 동역학적 파라미터를 사용하여 mismatch를 배제함으로써 단일 뉴클레오타이드 해상도면에서 정확한 let-7a 서열을 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
다음으로, let-7a(WT), mismatch target1, mismatch target2, 및 mismatch target3 각각에서의 imager 1, imager 2 및 imager 3의 결합상태 Time fraction (= T/P, T: 검출 시간 중 형광 신호가 감지되는 총 시간, P: 검출 시간)을 측정하였으며, 그 결과를 도 4c에 나타냈다. Time fraction의 임계값은 0.1로 설정하였다.
도 4c에 나타낸 바와 같이, 오직 let-7a 서열만이 세가지 유형의 guides 모두에서 0.1 이상의 time fraction을 나타냈으며, Mismatch target 1은 Imager 1이, Mismatch target 2는 Imager 2와 Imager 3이, Mismatch target 3는 Imager 3 에서 0.1 미만의 time fraction을 나타냈다.
따라서, 세 개의 형광 imager 모두에서 time fraction이 0.1 이상일 경우 let-7a라고 판단할 수 있으며, imager 하나라도 time fraction이 0.1 미만으로 측정될 경우, let-7a가 아니라고 판단할 수 있으므로, 단지 하나의 뉴클레오타이드가 상이한 경우에도 배제 가능하였고, 상기 결과로부터 본 발명의 측정방법으로 단일 염기 수준까지 RNA를 검출해 낼 수 있으며, SNP 측정이 가능함을 확인할 수 있었다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Method for detecting polynucleotide using RISC <130> DPP20181130KR <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let-7a miRNA <400> 1 ugagguagua gguuguauag u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let-7c miRNA <400> 2 ugagguagua gguuguaugg u 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Imager 1 <400> 3 actacctcat tttttttttt t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Imager 2 <400> 4 tacaacctac tcattttttt t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Imager 3 <400> 5 actatacaac cattatttat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Imager 4 <400> 6 accatacaac ttttatttat t 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mismatch target 1 (seed region) <400> 7 ugagcuagua gguuguauag u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mismatch target 2 (mid region) <400> 8 ugagguagua cguuguauag u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mismatch target 3 (tail region) <400> 9 ugagguagua gguuguuuag u 21

Claims (25)

  1. 아고너트(Argonaute) 단백질; 및
    검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 핵산 분자가 결합된, 단백질-핵산 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 형광물질이 결합된 (fluorescence-conjugated) 것인, 단백질-핵산 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자는 링커를 포함하고, 상기 링커는 아민기를 포함하며, 상기 형광은 상기 링커의 아민기를 통해 상기 핵산 분자에 결합되는 것인, 단백질-핵산 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 및miRNA로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 단백질-핵산 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 5 내지 50개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 것인, 단백질-핵산 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 DNA 또는 RNA인, 단백질-핵산 복합체.
  7. 아고너트(Argonaute) 단백질; 및 핵산 분자가 결합된 단백질-핵산 복합체를 포함하고,
    상기 핵산 분자는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지며,
    상기 핵산 분자는 형광물질로 표지된 것인, 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드 내의 연속하는 5 내지 15개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 서로 다른 2종 이상의 단백질-핵산 복합체를 포함하며, 상기 서로 다른 2종 이상의 단백질-핵산 복합체는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 서로 다른 2 이상의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 것인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 서로 다른 2종 이상의 단백질-핵산 복합체는, 서로 다른 2종 이상의 신호를 발생시키는 형광물질로 표지된 것인, 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 핵산 분자는 링커를 포함하고, 상기 링커는 아민기를 포함하며, 상기 형광물질은 상기 링커의 아민기를 통해 상기 핵산 분자에 표지된 것인, 조성물.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드는 서로 다른 2종 이상인, 조성물.
  13. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 및 miRNA로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 생물학적 시료는, 분리된 세포, 세포 용해물, 세포 추출물, 세포 파쇄물, 또는 분리된 DNA 또는 RNA인, 폴리뉴클레오타이드 검출 방법.
  16. 제7항의 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 생물학적 시료와 접촉시키는 단계;
    상기 접촉에 의해 발생하는 형광신호를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 형광신호를 이용하여 결합상태 시간분율 (time fraction)을 계산하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방법을 적어도 2회 이상 수행하되, 각각의 수행은 서로 다른 단백질-핵산 복합체를 사용하여 수행되는 것이며,
    상기 서로 다른 단백질-핵산 복합체는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 서로 다른 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 것인, 방법.
  18. 제10항의 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 생물학적 시료와 접촉시키는 단계;
    상기 접촉에 의해 발생하는 서로 다른 2종 이상의 형광신호를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 서로 다른 2종 이상의 형광신호를 이용하여 각각의 결합 상태 시간분율 (time fraction)을 계산하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계산된 결합상태 시간분율 (time fraction)이 임계값 이상일 경우, 상기 생물학적 시료는 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합상태 시간분율은 하기 [수학식 1]로 계산되는 것인, 방법:
    [수학식 1]
    결합상태 시간분율 (time fraction) = T / P
    (T: 형광 신호가 감지되는 총 시간,
    P: 검출 시간)
  21. 제19항에 있어서, 상기 임계값은, 상기 검출하고자 하는 검출 대상 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산 부위와 상보적인 핵산 서열을 가지는 임의의 핵산 분자에 의한 결합상태 시간분율 (time fraction) 중 최소값 이하인, 방법.
  22. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드와 염기 상동성이 90% 이상인 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 방법.
  23. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광신호를 측정하는 단계는 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy; TIRF), 다초점 형광 현미경 (Confocal microscopy), Epi-형광 현미경 (Epi-fluorescence microscopy), HiLo 현미경 (HiLo microscopy), 및 라인 스캐닝 공초점 현미경 (Line-scanning confocal microscopy)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 측정하는 것인, 방법.
  24. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 대상 폴리뉴클레오타이드는 말단에 폴리뉴클레오타이드 꼬리를 가져 검출 칩 (chip)에 고정되는 것인, 방법.
  25. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 검출용 조성물을, 검출 대상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 단일 염기 다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP)의 검출 방법.
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